Структурно-функциональное изучение гомологичных фрагментов факторов дифференцировки PEDF и HLDF тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Жохов, Сергей Сергеевич

• Жохов, Сергей Сергеевич
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Жохов, Сергей Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ:ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РЕБР, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОФНЫМ И АНТИАНГИОГЕННЫМ

ДЕЙСТВИЕМ.

1. Идентификация фактора РЕБР в различных типах клеток.

1.1. Идентификация РЕББ в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза человека.

1.2. Идентификация РЕОР (ЕРС-1) в культуре легочных фибробластов. Зависимость уровня экспрессии РЕОР от возраста клеточной культуры.

1.3. Идентификация РЕОР мыши (каспина - коллаген-связывающего серпина).

2. Особенности структуры РЕОР и кодирующего его гена.

2.1. Установление первичной структуры РЕОР человека и его кДНК.

2.2. Принадлежность РЕОР к семейству неингибиторных серпинов.

2.3. Наличие в РЕОР связи, высокочувствительной к действию сериновых протеиназ.

2.4. Асимметричное расположение положительных и отрицательных зарядов в молекуле РЕОР. Кристаллическая структура РЕОР.

2.5. Строение и свойства гена рей/человека.

2.6. Распространенность и эволюционная консервативность фактора РЕОР.

2.7. Рекомбинантный РЕОР.

3. Дифференцирующее действие РЕОР и его влияние на метаболизм.

3.1. Дифференцирующее действие РЕОР на эмбриональные ткани. Влияние РЕОР на метаболизм глиальных клеток.

3.2. Дифференцирующее действие РЕОР на опухолевые клетки.

3.3. Влияние РЕОР на накопление меланина и активность тирозиназы в клетках пигментного эпителия сетчатки глаза.

4. Нейропротекторное действие РЕОР.

4.1. Протекторное действие РЕОР на нейроны сетчатки глаза.

4.2. Протекторное действие РЕОР на гранулярные клетки мозжечка крыс.

4.3. Протекторное действие РЕОР на нейроны гиппокампа.

4.4. Протекторное действие РЕОР на двигательные нейроны спинного мозга.

5. Антиангиогенное действие РЕОР.

5.1. Корреляция уровня РЕОР и УЕОР с ангиогенезом в сетчатке. Влияние содержания кислорода в окружающей среде на экспрессию РЕОР.

5.2. Изменения уровня РЕОР при зрительных патологиях, связанных с избыточным ангиогенезом.

5.3. Возможные механизмы антиангиогенного действия РЕОБ.

6. Взаимосвязь между структурой и функциональными свойствами РЕОР. Идентификация рецептора РЕОР.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Идентификация гомологичных фрагментов молекул факторов НЬОР и РЕОР, отвечающих за их дифференцирующее действие на клетки НЬ-60 и эктодерму эмбрионов Хепория ¡аеугя на стадии ранней гаструлы.

1.1. Структурная гомология фрагментов молекул факторов НЬОР и РЕОР. Сравнительное изучение дифференцирующего действия факторов НЬОР и РЕОР на клетки линии НЬ-60.

1.2. Сравнительное изучение индукционного действия факторов НЬОР и РЕОР, а также пептидов НЬОР-6 и РЕОР-6 на эктодерму эмбрионов^ \ae\is.

2. Сравнительное изучение протекторного действия пептидов НЬОР-6 и РЕОБ-б на нейроны червя мозжечка крыс и клетки линии НЬ-60 при индуцированной химической гипоксии.

2.1. Протекторное действие пептидов на клетки червя мозжечка крыс. Восстановление под действием пептидов поведенческих реакций, нарушаемых при химической гипоксии червя мозжечка.

2.2. Влияние пептидов НЬОР-6 и РЕОР-6 на выживаемость клеток линии НЬ-60 при индуцируемой химической гипоксии.

3. Изучение молекулярных механизмов действия пептидов НЬВР-6 и РЕЭР-б на клетки линии НЬ-60.

3.1. Определение характера взаимодействия пептидов с клетками. Влияние пептидов на подвижность липидов в мембранных системах.

3.2. Влияние пептидов Н1ЛЗР-6 и РЕОР-б на активность аденилатциклазы в клетках линии НЬ-60 и выделенных клеточных мембранах.

3.3. Влияние пептидов НЫ)Р-6 и РЕЭР-б на активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С.

4. Компьютерное моделирование пространственной структуры РЕОР. Регуляторная роль протеолиза связи

382Ь383Т в молекуле РЕЭР.

5. Роль фактора РЕОР в индукционном действии стекловидного тела глаза быка на эктодерму эмбрионов Хепорш \ae\is.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ).

1. Материалы.

1.1. Реактивы.

1.2. Сорбенты.

1.3. Протеолитические ферменты.

1.4. Факторы дифференцировки, антитела, клеточные линии.

1.5. Буферные растворы.

1.6. Растворы для индукции дифференцировки эмбрионов Хепорш 1аеч1з и гистологической обработки тканей.

2. Методы.

2.1. Культивирование клеток линии НЬ-60.

2.2. Определение дифференцирующей активности.

2.3. Исчерпывающий гидролиз белков смесью трипсина и а-химотрипсина.

2.4. Синтез пептидов.

2.5. Дополнительная хроматографическая очистка синтезированных пептидов.

2.6. Индукция дифференцировки эктодермы эмбрионов Хепорш \aevis на стадии ранней гаструлы.

2.7. Гистологическая обработка дифференцированной эктодермы Хепорш 1аеУ1Я.

2.8. Содержание экспериментальных животных.

2.9. Изучение влияния пептидов на поведенческие реакции крыс, зависимые от функций червя мозжечка.

2.10. Определение количества гиперхромных клеток Пуркинье червя мозжечка крыс.

2.11. Определение количества жизнеспособных клеток HL-60 методом МТТ-теста.

2.12. Радиолигандный анализ.

2.13. Получение липосом, содержащих флуоресцентный зонд.

