Структурно-динамические особенности микоплазменных гистоноподобных HU белков по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Алтухов Дмитрий Алексеевич

• Алтухов Дмитрий Алексеевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Алтухов Дмитрий Алексеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Цель работы

Актуальность работы

Основные задачи исследования

Научная новизна

Теоретическая и практическая значимость

Положения, выносимые на защиту

Личный вклад

Степень достоверности результатов

Апробация результатов работы

Объем и структура диссертации

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метод ЯМР

1.1.1. Общие сведения о принципах ЯМР-спектроскопии

1.1.2. Применение метода ЯМР для исследования структуры белков

1.2. Гистоноподобные Ни белки

1.2.1. Общие сведения о Ни белках

1.2.2. Роль Ни белков в бактериальной клетке и связь с вирулентностью бактерий

1.3. Структурные исследования Ни белков и их комплексов

1.3.1. Структурные исследования Ни белков методом РСА

1.3.2. Структурные исследования Ни белков методом ЯМР-спектроскопии

Заключение

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.2. Методы

2.2.1. Приготовление химически-компетентных клеток E. coli BL21(DE3) RIPL

2.2.2. Трансформация компетентных клеток

2.2.3. Экспрессия 15N/13C -меченных рекомбинантных белков

2.2.4. Подбор оптимальных условий экспрессии рекомбинантных белков на минимальной среде

2.2.5. Выделение изотопно-меченых рекомбинантных белков HUSpm и HUMgal

2.2.6. Электрофорез белков в денатурирующем полиакриламидном геле

2.2.7. Получение дцДНК-дуплексов

2.2.8. Электрофоретический анализ комплексов HU белков с дцДНК

2.2.9. ЯМР-спектроскопия микоплазменных HU белков

2.2.10. Обработка результатов ЯМР-спектроскопии

2.2.11. Исследование комплексов HUSpm с дцДНК и низкомолекулярным ингибитором БПФ4 c помощью ЯМР-спектроскопии

2.2.12. Моделирование пространственной структуры белков и комплексов

2.2.13. Молекулярно-динамическая (МД) симуляция

2.2.14. Депонирование

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Наработка, выделение и предварительный анализ с помощью ЯМР-спектроскопии микоплазменных HU белков

3.2. Структура и динамика HUMgal в растворе по данным ЯМР-спектроскопии и молекулярно-динамических исследований

3.2.1. Анализ результатов ЯМР-спектроскопии

3.2.2. Визуализация конформационной динамики HUMgal в процессе МД-симуляции

3.3. Сравнительный анализ структуры и динамики HUSpm в растворе по данным ЯМР-спектроскопии и молекулярной динамики

3.4. Анализ изменения конформационной динамики Н^рт при связывании дцДНК-дуплекса DS14 и ингибитора БПФ4 методами ЯМР-спектроскопии и

молекулярной динамики

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основные выводы работы

Благодарности

Опубликованные работы по теме диссертации

Тезисы докладов конференций

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CIP - cross-peak intensity perturbations, изменения интенсивностей сигналов на ЯМР-спектрах;

COSY - correlation spectroscopy;

CSP - chemical shift perturbations, изменения химических сдвигов на ЯМР-спектрах;

DBD - ДНК-связывающий домен (DNA-binding domain);

DS - сигнал димеризации (dimerisation signal);

EcHU - HU белок из Escherichia coli;

EMSA - Electrophoretic mobility shift assay;

HSQC - heteronuclear single-quantum correlation spectroscopy;

HTH - helix-turn-helix (спираль-поворот-спираль);

HUBst - HU белок из Bacillus stearothermophilusis;

HUMgal - HU белок из Mycoplasma gallisepticum;

Hup - HU белок из Helicobacter pylori;

HUSpm - HU белок из Spiroplasma melliferum;

HUTmar - HU белок из Thermotoga maritima;

NOESY - nuclear Overhauser effect spectroscopy;

PDB - Protein Data Bank;

RMSD - среднеквадратичное отклонение (root mean square deviation);

TOCSY - total correlation spectroscopy;

Tr - общее время вращательной корреляции;

TROSY - transverse relaxation optimized spectroscopy;

tr - локальное время вращательной корреляции;

БПФ - бисфенольные производные флуорена;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДСН - додецилсульфат натрия;

дцДНК-дуплекс - двухцепочечный ДНК-дуплекс;

ИПТГ - изопропил-Р-0-1-тиогалактопиранозид;

КД - круговой дихроизм;

КССВ - константа спин-спинового взаимодействия; МД - молекулярная динамика;

МХАХ - металл-хелатная аффинная хроматография;

НАБ - нуклеоид-ассоциированные белки; ПААГ - полиакриламидный гель; РСА - рентгеноструктурный анализ;

РЦ МКБ - ресурсный центр молекулярной и клеточной биологии;

ССИ - спад свободной индукции;

ТАЕ - Трис-ацетатный буфер;

ТЕМЕД - К,К,К,№-тетраметилэтилендиамин;

ТМС - тетраметилсилан;

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

ЯМР - ядерный магнитный резонанс;

ЯЭО (NOE) - ядерный эффект Оверхаузера (nuclear Overhauser effect).

ВВЕДЕНИЕ

Геномная ДНК прокариотической клетки содержится в зоне цитоплазмы, называемой нуклеоидом. Компактизация и суперскрученность молекул ДНК поддерживаются нуклеоид-ассоциированными белками (НАБ), которые влияют также на экспрессию генов. Из всех НАБ только HU белки присутствуют абсолютно во всех бактериальных клетках, а также в некоторых растениях и вирусах. В простейших бактериях, микоплазмах, НАБ представлены именно HU белком, генетический нокаут HU белка приводит к гибели микоплазмы. У более сложных бактерий при устранении HU белка происходит замедление роста и нарушается адаптация к стрессовым условиям.

Цели и задачи исследования

Цель работы

Целью данной работы являлись структурные исследования микоплазменных гистоноподобных белков HU в свободном виде и в комплексах с ДНК и ингибитором ДНК-связывания методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-динамические особенности микоплазменных гистоноподобных HU белков по данным гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения»

Актуальность работы

Микоплазмы являются самыми маленькими из известных микроорганизмов, они вызывают заболевания человека и животных, плохо поддающиеся терапии. Для микоплазм характерно отсутствие клеточной стенки, паразитический образ жизни и уменьшенный размер генома, что позволяет закодировать только базовые (необходимые для жизни) белки. Например, из всего разнообразия НАБ, в микоплазмах к присутствуют только HU белки, и соответственно нокаут генов HU белков приводит к гибели клеток. Это делает HU белки перспективной мишенью для разработки таргетных антимикоплазменных препаратов, что в свою очередь определяет необходимость структурных исследований белков данного класса. HU белки являются удобным объектом для исследований методом ЯМР-спектроскопии, так как имеют небольшой размер: молекулярная масса димерного белка примерно 20 кДа.

Объектами настоящего исследования были HU белки (HUMgal и HUSpm) из микоплазм Mycoplasma gallisepticum - патоген домашней птицы, вызывающий хронические респираторные заболевания у кур и инфекционный синусит у индеек, и Spiroplasma melliferum - микоплазма, паразитирующая в медовых пчелах.

Основные задачи исследования

В ходе выполнения работы были поставлены и решены три основных задачи. На первом этапе было необходимо получить 15К/13С-меченные препараты рекомбинантных белков HUMgal и Н^рт, пригодные для исследования методами ЯМР-спектроскопии. Далее выполнялось исследование структуры белков в растворе и сравнение конформационной динамики белков. На третьем этапе работы изучались изменения конформационной динамики Н^рт при связывании короткой двухцепочечной ДНК и ингибитора, относящегося к бисфенольным производным флуорена.

Научная новизна

Используя комбинацию ЯМР-спектроскопии и молекулярной динамики, впервые были получены структуры двух микоплазменных Ни белков в растворе и проведено сравнение их конформационной динамики. Было обнаружено, что гидрофобные (но не ароматические) и полярные взаимодействия играют важную роль во внутренней динамике HUMgal, тогда как два ароматических кластера, образующих два центра стэкинг-взаимодействий в димерном интерфейсе Н^рт, отвечают за структурную пластичность Н^рт, наблюдаемую в ЯМР-спектрах в виде медленного конформационного обмена, который связан со "скольжением" фенильных колец, находящихся в одном кластере, друг относительно друга.

