Структурно-функциональная организация Са-АТФазы плазматических мембран человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Пестов, Николай Борисович

• Пестов, Николай Борисович
• кандидат химических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат химических наук Пестов, Николай Борисович

Введение

ГЛАЗА 1. Са-АТФазэ плазматических мембран (Обзор литературы)

1.1. Очистка и реконструкция

1.2. Общая функциональная характеристика

1.3. Топология молекулы

1.4. Регуляция активности аутоингибиторным доменом

1.5. Другие механизмы модуляции активности

1.6. Разнообразие изоформ, альтернативный сплайсинг, 28 тканеспецифичность и регуляция экспрессии ¡n vivo

1.7. Системы клеточной экспрессии и сайт-направленный мутагенез

1.8. Медицинские аспекты

ГЛАВА 2. Исследование структурно-функциональной организации Са-АТФазы 47 плазматических мембран при помощи фагового дисплея, иммунохимических, белкозоинженерных методов

Результаты и их обсуждение)

2.1. Получение и свойства фрагментов РМСА

2.3. Тонкое картирование эпитопов моноклональных 50 антител к РМСА

2.4. Структурно-функциональные соответствия РМСА

2.5. Общий эпитоп РМСА и АРР 5S

2.6. Применение С-концевого фрагмента РМСА .для продукции и аффинной 62 очистки химерных белков

ГЛАВА 3. Экспериментальная часть

3.1. Материалы

3.2. Методы исследования 68 Выводы 77 Благодарности 78 Список сокращений 79 Список литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональная организация Са-АТФазы плазматических мембран человека»

Актуальность проблемы. В регуляции многих процессов жизнедеятельности клетки ключевая роль принадлежит ионам Са. В основе регуляторного действия ионов Са лежит изменение внутриклеточной концентрации "мессенджера", которая внутри клетки приблизительно в 10000 меньше, чем снаружи. Первостепенную роль в поддержании такого градиента концентрации иона играет Са-АТФаза плазматических мембран (РМСА) — система активного транспорта, использующая энергию АТФ для удаления избыточных количеств кальция. Нарушение внутриклеточного гомеостаза иона вызывает необратимые метаболические сдвиги, губительные для клетки, а на уровне всего организма является причиной развития многих тяжелых заболеваний. Поэтому изучение механизмов гомеостаза кальция, а в том числе механизма функционирования РМСА, относится к числу фундаментальных проблем физиологии, медицины и физико-химической биологии.

Цель работы. Основной задачей данной работы явилась характеризация моноклональных антител к Са-АТФазе плазматических мембран человека (ИРМСА) с использованием различных методов, в том числе картирование эпитопов при помощи фагового дисплея. Зная расположение эпитопов моноклональных антител в первичной последовательности РМСА, предполагалось проведение исследований структуры РМСА — трансмембранной топологии.

Научная новизна и практическая ценность работы. В ходе выполнения данной работы помимо достижения первоначальных задач (картирования эпитопов моноклональных антител) удалось получить неожиданные интересные результаты. Прежде всего нужно отметить теоретическое предсказание и экспериментальное подтверждение существования общего эпитопа четвертой изоформы Са-АТФазы плазматических мембран человека (ИРМСА4) и предшественника р-амилоида. Кроме того, показана практическая возможность использования С-концевого домена РМСА для биотехнологических целей — аффинной очистки рекомбинантных белков.

ГЛАВА 1

Са-АТФаза плазматических мембран {Обзор литературы)

Са-АТФаза плазматических мембран (РМСА, кальциевый насос) — интегральный мембранный белок, обнаруженный з клетках эукариот: животных и растений. Ее функция — поддержание внутриклеточного кальциевого гомеостаза — исключительно важна для нормальной жизнедеятельности. Используя энергию АТФ, РМСА переносит ионы Са за пределы клетки против 10000-кратного градиента концентрации.

После обнаружения Са-зависимой АТФазной активности в мембранах эритроцитов [1] и ее связи с транспортом Са [2], наиболее важными, ключевыми этапами в исследованиях РМСА можно назвать:

1. Открытие активирующего эффекта кальмодулина на РМСА [3,4]

2. Разработка процедуры очистки РМСА на иммобилизованном кальмодулине

5].

3. Определение нукпеотидной последовательности «ДНК РМСА — дедукция аминокислотной последовательности с немедленным открытием существования нескольких изофоом фермента [6-8]

4. Локализация кальмодулин-связывающего домена РМСА [9].

Опубликовано немало обзороа, посвященных РМСА [10-25], з данной работе сделана попытка разностороннего охвата всей научной литературы, связанной с исследованиями этого интересного фермента.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Пестов, Николай Борисович

выводы

1. Перекрывающиеся фрагменты четвертой изоформы Са-АТФазы плазматических мембран человека (h.DMCA4) и несколько фрагментов первой изоформы (hPMCAl) продуцированы в бактериальных клетках и очищены при помощи металлоаффинной хроматографии.