2.14. Изучение влияния пептидов на анизотропию поляризации флуоресценции зонда в липосомах.

2.15. Хроническая морфинизация клеток HL-60.

2.16. Выделение и солюбилизация мембран клеток HL-60.

2.17. Изучение влияния пептидов на активность аденилатциклазы в клетках HL-60 и препарате выделенных мембран клеток HL-60.

2.18. Определение количества цАМФ в пробах.

2.19. Определение внутриклеточной концентрации инозитолмоно- и дифосфатов в клетках линии HL-60.

2.20. Выделение стекловидного тела глаза быка.

2.21. Измерение концентрации белка методом Бредфорд.

2.22. Определение N-концевых аминокислотных последовательностей.

2.23. SDS-электрофорез белков в полиакриламидном геле.

2.24. Компьютерное моделирование пространственной структуры молекулы PEDF.

2.25. Статистическая обработка экспериментальных результатов.

ВЫВОДЫ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональное изучение гомологичных фрагментов факторов дифференцировки PEDF и HLDF»

Одной из актуальных проблем современной биоорганической химии является поиск и структурно-функциональные исследования новых белковых факторов дифференцировки. Нарушение процессов нормального созревания клеток и их превращения в дифференцированные, функционально активные формы является ключевой стадией патогенеза многих злокачественных новообразований. Вещества, индуцирующие дифференцировку клеток, находят широкое применение в терапии опухолей как сами по себе, так и в сочетании с цитостатиками - агентами, вызывающими гибель делящихся клеток.

Как правило, белковые факторы дифференцировки представляют собой относительно крупные молекулы. Для многих из них помимо способности индуцировать дифференцировку клеток показано наличие целого ряда других биологических активностей. К таким многофункциональным факторам дифференцировки относятся факторы HLDF (Human Leukemia Differentiation Factor) и PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor).

Фактор HLDF с молекулярной массой 8,2 кДа ингибирует пролиферацию клеток промиелоцитарной лейкемической линии человека HL-60 и индуцирует их дифференцировку в зрелые гранулоциты, а также повышает выживаемость клеток этой линии при различных повреждающих воздействиях. Фактор PEDF с молекулярной массой 50,1 кДа является фактором дифференцировки опухолевых клеточных линий нейронального происхождения и эмбриональных нейронов. Он также обладает нейропротекторным и антиангиогенным действием, является регулятором клеточного цикла и апоптоза. При сравнительном компьютерном анализе первичных структур факторов HLDF и PEDF были обнаружены гомологичные области молекул этих факторов; данная область фактора HLDF содержит фрагмент, отвечающий за его дифференцирующее и протекторное действие.

Установление взаимосвязи структурных особенностей белка и его функциональных характеристик имеет принципиальное значение для понимания молекулярных механизмов его функционирования. Перспективным подходом для изучения белков с широким спектром активностей является исследование их коротких фрагментов, обладающих биологической активностью.

Данная работа является частью структурно-функциональных исследований, проводимых в лаборатории белков гормональной регуляции Института биоорганической химии им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, направленных на изучение механизмов действия фактора дифференцировки НЬЭР и пептида НЬБР-б, соответствующего фрагменту молекулы НЬЭР 41ТСЕ>ЩК46, обеспечивающему его дифференцирующую активность, а также гомологичных белков и их фрагментов.

Целью данной работы явилось сравнительное изучение функциональной роли гомологичных фрагментов молекул факторов НЬБИ и РЕОИ при их действии на различные биологические объекты.

Автор выражает искреннюю признательность своему научному руководителю, кандидату химических наук И.А. Костанян и заведующему лабораторией белков гормональной регуляции, члену-корреспонденту РАН В.М. Липкину за постоянное внимание к данной работе и помощь в ее проведении, а также кандидату химических наук И.Д. Артамонову, кандидатам биологических наук О.Н. Голубевой и З.И, Сторожевой за помощь, поддержку и ценные советы в работе. Автор также признателен кандидату химических наук И.Л. Родионову за синтез пептидов.

ФАКТОР ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ РЕОЕ, ОБЛАДАЮЩИЙ НЕЙРОТРОФНЫМ И АНТИАНГИОГЕННЫМ ДЕЙСТВИЕМ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Фактор PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor - фактор, выделенный из пигментного эпителия) был впервые идентифицирован в культуральной среде клеток пигментного эпителия сетчатки глаза. К настоящему времени известно, что этот белок экспрессируется почти во всех тканях млекопитающих и птиц и выполняет множество функций. К числу функций PEDF относится:

1) дифференцирующее действие на эмбриональные и опухолевые клетки;

2) протекторное действие на зрелые нейроны и другие клетки, входящие в состав нервной ткани; 3) антиангиогенная активность - ингибирование образования новых сосудов.

Многофункциональность и широкая распространенность фактора PEDF явилась причиной того, что он был идентифицирован и выделен из различных источников независимо несколькими группами ученых. Вследствие этого он изначально получил разные названия.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Жохов, Сергей Сергеевич

выводы.

1. Идентифицированы гомологичные фрагменты молекул факторов дифференцировки HLDF и PEDF. Показано, что данные фрагменты отвечают за дифференцирующее действие факторов на клетки линии HL-60 и эктодерму эмбрионов Xenopus laevis на стадии ранней гаструлы.

2. Установлено протекторное действие гомологичных гексапептидов TGENHR (HLDF-6) и TQVEHR (PEDF-6) на клетки Пуркинье червя мозжечка крыс при индуцированной химической гипоксии. Показано восстановление под действием данных пептидов поведенческих реакций крыс, нарушаемых при гипоксии червя мозжечка in vivo.

3. Показано, что пептид TGENHR увеличивает количество клеток линии HL-60, жизнеспособных в условиях индуцированной химической гипоксии, в то время как пептид TQVEHR не обладает подобным действием.

