Структурно-функциональные исследования активного центра бактериальной РНК-полимеразы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Зоров, Савва Дмитриевич

• Зоров, Савва Дмитриевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зоров, Савва Дмитриевич

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.стр.

ВВЕДЕНИЕ.стр.

Актуальность проблемы.стр.

Цель работы и задачи исследования.стр.

Научная новизна.стр.

Практическое значение работы.стр.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ . стр.

1.1. Общие сведения о РНК-полимеразе и

Транскрипционном цикле.стр.

1.2. Структурные особенности РНК-полимеразы.стр.

1.3. Структурно-функциональная модель активного центра РНК-полимеразы.стр.

1.3.1. Двуметаллический механизм катализа.стр.

1.3.2. Механизм катализа многосубъединичной РНКП.стр.

1.3.3. Характеристика реакции 3'-5'-экзонуклеазного расщепления.стр.

1.3.4. Влияние мутационных замен в (З-субъединице РНКП

Е. coli на 3'-5'-экзонуклеазную активность.стр.

1.3.5. Молекулярное моделирование активного центра РНКП Е. Coli.стр.

1.4. Ингибиторы РНК-полимеразы. Антибиотики.стр.

1.4.1. Рифампицин.стр.

1.4.2. Тагетитоксин.стр.

1.4.3. Альфа-аманитин.стр.

1.4.4. Специфичность действия аманитина и тагетитоксина.стр.

1.4.5. Стрептолидигин.стр.

1.4.6. Липиармицин.стр.

1.4.7. Микроцин J25.стр.

1.4.8. Ингибиторы серии CBR703.стр.

1.4.9. Дауномицин и марселломицин.стр.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.стр.

2.1. Бактериальные штаммы и плазмиды.стр.

2.2. Полимеразы.стр.

2.3. Приготовление РНК-полимеразы из клеток.стр.

2.3.1. Выделение РНК-полимеразы E.coli.стр.

2.3.2. Выделение РНК-полимеразы Thermus aquaticus.стр.

2.4. Бактериальные среды.стр.

2.5. Электрофорез.стр.

2.6. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).стр.

2.7. Метод Ре2+-индуцированного расщепления белка.стр.

2.8. Радиоактивное мечение олигонуклеотидов.стр.

2.9. Транскрипция с Т7А1 промотора, абортивный синтез.стр.

2.10. Транскрипция на искуственных транскрипционных комплексах (нуклеиновокислотных скаффолдах).стр.

2.11. Эндонуклеотическое и экзонуклеотическое расщепление, пирофосфоролиз.стр.

2.12. Измерение быстрых кинетик реакции элонгации.стр.

2.13. Определение скоростей реакций (Kobs ,Vmax) и константы Михаэлиса (Km).стр.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.стр.

3.1. Исследование механизма ингибирования бактериальной РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином.стр.

3.1.1. Стрептолидигин ингибирует присоединение нуклеотида, разделяя злонгационноые комплексы на медленную и быструю фракции.стр.

3.1.2. Характеристика фракций элонгационных комплексов, образующихся в присутствии стрептолидигина.стр.

3.1.3. Стрептолидигин ингибирует внутреннее расщепление РНК, при этом также разделяя комплексы на медленную и быструю фракции.стр.

3.1.4. Присутствие стрептолидигина не изменяет значение

Км для входящего нуклеозидтрифосфата.стр.

3.1.5. Стрептолидигин замедляет некую стадию, предшедствующую синтезу фосфодиэфирной связи.стр.

3.1.6. Кристаллическая структура РНКП со связанным с ней стрептолидигином. Модель ингибирования РНКП стрептолидигином и функционирования активного центра РНКП.стр.

3.2. Изучение роли триады остатков аспарагиновой кислоты в двуметаллическом механизме катализа в активном центре РНК-полимеразы.стр.

3.2.1. Замены остатков Asp в активном центре РНКП делают невозможной промотор-зависимую транскрипцию.стр.

3.2.2. Замены каталитических остатков Asp влияют на связывание Ме2+ со свободной РНКП.стр.

3.2.3. Мутантные РНКП частично активны в элонгационном комплексе.стр.

3.2.4. Замены Asp лишь умеренно уменьшают кажущееся сродство каталитического центра к Ме2+ в транскрипционных комплексах.стр.

3.2.5. Расщепление транскрипта мутантными РНКП.стр.

ВЫВОДЫ.стр.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные исследования активного центра бактериальной РНК-полимеразы»

Актуальность проблемы.