Кроме того, впервые был проведен сравнительный анализ изменения конформационной динамики Н^рт при связывании короткой двухцепочечной ДНК и ингибитора ДНК связывания. В результате было установлено, что сайт связывания ингибитора находится не в центре ДНК-связывающей области, а в интерфейсе между а-спиральным доменом одного мономера и Р-листовым седловидным доменом другого мономера, что указывало на новый аллостерический механизм действия ингибитора.

Теоретическая и практическая значимость

Были расширены знания о семействе белков Ни в целом и в частности о Ни белках микоплазм. Полученная структурная информация подтвердила, что Ни белки микоплазм имеют консервативные пространственные структуры, но различную конформационную динамику. Кроме того, было подтверждено наличие у белков этого класса минорной конформации.

ЯМР-спектроскопия позволила описать динамику молекулы Н^рт в растворе и исследовать влияние на неё различных физиологических (ДНК) и патологических

(ингибитор) воздействий, что дополнило и расширило структурные данные, полученные с помощью РСА, которые позволяли установить только зафиксированную в некоторый момент конформацию белковой молекулы.

Обнаруженный новый (аллостерический, без конкуренции за сайт связывания ДНК) механизм ингибирования Ни белков может быть использован при разработках фармакологически-востребованных ингибиторов ДНК-связывающих олигомерных белков и создания антибактериальных препаратов, воздействующих на нуклеоид.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан новый эффективный метод препаративной наработки изотопно-меченных белков в минимальной среде, заключающийся в индукции с помощью 0,2 мМ ИПТГ при температуре 250С в течение ночи, а для выделения белков - в комбинации металлохелатной и ионообменной хроматографии.

2. Вторичные структуры HUMgal и Н^рт состоят из трех а-спиралей и шести Р-тяжей, расположенных в порядке: р1-а1-а2-р2-р3-р4-р5-рб-а3, Р-тяжи образуют два нерегулярных антипараллельных Р-слоя - р2/р3/рб и Р4/Р5.

3. Пространственные димерные структуры НЦМ^а1 и Н^рт представляют собой две сложенные а-спиральные «руки», переходящие в седлообразный Р-лист, заканчивающийся гибкими изогнутыми «пальцами», кончики которых работают как высокоаффинные эпитопы, узнающие цепь ДНК.

4. У НиМ^а1 наблюдается высокая подвижность в области ДНК-связывающего домена в пико-наносекундном диапазоне - оставшаяся часть молекулы, включая три а-спирали и центральный седловидный Р-слой, более стабильна. У Н^рт также высокоподвижна область ДНК-связывающего домена в пико-наносекундном диапазоне, однако в отличие от HUMgal, у Н^рт, присутствует конформационный обмен в регионах Р2 и а3 (С-конец) в диапазоне микро-миллисекунд. Наблюдаемая разница в конформационной динамике белков определяется наличием 2-х ароматических кластеров стэкинг-взаимодействий в гидрофобном ядре димерного интерфейса Н^рт.

5. Воздействие короткой дцДНК и ингибитора ДНК-связывания на конформационную динамику Н^рт практически противоположны - в первом случае наибольшее изменение химических сдвигов наблюдалось в С-концевой области ДНК-связывающего домена, а во втором - в области а1-спирали и КК-концевой части а2-спирали.

6. Обнаружен аллостерический механизм действия ингибиторов связывания Ни белков с ДНК, который заключается в том, что сайт связывания ингибитора находится не

в центре ДНК-связывающей области, а в интерфейсе между а-спиральным доменом одного мономера и Р-листовым седловидным доменом другого мономера.

Личный вклад

Алтухов Д.А. принимал активное участие в планирование и постановке экспериментов, разработке методик, а также в обработке и анализе результатов.

Автором были получены препараты 15К/13С-меченных рекомбинантных белков, проведены ЯМР-эксперименты, обработаны и проанализированы экспериментальные данные.

Степень достоверности результатов

Достоверность полученных результатов определяется надёжностью применявшихся методов исследования, повторяемостью значений измеряемых параметров в многочисленных экспериментах. Полученные в работе результаты подтверждаются современными исследованиями в данной тематике.

Апробация результатов работы

Содержание работы отражено в девяти публикациях, в том числе - в шести опубликованных статьях в рецензируемых научных журналах и в трех тезисах конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав, заключения и списка литературы.

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулированы цель, задачи и методы исследования, отражены научная новизна и практическая значимость работы, описана апробация полученных результатов.

Первая глава представляет собой литературный обзор, посвященный развитию метода ЯМР-спектроскопии, и его использованию в структурных исследованиях белков, в том числе представителей семейства Ни белков. Литературный обзор также содержит разделы, посвящённые описанию роли Ни белков в бактериальной клетке и их исследованиям методом рентгеноструктурного анализа.

Вторая глава включает в себя описание материалов, оборудования и методов,

использованных в работе. Изложена процедура получения изотопно-меченых рекомбинантных белков, приведены параметры ЯМР- и МД-экспериментов, описан способ определения сайтов связывания дцДНК-дуплекса (DS14) и ингибитора, относящегося к классу бисфенольных производных флуорена (БПФ4), на молекуле НШрт.

Третья глава состоит из трёх разделов. В первом разделе третьей главы представлены результаты получения изотопно-меченных препаратов. Во втором разделе третьей главы представлены результаты ЯМР-исследований структуры Ни белков в растворе и сравнение их конформационной динамики. В третьем разделе третьей главы приведены результаты исследования изменения конформационной динамики Н^рт при связывании короткой двухцепочечной ДНК и ингибитора, а также произведен сравнительный МД-анализ Н^рт в апо-форме и комплексах с ДНК и ингибитором.

В заключении диссертационной работы представлены основные выводы и приведен библиографический список цитируемой литературы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метод ЯМР

1.1.1. Общие сведения о принципах ЯМР-спектроскопии

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) - это явление резонансного поглощения энергии электромагнитного поля ядрами, находящимися в сильном внешнем магнитном поле. ЯМР-спектроскопия - метод, основанный на явлении ЯМР, который позволяет получить информацию о молекулярном строении, узнать пространственную структуру, а также исследовать динамику молекулы. Ядерный магнитный резонанс был открыт в 1945 году американскими физиками Феликсом Блохом и Эдуардом Миллсом Парселлом [1, 2] За это открытие и основанный на нем метод ученые в 1952 году получили Нобелевскую премию.

Как известно, протоны и нейтроны, из которых состоят ядра, обладают спином -собственным механическим моментом. В зависимости от состава спин ядра принимает различные значения: четное число протонов, четное число нейтронов - спин ядра равен нулю (например, 12С, 160, 3^); четное число протонов и нечетное число нейтронов или наоборот - спин ядра полуцелый (например, 1Н, 19Р); нечетное число протонов и нечетное число нейтронов - спин ядра целый (например, 2Н, 1Ф№, 22Ш). Ядра, обладающие ненулевым спином, имеют также ненулевой магнитный момент, вследствие чего во внешнем магнитном поле наблюдается эффект Зеемана - происходит расщепление уровней энергии таких ядер во внешнем магнитном поле [3, 4]. Сущность метода ядерного магнитного резонанса заключается в наблюдении переходов между этими уровнями в радиочастотном диапазоне. Переход на более высокий энергетический уровень может произойти при поглощении ядром кванта электромагнитного поля определенной частоты, которая называется резонансной частотой данного ядра. Эта частота определяется типом ядра и величиной внешнего магнитного поля, в котором находится ядро. Например, резонансная частота протона (ядро изотопа водорода 1Н) в постоянном магнитном поле с напряженностью 16,4 Тл равна 700 МГц, а для ядра изотопа углерода 13С в этом же поле будет 176 МГц. Поле такой величины обеспечивается сверхпроводящим магнитом, который охлаждается жидким гелием до температуры ~4 К.

Значение напряженности постоянного магнитного поля, создаваемого внутри прибора, является его ключевой характеристикой. Чем сильнее это поле, чем выше разрешающая способность ЯМР-спектрометра. Резонансную частоту протонов,

соответствующую магнитному полю конкретного прибора, называют его рабочей частотой. На сегодняшний день для коммерческих ЯМР-спектрометров удалось достичь значения 28,2 Тл (примерно в 600000 раз больше магнитного поля Земли), что соответствует рабочей частоте 1,2 ГГц [5].