4. Установлено различное действие пептидов TGENHR и TQVEHR на системы биосинтеза вторичных мессенжеров в клетках HL-60. Пептид TGENHR ингибирует активность аденилатциклазы, пептид TQVEHR понижает активность фосфатидилинозитол-специфической фосфолипазы С при ее стимуляции тетрафторидом алюминия.

5. С помощью компьютерного моделирования пространственной структуры молекулы PEDF показана локализация фрагмента 354TQVEHR359, отвечающего за действие фактора на клетки линии HL-60. Предположена регуляторная роль протеолиза связи L- Т в молекуле PEDF.

6. Установлено, что PEDF является единственным фактором в составе стекловидного тела глаза, вызывающим индукцию нервных образований в эмбриональной ткани.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Жохов, Сергей Сергеевич, 2004 год

1. Tombran-Tink J., Johnson L.V. Neuronal differentiation of retinoblastoma cells induced bymedium conditioned byhuman RPE cells. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1989, Vol. 30, p. 1700-1707.

2. T ombran-Tink J., C hader G .J., Johnson L .V. P EDF: a p igment epithelium-derived factor with potent neuronal differentiative activity. Exp. Eye Res., 1991, Vol. 53, p. 411-414.

3. Cunha-Vaz J.G. The blood-ocular barriers. Surv. Ophthalmol., 1979, Vol. 23, p. 279-296.

4. Miller S., Steinberg R.H. Potassium transport across the frog retinal pigment epithelium. J. Membr. Biol., 1982, Vol. 67, p. 199-209.

5. Zinn K.M., Benjamin-Henkind J.V. In The Retinal Pigment Epithelium, ed. K.M. Zinn and M.F. Marmor, Harvard University Press, Cambridge, 1979, p. 3-31.

6. Schweigerer L., Malerstein B., Neufeld G., Gospodarovicz D. Basic fibroblast growth factor is synthesized in cultured retinal pigment epithelial cells. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1987, Vol. 143, p. 934-940.

7. Campochiaro P.A., Suggs R., Grotendorst G., Hjelmeland L. Retinal pigment epithelial cells produce PDGF-like proteins and secrete them into their media. Exp. Eye Res., 1989, Vol. 49, p. 217-227.

8. Steele F., Chader G.J., Johnson L.V., Tombran-Tink J. Pigment epithelium-derived factor: Neurotrophic activity and identification as a member of the serine protease inhibitor gene family. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, Vol. 90, p. 15261530.

9. Tombran-Tink J., Li A., Johnson M.A., Johnson L.V., Chader G.J. Neurotrophic activity of interphotoreceptor matrix on human Y79 retinoblastoma cells. J. Comp. Neurol., 1992, Vol. 317, p. 175-186.

10. Wu Y-Q., Notario V., Chader G.J., Becerra S.P. Identification of pigment epithelium-derived factor in the interphotoreceptor matrix of bovine eyes. Protein Expr. Purif., 1995, Vol. 6, p. 447-456.

11. Pignolo R.J., Cristofalo V.J., Rotenberg M.O. Senescent WI-38 cells fail to express EPC-1, a gene induced in young cells upon entry into the Go state. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, p. 8949-8957.

12. Tresini M., Mawal-Dewan M., Cristofalo V.J., Sell C. A phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor induces a senescent-like growth arrest in human diploid fibroblasts. Cancer Res., 1998, Vol. 58, p. 1-4.

13. Coljee V.W., Rotenberg M.O., Tresini M., Francis M.K., Cristofalo V.J., Sell C. Regulation of EPC-1/PEDF in normal human fibroblasts is posttranscriptional. J. Cell. Biochem., 2000, Vol. 79, p. 442-452.

14. Pignolo R.J., Francis M.K., Rotenberg M.O., Cristofalo V.J. Putative role for EPC-1/PEDF in the GO growth arrest of human diploid fibroblasts. J. Cell. Physiol., 2003, Vol. 195, p. 12-20.

15. Grove G.L., and Cristofalo V.J. Characterization of the cell cycle of cultured human diploid cells: effects of aging and hydrocortisone. J. Cell. Physiol., 1977, Vol. 90, p. 415-422.

16. Ross J. Control of messenger RNA stability in higher eukaryotes. Trends Genet., 1996, Vol. 12, p. 171-175.

17. Tombran-Tink J., Shivaram S.M., Chader G.J., Johnson L.V., Bock D. Expression, secretion and age-related downregulation of pigment epithelium-derived factor, a serpin with neurotrophic activity. J. Neurosci., 1995, Vol. 15, p. 4992-5003.

18. Palmieri D. Watson J.M., Rinehart C.A. Age-related expression of PEDF/EPC-1 in human endometrial stromal fibroblasts: implications for interactive senescence. Exp. Cell Res., 1999, Vol. 247, p. 142-147.

19. Martin G.M., Sprague C.A., Epstein C.J. Replicative lifespan of cultivated human cells. Effect of donor age, tissue, and genotype. Lab. Invest., 1970, Vol. 23, p. 86-92.

20. Boyd J. A., Kaufman D.G. Expression of transforming growth factor beta 1 by human endometrial carcinoma cell lines: inverse correlation with effects on growth rate and morphology. Cancer Res., 1990, Vol. 50, p. 3394-3399.

21. Stratikos E., Alberdi E., Gettins P.G., Becerra S.P. Recombinant human pigment epithelium-derived factor (PEDF): characterization of PEDF overexpressed and secreted by eukaryotic cells. Protein Sci., 1996, Vol. 5, p. 2575-2582.

22. Petersen S.V., Valnickova Z., Enghild J.J. Pigment-epithelium-derived factor (PEDF) occurs at a physiologically relevant concentration in human blood: purification and characterization. Biochem. J., 2003, Vol. 374, p. 199-206.

23. Carrell R.W., Pemberton P.A., Boswell D.R. The serpins: evolution and adaptation in a family of protease inhibitors. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1987, Vol. 52, p. 527-535.

