Структура над-зависимой гидрогеназы водородокисляющих бактерий Alcagenes eutrophus Z-1 и кинетические особенности ее действия тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Газарян, Ирина Георгиевна

• Газарян, Ирина Георгиевна
• кандидат химических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат химических наук Газарян, Ирина Георгиевна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА I.Свойства НАД-зависимых гидрогеназ

I.I.Общая характеристика ферментов класса гидро-геназ(КФ I.I2).

1.2.Представления о механизме каталитического действия гидрогеназ

1.3.Исследования по стабильности и кинетике действия гидрогеназ

IЛ.Общая характеристика НАД-зависимых гидрогеназ (КФ 1.12.1.2).

1.5.Схемы выделения высокоочищенных НАД-зависимых гидрогеназ,стабильность ферментов представления d механизме активации

1.6.Кинетические свойства НАД-зависимых гидрогеназ

1.7.Пути возможного практического использования НАД-зависимых гидрогеназ.

ГЛАВА 2.Особенности поведения диссоциирующих ферментных систем.

2.1.Зависимость удельной ферментативной активности от концентрации фермента для равновесия типа 2М=^Д.35"

2.2.Кинетика диссоциации/ассоциации ферментов вызываемая изменением условий.

2.3.Дивсоциирующие ферментные системы типа мономера димер 5^тетрамер(для случая актртвного тетрамера )

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА 3.Материалы и методы

3.1. Материалы.

3.2.Метод ы.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

ГЛАВА 4.Очистка гидрогеназы водородокисляющих бактерий A .tudwjrius. £-1 до гомогенного состояния методом гидрофобной хроматографии.

4.1.Методика очистки.

4.2.Спектральные характеристики гомогенной гидрогеназы.

4.3.Определение молекулярного веса НАД-зависимой гидрогеназы из £-1.

4.4.Субъединичиый состав НАД-зависимой гидрогеназы.

ГЛАВА 5.Определение равновесной и кинетических констант процесса диссоциации гидрогеназы.

ГЛАВА 6.Инактивация гидрогеназы под действием мочевины.

ГЛАВА 7.Кинетические свойства НАД-зависимой гидрогеназы, проявляемые при катализе НАДН-дегидрогеназной реакции.

7.1.Кинетические параметры НАДН-дегидрогеназной реакции.

7.2.Кинетический метод альтернативных субстратов.

7.3.Ингибирование НАДН-дегидрогеназной активности субстратами продуктами и аналогом продукта

ГЛАВА 8.Формальная кинетика реакции восстановления НАД водородом.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура над-зависимой гидрогеназы водородокисляющих бактерий Alcagenes eutrophus Z-1 и кинетические особенности ее действия»

В последнее время в энзимологии все большее внимание уделяется изучению структуры и механизма действия гидрогеназ -ферментов,катализирующих реакцию поглощения или выделения молекулярного водорода.Повышенный интерес к данной группе ферментов во многом обусловлен перспективой их применения в различных областях биотехнологии,в частности,в системах биоконверсии энергии и в тонком органическом синтезе:в электрохимических преобразователях энергии(топливных элементах), системах биофотолиза воды,для синтеза органических соединений из COg и водорода.

Гидрогеназы широко распространены в природе.Особое место среди ферментов данной группы занимают растворимые гидрогеназы водородокисляющих бактерий.В отличие от остальных ферментов данной группы они характеризуются высокой стабильностью к действию кислорода воздуха,а также широкой субстратной специфичностью по отношению к акцептору электронов.Физиологическим субстратом этих гидрогеназ является никотин-амидадениндинуклеотид(НАД),что открывает дополнительные возможности применения гидрогеназ водородокисляющих бактерий в биотехнологии для создания крупномасштабных систем регенерации кофактора.