ДНК-зависимые РНК-полимеразы (РНКП) осуществляют процесс транскрипции, т.е. создание РНК-копии генов для последующей трансляции. Выделяют три стадии транскрипционного цикла: инициацию, элонгацию и терминацию, при этом непосредственно реакция полимеризации происходит на стадии элонгации. Ключевым этапом процесса элонгации является образование фосфодиэфирной связи между входящим субстратом (нуклеозидтрифосфатом) и З'-концевым нуклеотидом цепи РНК в активном центре РНКП. Несмотря на множество биохимических и структурных данных, механизм функционирования активного центра РНКП в целом остается не полностью изученным.

Недавно была предложена универсальная модель, по которой реакция образования фосфодиэфирной связи в активном центре РНКП, также как и другие виды активностей, такие как расщепление РНК, пирофосфоролиз, происходит при участии двух ионов магния, находящихся в активном центре РНКП (Sosunov et al, 2003). Однако необходима дальнейшая исследовательская работа по проверке и совершенствованию этой модели.

Кроме того, не изучены другие процессы в активном центре, предшествующие образованию фосфодиэфирной связи, и в этом направлении остается огромное поле для деятельности.

Понимание всех этих этапов в работе РНКП необходимо для выяснения механизма функционирования активного центра РНКП в целом.

Помимо чисто научного, понимание функционирования активного центра РНКП несет в себе и практический интерес, особенно в случае бактериальной РНКП, поскольку его можно применить в разработке новых антибиотиков.

Цель работы и задачи исследования.

Целью настоящей работы было изучение структурно-функциональной организации активного центра бактериальной РНКП. В задачи данного исследования входило:

1. Изучить механизм ингибирования РНК-полимеразы антибиотиком стрептолидигином, действующим на уровне активного центра.

2. На основе структурных и биохимических данных по ингибированию РНКП стрептолидигином предложить общую схему функционирования активного центра РНКП.

3. Произвести проверку универсальной модели двуметаллического механизма катализа в активном центре РНКП.

Научная новизна.

В работе исследован механизм действия антибиотика стрептолидигина на бактериальную РНК-полимеразу. Несмотря на то, что этот антибиотик известен уже очень давно (Siddhikol et al.,1969), до настоящего времени исследования механизма его действия детально не проводились. При этом известно, что ингибирование РНКП стрептолидигином непосредственно связано с активным центром РНКП (Severinov et al., 1995), поэтому исследование механизма ингибирования РНКП стрептолидигином представляло существенный интерес в понимании функционирования активного центра РНКП.

В настоящей работе впервые, с помощью структурных и биохимических данных, был детально изучен механизм действия стрептолидигина. Было показано, что стрептолидигин ингибирует РНКП по необычному механизму, когда РНКП, связанная со стрептолидигином остается активной, но скорость реакций, осуществляемых РНКП, сильно снижена. Это первый пример описанного ингибитора РНКП, действующего таким образом, а не полностью инактивирующим РНКП при связывании с ней.

Кроме того, с помощью стрептолидигина впервые было получено свидетельство существования некой стадии процесса элонгации, предшествующей синтезу фосфодиэфирной связи.

На основе результатов данной работы была предложена новая модель функционирования активного центра РНКП.

Также, в данной работе, при помощи мутагенеза была проверена и подтверждена недавно предложенная модель двуметаллического катализа образования фосфодиэфирной связи в активном центре. В этой модели два иона магния координированы в активном центре тремя консервативными остатками аспарагиновой кислоты. В настоящей работе показано, что каждый из трех остатков аспарагиновой кислоты участвует в акте катализа, а также впервые экспериментально показано, что нуклеиновые кислоты принимают серьезное участие в связывании Мд2+ в активном центре. Практическое значение работы.

Понимание каталитического механизма бактериальной РНКП расширяет горизонты для различных стратегий антибактериальной защиты. В частности, изучение стрептолидигина представляет большой интерес, так как этот антибиотик или его производные в перспективе могут найти применение в клинической практике вообще и в борьбе с устойчивыми штаммами бактерий в частности.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зоров, Савва Дмитриевич

выводы

1. Впервые детально изучен механизм ингибирования РНК-полимеразы стрептолидигином. Доказано, что стрептолидигин ингибирует РНК-полимеразу по необычному механизму, при котором антибиотик, связываясь с элонгационным комплексом, приводит не к полной инактивации, а к сильному замедлению активности РНК-полимеразы.

2. Показано, что стрептолидигин ингибирует стадию рабочего цикла РНК-полимеразы, предшествующую образованию фосфодиэфирной связи в активном центре, при этом не влияя на связывание субстрата. Эта стадия видимо представляет собой опосредованный изгибанием F-спирали перенос находящегося в активном центре нуклеотида в оптимальное положение для катализа.