24. Travis J., Salvesen G.S. Human plasma proteinase inhibitors. Annu Rev. Biochem., 1983, Vol. 52, p. 655-709.

25. Huber R., C arrell R .W. Implications of the three-dimensional structure o f alpha 1-antitrypsin for structure and function of serpins. Biochemistry, 1989, Vol. 28, p. 8951-8966.

26. Hunt L.T., Dayhoff M.O. A surprising new protein superfamily containing ovalbumin, antithrombin-III, and alpha 1-proteinase inhibitor. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1980, Vol. 95, p. 864-871.

27. Tone M., Kikuno R., Kume-Iwaki A., Hashimoto-Gotoh T. Structure of human alpha 2-plasmin inhibitor deduced from the cDNA sequence. J. Biochem. (Tokyo), 1987, Vol. 102, p. 1033-1041.

28. Perez-Mediavilla L.A., Chew C., Campochiaro P.A., Nickells R.W., Notario V., Zack D.J., Becerra S.P. Sequence and expression analysis of bovine pigment epithelium-derived factor. Biochim. Biophys. Acta, 1998, Vol. 1398, p. 203-214.

29. Becerra S.P., Palmer I., Kumar A., Steele F., Shiloach J., Notario V., Chader G.J. O verexpression o f fetal h uman p igment epithelium-derived factor i n E scherichia coli. J. Biol. Chem., 1993, Vol. 268, p. 23148-23156.

30. Marshall C.J. Evolutionary relationships among the serpins. Phil. Trans. Soc. Lond. B, 1993, Vol. 342, p. 101-119.

31. Doolittle R.F. Angiotensinogen is related to the antitrypsin-antithrombin-ovalbumin family. Science, 1983, Vol. 222, p. 417-419.

32. Evans D.L., McGrogan M., Scott R.W., Carrell R.W. Protease specificity and heparin binding and activation of recombinant protease nexin I. J. Biol. Chem., 1991, Vol. 266, p. 22307-22312.

33. Monard D., Niday E., Limat A., Soloman F. Inhibition of protease activity can lead to neurite extension in neuroblastoma cells. Prog. Brain Res., 1983, Vol. 58, p. 359-364.

34. Becerra S.P., Sagasti A., Spinella P., Notario V. Pigment epithelium-derived factor behaves like a noninhibitory serpin. Neurotrophic activity d oes not require the serpin reactive loop. J. Biol. Chem., 1995, Vol. 270, p. 25992-25999.

35. Shao H., Schvartz I., Shaltiel S. Secretion of pigment epithelium-derived factor. Mutagenic study. Eur. J. Biochem., 2003, Vol. 270, p. 822-831.

36. Alberdi E., Hyde C.C., Becerra S.P. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) binds to glycosaminoglycans: analysis of the binding site. Biochemistry, 1998, Vol. 37, p. 10643-10652.

37. Meyer C., Notari L., Becerra S.P. Mapping the type I collagen binding site on pigment epithelium-derived factor. Implications for its antiangiogenic activity. J. Biol. Chem., 2002, Vol. 277, p. 45400-45407.

38. Yasui N., Mori T., Morito D., Matsushita O., Kourai H., Nagata K., Koide T. Dual-site recognition of different extracellular matrix components by anti-angiogenic/neurotrophic serpin, PEDF. Biochemistry, 2003, Vol. 42, p. 3160-3167.

39. Simonovic M., Gettings P.G., Volz K. Crystal structure of human PEDF, a potent antiangiogenic and neurite-growth-promoting factor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2001, Vol. 98, p. 11131-11135.

40. Sweeney S.M., Guy C.A., Fields J.B., San Antonio J.D. Defining the domains of type I collagen involved in heparin- binding and endothelial tube formation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, Vol. 95, p. 7275-7280.

41. Tombran-Tink J., Pawar H., Swaroop A., Rodriguez I., Chader G.J. Localization of the gene for pigment epithelium-derived factor (PEDF) to chromosome 17pl3.1 and expression in cultured human retinoblastoma cells. Genomics, 1994, Vol. 19, p. 266-272.

42. Isobe M., Emanuel B.S., Givol D., Oren M., Croce C.M. Localization of the gene for human p53 tumor antigen to band 17p 13. Nature, 1986, Vol. 320, p. 84-86.

43. McDonald J.D., Danehsvar L., Willert J.R., Matsumura K., Waldman F., Cogen P.H. Physical mapping of chromosome 17pl3.3 in the region of a putative tumor suppressor gene important in medulloblastoma. Genomics, 1994, vol. 23, p. 229-232.

44. Matsuda M., Tanaka S., Nagata S., Kojima A., Kurata T., Shibuya M. Two species of human CRK cDNA encode proteins with distinct biological activities. Mol. Cell. Biol., 1992, Vol. 12, p. 3482-3489.

45. Phillips N.J., Ziegler M., Radford D.M., Fair K.L., Steinbrueck T., Xynos F.P., Donis-Keller H. Allelic deletion on chromosome 17pl3.3 in early ovarian cancer. Cancer Res., 1996, Vol. 56, p. 606-611.

46. Pignolo R.J., Rotenberg M.O., Cristofalo V.J. Analysis of EPC-1 growth state-dependent expression, specificity, and conservation of related sequences. J. Cell. Physiol., 1995, Vol. 162, p. 110-118.

47. Bilak M.M., Corse A.M., Bilak S.R., Lehar M., Tombran-Tink J., Kuncl R.W. Pigment epithelium-derived factor protects motor neurons from chronic glutamate-mediated degeneration. J. Neuropathol. Exp. Neurol., 1999, Vol. 58, p. 719728.

48. Karakousis P., John C., Behling K., Surace E., Smith J., Hendrickson A., Tang W.-X, Bennett J., Milam A.H. Localization of pigment epithelium derived factor (PEDF) in developing and adult human ocular tissues. Mol. Vis., 2001, Vol. 7, p. 154163.

49. Wu Y-Q., Becerra S.P. Proteolytic activity directed towards pigment epithelium-derived factor in vitreous humor of bovine eyes: implications of proteolytic processing. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1996, Vol. 37, 1984-1993.