Для регистрации сигналов ядерного магнитного резонанса в первых ЯМР-спектрометрах применялся метод непрерывной развертки, при котором происходит плавное изменение частоты переменного электромагнитного поля и регистрация спектра поглощения. Основной недостаток данного метода заключается в больших временных затратах для достижения хорошего разрешения. В современных ЯМР-экспериментах применяют другой подход: образец облучают коротким радиочастотным импульсом с

частотой V длительностью Т. При этом происходит возбуждение ядер образца в

диапазоне У^ ± 1/ Т и меняется заселенность энергетических уровней этих ядер. В

процессе обратных переходов к энергетически более низким состояниям ядра излучают электромагнитные волны - такой отклик образца регистрируют в виде сигнала, именуемого спадом свободной индукции (ССИ). После этого ССИ подвергают преобразованию Фурье и получают ЯМР-спектр [6] (рисунок 1). Импульсный метод регистрации ЯМР-сигналов имеет значительное преимущество во времени и чувствительности по сравнению с методом непрерывной развертки. Описанный метод был разработан в 1964 году Эрнстом Рихардом [7], а в 1991 году ученый получил Нобелевскую премию по химии.

результате преобразования Фурье от ССИ. [6]

В составе молекул ядра окружены электронными оболочками, которые частично экранируют внешнее магнитное поле. Окружения ядер отличаются друг от друга, поэтому

наблюдаются небольшие отклонения резонансной частоты для ядер одного типа - данное явление было открыто в 1951 году [8] и получило название "химический сдвиг". Таким образом, каждому ядру в ЯМР-спектре соответствует свой сигнал. На практике для описания положений сигналов в спектрах используют шкалу относительных химических

сдвигов (слово "относительный" часто опускают): £ = (-стандарт) 106, где у -

V стандарт

резонансная частота исследуемого ядра, Устандарт - резонансная частота некоторого

стандартного соединения. В качестве стандарта химического сдвига для ЯМР-исследований часто используют тетраметилсилан (ТМС, формула (CH3)4Si). Единицей измерения является "миллионная доля" (м.д.) или "part per million" (ppm). Удобство данной шкалы заключается в том, что, в отличие от абсолютных частот, значения S не зависят от напряженности постоянного магнитного поля. Таким образом, сигналы в спектрах, полученных на приборах с различной рабочей частотой, будут иметь идентичные положения.

1.1.2. Применение метода ЯМР для исследования структуры белков

Химические сдвиги позволяют получить некоторую информацию о структуре белка. Неструктурированные и а-спиральные белки обычно проявляют небольшую дисперсию сигналов 1МН протонов, у Р-структурных белков дисперсия заметно больше -это дает возможность при простом анализе спектра определить общий тип структуры белка [9]. Значительной информативностью обладают вторичные химические сдвиги -отклонения от известных для каждого аминокислотного остатка химических сдвигов случайного клубка: для а-спиралей и Р-слоев знаки этих отклонений противоположны. С помощью специальных программ (например, TALOS+ [10]) из химических сдвигов можно получить эмпирические предсказание торсионных углов ф и у, а также распределения вторичной структуры и некоторых динамических характеристик белковой молекулы.

Даже небольшой пептид дает очень много ЯМР-сигналов, которые сильно перекрываются в спектре. Для решения этой проблемы используют многомерную ЯМР-спектроскопию [6, 9]. В основе этого метода лежит перенос намагниченности между ядрами, который может осуществляться двумя путями. Первый - с помощью спин-спиновых межъядерных взаимодействий. В этом случае передача происходит через электронные оболочки ковалентно связанных атомов. Второй путь переноса намагниченности - диполь-дипольное взаимодействие, при этом намагниченность

передается непосредственно через пространство (ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО), nuclear Overhauser effect (NOE) [9]). Если ядра взаимодействуют каким-либо способом, то в соответствующем многомерном спектре будет наблюдаться кросс-пик, координаты которого равны химическим сдвигам этих ядер. ЯМР-эксперименты, в основе которых лежат спин-спиновые взаимодействия (COSY, TOCSY), позволяют выявить ковалентно-связанные атомы, а основанные на диполь-дипольных взаимодействиях эксперименты (NOESY) дают возможность определить пространственно сближенные атомы, для ядер которых наблюдается магнитный резонанс.

Подобным качественным анализом применение межъядерных взаимодействий в ЯМР-исследованиях не ограничивается. Количественной мерой спин-спиновых взаимодействий является константа спин-спинового взаимодействия (КССВ). С помощью измерения КССВ через три связи можно рассчитать торсионные углы в молекуле белка. Интенсивности сигналов в NOESY спектрах обратно пропорциональны шестой степени межъядерных расстояний (~1/r6) [9], благодаря чему с помощью калибровки можно измерять расстояния между ядрами, подверженными ЯЭО взаимодействиям. Максимальная величина расстояний, которые можно измерить таким образом, составляет ~6 Á.

В 1985 году швейцарский химик Курт Вютрих разработал метод, позволяющий с помощью ЯМР-спектроскопии исследовать пространственную структуру белков [11]. До этого единственным способом получения белковых структур был рентгеноструктурный анализ. За свое открытие ученый был удостоен Нобелевской премии по химии (^ часть) в 2002 году.

Стандартная процедура определения пространственной структуры начинается с отнесения сигналов белка. На этом этапе нужно установить соответствие между сигналами в ЯМР-спектрах и ядрами молекулы. Для этого сначала определяют спиновые системы, а затем производят их последовательное отнесение - соединение спиновых систем в цепочки. В случае небольших белков (до ~9 кДа для Р-структурных белков и до ~6 кДа для a-спиральных белков [11] часто бывает достаточно двумерных протонных спектров TOCSY и NOESY, при этом не требуется искусственного обогащения изотопами. Для более сложных случаев необходимо подключать трехмерную гетероядерную ЯМР-спектроскопию - например, эксперименты 15N-TOCSY-HSQC, HN(CO)CA, HNCA и другие (рисунок 2, [12]). Проведение таких экспериментов требует введение изотопных меток (13C, 15N), так как их естественное содержание мало (1,1% и 0,36% соответственно). Далее измеряют параметры, позволяющие получить ограничения на пространственную структуру белка: КССВ (ограничения на торсионные углы), интенсивности кросс-пиков в

ЯЭО спектрах и температурные градиенты химических сдвигов (ограничения на межатомные расстояния), и другие. В специальных программах (например, [13]) с помощью минимизации энергии и молекулярной динамики рассчитывается трехмерная структура белка.

J V

V ¡-1 (а) V

(нуЬ -Чсу'Ь Чй) (НуЬ ЧСуЬ Чну)

(нр.ь —(СР>- Чщ) (нрЬ ЧсрЬ Чнр)

( N V —(Са)— Чс)— Ч N Ь —: Са,'— Ас)

(ны) МНа) (°) Я-шУ (На; (о)

> < J

V ¡-1 (г) V

Рисунок 2. Схема переноса намагниченности в трехмерных гетероядерных ЯМР-экспериментах: (а) 15N-TOCSY-HSQC; (б) Н^СО)СА; (в) Н^А; (г) НЖ!АСВ; (д) Н^СА)СО; (е) HCCH-COSY [12].

Благодаря явлению релаксации ядерной намагниченности с помощью ЯМР-спектроскопии оказывается возможным исследовать белковые структуры в динамике -это одно из основных преимуществ метода ЯМР перед РСА. Для этого измеряют параметры продольной и поперечной релаксации, зависящие от внутренних молекулярных движений. Релаксационная ЯМР-спектроскопия позволяет исследовать подвижность белков в двух диапазонах времен: в пико-наносекундном (быстрые движения) и в микро-миллисекундном (медленные движения). На рисунке 3 изображена временная шкала, характеризующая скорости динамических процессов, в которых участвует молекула белка.

Рисунок 3. Временная шкала динамических процессов в белках в масштабе от одного часа до фемтосекунд [14]. Визуальные изображения биологически значимых макромолекулярных движений показаны выше (белковый фолдинг, вращение боковых цепей) и ниже (перемещение белков, связывание комплексов и лигандов, движения доменов).