3. На основании структурных и биохимических данных по ингибированию РНК-полимеразы стрептолидигином была предложена новая модель функционирования активного центра РНК-полимеразы, в которой нукпеотид образует связь с комплементарным основанием ДНК в так называемом "прединсерционном" сайте, а затем переносится в "инсерционный" сайт, где происходит синтез фосфодиэфирной связи.

4. Подтвержден универсальный механизм синтеза и расщепления фосфодиэфирной связи в активном центре клеточной РНК-полимеразы с участием двух ионов двухвалентных металлов. Показано, что каждый из трех консервативных остатков аспарагиновой кислоты в активном центре фермента участвует в акте катализа.

5. Показано, что нуклеиновые кислоты вносят ощутимый вклад в связывание иона металла в активном центре элонгационного комплекса РНК-полимеразы, компенсируя отсутствие любого из трех участвующих в образовании координационных связей остатков аспарагиновой кислоты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зоров, Савва Дмитриевич, 2005 год

1. Лисицин Н.А., Свердлов Е.Д., Моисеева Е.П., Никифоров В.Г. (1985) Локализация мутации, приводящей к устойчивости РНК-полимеразы E.coli к антибиотику стрептолидигину, в гене гроВ, кодирующем ст-субъединицу фермента. Биоорган. Химия 11:132-134

2. Лурье Ю. (1989) Руководство по аналитической химии. Химия. Москва

3. Николаев А.В. (1999) Дипломная работа, Институт Молекулярной генетики РАН, Москва

4. Archambault J, Friesen JD (1993) Genetics of eukaryotic RNA polymerases I, II, and III. Microbiol Rev. 57(3):703-724

5. Artsimovitch I, Chu C, Lynch AS, Landick R. (2003) A new class of bacterial RNA polymerase inhibitor affects nucleotide addition. Science 302(5645):650-654

6. Axen A, Carlsson A, Engstrom A, Bennich H. (1997) Gloverin, an antibacterial protein from the immune hemolymph of Hyalophora pupae. Eur J Biochem. 247(2):614-619

7. Bar-Nahum G, Epshtein V, Ruckenstein AE, Rafikov R, Mustaev A, Nudler E. (2005) A ratchet mechanism of transcription elongation and its control. Cell 120(2):183-193.

8. Baroudy BM, Moss В (1980) Purification and characterization of a DNA-dependent RNA polymerase from vaccinia virions. J Biol Chem. 255(9):4372-4380

9. Bartolomei MS, Corden JL (1987) Localization of an alpha-amanitin resistance mutation in the gene encoding the largest subunit of mouse RNA polymerase II. Mol Cell Biol. 7(2):586-594

10. Bartolomei MS, Corden JL (1995) Action of alpha-amanitin during pyrophosphorolysis and elongation by RNA polymerase II. J Biol Chem. 270(32):19114-19119

11. Bateman A, Singh A, Congote LF, Solomon S. (1991) The effect of HP-1 and related neutrophil granule peptides on DNA synthesis in HL60 cells. Regul Pept. 35(2): 135-143

12. Beese LS, Steitz ТА. (1991) Structural basis for the 3-5' exonuclease activity of Escherichia coli DNA polymerase I: a two metal ion mechanism. EMBO J., 10:25-33

13. Bellamy W, Takase M, Wakabayashi H, Kawase K, Tomita M. (1992) Antibacterial spectrum of lactoferricin B, a potent bactericidal peptide derived from the N-terminal region of bovine lactoferrin. J Appl Bacteriol. 73(6):472-479

14. Boman HG, Agerberth B, Boman A. (1993) Mechanisms of action on Escherichia coli of cecropin P1 and PR-39, two antibacterial peptides from pig intestine. Infect Immun. 61(7):2978-2984

15. Bonner G, Patra D, Lafer E, Sousa R (1992) Mutations in T7 RNA polymerase that support the proposal for a common polymerase active site structure. EMBO J. 11: 3767-3775

16. Borukhov S, Goldfarb A (1993) Recombinant Escherichia coli RNA polymerase: purification of individually overexpressed subunits and in vitro assembly. Protein Expr. Purif. 4: 503-511

17. Borukhov S, Sagitov V, Goldfarb A (1993) Transcript cleavage factors from E. coli. Cell 72: 459-466

18. Borukhov S, Laptenko O, Lee J (2001) Escherichia coli transcript cleavage factors GreA and GreB: functions and mechanisms of action. Methods Enzymol. 342: 64-76