50. Houenou L.J., D'Costa A.P., Linxi L., Turgeon V.L., Enyadike C., Alberdi E., Becerra S.P. Pigment epithelium-derived factor promotes the survival and differentiation of developing spinal motor neurons. J. Comp. Neurol., 1999, Vol. 412, p. 506-514.

51. Jablonski M.M., Tombran-Tink J., Mrazek D.A., Iannaccone A. Pigment epithelium-derived factor supports normal development of photoreceptor neurons and opsin expression after retinal pigment epithelium removal. J. Neurosci., 2000, Vol. 20, p. 7149-7157.

52. Jablonski M.M., Tombran-Tink J., Mrazek D.A., Iannaccone A. Pigment epithelium-derived factor supports normal Müller cell development and glutamine synthetase expression after removal of the retinal pigment epithelium. Glia, 2001, Vol. 35, p. 14-25.

53. Sugita Y., Becerra S.P., Chader G.J., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) has direct effect on the metabolism and proliferation of microglia and indirect effect on astrocytes. J. Neurosci. Res., 1997, Vol. 49, p. 710-718.

54. Brodeur G.M., Maris J.M., Yamashiro D.J., Hogarty M.D., White P.S. Biology and genetics of neuroblastomas. J. Pediatr. Hematol. Oncol., 1997, Vol. 19, p. 93-101.

55. Linet M.S., Ries L.A., Smith M.A., Tarone R.E., Devesa S.S. Cancer surveillance series: recent trends in childhood cancer incidence and mortality in the United States. J. Natl. Cancer Inst., 1999, Vol. 91, p. 1051-1058.

56. Brodeur G.M. Schwann cells as antineuroblastoma agents. New Engl. J. Med., 1996, Vol. 334, p. 1537-1539.

57. Guillery R.W. Neural abnormalities in albinos. Trends Neurosci., 1986, Vol. 9, p. 364-367.

58. Abul-Hassan Kh., Walmsley R., Tombran-Tink J., Boulton M. Regulation of tyrosinase expression and activity in cultured human retinal pigment epithelial cells. Pigment Cell Res., 2000, Vol. 13, p. 436-441.

59. Cayouette M., Smith S.B., Becerra S.P., Gravel C. Pigment epithelium-derived factor delays the death of photoreceptors in mouse models of inherited retinal degenerations. Neurobiol. Dis., 1999, Vol. 6, p. 523-532.

60. Cao W., Tombran-Tink J., Chen W., Mrazek D., Elias R., McGinnis J.F. Pigment epithelium-derived factor protects cultured retinal neurons against hydrogen peroxide-induced cell death. J. Neurosci. Res., 1999, Vol. 57, p. 789-800.

61. Taniwaki T., Becerra S.P., Chader G.J., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor is a survival factor for cerebellar granule cells in culture. J. Neurochem., 1995, Vol. 64, p. 2509-2517.

62. Araki T., Taniwaki T., Becerra S.P., Chader G.J., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor (PEDF) differently protects immature but not mature cerebellar granule cells against apoptotic cell death. J. Neurosci. Res., 1998, Vol. 53, p. 7-15.

63. Taniwaki T., Hirashima N., Becerra S.P., Chader G.J., Etcheberrigaray R., Schwartz J.P. Pigment epithelium-derived factor protects cultured cerebellar granule cells against glutamate-induced neurotoxicity. J. Neurochem., 1997, Vol. 68, p. 26-32.

64. DeCoster M.A., Schabelman E., Tombran-Tink J., Bazan N.G. Neuroprotection by pigment epithelium-derived factor against glutamate toxicity in developing primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res., 1999, Vol. 56, p. 604-610.

65. Tombran-Tink J. Function, age-related expression and molecular characterization of PEDF, a neurotrophic serpin secreted by human RPE cells. Degenerative Diseases of the Retina, Edited by Robert E. Anderson et al., Plenum Press, New York, 1995.

66. Yamashita H., Horie K., Yamamoto T., Nagano T., Hirano T. Light-induced retinal damage in mice. Hydrogen peroxide production and superoxide dismutase activity in retina. Retina, 1992, Vol. 12, p. 59-66.

67. Clement M.V., Ponton A., Pervaiz S. Apoptosis induced by hydrogen peroxide is mediated by decreased superoxide anion concentration and reduction of intracellular milieu. FEBS Lett., 1998, Vol. 440, p. 13-18.

68. Yabe T., Wilson D., Schwartz J.P. NF-kappaB activation is required for the neuroprotective effects of pigment epithelium-derived factor (PEDF) on cerebellar granule neurons. J. Biol. Chem., 2001, Vol. 276, p. 43313-43319.

69. Mao X., Barger S.W. Neuroprotection by dehydroepiandrosterone-sulfate: role of an NFkappaB-like factor. Neuroreport, 1998, Vol. 9, p. 759-763.

70. Tamatani M., Mitsuda N., Matsuzaki H., Okado H., Miyake S., Vitek M.P., Yamaguchi A., Tohyama M. A pathway of neuronal apoptosis induced by hypoxia/reoxygenation: roles of nuclear factor-kappaB and Bcl-2. J. Neurochem., 2000, Vol. 75, p. 683-693.

71. Choi J.S., Kim J.A., Kim D.H., Chun M.H., Gwag B.J., Yoon S.K., Joo C.K. Failure to activate N F-kappaB promotes apoptosis of retinal g anglion c ells following optic nerve transection. Brain Res., 2000, Vol. 883, p. 60-68.

72. Post A., Crochemore C., Uhr M., Holsboer F., Behl C. Differential induction of NF-kappaB activity and neural cell death by antidepressants in vitro. Eur. J. Neurosci., 2000, Vol. 12, p. 4331-4337.•

73. Tamatani M., Che Y.H., Matsuzaki H., Ogawa S., Okado H., Miyake S., Mizuno T., Tohyama M. Tumor necrosis factor induces Bcl-2 and Bcl-x expression through NFkappaB activation in primary hippocampal neurons. J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274, p. 8531-8538.