Наряду с возможностью практического применения НАД-зави-симые гидрогеназы представляют интерес с точки зрения теоретической энзимологии,поскольку их отличает сложная четвертичная структура,наличие нескольких видов простетических групп и способность проявлять несколько типов каталитической активности с широким спектром субстратов.Гидрогеназы водородокисляющих бактерий могут являться удобными модельными объектами для исследования подходов к выяснению механизмов действия и стабилизации подобного рода сложных ферментных структур.Наличие внутримолекулярной электрон-транспортной цепи позволяет считать их моделью полиферментных систем,об-единенных в одном олигомерном ферменте.

Решение важных практических задач,связанных с возможным использованием НАД-зависимых гидрогеназ,в частности,создание технологического катализатора на основе гидрогеназы,невозможно без всестороннего исследования ее физико-химических свойств и механизма действия.

Разработанные к настоящему времени методы выделения препаратов гомогенных гндрогеназ представляют собой трудоемкие процессы,приводящие к низким выходам активного фермента.

Б литературе полностью отсутствуют сведения о влиянии четвертичной структуры НАД-зависимой гидрогеназы на ее стабильность,не проводилось систематического изучения ее кинетических свойств.

Целью настоящего исследования являлись:разработка простого и эффективного метода выделения и очистки НАД-зависимой гидрогеназы водородокисляющих бактерий MuUigints штамм £-1,изучение четвертичной структуры фермента и ее связи с каталитической активностью,а также выяснение кинетических закономерностей протекания различных реакций,катализируемых ЙАД-зависимой гидрогеназой.

0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1.Свойт1сва НАД-зависимых гидрогеназ.

I.I.Общая характеристика ферментов группы гидрогеназ (КФ I.I2).

Термин "гидрогеназа" был предложен в 1931 году Стефенсоном и Стиклендом £i] для фермента,обуславливающего способность клеток oo&i поглощать водород.В настоящее время гидрогеназы обнаружены у многих микроорганизмов.Только среди хемотрофных бактерий известно до 35 родов,представители которых обладают гидрогеназной активностью.Гидрогеназную активность проявляют некоторые эвгленовые микроводоросли,отдельные виды морских форм зеленых,бурых и красных водорослей.Имеются сообщения о наличии гидрогеназной активности у лишайников,некоторых простейших и даже у эмбрионов лягушки \2 - 5j| .

Гидрогеназы играют важную роль в метаболизме многих видов микроорганизмов.Они участвуют в энергообеспечении клетки,поддержании рН внутриклеточной среды на благоприятном для жизнедеятельности уровне,в процессах метаногенеза,азотфиксации и др. [2 - i] .

Гидрогеназы локализованы в различных частях клетки:мембра-не,цитоплазме,периплазме.Локализация фермента определяет лишь некоторые из его свойств,тем не менее в литературе утвердилось деление гидрогеназ на растворимые и мембраносвязанные. Более строгой является классификация гидрогеназ на основе субстратной специфичности(по природному донору/акцептору элект~ ронов).Так,различают цитохром Сз-,НАД-,флаводоксин- и ферре-доксин-зависимые гидрогеназы.Следует отметить при этом,что практически все гидрогеназы взаимодействуют с целым рядом искусственных субстратов - метилвиологеном,бензилвиологеном, феррицианидом,2,б-дихлошенолиндофенолом(ДХФИФ),метиленовой синьюх) и др.

Способность гидрогеназ образовывать прочные комплексы с другими ферментами и белками,а также крайняя их лабильность и чувствительность к присутствию кислорода приводят к большим трудностям в получении гомогенных препаратов.Число работ,выполненных на гомогенных препаратах гидрогеназ, тем не менее,увеличивается с каждым годом.Основой большинства методов очистки гидрогеназ является ионообменная хроматография,однако,в работе использована биоспецифическая хроматография для очистки гидрогеназы из JL'pul^so,

XoStojXA- fr t< n-a— .