19. Broyles SS, Moss В (1986) Homology between RNA polymerases of poxviruses, prokaryotes, and eukaryotes: nucleotide sequence and transcriptional analysis of vaccinia virus genes encoding 147-kDa and 22-kDa subunits. Proc Natl Acad Sci USA 83(10):3141-3145

20. Bushnell DA, Cramer P, Kornberg RD (2001) Selenomethionine incorporation in Saccharomyces cerevisiae RNA polymerase II. Structure (Camb). 9(1):R11-14

21. Campbell EA, Korzheva N, Mustaev A, Murakami K, Nair S, Goldfarb A, Darst SA (2001) Structural mechanism for rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell 104(6):901-912

22. Cassani G, Burgess RR, Goodman HM, Gold L. (1971) Inhibition of RNA polymerase by streptolydigin. Nat New Biol. 230(15): 197-200

23. Cermakian N, Ikeda TM, Miramontes P, Lang BF, Gray MW, Cedergren R. (1997) On the evolution of the single-subunit RNA polymerases. J Mot Evoi 45(6):671-681

24. Chafin DR, Guo H, Price DH. (1995) Action of alpha-amanitin during pyrophosphorolysis and elongation by RNA polymerase II. J Biol Chem. 270(32):19114-19119

25. Cochet-Meilhac M, Chambon P (1974) Animal DNA-dependent RNA polymerases. 11. Mechanism of the inhibition of RNA polymerases В by amatoxins. Biochim Biophys Acta. 353(2):160-184

26. Copeland WC, Wang TS (1993) Mutational analysis of the human DNA polymerase alpha. The most conserved region in alpha-like DNA polymerasesis involved in metal-specific catalysis. J Biol Chem. 268: 11028-11040

27. Coppola JA, Luse DS (1984) Purification and characterization of ternary complexes containing accurately initiated RNA polymerase II and less than 20 nucleotides of RNA. J Mot Biol. 178(2):415-437

28. Coronelli C, White RJ, Lancini GC, Parenti F. (1975) Lipiarmycin, a new antibiotic from Actinoplanes. II. Isolation, chemical, biological and biochemical characterization. JAntibiot (Tokyo) 28(4):253-259

29. Couto MA, Harwig SS, Lehrer Rl (1993) Selective inhibition of microbial serine proteases by eNAP-2, an antimicrobial peptide from equine neutrophils. Infect Immun. 61(7):2991-2994

30. Cramer P, Bushnell DA, Fu J, Gnatt AL, Maier-Davis B, Thompson NE, Burgess RR, Edwards AM, David PR, Kornberg RD (2000) Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science, 288; 640-649

31. Cramer P, Bushnell DA, Kornberg RD (2001) Structural basis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 angstrom resolution. Science, 292: 1863-1876

32. Date T, Yamamoto S, Tanihara K, Nishimoto Y, Matsukage A (1991) Aspartic acid residues at positions 190 and 192 of rat DNA polymerase beta are involved in primer binding. Biochemistry 30: 5286-5292

33. Delgado MA, Rintoul MR, Farias RN, Salomon RA (2001) Escherichia coli RNA polymerase is the target of the cyclopeptide antibiotic microcin J25. J Bacteriol. 183(15):4543-4550

34. Ebright RH. (2000) RNA polymerase: structural similarities between bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNA polymerase II. J Mol Biol. 304: 687-98

35. Epand RM, Vogel HJ. (1999) Diversity of antimicrobial peptides and their mechanisms of action. Biochim Biophys Acta. 1462(1-2):11-28

36. Epshtein V, Mustaev A, Markovtsov V, Bereshchenko O, Nikiforov V, Goldfarb A. (2002) Swing-gate model of nucleotide entry into the RNA polymerase active center. Mol Cell 10: 623-634

37. Foster JE, Holmes SF, Erie DA. (2001) Allosteric binding of nucleoside triphosphates to RNA polymerase regulates transcription elongation. Cell 106(2):243-52.

38. Geiduschek EP, Tocchini-Valentini GP (1988) Transcription by RNA polymerase III. Annu Rev В/осЛет.57:873-914

39. Gnatt AL, Cramer P, Fu J, Bushnell DA, Kornberg RD (2001) Structural basis of transcription: an RNA polymerase II elongation complex at 3.3 A resolution. Science, 292(5523): 1876-1882

40. Gnatt AL. (2002) Elongation by RNA polymerase II: structure-function relationship. Biochim Biophys Acta, 1577(2):175-190

41. Greenleaf AL (1983) Amanitin-resistant RNA polymerase II mutations are in the enzyme's largest subunit. J Biol Chem. 258(22): 13403-13406

42. Gross C.A., Chan C., Dombroski A., Gruber Т., Sharp M., Tupy J., Young B. (1998) The functional and regulatory roles of sigma factors in transcription. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 63:141-155

43. Gu W, Powell W, Mote J Jr, Reines D (1993) Nascent RNA cleavage by arrested RNA polymerase II does not require upstream translocation of the elongation complex on DNA. J Biol Chem. 268(34):25604-25616.