74. Glasgow J.N., Wood T., Prerz-Polo J.R. Identification and characterization of n uclear factor k appaB b inding s ites i n t he murine b cl-x p romoter. J. N eurochem., 2000, Vol. 75, p. 1377-1389.

75. Tanaka M., Ito S., Kiuchi K. Novel alternative promoters of mouse glial cell line-derived neurotrophic factor gene. Biochim. Biophys. Acta, 2000, Vol. 1494, p. 6374.

76. Friedman W.J., Thakur S ., Seidman L., Rabson A.B. Regulation of nerve growth factor mRNA by interleukin-1 in rat hippocampal astrocytes is mediated by NFkappaB. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, p. 31115-31120.

77. Rothstein J.D., Martin L., Kuncl R.W. Decreased glutamate transport by the brain and spinal cord in amyotrophic lateral sclerosis. Nat. Engl. J. Med., 1992, Vol. 326, p. 1464-1468.

78. Kuncl R.W., Bilak M.M., Bilak S.R., Corse A.M., Royal W., Becerra S.P. Pigment epithelium-derived factor is elevated in CSF of patients with amyotrophic lateral sclerosis. J. Neurochem., 2002, Vol. 81, p. 178-184.

79. Ferrara N., Davis-Smyth T. The biology of vascular endothelial growth factor. Endocr. Rev., 1997, Vol. 18, p. 4-25.

80. Klagsbrun M., Vlodavsky I. Biosynthesis and storage of basic fibroblast growth factor (bFGF) by endothelial cells: implication for the mechanism of action of angiogenesis. Progress in Clin, and Biol. Res., 1988, Vol. 266, p. 55-61.

81. DiPietro L.A., Nebgen D .R., Polverini P .J. Downregulation o f endothelial cell thrombospondin 1 enhances in vitro angiogenesis. J. Vase. Res., 1994, Vol. 31, p. 178-185.

82. Dawson D.W., Volpert O.V., Gillis P., Crawford S.E., Xu H.-J., Benedict W., Bouck N.P. Pigment epithelium-derived factor: a potent inhibitor of angiogenesis. Science, 1999, Vol. 285, p. 245-248.

83. Smith L.E. Wesolowski E., McLellan A., Kostyk S.K., D'Amato R., Sullivan R., D'Amore P.A. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1994, Vol. 35, p. 101-111.

84. Stellmach V., Crawford S., Zhou W., Bouck N. Prevention of ischemia-induced retinopathy by the natural ocular antiangiogenic agent pigment epithelium-derived factor. Proc. Natl. Acad .Sci. USA, 2001, Vol. 98, p. 2593-2597.

85. Gao G., Li Y., Zhang D., Gee S., Crosson C., Ma J.-X. Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. FEBS Lett., 2001, Vol. 489, p. 270-276.

86. Ogata N., Nishikawa M., Nishimura T., Mitsuma Y., Matsumura M. Unbalanced vitreous levels of pigment epithelium-derived factor and vascular endothelial growth factor in diabetic retinopathy. Am. J. Ophthalmol., 2002, Vol. 134, p. 348-353.

87. Holekamp N.M., Bouck N., Volpert O. Pigment epithelium-derived factor is deficient in the vitreous of patients with choroidal neovascularization due to age-related macular degeneration. Am. J. Ophthalmol., 2002, Vol. 134, p. 220-227.

88. Ogata N., Tombran-Tink J., Jo N., Mrazek D., Matsumura M. Upregulation of pigment epithelium-derived factor after laser photocoagulation. Am. J. Ophthalmol., 2001, Vol. 132, p. 427-429.

89. Wang L., Schmitz V., Perez-Mediavilla A., Izal I., Prieto J., Qian C. Suppression of angiogenesis and tumor growth by adenoviral-mediated gene transfer of pigment epithelium-derived factor. Mol. Ther., 2003, Vol. 8, p. 72-79.

90. Dhanabal M., Ramchandran R., Waterman M.J., Lu H., Knebelmann B., Segal M., Sukhatme V.P. Endostatin induces endothelial cell apoptosis. J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274, p. 11721-11726.

91. Jimenez BVolpert O.V., Crawford S .E., Febbraio M., Silverstein R.L., Bouck N. Signals leading to apoptosis-dependent inhibition of neovascularization by thrombospondin-1. Nat. Med., 2000, Vol. 6, p. 41-48.

92. Bouck N. PEDF: anti-angiogenic guardian of ocular function. Trends in Mol. Med., 2002, Vol. 8, p. 330-334.

93. Krammer P.H. CD95's deadly mission in the immune system. Nature, 2000, Vol. 407, p. 789-795.

94. Gerber H.P., Dixit V., Ferrara N. Vascular endothelial growth factor induces expression of the antiapoptotic proteins Bcl-2 and Al in vascular endothelial cells. J. Biol. Chem., 1998, Vol. 273, p. 13313-13316.

95. Carmeliet P. Basic concepts of (myocardial) angiogenesis: role of vascular endothelial growth factor and angiopoietin. Curr. Interv. Cardiol. Rep., 1999, Vol. 1, p. 322-325.

96. Aoudjit F., Vuori K. Matrix attachment regulates Fas-induced apoptosis in endothelial cells: a role for c-flip and implications for anoikis. J. Cell. Biol., 2001, Vol. 152, p. 633-644.

97. Hutchings H., Maitre-Boube M., Tombran-Tink J., Plouet J. Pigment epithelium-derived factor exerts opposite effects on endothelial cells of different phenotypes. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2002, Vol. 294, p. 764-769.

98. Alberdi E., Aymerich M.S., Becerra S.P. Binding of pigment epithelium-derived factor (PEDF) to retinoblastoma cells and cerebellar granule neurons. Evidence for a PEDF receptor. J. Biol. Chem., 1999, Vol. 274, p. 31605-31612.