На сегодняшний день с помощью наиболее традиционных методов ядерного магнитного резонанса, включающих 13С/15К-мечение, стандартные эксперименты тройного резонанса и трехмерные NOESY спектры, удается исследовать структуры белков, имеющих молекулярную массу до ~30 кДа [14, 15]. У такого ограничения есть две основные причины. Первая заключается в том, что с увеличением размера молекулы и, соответственно, массы падает скорость ее броуновского вращательного движения. Это влечет быстрый спад ядерной намагниченности за счет поперечной релаксации и как следствие - уширение ЯМР-сигналов, что приводит к снижению чувствительности метода. Вторая причина состоит в том, что с увеличением числа атомов в молекуле растет количество сигналов в ЯМР-спектре, а разрешение спектрометра ограничено его магнитным полем. Поэтому для больших молекул перекрывание сигналов становится критичным. Эта проблема особенно проявляется при исследовании а-спиральных и неструктурированных белков, сигналы которых имеют небольшую дисперсию.

Белки массой 30-100 кДа удается исследовать при помощи основанных на TROSY экспериментов в комбинации с дейтерированием боковых цепей [14, 15, 16]. А селективное метильное мечение боковых цепей с дейтерированием растворителя позволяет получить информацию о структуре и динамике белков и комплексов массой до 500 кДа [14, 15, 17, 18].

Первая ЯМР-структура депонирована 1989 году (рисунок 4а, РББ 1BDS, [19]).

Объектом был пептид BDS-I из морских анемон длиной 43 аминокислотных остатка и массой 4,72 кДа. RMSD по всем атомам 42 структур составило 0,9 А. В том году это была единственная белковая структура, полученная методом ЯМР.

Рисунок 4. (а) Первая депонированная ЯМР структура - пептид BDS-I (PDB 1BDS, [19]). (б) Структура первого комплекса белок-ДНК (PDB 1AHD, [24]). (в) Внутриклеточный и трансмембранный домены человеческого альфа-7 никотинового ацетилхолинового рецептора (PDB 7RPM, [26]) (г) Структура самого большого объекта, сделанного с помощью ЯМР в комбинации с крио-ЭМ (PDP 6R8N, [18]). (д) Самый большой объект, структура которого получена только с использованием ЯМР (PDB 6O22, [25]).

В последующие годы наблюдается довольно бурный рост депонирования ЯМР-структур (рисунок 5, [20]). Это связано с совершенствованием трех- и четырехмерных гетероядерных методов ЯМР-спектроскопии, что позволило решить многие проблемы перекрывающихся сигналов и широких линий, а также с улучшением способов определения КССВ и 13C и химических сдвигов [21, 22]. К тому же все очевиднее становился потенциал ЯМР-спектроскопии и его преимущества по сравнению с РСА -возможность получить "истинную" структуру в растворе при сравнимой точности

(ошибки 0,2-0,3 А в РСА с разрешением 1,5-2,0 А против точности 0,4-0,8 А в ЯМР по атомам основной цепи) [21, 23]. Через пять лет после депонирования первой ЯМР структуры, в 1994 году, уже было депонировано 339 структур, полученных с помощью ЯМР-спектроскопии. А за 10 лет, к 2000 году - 1765 ЯМР-структур.

Number cj Structures Released Annual^ J^^BI Tosal Number of Entries Available

^a ^ tfii ^ scf>i ^¡m гСр» ^г гфг гвс£ гСрв г0Св г0« г0\г г0\и г0\ь г„\1 г0\в г0уэ ^¡¡а гйг\ гйгг

Year

Рисунок 5. Количество структур, полученных с помощью ЯМР-спектроскопии, с 1989 по 2022 год, а также их годовой прирост [20].

Первая структура комплекса белок-ДНК появилась в 1993 году (рисунок 4б, PDB 1AHD, [24]). Молекулярный вес данного комплекса составлял 17,22 кДа.

Самый большой объект, структура которого была установлена с помощью ЯМР совместно с криогенной электронной микроскопией (крио-ЭМ) - это додекамерная аминопептидаза TET2 (tet methylcytosine dioxygenase 2) массой 468 кДа (рисунок 4г , PDB 6R8N, [18]). Благодаря комбинации методов удалось достичь точности в 1 А.

Наибольшая структура, при установлении которой из структурных методов применялся только ЯМР, имеет молекулярный вес 170 кДа - это комплекс гистонового шаперона - лизиновой ацетилтрансферазы с гистоновым субстратом (рисунок 4д, PDB 6O22, [25]). Исследовать столь большой белок удалось благодаря селективному 1H-13C-мечению метильных групп, а также введению парамагнитной метки.

Совсем недавно, в 2021 году, была получена структура внутриклеточного домена и трансмембранного домена человеческого альфа-7 никотинового ацетилхолинового рецептора массой 149 кДа (рисунок 4в, PDB 7RPM, [26]). Она была также получена только лишь с использованием комбинации различных методов ЯМР.

Всего на данный момент (дата входа в базу 09.04.22.) с использованием ЯМР-спектроскопии получено около 13653 структурs.

Многообразие задач, которые можно решить с помощью ЯМР-спектроскопии макромолекул, на сегодняшний день очень велико. При этом значительная часть работ в данной области посвящена получению структур небольших растворимых белков. В связи с этим Ни белки являются подходящими объектами для исследований методом ЯМР.

1.2. Гистоноподобные HU белки

1.2.1. Общие сведения о HU белках

Нуклеоид-ассоциированные белки (НАБ) — это глобальные регуляторы топологии ДНК и экспрессии генов у бактерий [27]. Влияние НАБ на ДНК-топологию приводит к многочисленным эффектам в бактериальных клетках, включая изменения в регуляции транскрипции [27]. В кишечной палочке Escherichia coli известно двенадцать типов НАБ, отличающихся разной ДНК-специфичностью; их гены обычно экспрессируются на высоком уровне по сравнению с другими генами, при этом уровень экспрессии зависит от фазы роста бактериальной культуры [28, 29]. Регуляторный эффект НАБ осуществляется путем модуляции компактизации ДНК, приводящей к обеспечению доступности свободных супервитков ДНК для транскрипционного комплекса [30, 31].

Наиболее распространённый представитель семейства НАБ - гистоноподобный белок HU - был открыт в конце прошлого века французскими исследователями Rouviere-Yaniv J. и Gros F.: в 1975 году из штамма E. coli U13 был выделен маленький ДНК-связывающий белок, названный фактором U [32]. По своим свойствам этот белок проявлял сходство с гистонами эукариот и был назван HU белком [32, 33]. Такое название происходит от "H" - histone-like, гистоноподобный (так как его способность к связыванию и изгибанию ДНК была аналогична свойствам эукариотических гистонов) и "U" - от названия штамма E. coli U13, из которого он был выделен первоначально [32].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алтухов Дмитрий Алексеевич, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Purcell E. M., Torrey H. C., Pound R. V. Resonance Absorption by Nuclear Magnetic Moments in a Solid. // (1946) Physical Review, 69, 37. DOI: https://doi.org/10.1103/PhysRev.69.37

2. Bloch F., Hansen W. W., Packard M. Nuclear Induction. // (1946) Physical Review, 69, 127. DOI: https://doi.org/10.1103/PhysRev.69.127

3. Zeeman P. The Effect of Magnetisation on the Nature of Light Emitted by a Substance // (1897) Nature 55, page347. DOI: https://doi.org/10.1038/055347a0

4. Сивухин Д. В. Общий курс физики. Т. 5. Атомная и ядерная физика. // (2002) М: Физматлит; Изд-во МФТИ, 784стр.

5. Luchinat E., Barbieri L., Cremonini M., Banci L. Protein in-cell NMR spectroscopy at 1.2 GHz. // (2021) Journal of Biomolecular NMR, 75, 97-107. DOI: https://doi.org/10.1007/s10858-021-00358-w

6. Andrew E. Derome. Modern NMR Techniques for Chemistry Research. // (1987) The Dyson Perrins Laboratory, University of Oxford, UK.

7. Ernst R. R., Anderson W. A. Application of Fourier Transform Spectroscopy to Magnetic Resonance. // (1966) Review of Scientific Instruments, 37, 93. DOI: https://doi.org/10.1063/L1719961

8. Arnold J.T., Dharmatti S.S., Packard M.E. Chemical Effects on Nuclear Induction Signals from Organic Compounds. // (1951) The Journal of Chemical Physics, 19, 507. DOI: https://doi.org/10.1063/L1748264

9. Cavanagh J., Fairbrother W. J., Palmer A. G., Skelton N. J., Rance M. Protein NMR spectroscopy: principles and practice. // (2007) Academic Press.