44. Handschin JC, Wehrli W. (1976) On the kinetics of the rifampicin-RNA-polymerase complex. Differences between crude and purified enzyme fractions. Eur J Biochem. 66(2):309-317

45. Hajdukiewicz PT, Allison LA, Maliga P (1997) The two RNA polymerases encoded by the nuclear and the pJastid compartments transcribe distinct groups of genes in tobacco plastids. EMBO J. 16(13):4041-4048

46. Hedtke B, Borner T, Weihe A (1997) Mitochondrial and chloroplast phage-type RNA polymerases in Arabidopsis. Science 277(5327):809-811

47. Heil A, Zillig W (1970) Reconstitute of bacterial DNA-dependent RNA-polymerase from isolated subunits as a tool for the elucidation of the role of the subunits in transcription. FEBS Lett. 11(3):165-168

48. Heisler LM, Suzuki H, Landick R, Gross CA (1993) Four contiguous amino acids define the target for streptolydigin resistance in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 268(34):25369-25375

49. Hess WR, Borner T. (1999) Organellar RNA polymerases of higher plants. Int RevCytol. 190:1-59

50. Hinkle DC, Mangel WF, Chamberlin MJ. (1972) Studies of the binding of Escherichia coli RNA polymerase to DNA. IV. The effect of rifampicin on binding and on RNA chain initiation. J Mol Biol. 70(2):209-220.

51. Holmes SF, Erie DA. (2003). Downstream DNA sequence effects on transcription elongation. Allosteric binding of nucleoside triphosphates facilitates translocation via a ratchet motion. J Biol Chem. 278(37):35597-35608.

52. Huang H, Chopra R, Verdine GL, Harrison SC (1998) Structure of a covalently trapped catalytic complex of HIV-1 reverse transcriptase: implications for drug resistance. Science, 282; 1669-1675

53. Jin DJ, Gross CA. (1988) Mapping and sequencing of mutations in the Escherichia coli rpoB gene that lead to rifampicin resistance. J Mol Biol. 202(1 ):45-58

54. Kanyshkova TG, Semenov DV, Buneva VN, Nevinsky GA. (1999) Human milk lactoferrin binds two DNA molecules with different affinities. FEBS Lett. 451(3):235-237

55. Kapoor S, Sugiura M. (1999) Identification of two essential sequence elements in the nonconsensus type II PatpB-290 plastid promoter by using plastid transcription extracts from cultured tobacco BY-2 cells. Plant Cell 11(9): 17991810

56. Kashlev M, Nudler E, Severinov K, Borukhov S, Komissarova N, Goldfarb A (1998) Histidine-tagged RNA polymerase of Escherichia coli and transcription in solid phase. Methods Enzymol. 274: 326-334

57. Kaushik N, Rege N, Yadav PN, Sarafianos SG, Modak MJ, Pandey VN (1996) Biochemical analysis of catalytically crucial aspartate mutants of human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase. Biochemistry 35:1153611546

58. Kettenberger H, Armache KJ, Cramer P (2003) Architecture of the RNA polymerase ll-TFIIS complex and implications for mRNA cleavage. Cell. 114: 347-357

59. Kettenberger H, Armache K.J., Cramer P. (2004) Complete RNA polymerase II elongation complex structure and its interactions with NTP and TFIIS. Mol Cell 16(6):955-965.

60. Kim HS, Yoon H, Minn I, Park CB, Lee WT, Zasloff M, Kim SC. (2000) Pepsin-mediated processing of the cytoplasmic histone H2A to strong antimicrobial peptide buforin I. J Immunol. 165(6):3268-3274.