99. Alberdi E.M., Weldon J.E., Becerra S.P. Glycosaminoglycans in human retinoblastoma cells: heparan sulfate, a modulator of the pigment epithelium-derived factor-receptor interactions. BMC Biochem., 2003, Vol. 4, p. 1.

100. Bilak M.M., Becerra S.P., Vincent A.M., Moss B.H., Aymerich M.S., Kuncl R.W. Identification of the neuroprotective molecular region of pigment epithelium-derived factor and its binding sites on motor neurons. J. Neurosci., 2002, Vol. 22, p. 9378-9386.

101. Baehner R.L., Nathan D.G. Quantitative nitroblue tetrazolium test in chronic granulomatous disease. Nat. Engl. J. Med., 1968, Vol. 278, p. 971-976.

102. Nieuwkoop P.D. The organization center of the amphibian embryo: its origin, spatial organization, and morphogenetic action. Adv. Morphog., 1973, Vol. 10, p. 1-39.

103. Palmer G. Current issues in the chemistry of cytochrome с oxidase. J. Bioenerg. Biomembr., 1993, Vol. 25, p.145-151.

104. Leaton R.N., Supple W.F. Cerebellar vermis: essential for long-term habituation of the acoustic startle response. Science, 1986, Vol. 232, p. 513-515.

105. Supple W.F., Leaton R.N., Fanselow M.S. Effects of cerebellar vermal lesions on species-specific fear responses, neophobia, and taste-aversion learning in rats. Physiol. Behav., 1987, Vol. 39, p. 579-586.

106. Storozheva Z.I., Pletnicov M.V. Habituation of acoustic startle in rats a functional ablation study. Neuroreport, 1994, Vol. 5, p. 2065-2068.

107. Есипова З.Я. «Ультраструктура коры головного мозга и гиппокампа крыс в раннем постреанимационном периоде после тотальной ишемии». Бюлл. экспер. биол. и медиц., 1988, Т. 105, № 4, стр. 494-497.

108. Iselt М, Holtei W, Hilgard P. The tetrazolium dye assay for rapid in vitro assessment of cytotoxicity. Arzneimittelforschung, 1989, Vol. 39, p.747-749.

109. Khare S., Banai Y., Gokulan K., Smith R. 3rd, Linthicum D.S., Modiano J.F. Early changes in metabolism of leukemic cell lines upon induction of apoptosis by cytotoxic drugs. Eur. J. Pharmacol., 2003, Vol. 465, p. 23-30.

110. Bal-Price A., Brown G. Nitric-oxide-induced necrosis and apoptosis in PC12 cells mediated by mitochondria. J. Neurochem., 2000, Vol. 75, p. 1455-1464.

111. LotemJ, SachsL. Hematopoietic cytokines inhibit apoptosis induced by transforming growth factor beta 1 and cancer chemotherapy compounds in myeloid leukemic cells. Blood, 1992, Vol. 80, p. 1750-1757.

112. Tallarida R.J. Pharmacologic methods for identification of receptors. Life Sci., 1988, Vol. 43, p. 2169-2176.

113. Levi M„ Wilson P., Nguyen S., Iorio E., Sapora O., Parasassi T. In K562 and HL60 cells membrane ageing during cell growth is associated with changes in cholesterol concentration. Mech. Ageing Dev., 1997, Vol. 97, p. 109-119.

114. Thomas G., Chomienne C., Balitrand N., Schaison G., Abita J.P., Baulieu E.E. Granulocytic differentiation induced by retinoic acid in HL-60 cells is associated with changes in adenylate cyclase activity. Anticancer Res., 1986, Vol. 6, p. 857-860.

115. Geny B., Le Peuch C., Cost H., Basset M., Cockcroft S. Phorbol esters inhibit inositol phosphate and diacylglycerol formation in proliferating HL60 cells. Relationship to differentiation. FEBS Lett., 1988, Vol. 233, p. 239-243.

116. Weitzmann M.N., Savage N. Cyclic adenosine 3',5'-monophosphate, a second messenger in interleukin-1 mediated K562 cytostasis. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1993, Vol. 190, p. 564-570.

117. Insel P.A., Ostrom R.S. Forskolin as a tool for examining adenylyl cyclase expression, regulation, and G protein signaling. Cell. Mol. Neurobiol., 2003, Vol. 23, p. 305-314.

118. Duncan J.A., Gilman A.G. Autoacylation of G protein alpha subunits. J. Biol. Chem., 1996, Vol. 271, p. 23594-23600.

119. Gudi S., Nolan J.P., Frangos J. Modulation of GTPase activity of G proteins by fluid shear stress and phospholipids composition. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 1998, Vol. 95, p. 2515-2519.

120. Dessauer C.W., Chen-Goodspeed M., Chen J. Mechanism of G alpha i-mediated inhibition of type V adenylyl cyclase. J. Biol. Chem., 2002, Vol. 277, p. 28823-28829.

121. Taussig R., Tang W.J., Hepler J.R., Gilman A.G. Distinct patterns of bidirectional regulation of mammalian adenylyl cyclases. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, p. 6093-6100.

122. Sunahara R.K., Dessauer C.W., Gilman A.G. Complexity and diversity of mammalian adenylyl cyclases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1996, Vol. 36, p. 461480.

123. Thomas J.M., Hoffman B.B. Adaptive increase in adenylyl cyclase activity in NG108-15 and S49 cells induced by chronic treatment with inhibitory drugs is not due to a decrease in cyclic AMP concentrations. Cell. Signal., 1992, Vol. 4, p. 417-428.

124. Parsons W.J., Stiles G.L. Heterologous desensitization of the inhibitory A1 adenosine receptor-adenylate cyclase system in rat adipocytes. Regulation of both Ns and Ni. J. Biol. Chem., 1987, Vol. 262, p. 841-847.

125. Avidor-Reiss T., Nevo I., SayaD., Bayewitch M., Vogel Z. Opiate-induced adenylyl cyclase superactivation is isozyme-specific. J. Biol. Chem., 1 997, Vol. 2 72, p. 5040-5047.