В таблице I представлены основные характеристики гомогенных гидрогеназ.Как следует из приведенных в табл.1 данных, молекулярный вес и субъединичный состав гидрогеназ из различных источников изменяются в достаточно широких пределах. В большинстве случаев,гидрогеназы имеют сложную четвертичную структуру,характер организации которой оказывает решающее влияние на свойства фермента.

По мнению Чена и Мортенсона к общемв свойству гидрогеназ можно отнести близость молекулярного веса ферментов к 60000 или наличие субъединицы с молекулярным весом,близким к 60000.Главным и общим свойством для всех гидрогеназ является присутствие в молекуле железо-серных кластеров типа Ре^Д^ {9 - 2?J .Чисйо таких кластеров у гидрогеназ из Uovt-liciiил*, 'алъилл, составляет 3 [9 - IlJ,столько же у vittAo ffrM [l2 - 15J и 9>ittUfwi'iM о irutyxAtSl6,I7j ;y 3. vntfaMs (из мембраны) [l8,I9] - 2;по одному х^активность с метиленовой синью ранее использовали для сопоставления каталитической эффективности гидрогеназ.

ТАБЛЙЦА I.Свойства очищенных гидрогеназ

Фотосинтетические бактерии

1. Локализация

2. Физиологическая роль

3. Природный субстрат

4. Чувствительность к кислороду при хранении в условиях реакции

5. Выход(мг/ЮОг сухого веса)

6. Молекулярный вес,тыс,

7. Субъединицы,молекулярный вес,тыс.

8. Отношение числа атомов железа и серы в молекуле

Ре: £

9. Другие простетические группы

10.<f280= ^4-СХГ

11. Изоэлектрическая точка мембраны,цитоплазма мембраны поглощение цитохром С^С?) отн.стабильна чувствительна

68

25,27 4:4

4.2

12. Удельная активность по выделению водорода из восстановленного метил-виологена(в скобках концентрация субстрата)

13. Субстраты

5(1мМ) метилвиологен бензилвиологен

Характеристики :ЗПР-спектров окисл. восст. поглощение Н2 неизвестен стабильна чувствительна

13,3 98(?)

50x2 флавин(?) 96 14

4,2;4,4

I,9(5мМ) метилвиологен бензилвиологен метиленовая синь ФМН П Продолжение Таблицы I.

• № : пп: Фотосинтетические ftkoctoSf^' V tti WWs ил&иилч, Аэробные водородокисляющие

I. мембраны цитоплазма мембраны

2. поглощение поглощение Н2 поглощение Н2

3. неизвестен НАД хиноны(?)

4. отн.стабильна чувствительна стабильна нечувствительна стабильна чувствительна

5. 2,4 8,0

6. бб 205 98

7. бб 68,60,29x2 67,31

8. 4:4 12:12 6:6

9. - ФМН

10. 36 250 122

II. 8,3 69(420 нм) 30(408 ;

II. 5,3 4,85 6,5

12. 33х) 48(2,4 мМ)

13.

14. метилвиологен бензилвиологен дихлорфенолиндофенол цитохром С^,ФМН феррицианид

Их метилвиологен бензилвиологен дихлорфенол-индофенол,ФМН феррицианид,ФАД цитохром С*,НАД менахинон,убихинон метиленовая синь слаб. £=2,02 выс.темп. 9=2,04;1,95 низ.темп. ^=2,00;1,95 1,93;1,8б 2,04 метиленовая синь менадион феррицианид

Продолжение Таблицы I. jjb- : Факультативные анаэробы Анаэробные пп1 ЗиЛил^'с^иа, ooltPlottuA YHiiJiMitis ttotfu'cliuM* ри^Лииисупипь

1.

2.

3.

4.

5.

6.

7.

8.

9.

10.

11.

12.

13.