61. Kobayashi Y, Dokiya Y, Kumazawa Y, Sugita M. (2002) Non-AUG translation initiation of mRNA encoding plastid-targeted phage-type RNA polymerase in Nicotiana sylvestris. Biochem Biophys Res Commun. 299(1 ):57-61

62. Kobayashi Y, Dokiya Y, Sugita M. (2001) Dual targeting of phage-type RNA polymerase to both mitochondria and plastids is due to alternative translation initiation in single transcripts. Biochem Biophys Res Commun. 289(5): 11061113

63. Kock J, Cornelissen AW (1991) Characterization of the RNA polymerases of Crithidia fasciculata. Mol Microbiol. 5(4):835-842

64. Korzheva N, Mustaev A, Nudler E, Nikiforov V, Goldfarb A (1998) Mechanistic model of the elongation complex of Escherichia coli RNA polymerase. Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 63: 337-345

65. Korzheva N, Mustaev A, Kozlov M, Malhotra A, Nikiforov V, Goldfarb A, Darst SA. (2000) A structural model of transcription elongation. Science 289(5479):619-625

66. Kragol G, Lovas S, Varadi G, Condie BA, Hoffmann R, Otvos L Jr. (2001) The antibacterial peptide pyrrhocoricin inhibits the ATPase actions of DnaK and prevents chaperone-assisted protein folding. Biochemistry 40(10):3016-3026

67. Kriebardis T, Meng D, Aktipis S. (1987) Inhibition of the RNA polymerase-catalyzed synthesis of RNA by daunomycin. Effect of the inhibitor on the late steps of RNA chain initiation. J Biol Chem. 262(26): 12632-12640

68. Mathews DE, Durbin RD (1990) Tagetitoxin inhibits RNA synthesis directed by RNA polymerases from chloroplasts and Escherichia coli. J Biol Chem. 265(1 ):493-498

69. McClure WR (1985) Mechanism and control of transcription initiation in prokaryotes. Annu Rev Biochem. 54: 171-204

70. McClure WR (1980) On the mechanism of streptolydigin inhibition of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 255: 1610-1616

71. McClure WR, Cech CL. (1978) On the mechanism of rifampicin inhibition of RNA synthesis. J Biol Chem. 253(24):8949-8956

72. Mosteller RD, Yanofsky C. (1970) Transcription of the tryptophan operon in Escherichia coli: rifampicin as an inhibitor of initiation. J Mol Biol. 48(3):525-531

73. Mukhopadhyay J, Sineva E, Knight J, Levy RM, Ebright RH (2004) Antibacterialpeptide microcin J25 inhibits transcription by binding within and obstructing the RNA polymerase secondary channel. Mol Cell. 14: 739-751

74. Murakami KS, Masuda S, Campbell EA, Muzzin O, Darst SA. (2002a) Structural basis of transcription initiation: an RNA polymerase holoenzyme-DNA complex. Science 296:1285-1290

75. Murakami KS, Masuda S, Darst SA. (2002b) Structural basis of transcription initiation: RNA polymerase holoenzyme at 4 A resolution. Science 296:12801284

76. Mustaev A, Zaychikov E, Severinov K, Kashlev M, Polyakov A, Nikiforov V, Goldfarb A (1994) Topology of the RNA polymerase active center probed by chimeric rifampicin-nucleotide compounds. Proc Natl Acad Sci USA. 91(25): 12036-12040

77. Mustaev A, Kozlov M, Markovtsov V, Zaychikov E, Denissova L, Goldfarb A (1997) Modular organization of the catalytic center of RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 94: 6641-6645

78. Naryshkina T, Mustaev A, Darst SA, Severinov К (2001) The beta' subunit of Escherichia coli RNA polymerase is not required for interaction with initiating nucleotide but is necessary for interaction with rifampicin. J Biol Chem. 276(16):13308-13313

79. Navarro JA, Vera A, Flores R (2000) A chloroplastic RNA polymerase resistant to tagetitoxin is involved in replication of avocado sunblotch viroid. Virology 268(1):218-225

80. Nedea EC, Markov D, Naryshkina T, Severinov К (1999) Localization of Escherichia coli rpoC mutations that affect RNA polymerase assembly and activity at high temperature. J Bacteriol. 181: 2663-2665

81. Nedialkov YA, Gong XQ, Hovde SL, Yamaguchi Y, Handa H, Geiger JH, Yan H Burton ZF (2003). NTP-driven translocation by human RNA polymerase II. J Biol Chem. 278: 18303-18312

82. Nishikata M, Kanehira T, Oh H, Tani H, Tazaki M, Kuboki Y (1991) Salivary histatin as an inhibitor of a protease produced by the oral bacterium Bacteroides gingivalis. Biochem Biophys Res Commun. 174(2):625-630

83. Opalka N, Chlenov M, Chacon P, Rice WJ, Wriggers W, Darst SA (2003) Structure and function of the transcription elongation factor GreB bound to bacterial RNA polymerase. Cell, 114: 335-345

84. Park CB, Kim HS, Kim SC. (1998) Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions. Biochem Biophys Res Commun. 244(1 ):253-257