2. На примере никотинамидадениннуклеотидтрансгидрсгеназы £. coli показано, что С-концевой фрагмент hPMCA4b, может быть успешно использован для продукции, детекции и очистки рекомбинантных белков, аффинной хроматографией на иммобилизованном кальмодулине.

3. При помощи иммуноферментного анализа полученных фрагментов РМСА и скрининга больших библиотек случайных гекса- и пентадекапептидов при помощи фагового дисплея картированы эпитопы четырех монокпональных антител к РМСА (МА). Эпитоп MA 2D8 локализован в районе 222-249 (в предполагаемом домеке трансдукции), зпитопы MA 8В8 и 7С8 — в'районе 330-353 (в сайте связывания кислых фосфолипидов), MA 5Е6 - в районе 791-843 (в предполагаемом шарнирном регионе). MA 2D8 распознает РМСА1 и РМСА4, в то время как 8В8 и 7С8 специфичны к hPMCA4.

4. Предсказано теоретически и показано экспериментально, что ПРМСА4 и белок-предшественник ß-амилоида имеют общий эпитоп — последовательность DKKAV — с которым реагируют MA 7С8 и 8В8.

Благодарности

Автор благодарит за помощь Н.С. Быстрова (синтез олигонуклеотидов), Е. Штрейлера (кДНК РМСА), Дж. Смита (фаговые библиотеки и штаммы), Муравьеву с коллегами (кальмодулин мозга быка), М. Фещенко (моноклональные антитела к РМСА), H.H. Модянова (плодотворные дискуссии об АТФазах), Е.А. Платошкиной (Na,K-АТФаза почек свиньи), И.А. Прохоренко (некоторые полезные советы), Д. Стеценко (пентафторфениловый эфир биотина).

Работа частично финансировалась Российским фондом фундаментальных исследований, Министерством науки, Международным научным фондом, Шведским советом по естественным наукам, Американским фондом гражданских исследований для новых независимых государств бывшего Советского Союза и ИНТАС.

Автор выражает глубокую благодарность всем коллегам, работавшим бок о бок в течение этого столь длительного периода: М.И. Шахпаронову (научный руководитель), Т.В. Ксрнеенко (жена, друг и коллега), а также: М.Б. Костиной, М.В. Егорову, М.В. Ивановой, Л.Г. Романовой, B.C. Гевондян, Н.М. Гевондян, Н.М. Владимировой, Д.И. Ларину.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Пестов, Николай Борисович, 1999 год

1. Dunham G., Glynn P. /7 Ca2"-dependent adenosinetriphospahatse in human erythrocytes. J. Physiol. (London). 1961. V. 156. P. 274-293.

2. Schatzmann H.J. // A.TP-dependent Ca2''" extrusion from human red cells. Experientia. 1996. V. 22. P. 364-365.

3. Shull G.E., Greeb J. II Molecular cloning of two isoforms of "the plasma mebrane Ca2"-transporting ATPase from rat brain. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 8646-8657.

4. James P., Maeda .1/, Fischer R., Verma A.K., KrebsJ., Penniston J.Т., Carafoli E. // Identification and primary structure of a calmodulin binding domain of the Ca2* pump of human erythrocytes. J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 2905-2910.

5. Penniston J.T., Enyedi A. II Modulation of the piasma membrane Ca2" pump. J. Membr. Biol. 1998. V. 165. P. 101-109.

6. Guerini D. II The significance of the isoforms of plasma membrane calcium ATPase. Cell Tissue Res. 1998. V. 292. P. 191-197.

7. Penniston J.T., Enyedi .4., Verma A.K., Adamo H.P., Filoteo A.G. II Plasma membrane Ca"" pumps. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. V. 834. P. 56-64.

8. Carafoli E. II Plasma membrane calcium pump: structure, function and relationships. Basic. Res. Cardiol. 1997. V. 92 Suppl. 1. P. 59-61.

9. Carafoli E., Garcia-Martin E., Guerini D. II The plasma membrane calcium pump: recent developments and future perspectives. Experientia. 1996. V. 15. P. 1091-1100.

10. Brandt P.C., Vanaman T.C. II The plasma membrane calcium pump: not just another pretty ion translocase. Glycobiology. 1996. V. 6. P. 665-668.

11. Smith J.В., Lee H.W., Smith L. И Regulation of expression of sodium-calcium exchanger and plasma membrane calcium ATPase by protein kinases, glucocorticoids, and growth factors. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1996. V. 779. P. 258-271.'

12. Guerini D., Carafoli E. I I The targeting of the plasma membrane calcium pump in the cell. Biosci. Rep. 1996. V. 16. P. 129-137.

13. Abramowitz J., Suki W.N II Ca-ATPase and bone cell mineralization. Miner. Electrolyte Metab. 1996. V. 22. P. 336-344.

14. Зварич Е.И. И Са2-|--АТФаза плазматических мембран. Структура и функции. Био.т. мембраны. 1991.Т.8. С. 565-585.

15. Wolf H.U., Dieclavss G., Lichmer R. I I Purification and properties of high-affinity Ca2"-ATPase of human erythrocyte membranes. Acta Biol. Med. Germ. 1977. V. 36. P. 847-858.27