10. Shen Y., Delaglio F., Cornilescu G., Bax A. TALOS+: a hybrid method for predicting protein backbone torsion angles from NMR chemical shifts. // (2009) Journal of Biomolecular NMR, 44(4):213-23. DOI: https://doi.org/10.1007/s10858-009-9333-z

11. Wuthrich K. NMR of Proteins and Nucleic Acids. // (1986) John Wiley and Sons, New York.

12. Dr. Vicky Higman. Protein MMR. A practical guide. URL: https://www.protein-nmr.org.uk/

13. Guntert P. Automated NMR structure calculation with CYANA. // (2004) Methods in

Molecular Biology, 278, 353-378. DOI: https://doi.Org/10.1385/1-59259-809-9:353

14. Boswell Z., Latham M. Methyl-Based NMR Spectroscopy Methods for Uncovering Structural Dynamics in Large Proteins and Protein Complexes. // (2019) Biochemistry, 58(3): 144-155. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.biochem.8b00953

15. Hu Y., Cheng K., He L., Zhang X., Jiang B., Jiang L., Li C., Wang G., Yang Y., Liu M. NMR-Based Methods for Protein Analysis. // (2021) Analytical Chemistry, 93(4):1866-1879. DOI: https://doi.org/10.1021/acs.analchem.0c03830

16. Pritchard R.B., Hansen D.F. Characterising side chains in large proteins by protonless 13C-detected NMR spectroscopy. // (2019) Nature Communications, 10(1):1747. DOI: https://doi .org/ 10.1038/s41467-019-09743-4

17. Religa T.L., Kay L.E. Optimal methyl labeling for studies of supra-molecular systems // (2010) Journal of Biomolecular NMR, 47(3):163-9. DOI: https://doi.org/10.1007/s10858-010-9419-7.

18. Gauto D.F., Estrozi L.F., Schwieters C.D., Effantin G., Macek P., Sounier R., Sivertsen A.C., Schmidt E., Kerfah R., Mas G., Colletier J.-F., Güntert P., Favier A., Schoehn G., Schanda P., Boisbouvier J. Integrated NMR and cryo-EM atomic-resolution structure determination of a half-megadalton enzyme complex. // (2019) Nature Communications, 10(1):2697. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-10490-9

19. Driscoll P.C., Gronenborn A.M., Beress L., Clore G.M. Determination of the three-dimensional solution structure of the antihypertensive and antiviral protein BDS-I from the sea anemone Anemonia sulcata: a study using nuclear magnetic resonance and hybrid distance geometry-dynamical simulated annealing. // (1989) Biochemistry, 28, 5, 21882198. DOI: https://doi.org/10.1021/bi00431a033

20. Protein data bank. URL: https://www.rcsb.org/

21. Gronenborn A.M., Clore G.M. Structures of protein complexes by multidimensional heteronuclear magnetic resonance spectroscopy. // (1995) Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology, 30(5):351-85. DOI: https://doi.org/10.3109/10409239509083489

22. Grzesiek S., Bax A. Amino acid type determination in the sequential assignment procedure of uniformly 13C/15N-enriched proteins. // (1993) Journal of Biomolecular NMR, 3(2):185-204. DOI: https://doi.org/10.1007/BF00178261

23. Clore G.M., Gronenborn A.M. Comparison of the solution nuclear magnetic resonance

and X-ray crystal structures of human recombinant interleukin-1 beta. // (1991) Journal of Molecular Biology,221(1):47-53.DOI: https://doi.org/10.1016/0022-2836(91)80202-6

24. Billeter M., Qian Y.Q., Otting G., Müller M., Gehring W., Wüthrich K. Determination of the Nuclear Magnetic Resonance Solution Structure of an Antennapedia Homeodomain-DNA Complex. // (1993) Journal of Molecular Biology, 234(4):1084-93. DOI: https://doi.org/10.1006/jmbi.1993.1661

25. Danilenko N., Lercher L., Kirkpatrick J., Gabel F., Codutti L., Carlomagno T. Histone chaperone exploits intrinsic disorder to switch acetylation specificity. // (2019) Nature Communications, 10(1):3435. DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-019-11410-7

26. Bondarenko V., Wells M.M., Chen Q., Tillman T.S., Singewald K., Lawless M.J., Caporoso J., Brandon N., Coleman J.A., Saxena S., Lindahl E., Xu Y., Tang P. Structures of highly flexible intracellular domain of human a7 nicotinic acetylcholine receptor. // (2022) Nature Communications, ,13(1):793. DOI https://doi.org/10.1038/s41467-022-28400-x

27. Dillon S.C., Dorman C.J. Bacterial nucleoid-associated proteins, nucleoid structure and gene expression. // (2010) Nature Reviews Microbiology, 8(3):185-95. DOI: https://doi.org/10.1038/nrmicro2261

28. Azam, T.A., Ishihama A. Twelve species of the nucleoid-associated protein from Escherichia coli. Sequence recognition specificity and DNA binding affinity. // (1999) Journal of Biological Chemistry, 274(46):33105-13. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.274.46.33105

29. Azam T.A., Iwata A., Nishimura A., Ueda S., Ishihama A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. // (1999) Journal of Bacteriology, 181(20):6361-70. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.181.20.6361-6370.1999.

30. Dame R.T. The role of nucleoid-associated proteins in the organization and compaction of bacterial chromatin. // (2005) Molecular Microbiology, 56(4):858-70. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2005.04598.x

31. Travers A., Muskhelishvili G. Bacterial chromatin. // (2005) Current Opinion in Genetics & Development, 15(5):507-14. DOI: https://doi.org/10.10167j.gde.2005.08.006.

32. Rouvière-Yaniv J., Gros F. Characterization of a novel, low-molecular-weight DNA-binding protein from Escherichia coli. // (1975) Proceedings of the National Academy of

Sciences, 72 (9) 3428-3432. DOI: https://doi.Org/10.1073/pnas.72.9.3428

33. Drlica K., Rouviere-Yaniv J. Histonelike proteins of bacteria. // (1987) Microbiological Reviews, 51, 3. DOI: https://doi.org/10.1128/mr.51.3.301-319.1987

34. Grove A. Functional evolution of bacterial histone-like HU proteins. // (2010) Current Issues in Molecular Biology,13(1):1-12. DOI: https://doi.org/10.21775/cimb.013.001

35. Ali Azam T., Iwata A., Nishimura A., Ueda S., Ishihama A. Growth phase-dependent variation in protein composition of the Escherichia coli nucleoid. // (1999) Journal of Bacteriology, 181, 6361-6370. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.181.20.6361-6370.1999

36. Pettijohn D. E. Histone-like proteins and bacterial chromosome structure. // (1988) Journal of Biological Chemistry, 263, 12793-12796. DOI: https://doi.org/10.1016/s0021-9258(18)37625-7

37. Bhowmick T., Ghosh S., Dixit K., Ganesan V., Ramagopal U. A., Dey D., Sarma S.P, Ramakumar S., Nagaraja V. Targeting Mycobacterium tuberculosis nucleoid-associated protein HU with structure-based inhibitors. // (2014) Nature Communications, 5:4124. DOI: https://doi.org/10.1038/ncomms5124

38. Oliveira Paiva A. M., Friggen A. H., Qin L., Douwes R., Dame R. T., Smits, W. K. The bacterial chromatin protein HupA can remodel DNA and associates with the nucleoid in Clostridium difficile. // (2019) Journal of Molecular Biology, 431, 653-672. DOI: https://doi.org/10.1016/jjmb.2019.01.001

39. Kamashev D., Agapova Y., Rastorguev S., Talyzina A. A., Boyko K. M., Korzhenevskiy D. A., Vlaskina A., Vasilov R., Timofeev V.I., Rakitina T.V. Comparison of histone-like HU protein DNA-binding properties and HU/IHF protein sequence alignment.// (2017) PLOS ONE, 12(11):e0188037. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0188037

40. Broyles S.S., Pettijohn D.E. Interaction of the Escherichia coli HU protein with DNA. Evidence for formation of nucleosome-like structures with altered DNA helical pitch. // (1986) Journal of Molecular Biology, 187, 47-60. DOI: https://doi.org/10.1016/0022-2836(86)90405-5