14. мембраны выделение Hg неизвестен чувствительна чувствительна

1.1

ИЗ 56x2 12:12

140 49

4.2

I36x) метилвиологен бензилвиологен метиленовая синь феррицианид сложи.^>2 мембраны выделение Е^ неизвестен цитоплазма выделение Е^ ферредоксин-(флаводоксин) нечувствительна очень чувствительна очень чувствительна

1,6

205

63x2,33x2 24:24

390 106 4,75 метилвиологен бензилвиологен

13,6(сух.клетки) 60 60 12:12

66 37 5,0

4000х) метилвиологен бензилвиологен метиленовая синь метиленовая синь ферредоксин fo[t/> ,g>2 слонн.<?=2,079 (1 1,961

1,842

Продолжение Таблицы I. пп

1.

2. 3.

5.

6.

7.

8.

9.

10,

11,

12, 13,

14, Анаэробные бактерии vula^uS $ ivuZj-ovit^o

AtQCLtfiI&LMl lltcUh-Ci мембраны поглощение H. цитохром С? отн.стабильна отн.стабильна

89

59,28 8:8

164

47

6,2

90х) цитохром С^ метилвиологен периплазма поглощение Hg цитохром С^ отн.стабильна отн.стабильна

9,1

50

50

12:12

128 46

104000х) цитохром С7 периплазма цитоплазма поглощение выделение Е^ цитохром С* -ферредоксин (флаводоксин) чувствительна чувствительна чувствительна чувствительна

27,5 89 62,26 12:12

170 47

91 (ЗД) цитохром С;

6,4 50 50 12:12

143(275 нм) 46

8400х) метилвиологен метилвиологен бензилвиологен бензилвиологен

ФМН типа tyip типа

8Ре типа ферредоксина х) максимальная скорость реакции выделения водорода из восстановленного метилвиологена. кластеру у ферментов ия I .ъокормлпЫпь^20J ib'Mw*. xiaAsvu*u, ^23J , U^v^oMu-r^

Соединения,образующие комплексы с кластерным нелезом -МО, сЛ, 4/-дипиридил;с>-фенантролин - а также реагенты,модифицирующие $Н-группы(иодацетат,л-хлормеркурийбензоат) подавляют гидрогеназную активность [28].СО является обратимым ингибитором по отношению к водороду £29-33] .Для ряда очищенных гидрогеназ показано,что молекула гидрогеназы присоединяет I молекулу СО.Для гидрогеназы из CUa^dcMonAS ъикбдксШ [3i^J было показано,что СО защищает молекулу фермента от инактивации кислородом.Однако,СО не является ингибитором гидрогеназы из Jtc&l<cjt4ie* tuX'xojsMfS. HI б [35] и ее связывание не влияет на ЭПР-спектр',Совокупность вышеприведенных данных свидетельствует о существенной роли железо-серного кластера в механизме каталитического действия гидрогеназ.

По последним сообщениям [зб - 44]у целого ряда гидрогеназ обнаружен атом никеля.Показано,что никель играет важную роль в осуществлении гидрогена зной активности у чли'и^ггЗ} tpftHSr- , tkMwourfoUcpkiCUfajC.viMSltb^ 44J .

Имеются частные сообщения о присутствии атома никеля в гид-рогеназах из и Ж.емХкярки* .Однако,в литературе отсутствуют строгие доказательства участия атома никеля в электрон-транспортной цепи гидрогеназы.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Газарян, Ирина Георгиевна

ВЫВОДЫ

1.Разработан метод препаративного выделения гомогенной НАД-зависимой гидрогеназы водородокислящих бактерий л&лЬ^хм шЯлор-Ьиь £-1.Показано,что фермент имеет сложную четвертичную структуру,состоящую из четырех суб-единиц с молекулярными весами 65,5 - 1,1;54,5 - 0,2; 29,4 i 0,6 и 26 ± 2 килодальтон.