126. Nestler E.J., Hope B.T., Widnell K.L. Drug addiction: a model for the molecular basis of neural plasticity. Neuron, 1993, Vol. 11, p. 995-1006.

127. Yan Y., Chi P.P., Bourne H.R. RGS4 inhibits Gq-mediated activation of mitogen-activated protein kinase and phosphoinositide synthesis. J. Biol. Chem., 1997, Vol. 272, p. 11924-11927.

128. Watson N., binder M.E., Druey K.M., Kehrl J.H., Blumer К,J. RGS family members: GTPase-activating proteins for heterotrimeric G-protein alpha-subunits. Nature, 1996, Vol. 383, p. 172-175.

129. Rahmanian M., Jarett L. Activation of rat adipocyte plasma membrane adenylate cyclase by sodium azide. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1974, Vol. 61, p. 1051-1056.

130. Kiang J.G., Wu Y.Y., Lin M.C. Heat treatment induces an increase in intracellular cyclic AMP content in human epidermoid A-431 cells. Biochem. J., 1991, Vol. 276, p. 683-689.

131. Jarvis W.D., Fornari F.A., Browning J.L., Gewirtz D.A., Kolesnick R.N., Grant S. Attenuation of ceramide-induced apoptosis by diglyceride in human myeloid leukemia cells. J. Biol. Chem., 1994, Vol. 269, p. 31685-31692.

132. Ghoumari A.M., Wehrle R., De Zeeuw C.I., Sotelo C., Dusart I. Inhibition of protein kinase C prevents Purkinje cell death but does not affect axonal regeneration J. Neurosci., 2002, Vol. 22, p. 3531-3542.

133. Musashi M, Ota S, Shiroshita N. The role of protein kinase C isoforms in cell proliferation and apoptosis. Int. J. Hematol., 2000, Vol. 72, p. 12-19.

134. Yakushiji K., Sawai H., Kawai S., Kambara M., Domae N. Characterization of C2-ceramide-resistant HL-60 subline (HL-CR): involvement of PKC delta in C2-ceramide resistance. Exp Cell Res., 2003, Vol. 286, p. 396-402.

135. Visnjic D., Batinic D., Banfic H. Different roles of protein kinase C alpha and delta isoforms in the regulation of neutral sphingomyelinase activity in HL-60 cells. Biochem. J., 1999, Vol. 344, p. 921-928.

136. Barmack N.H., Qian Z.Y., Kim H.J., Yoshimura J. Activity-dependent distribution of protein kinase C-delta within rat cerebellar Purkinje cells following unilateral labyrinthectomy. Exp. Brain Res., 2001, Vol. 141, p. 6-20.

137. Skinner R., Abrahams J., Whisstock J., Lesk A., Carrell R., Wardell M. The 2.6 A structure of antithrombin indicates a conformational change at the heparin binding site. J. Mol. Biol., 1997, Vol. 266, p. 601-609.

138. Baumann U., Huber R., Bode W., Grosse D., Lesjak M., Laurell C. Crystal structure of cleaved human alpha-1-antichymotrypsin at 2.7 angstroms resolution and is comparison with other serpins. J. Mol. Biol., 1991, Vol. 218, p. 595-606.

139. Baumann U., Bode W., Huber R., Travis J., Potempa J. Crystal structure of cleaved equine leucocyte elastase inhibitor determined at 1.95 angstroms resolution. J. Mol. Biol., 1992, Vol. 226, p. 1207-1218.

140. Sippy B.D., Hofman F.M., Wright A.D., He S., Ryan S.J., Hinton D.R. Soluble tumor necrosis factor receptors are present in human vitreous and shed by retinal pigment epithelial cells. Exp. Eye Res., 1996, Vol. 63, p. 311-317.

141. Abu el Asrar A.M., Maimone D., Morse P.H., Gregory S., Reder A.T. Cytokines in the vitreous of patients with proliferative diabetic retinopathy. Am. J. Ophthalmol., 1992, Vol. 114, p. 731-736.

142. Hardwick C., Feist R., Morris R., White M., Witherspoon D., Angus R., Guidry C. Tractional force generation by porcine Muller cells: stimulation by growth factors in human vitreous. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 1997, Vol. 38, p. 2053-2063.

143. T ombran-Tink J., Barnstable C .J. Therapeutic prospects forPEDF: more than a promising angiogenesis inhibitor. Trends Mol. Med., 2003, Vol. 6, p. 244-250.

144. Drake C.J., Hungerford J.E., Little C.D. Morphogenesis of the first blood vessels. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1998, Vol. 857, p. 155-179.

145. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, Vol. 72, p. 248-254.

146. Rodionov I., Baru M., Ivanov V. A swellographic approach to monitoring continuous-flow solid-phase peptide synthesis. Pept. Res., 1992, Vol. 5, p. 119-125.

147. Nieuwkoop P.D., Faber L. Normal table of Xenopus laevis (Daudin). North Holland publication company Amsterdam-Oxford, 1975.

148. Хоперская О.А. Техника экспериментов с зародышами. В кн. «Методы биологии развития». Под ред. Б.Л. Астаурова. М., Наука, 1974, 620 е., стр. 161183.

149. Niu М.С., Twitty V.C. The differentiation of gastrula ectoderm in medium conditioned by axial mesoderm. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1953, Vol. 39, p. 985-989.

150. Pletnicov M.V., Storozheva Z.I., Sherstnev V.V. Developmental analysis of habituation оf the acoustic startle response in the preweanling and adult rats. Behav. Process., 1995, Vol. 34, p. 269-277.

151. Лилли P. Патологическая техника и практическая гистохимия. Изд-во "Мир", М., 1969, 645 е., стр. 166-167.

152. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 1970, Vol. 227, p. 680-685.

153. Needleman S., Wunsch C. A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequence of two proteins. J. Mol. Biol., 1970, Vol. 48, p. 443-453.