41. Roy S., Dimitriadis E.K., Kar S., Geanacopoulos M., Lewis M.S., Adhya S. Gal repressor-operator-HU ternary complex: pathway of repressosome formation. // (2005) Biochemistry 44, 5373-5380. DOI: https://doi.org/10.1021/bi047720t

42. Oberto J., Nabti S., Jooste V., Mignot H., Rouviere-Yaniv J. The HU regulon is composed of genes responding to anaerobiosis, acid stress, high osmolarity and SOS induction. //

(2009). PLOS ONE 4:e4367. DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0004367

43. Balandina A., Kamashev D., Rouviere-Yaniv J. The bacterial histonelike protein HU specifically recognizes similar structures in all nucleic acids DNA, RNA, and their hybrids. // (2002). Journal of Biological Chemistry, 277, 27622-27628. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.M201978200

44. Kamashev D., Rouviere-Yaniv J. The histone-like protein HU binds specifically to DNA recombination and repair intermediates. // (2000). The EMBO Journal, 19, 6527-6535. DOI: https://doi.org/10.1093/emboj/19.23.6527

45. Boubrik F., Rouviere-Yaniv J. Increased sensitivity to gamma irradiation in bacteria lacking protein HU. // (1995). Proceedings of the National Academy of Sciences, 92, 3958-3962. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.92.9.3958

46. Rouviere-Yaniv J., Yaniv M., Germond J. E. E. coli DNA binding protein HU forms nucleosomelike structure with circular double-stranded DNA. // (1979) Cell, 17, 265274. DOI: https://doi.org/10.1016/0092-8674(79)90152-1

47. Bonnefoy E., Rouviere-Yaniv J. HU, the major histone-like protein of E. coli, modulates the binding of IHF to oriC. // (1992). The EMBO Journal, 11, 4489-4496. DOI: https://doi.org/10.1002/j.1460-2075.1992.tb05550.x

48. Preobrajenskaya O., Boullard A., Boubrik F., Schnarr M., Rouviere-Yaniv, J. The protein HU can displace the LexA repressor from its DNA-binding sites. // (1994). Molecular Microbiology, 13, 459-467. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.1994.tb00440.x

49. Aki T., Choy H. E., Adhya S. Histone-like protein HU as a specific transcriptional regulator: co-factor role in repression of gal transcription by GAL repressor. // (1996). Genes Cells, 1, 179-188. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1365-2443.1996.d01-236.x

50. Камашев Д.Э., Ракитина Т.В., Матюшкина Д.С., Евсютина Д.В., Ванюшкина А.А., Агапова Ю.К., Анисимова В.Е., Дробышев А.Л., Бутенко И.О., Побегуц О.В., Фисунов Г.Ю. Изменение протеомного профиля E. coli при удалении генов, кодирующих гистоноподобный белок HU: по данным дифференциального двумерного гель-электрофореза. // (2019) Биоорганическая химия, T. 45, № 5, стр. 524-533. DOI: https://doi.org/10.1134/S0132342319050026

51. Li S., Waters R. Escherichia coli strains lacking protein HU are UV sensitive due to a role for HU in homologous recombination. // (1998) Journal of Bacteriology, 180, 37503756. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.180.15.3750-3756.1998

52. Ferrandiz M.-J., Carreno D., Ayora S., Adela G de la Campa. HU of Streptococcus pneumoniae Is Essential for the Preservation of DNA Supercoiling. // (2018) Frontiers in Microbiology, 9:493. DOI: https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.00493

53. Phan N.Q., Uebanso T., Shimohata T., Nakahashi M., Mawatari K., Takahashi A. DNA-Binding Protein HU Coordinates Pathogenicity in Vibrio parahaemolyticus. // (2015) Journal of Bacteriology, 197(18):2958-64. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.00306-15

54. Mangan M.W., Lucchini S., O Croinin T., Fitzgerald S., Hinton J.C.D., Dorman C.J. Nucleoid-associated protein HU controls three regulons that coordinate virulence, response to stress and general physiology in Salmonella enterica serovar Typhimurium. // (2011) Microbiology, 157:1075-1087. DOI: https://doi.org/10.1099/mic.0.046359-0

55. Pavla Stojkova, Petra Spidlova, Juraj Lenco, Helena Rehulkova, Lucie Kratka, Jiri Stulik. HU protein is involved in intracellular growth and full virulence of Francisella tularensis. // Virulence, 9(1):754-770. DOI: https://doi.org/10.1080/21505594.2018.1441588

56. Priyadarshini R., Cugini C., Arndt A., Chen T., Tjokro N. O., Goodman S. D. et al. The nucleoid-associated protein HUb affects global gene expression in Porphyromonas gingivalis. // (2013) Microbiology, 159, 219-229. DOI: https://doi.org/10.1099/mic.0.061002-0

57. Conforte V. P., Malamud F., Yaryura P. M., Terrones L. T., Torres P. S., Pino V. D. et al. The histone-like protein HupB influences biofilm formation and virulence in Xanthomonas citri ssp. citri through the regulation of flagellar biosynthesis. // (2018) Molecular Plant Pathology, 20, 589-598. DOI: https://doi.org/10.1111/mpp.12777

58. Guan Z., Wang Y., Gao L., Zhang W., Lu X. Effects of the histone-like protein HU on cellulose degradation and biofilm formation of Cytophaga hutchinsonii. // (2018) Applied Microbiology and Biotechnology, 102, 6593-6611. DOI: https://doi.org/10.1007/s00253-018-9071 -9

59. Hammel M., Amlanjyoti D., Reyes F.E., Chen J.-H., Parpana R., Tang H.Y.H., Larabell C.A., Tainer J.A., Adhya S. HU multimerization shift controls nucleoid compaction. // (2016) Science Advances, 2(7):e1600650. DOI: https://doi.org/10.1126/sciadv.1600650

60. Remesh S.G., Verma S.C., Chen J.-H., Ekman A.A., Larabell C.A., Adhya S., Hammel M. Nucleoid remodeling during environmental adaptation is regulated by HU-dependent DNA bundling. // (2020) Nature Communications, 11(1):2905. DOI: https://doi.org/10.! 038/s41467-020-16724-5

61. White S.W., Appelt K., Wilson K.S., Tanaka I. A protein structural motif that bends DNA. // (1989) Proteins, 5(4):281-8. DOI: https://doi.org/10.1002/prot.340050405

62. Christodoulou E., Vorgias C.E. Cloning, overproduction, purification and crystallization of the DNA binding protein HU from the hyperthermophilic eubacterium Thermotoga maritima.// (1998) Acta Crystallographica Section D: Structural Biology, 1;54(Pt 5):1043-5. DOI: https://doi.org/10.1107/s0907444998000341

63. Ramstein J., Hervouet N., Coste F., Zelwer C., Oberto J., Castaing B. Evidence of a thermal unfolding dimeric intermediate for the Escherichia coli histone-like HU proteins: thermodynamics and structure. // (2003) Journal of Molecular Biology, 331(1): 101-21. DOI: https://doi.org/10.1016/s0022-2836(03)00725-3

64. Guo F., Adhya S. Spiral structure of Escherichia coli HUalphabeta provides foundation for DNA supercoiling. // (2007) Proceedings of the National Academy of Sciences, 104(11):4309-14. DOI: https://doi.org/10.1073/pnas.0611686104

65. Boyko K.M., Rakitina T.V., Korzhenevskiy D.A., Vlaskina A.V., Agapova Y.K., KamashevD.E., Kleymenov S.Y., Popov V.O. Structural basis of the high thermal stability of the histone-like HU protein from the mollicute Spiroplasma melliferum KC3. // (2016) Scientific Reports, 6:36366. DOI: https://doi.org/10.1038/srep36366

66. O'Neil P., Lovell S., Mehzabeen N., Battaile K., Biswas I. Crystal structure of histone-like protein from Streptococcus mutans refined to 1.9 Â resolution. // (2016) Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications, 72(Pt 4):257-62. DOI: https://doi.org/10.1107/S2053230X1600217X

67. Papageorgiou A.C., Adam P.S., Stavros P., Nounesis G., Meijers R., Petratos K., Vorgias C.E. HU histone-like DNA-binding protein from Thermus thermophilus: structural and evolutionary analyses. // (2016) Extremophiles, 20(5):695-709. DOI: https://doi.org/10.1007/s00792-016-0859-1