2.Установлено,что гидрогеназа обратимо диссоциирует при разбавлении растворов фермента на "гетеродимеры" с молекулярным весом около 90000.Показано,что гидрогеназной активностью обладает только нативный тетрамер гидрогеназы, а "гетеродимеры" сохраняют способность катализировать НАДН-дегидрогеназную реакцию.Определены термодинамические и кинетические параметры процесса диссоциации,показано, что кофакторы и субстраты являются эффекторами равновесия диссоциации гидрогеназы.

3.Показано,что под действием 2 М мочевины происходит диссоциация гидрогеназы на олигомерные и субъединичные фрагменты; фрагмент гидрогеназы с молекулярным весом около 60000 катализирует НАДН-дегидрогеназную реакцию с одно-электронными акцепторами типа метилвиологена.

4.Изучены кинетические закономерности протекания гидрогеназной и НАДН-дегидрогеназной реакций,катализируемых ферментом. Установлено, что все катализируемые ферментом реакции описываются формальным кинетическим механизмом типа пинг/понг,определены кинетические параметры реакций.

5.Кинетическим методом альтернативных субстратов и на основании экспериментов по диссоциации фермента в 2 М мочевине показано существование в молекуле гидрогеназы пространственно разобщенных центров связывания одно- и двух- электронных субстратов.

6.На основании результатов ингибиторного анализа НДЦН-де-гидрогеназной активности фермента высказано предположение о наличии в молекуле гидрогеназы дополнительного центра связывания адениндинуклеотидов,имеющего,по-види-мому,регуляторный характер.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Газарян, Ирина Георгиевна, 1984 год

1. Stephenson H.,Stickland L.H.Hydrogenase: a bacterial enzyme activating molecular hydrogen.I.The properties of the enzyme. Biochem. J., 1931,v.25,111,p.205-212.

2. Гоготов И.Н.Гидрогеназы микроорганизмов. Успехи микробиол.,1979,т.14,№ I,с.3-25.

3. Кондратьева Е.Н.,Гоготов И.Н.Молекулярный водород в метаболизме микроррганизмов.М.,Наука,1981,с.146-208.

4. Adams M.W.W.,Mortenson L.E.,Chen J.-S.Hydrogenase. -Biochim.Biophys.Acta,1980,v.594,N 1,p.105-175.5.0щепков В.П.Драсновский А.А.Фотообразование молекулярного водорода.-Изв.АН СССР,сер.биол.,т.I,с.87-100.

5. De Bont J.A.M.Hydrogenase activity in nitrogen-fixing methaneoxidizing bacteria. Antonie van Leevenhoek, 1976,v.42,IT 1,p.255-262.

6. В.Зорин Н.А.,Гоготов И.Н.Стабильность гидрогеназы из пурпурной бактерии Ч^ьоясрт^иш. -Биохимия, 1982,т.47,N5,с.827-833.

7. Multani J.S.,Mortenson L.E.Circular dichroism spectra of hydrogenase from Clostridium pasteurianum W5. -Biochim.Biophys.Acta,1972,v.256,П 1,p.66-70.

8. Chen J.-S.,Blanchard D.K.Isolation and properties of a unidirectional Hg-oxidizing hydrogenase from the stric-ly anaerobic Up-fixing bacterium Clostridium pasteurianuin W5. Biochem.Biophys.Res.Cominmun., 1978,v.84fN 4,p.1145-1150.

9. Chen J.-S.,Mortenson L.E.Purification and properties of hydrogenase from Clostridium pasteurianum W5. -Biochim.Biophys.Acta,1974,v.37,H 1,p.283-289.

10. Bell G.R.,Lee J.-P.,Peck H.D.,Le Gall J.Reactivity of Desulfovibrio gigas hydrogenase towards artificial and natural electron donors and acceptors. Biochemie, 1978,v.60,N 1,p.315-320.

11. Bell G.R.,Le Gall J.,Peck H.D.Evidence for the periplasmic location of hydrogenase in Desulfovibrio gigas. -J.Bacteriol.,1974,v.20,К 3,p.994-999.