85. Pelletier H, Sawaya MR, Wolfle W, Wilson SH, Kraut J. (1996) Crystal structures of human DNA polymerase beta complexed with DNA: implications for catalytic mechanism, processivity, and fidelity. Biochemistry, 35: 1274212761

86. Polesky, A.H., Dahlberg, M.E., Benkovic, S.J., Grindley, N.D., and Joyce, C.M. Side chains involved in catalysis of the polymerase reaction of DNA polymerase I from Escherichia coli (1992) J Biol Chem 267: 8417-8428

87. Pritchard AE, McHenry CS (1999) Identification of the acidic residues in the active site of DNA polymerase III. J Mol Biol. 285: 1067-1080

88. Putsep К, Normark S, Boman HG. (1999)The origin of cecropins; implications from synthetic peptides derived from ribosomal protein L1. FEBS Lett. 451(3):249-252

89. Quan S, Imai T, Mikami Y, Yazawa K, Dabbs ER, Morisaki N, Iwasaki S, Hashimoto Y, Furihata K. (1999) ADP-ribosylation as an intermediate step in inactivation of rifampin by a mycobacterial gene. Antimicrob Agents Chemother. (1):181-184

90. Rhodes G, Chamberlin MJ (1974) Ribonucleic acid chain elongation by Escherichia coli ribonucleic acid polymerase. I. Isolation of ternary complexes and the kinetics of elongation. J Biol Chem. 249: 6675-6683

91. Rudd MD, Luse DS (1996) Amanitin greatly reduces the rate of transcription by RNA polymerase II ternary complexes but fails to inhibit some transcript cleavage modes. J Biol Chem. 271 (35):21549-21558

92. Rusconi A, Calendi E. (1966) Action of daunomycin on nucleic acid metabolism in HeLa cells. Biochim Biophys Acta. 119(2):413-415

93. Salomon RA, Farias RN (1992) Microcin 25, a novel antimicrobial peptide produced by Escherichia coli. J Bacteriol. 174(22):7428-7435

94. Saturno J, Lazaro JM, Blanco L, Salas M (1998) Role of the first aspartate residue of the "YxDTDS" motif of phi29 DNA polymerase as a metal ligand during both TP-primed and DNA-primed DNA synthesis. J Mol Biol. 283: 633642

95. Schleif R (1969) Isolation and characterization of streptolydigin resistant RNA polymerase. Nature 223(210):1068-1069

96. Sentenac A (1985) Eukaryotic RNA polymerases CRC Crit Rev Biochem. 18( 1 ):31 -90

97. Seshadri V, McArthur AG, Sogin ML, Adam RD. (2003) Giardia lamblia RNA polymerase II: amanitin-resistant transcription. J Biol Chem. 278(30):27804-27810

98. Severinov K, Soushko M, Goldfarb A, Nikiforov V. (1993) Rifampicin region revisited. New rifampicin-resistant and streptolydigin-resistant mutants in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 268(20): 1482014825

99. Severinov K, Soushko M, Goldfarb A, Nikiforov V. (1994) RifR mutations in the beginning of the Escherichia coli rpoB gene. Mol Gen Genet. 244(2):120-126

100. Severinov K, Markov D, Severinova E, Nikiforov V, Landick R, Darst SA, Goldfarb A. (1995) Streptolydigin-resistant mutants in an evolutionarily conserved region of the beta' subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Biol Chem. 270(41 ):23926-23929

101. Siddhikol C, Erbstoeszer JW, Weisblum В (1969) Mode of action of streptolydigin. J Bacteriol. 99(1):151-155

102. Sidorenkov I, Komissarova N, Kashlev M (1998) Crucial role of the RNA:DNA hybrid in the processivity of transcription. Mol. Cell 2: 55-64

103. Simmaco M, Mignogna G, Barra D. (1998) Antimicrobial peptides from amphibian skin: what do they tell us? Biopolymers. 47(6):435-450

104. Sollner-Webb B, Tower J. (1986) Transcription of cloned eukaryotic ribosomal RNA genes. Annu Rev Biochem.55:801-830

105. Sonenshein AL, Alexander HB. (1979) Initiation of transcription in vitro inhibited by lipiarmycin. J Mol Biol. 127(1):55-72.

106. Sosunov V, Sosunova E, Mustaev A, Bass I, Nikiforov V, Goldfarb A (2003) Unified two-metal mechanism of RNA synthesis and degradation by RNA polymerase. EMBO J.;22(9):2234-2244.