68. Lee B.-J., Kim D.-H., Im H., Yoon H.-J. Crystal structure of apo nucleoid associated protein, SAV1473, beta-Arm flexibility of HU from Staphylococcus aureus dictates the DNA-binding and recognition mechanism. // (2014) Acta Crystallographica Section D: Structural Biology, 70, 3273-3289 (2014). DOI: https://doi.org/10.2210/pdb4qju/pdb

69. Swinger K.K., Lemberg K.M., Zhang Y., Rice P.A. Flexible DNA bending in HU-DNA cocrystal structures. // (2003) The EMBO Journal, 22(14):3749-60. DOI: https://doi.org/10.1093/emboj/cdg351

70. Mouw K.W., Rice P.A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: Crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. // (2007) Molecular Microbiology, 63, 1319-1330. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.05586.x

71. Vis H., Mariani M., Vorgias C.E., Wilson K.S., Kaptein R., Boelens R. Solution structure of the HU protein from Bacillus stearothermophilus. // (1995) Journal of Molecular Biology, 254(4):692-703. DOI: https://doi.org/10.1006/jmbi.1995.0648

72. Vis H., Boelens R., Mariani M., Stroop R., Vorgias C.E., Wilson K.S., Kaptein R. 1H, 13C, and 15N resonance assignments and secondary structure analysis of the HU protein from Bacillus stearothermophilus using two- and three-dimensional double- and triple-resonance heteronuclear magnetic resonance spectroscopy. // (1994) Biochemistry, 33(49):14858-70. DOI: https://doi.org/10.1021/bi00253a025

73. Tanaka I., Appelt K., Dijk J., White S.W., Wilson K.S. 3-A resolution structure of a protein with histone-like properties in prokaryotes. // (1984) Nature, 310(5976):376-81. DOI: https://doi.org/10.1038/310376a0

74. Durney M.A., Wechselberger R.W., Kalodimos C.G., Kaptein R., Vorgias C.E., Boelens R. An alternate conformation of the hyperthermostable HU protein from Thermotoga maritima has unexpectedly high flexibility. // (2004) FEBS Letters, 563(1-3):49-54. DOI: https://doi.org/10.1016/S0014-5793(04)00247-9

75. Grove A., Lim L. High-affinity DNA binding of HU protein from the hyperthermophile Thermotoga maritima. // (2001) Journal of Molecular Biology, 311(3):491-502. DOI: https://doi.org/10.1006/jmbi.2001.4763

76. Serban D., Arcineigas S.F., Vorgias C.E., Thomas G.J. Jr. Structure and dynamics of the DNA-binding protein HU of B. stearothermophilus investigated by Raman and ultraviolet-resonance Raman spectroscopy. // (2003) Protein Science, 12(4):861-70. DOI: https://doi.org/10.1110/ps.0234103

77. Christodoulou E., Vorgias C.E. The thermostability of DNA-binding protein HU from mesophilic, thermophilic, and extreme thermophilic bacteria. // (2002) Extremophiles, 6(1):21-31. DOI: https://doi.org/10.1007/s007920100235

78. Kawamura S., Abe Y., Ueda T., Masumoto K., Imoto T., Yamasaki N., Kimura M. Investigation of the structural basis for thermostability of DNA-binding protein HU from Bacillus stearothermophilus. // (1998) Journal of Biological Chemistry, 273(32):19982-7. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.273.32.19982

79. Pinson V., Takahashi M., Rouviere-Yaniv J. Differential binding of the Escherichia coli HU, homodimeric forms and heterodimeric form to linear, gapped and cruciform DNA. // (1999) Journal of Molecular Biology, 287(3):485-97. DOI: https://doi.org/10.1006/jmbi.1999.2631

80. Prieto A. I., Kahramanoglou C., Ali R. M., Fraser G. M., Seshasayee A. S. N., Luscombe N. M. Genomic analysis of DNA binding and gene regulation by homologous nucleoid-associated proteins IHF and HU in Escherichia coli K12. // (2012) Nucleic Acids Research, 40, 3524-3537. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkr1236

81. Giangrossi M., Giuliodori A.M., Gualerzi C.O., Pon C.L. Selective expression of the beta-subunit of nucleoid-associated protein HU during cold shock in Escherichia coli. // (2002) Molecular Microbiology, 44(1):205-16. DOI: https://doi.org/10.1046/j.1365-2958.2002.02868.x

82. Claret L., Rouviere-Yaniv J. Variation in HU composition during growth of Escherichia coli: the heterodimer is required for long term survival. // (1997) Journal of Molecular Biology, 273(1):93-104. DOI: https://doi.org/10.1006/jmbi.1997.1310

83. Garnier N., Loth K., Coste F., Augustyniak R., Nadan V., Damblon C., Castaing B. An alternative flexible conformation of the E. coli HUß2 protein: structural, dynamics, and functional aspects. // (2001) European Biophysics Journal, 40(2):117-29. DOI: https://doi.org/10.1007/s00249-010-0630-y

84. Le Meur R., Loth K., Culard F., Castaing B., Landon C. Backbone assignment of the three dimers of HU from Escherichia coli at 293 K: EcHUa2, EcHUß2 and EcHUaß. // (2015) Biomolecular NMR Assignments, 9, 359-363. DOI: https://doi.org/10.1007/s12104-015-9610-6

85. Jaiswal N., Raikwal N., Pandey H., Agarwal N., Arora A., Poluri K.M., Kumar D. NMR elucidation of monomer-dimer transition and conformational heterogeneity in histone-like DNA binding protein of Helicobacter pylori. // (2018) Magnetic Resonance in Chemistry, 56(4):285-299. DOI: https://doi.org/10.1002/mrc.4701

86. Panchal S.C., Bhavesh N.S., Hosur R.V. Improved 3D triple resonance experiments, HNN and HN(C)N, for HN and 15N sequential correlations in (13C, 15N) labeled proteins: application to unfolded proteins. // (2001) Journal of Biomolecular NMR, 20(2):135-47. DOI: https://doi.org/10.1023/a:1011239023422

87. Kumar D., Paul S., Hosur R. V. BEST-HNN and 2D-(HN) NH experiments for rapid

backbone assignment in proteins. // (2010) Journal of Magnetic Resonance, 204, 1731174. DOI: https://doi.org/10.1016/jjmr2010.08.010

88. URL:

http://www.nmr2.buffalo.edu/nesg.wiki/NMR_determined_Rotational_correlation_time

89. Wang G., Lo L.F., Maier R.J. A histone-like protein of Helicobacter pylori protects DNA from stress damage and aids host colonization. // (2012) DNA Repair, 11, 733-740. DOI: https://doi.org/10.1016Zj.dnarep.2012.06.006

90. Fisunov G.Y, Alexeev D.G., Bazaleev N.A., Ladygina V.G., Galyamina M.A., Kondratov I.G., Zhukova N.A., Serebryakova M.V., Demina I.A., Govorun V.M. Core proteome of the minimal cell: comparative proteomics of three mollicute species. // (2011) PLOS ONE, 6, e21964, DOI: https://doi.org/10.1371/journal.pone.0021964

91. Gorbachev A.Y., Fisunov G.Y., Izraelson M., Evsyutina D.V., Mazin P.V., Alexeev D.G., Pobeguts O.V., Gorshkova T.N., Kovalchuk S.I., Kamashev D.E., Govorun V.M. DNA repair in Mycoplasma gallisepticum. // (2013) BMC genomics, 14, 726. DOI: https://doi.org/10.1186/1471-2164-14-726

92. Kamashev D., Oberto J., Serebryakova M., Gorbachev A., Zhukova Y., Levitskii S., Govorun V.M. Mycoplasma gallisepticum produces a histone-like protein that recognizes base mismatches in DNA. // (2011). Biochemistry, 50, 8692-8702. DOI: https://doi.org/10.1021/bi2009097

93. Boyko K., Gorbacheva M., Rakitina T., Korzhenevskiy D., Vanyushkina A., Kamashev D., Lipkin A., Popov V. Expression, purification, crystallization and preliminary X-ray crystallographic analysis of the histone-like HU protein from Spiroplasma melliferum KC3. //(2015) Acta Crystallographica Section F: Structural Biology Communications, 71(Pt 1):24-7. DOI: https://doi.org/10.1107/S2053230X14025333