12. Уап der V/esten H,K.,Mayhew S.G.,Veeger C.Separation of hydrogenase from intact cells of Desulfovibrio vulgaris. Purification and properties.-FEBS Lett1978,v.86,N 1, p.122-124.

13. Hashke R.H.,Campbell L.L.Purification and properties of the hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris. J. Bacteriol., 1971,v. 105,1* 1,p.249-256.

14. Yagi T.Solubilization,purification and properties of particulate hydrogenase from Desulfovibrio vulgaris. -J.Biochem.,1970,v.68,U 3,p.649-656.

15. Yagi T.,Kimura K.,Daidoji H.,Sakai F.,^amuri S.,Inofeu-chi H.Properties of purified hydrogenase from the particulate fraction, of Besulfovibrio vulgaris, Lliyazalci. J.Biochem.,1976,v.793,p.661-671.

16. Серебрякова Н.Г.,Зорин Н.А.,Гоготов И.H.Очистка и свойства связанной с хроматофорами гидрогеназы фототрофной бактерии Т.loxfipMitfM. Биохимия, 1977,т.42,№ 4,с.740-745.

17. Гоготов И.Н.,Зорин Н.А.,Кондратьева Е.Н.Очистка и свойства гидрогеназы Ткос&^мь -г^я^б^ь'сг^ь. . Биохимия, 1976,т.41,№ 5,с.836-842.

18. Hiura H.,Kakuno Т., Yamash.it a J.,Bartsch R.G.,Horio Т. Extracellular hydrogenase from photosynthetic bacterium Rhmdospirillium rubrum. J.Biochem., 1979, v.86,IT 5,p.1151-1153.

19. Adams M.V/.V/. ,Hall D.O.Physical and catalytic properties of the hydrogenase of Rhodospirillium rubrum. In:Hyd-rogenases:Their catalytic activity,structure and function, /ed .H.G.Schlegel,K.Schneider.Gottingen,Goltze E.,1978,p.159-164.

20. Adams M.W.W.,Hall D.O.Properties of the solubilizied membrane-bound hydrogenase from the photosynthetic bacterium Rhodospirillium rubrum. Arch.Biochem.Biophys.,1979,v.195,H 2,p.288-299.

21. Gitlitz P.H.,Krasna A.I.Structural and catalytical properties of hydrogenase from Chromatium. Biochemistry, 1975,v.14,IT 2,2561-2568.

22. Strekas T.,Antanaitis B.C.,Krasna A.I.Characterization and stability of hydrogenase from Chromatium. Biochim. Biophys .Acta, 1980, v. 116,IT 1, p. 1-6.

23. Feigenblum E.,Krasna A.I.Solubilization and properties of the hydrogenase of Chromatium. Biochim.Biophys. Acta,1970,v.198,N 1,157-162.

24. Yagi I.,Honya M.,Tamiya IT. Purification and properties of hydrogenases of different origin. Biochim.Biophys. Acta,1968,v.153,N 2,p.699-706.

25. Hallenbeck P.С.,Benemarm I.R.Characterization and partial purification of the reversibl® hydrogenase of Anabaenacylindrica. FEBS Lett1978,v.94,N 1,p.261-264.

26. Llama Ы.J.,Serra J.L.,Rao К.K.,Hall D.O.Isolation and characterization of the hydrogenase activity from the nonheterocystous cyanobactei,ium Spirulins. maximarFEBS Lett.,1979,v.98,Ы 2,342-346.

27. Van der Werf A.IT.,Yates M.G.Hydrogenase from nitorgen-fixing Azotobacter chroococcum. In:Hydrogenases:Their structure,catalytic activity and function./Ed,H.G. Schlegel,IC.Schneider.Gottingen,Goltze E., 1978,p.307-326.

28. Puree L.,Krasna A.I.,Rittehberg D.The inhibition of hydrigenase by carbon monoxide and the reversal of this inhibition by light. Biochemis£ryTv.1,N 1,p.270-276.