107. Sosunova E, Sosunov V, Kozlov M, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A (2003) Donation of catalytic residues to RNA polymerase active center by transcription factor Gre. Proc Natl Acad Sci USA. 100:15469-15474

108. Svetlov V, Vassylyev DG, Artsimovitch I (2004) Discrimination against deoxyribonucleotide substrates by bacterial RNA polymerase. J Biol Chem. 279: 38087-38090

109. Steinberg TH, Burgess RR (1992) Tagetitoxin inhibition of RNA polymerase III transcription results from enhanced pausing at discrete sites and is template-dependent. J Biol Chem. 267(28):20204-20211

110. Steinberg TH, Mathews DE, Durbin RD, Burgess RR( 1990) Tagetitoxin: a new inhibitor of eukaryotic transcription by RNA polymerase III. J Biol Chem. 265(1):499-505

111. Steitz ТА (1998) A mechanism for all polymerases. Nature, 391; 231-232

112. Steitz ТА (1999) DNA polymerases: structural diversity and common mechanisms. J Biol Chem. 274: 17395-17398

113. Tang YQ, Yuan J, Osapay G, Osapay K, Tran D, Miller CJ, Ouellette AJ, Selsted ME (1999) A cyclic antimicrobial peptide produced in primate leukocytes by the ligation of two truncated alpha-defensins. Science 286(5439):498-502

114. Tavormina PL, Reznikoff WS, Gross CA (1996) Identifying interacting regions in the beta subunit of Escherichia coli RNA polymerase. J Mol Biol. 258(2):213-223

115. Tennyson CN, Klamut HJ, Worton RG (1995) The human dystrophin gene requires 16 hours to be transcribed and is ^transcriptionally spliced. Nat Genet. 9: 184-190

116. Toulokhonov I, Artsimovitch I, Landick R (2001). Allosteric control of RNA polymerase by a site that contacts nascent RNA hairpins. Science 292: 730733

117. Vanacova S, Tachezy J, Ullu E, Tschudi С (2001) Unusual diversity in alpha-amanitin sensitivity of RNA polymerases in trichomonads. Mol Biochem Parasitol. 115(2):239-247

118. Vassylyev DG, Sekine S, Laptenko O, Lee J, Vassylyeva MN, Borukhov S, Yokoyama S (2002) Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 A resolution. Nature 417: 712-719

119. Velasco M, Diaz-Guerra MJ, Diaz-Achirica P, Andreu D, Rivas L, Bosca L. (1997) Macrophage triggering with cecropin A and melittin-derived peptides induces type II nitric oxide synthase expression. J Immunol. 158(9):4437-4443

120. Wehrli W, Knusel F, Schmid K, Staehelin M. (1968) Interaction of rifamycin with bacterial RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A 61(2):667-673

121. Westover KD, Bushnell DA, Kornberg RD (2004) Structural basis of transcription: nucleotide selection by rotation in the RNA polymerase II active center. Cell, 119:481-489

122. Wu L, Pan J, Thoroddsen V, Wysong DR, Blackman RK, Bulawa CE, Gould AE, Ocain TD, Dick LR, Errada P, Dorr PK, Parkinson T, Wood T, Kornitzer D,

123. Weissman Z, Willis IM, McGovern K. (2003) Novel small-molecule inhibitors of RNA polymerase III. Eukaryot Cell 2(2):256-264

124. Yang, X., Price, С (1995) Streptolydigin resistance can be conferred by alterations to either the beta or beta' subunits of Bacillus subtilis RNA polymerase J. Biol. Chem. 270: 23930-23933

125. Yee D, Armstrong VW, Eckstein F. (1979) Mechanistic studies on deoxyribonucleic acid dependent ribonucleic acid polymerase from Escherichia coli using phosphorothioate analogues. 1. Initiation and pyrophosphate reactions. Biochemistry 18: 4116-4120

126. Zakharova E, Wang J, Konigsberg W (2004) The activity of selected RB69 DNA polymerase mutants can be restored by manganese ions: the existence of alternative metal ion ligands used during the polymerization cycle. Biochemistry 43: 6587-6595

127. Zanotti G, Mohringer C, Wieland T (1987) Synthesis of analogues of amaninamide, an amatoxin from the white Amanita virosa mushroom. Int J Pept Protein Res. 30(4):450-459

128. Zasloff M. (2002) Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 415(6870):389-395

129. Zaychikov E, Martin E, Denissova L, Kozlov M, Markovtsov V, Kashlev M, Heumann H, Nikiforov V, Goldfarb A, Mustaev A. (1996) Mapping of catalytic residues in the RNA polymerase active center. Science 273: 107-109

130. Zhang G, Campbell EA, Minakhin L, Richter C, Severinov K, Darst SA. (1999) Crystal structure of Thermus aquaticus core RNA polymerase at 3.3 A resolution. Ce//98(6):811-824