94. Nikolaeva A.Y., Timofeev V.I., Boiko K.M., Korzhenevskii D.A., Rakitina T.V., Dorovatovskii P.V., Lipkin A.V. Isolation, Purification, Crystallization, and Preliminary X-ray Diffraction Study of the Crystals of HU Proteinfrom M. gallisepticum. // (2015) Crystallography Reports, 60, 880-883. DOI: https://doi.org/10.1134/S1063774515060231

95. Agapova Y.K., Altukhov D.A., Timofeev V.I., Stroylov V.S., Mityanov V.S., Korzhenevskiy D.A., Vlaskina A.V., Smirnova E.V., Bocharov E.V., Rakitina T.V. Structure-based inhibitors targeting the alpha-helical domain of the Spiroplasma

melliferum histone-like HU protein. // (2020) Scientific Reports, 10(1):15128. DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-020-72113-4

96. Studier F.W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. // (2005) Protein Expression and Purification, 41(1):207-34. DOI: https://doi.org/10.1016/j.pep.2005.01.016

97. Phan N.Q., Uebanso T., Shimohata T., Nakahashi M., Mawatari K., Takahashi A. DNA-binding protein HU coordinates pathogenicity in Vibrio parahaemolyticus. // (2015) Journal of Bacteriology, 197, 2958-2964. DOI: https://doi.org/10.1128/JB.00306-15

98. Mouw K.W., Rice P.A. Shaping the Borrelia burgdorferi genome: crystal structure and binding properties of the DNA-bending protein Hbb. // (2007) Molecular Microbiology, 63(5): 1319-30. DOI: https://doi.org/10.1111/j.1365-2958.2007.05586.x

99. Christina, C., Ghosh S., Grove A. Substrate specificity of Helicobacter pylori histone-like HU protein is determined by insufficient stabilization of DNA flexure points. // (2004) Biochemical Journal, 383, 343-351. DOI: https://doi.org/10.1042/BJ20040938

100. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. // (1970) Nature, 227(5259):680-5. DOI: https://doi.org/10.1038/227680a0

101. Sattler M., Schleucher J., Griesinger C. Heteronuclear multidimensional NMR experiments for the structure determination of proteins in solution employing pulsed field gradients. // (1999) Progress in NMR Spectroscopy34 (2) 93-158. DOI: https://doi.org/10.1016/s0079-6565(98)00025-9

102. Masse J.E., Keller R. AutoLink: Automated sequential resonance assignment of biopolymers from NMR data by relative-hypothesis-prioritization-based simulated logic. // (2005) Journal of Magnetic Resonance, 174(1):133-51. DOI: https://doi.org/10.1016/jjmr.2005.01.017

103. Chill J.H., Louis J.M., Baber J.L., Bax A. Measurement of 15N relaxation in the detergent-solubilized tetrameric KcsA potassium channel. // (2006) Journal of Biomolecular NMR, 36(2):123-36. DOI: https://doi.org/10.1007/s10858-006-9071-4

104. Sali A., Blundell T.L. Comparative protein modelling by satisfaction of spatial restraints. // (1993) Journal of Molecular Biology, 234(3):779-815. DOI: https://doi .org/10.1006/jmbi.1993.1626

105. Строганов О.В., Чилов Г.Г., Новиков Ф.Н. и др. // Программа Mutate. 2011.

Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ 2011615051.

106. Emsley P., Lohkamp B., Scott W.G., Cowtan, K. Features and development of Coot. // (2010) Acta Crystallographica Section D: Structural Biology, 66, 486-501. DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444910007493

107. Stroganov O.V., Novikov F.N., Stroylov V.S., Kulkov V., Chilov G.G. Lead finder: An approach to improve accuracy of protein-ligand docking, binding energy estimation, and virtual screening. // (2008) Journal of Chemical Information and Modeling, 48, 23712385. DOI: https://doi.org/10.1021/ci800166p

108. Novikov F.N., Stroylov V.S., Stroganov O.V., Chilov G.G. Improving performance of docking-based virtual screening by structural filtration. // (2010) Journal of Molecular Modeling, 16, 1223-1230. DOI: https://doi.org/10.1007/s00894-009-0633-8

109. O'Boyle N.M., Banck M., James C.A., Morley C., Vandermeersch T., Hutchison G.R. Open Babel: An open chemical toolbox. // (2011) Journal of Cheminformatics, 3:33. DOI: https://doi.org/10.1186/1758-2946-3-33

110. Humphrey W., Dalke A., Schulten K. VMD: Visual molecular dynamics. // (1996) Journal of Molecular Graphics, 14, 33-38 (1996). DOI: https://doi.org10.1016/0263-7855(96)00018-5

111. Laskowski R.A., Swindells M.B.. LigPlot+: Multiple ligand-protein interaction diagrams for drug discovery. // (2011) Journal of Chemical Information and Modeling, 51, 27782786. DOI: https://doi.org/10.1021/ci200227u

112. URL: https://www.schrodinger.com/products/pymol.

113. Chen V.B., Arendall W.B. 3rd, Headd J.J., Keedy D.A., Immormino R.M., Kapral G.J., Murray L.W., Richardson J.S., Richardson D.C. MolProbity: all-atom structure validation for macromolecular crystallography. // (2010) Acta Crystallographica Section D: Structural Biology, 66(Pt 1):12-21. DOI: https://doi.org/10.1107/S0907444909042073

114. Van Der Spoel D., Lindahl E., Hess B., Groenhof G., Mark A.E., Berendsen H.J. GROMACS: Fast, flexible, and free. // (2005) Journal of Computational Chemistry, 26, 1701-1718. DOI: https://doi.org/10.1002/jcc.20291

115. Jorgensen W., Maxwell D., Tirado-Rives, J. Development and Testing of the OPLS AllAtom Force Field on Conformational Energetics and Properties of Organic Liquids. // (1996) Journal of American Chemical Society, 118, 11225-11236. DOI: https://doi.org/10.1021/ja9621760

116. Jorgensen W. L., Tirado-Rives J. Monte Carlo vs molecular dynamics for conformational sampling. // (1996) The Journal of Physical Chemistry, 100, 14508-14513. DOI: https://doi.org/10.1021/jp960880x

117. Dodda L. S., Cabeza de Vaca I., Tirado-Rives J., Jorgensen W.L. LigParGen web server: An automatic OPLS-AA parameter generator for organic ligands. // (2017) Nucleic Acids Research, 45, W331-W336. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gkx312

118. Case D.A., Cheatham T.E. 3rd, Darden T., Gohlke H., Luo R., Merz K.M. Jr, Onufriev A., Simmerling C., Wang B., Woods R.J. The Amber biomolecular simulation programs. // (2005) Journal of Computational Chemistry, 26(16):1668-88. DOI: https://doi.org/10.1002/jcc.20290

119. Garner M.M., Revzin A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. // (1981) Nucleic Acids Research, 9(13):3047-60. DOI: https://doi.org/10.1093/narZ9.13.3047

120. Daragan V.A., Mayo K.H. Motional model analyses of protein and peptide dynamics using 13C and 15N NMR relaxation. // (1997) Progress in Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy, 31, 63-105. DOI: https://doi.org/10.1007/s00249-007-0167-x

121. Robert X., Gouet P. Deciphering key features in protein structures with the new ENDscript server. // (2014) Nucleic Acids Research, 42, W1, W320-W324. DOI: https://doi.org/10.1093/nar/gku316

122. Christodoulou E., Rypniewski W.R., Vorgias C.R. High-resolution X-ray structure of the DNA-binding protein HU from the hyper-thermophilic Thermotoga maritima and the determinants of its thermostability. // (2003). Extremophiles, 7, 111-122. DOI: https://doi.org/10.1007/s00792-002-0302-7. doi:10.3103/S0027131416040027

123. Altukhov D.A., Agapova Y.K., Vlaskina A.V, Korzhenevskiy D.A., Nikolaeva A.Y., Frank-Kamenetskaya A.M., Bocharov E.V., Rakitina T.V. Preparation of the recombinant HU-proteins from S. melliferum and M. gallisepticum and of their complexes with DS-DNA for structural NMR experiments. // (2016) Moscow University Chemistry Bulletin, 71, 221-226. DOI: https://doi.org/10.3103/S0027131416040027

124. McGaughey G.B., Gagne M., Rappe A.K. n-Stacking Interactions Alive and Well in Proteins. // (1998) Journal of Biological Chemistry, 273, 15458. DOI: https://doi.org/10.1074/jbc.273.25.15458