29. Adams M.W.W.,Hall D.O.Purification of membrane-boundhydrogenase of Escherichia coli. Biochem.J.,1979,v.183, IT 1,p.11-22.

30. Erbes D.L.,King D.,Gibbs M.Inactivation of hydrogenase in cell-free extracts and whole cells of Chlamidomonas reinhardii by oxygen. Plant.Physiol.,1979,v.63,IT 5, p.1138-1142,

31. Schneider K.,Cammack R.,Schlegel H.G.,Hall D.O.The iron-sulfur centres of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophys. Biochim.Biophys.Acta,1979,v.578,U 2,p.445

32. Зб.ТаЫНоп R.,Weber F.,Kaltwasser H.Nickel requirement for chemolithotrophic growth in hydrogen-oxidizing bacteria. -Arch.Microbiol.,1980,v.124,N 1,p.131-135.

33. Unden G.,Bocher K.,Knecht J.,Kroger A.Hydrogenase from Yibrio succinogenes,a nickel protein. FEBS Lett.,1982, v.145,N 2,p.230-234.

34. Abbracht S.P.I.,Graf E.-G.,Thauer R.K.The EER properties of nickel in hydrogenase from Methanobacterium thermoauto-trophicum. FEBS Lett.,1982,v.140,N 2,p.311-313.39«Moura I.I.G.,Moura I.,Haynh B.H.,Kruger H.-I.,Tiexeira M.,

35. Du Yarney R.C.,Der Yartanian D.Y.,Xavier A.V.,Peck H.O.,

36. Gall I.Unambiguous identification of the nickel EPR 61signal in Ni-enriched Desulfovibrio gigas hydrigenase. Biochem.Biophys.Res.Gommun.,1982,v.108,lT 4,p.1388-1393.

37. Graf E.-G.,Thauer R.K.Hydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum,a nickel-containing enzyme. FEBS Lett.,1981,v.136,N 1,p.165-169.

38. Albracht P.S.J.,Kalkman M.L.,Slater E.C.Magnetic interaction of nickel(III> and the iron-sulfur cluster in hydrogenase from Chromatium vinosum. 3iochim.3iophys.Acta, 1983,v.724,N 2,p.304-316.

39. Teixeira M.,Moura I.,Xavier A.Y.,Der Vartanian D.Y.,Le Gall J.,Peck H.D.,Huynh B.H.,Moura I.I.G.Desulfovibrio gigas hydrogenase:redox properties of the nickel and iron-sulfur centers. Eur.J.Biochem.,v.130,H 2,p.481-484.

40. Kruger H.-J.,Huynh В.H.,Ljungdahl P.0.,Xavier A.Y.,Der

41. Krasna A.I.,Rittenberg D.Action of the enzyme hydrogenase.- Proc.Natl.Acad.Sci USA,1954,v.40,N 1,p.225-226. 47«Tamija N.,Miller S.L.Kinetic studies on hydrogenase.

42. Докл.АН СССР, 1975,т.220,Ш 1,с.237-239.

43. Тоай Ч.Д.,Варфоломеев С.Д.,Гоготов И.Н.,Березин И.В.Кинетические закономерности инактивации бактериальных гидрогеназ. Молек.биол. ,1976,т.10,№ 2,с.452-459.

44. Nakos G.,Mortenson L.E.Structural properties of yhdroge-nase from Clostridium pasteurianum. Biochemistry,1971,v.10,N 13,p.2442-2449.

45. Klibanov A.M.,Kaplan IT.0.,Kamen M.D.A rationale for stabilization. of oxygen-labile enzymes:Application to a clostridial hydrogenase. Proc.Ifatl.Acad.Sci USA,1978,v.75,1. Я 8,p.3640-3643.

46. Kakuno T.,Hiura H.,Tamashita J.,Bartsh R.G.,Horio T.Complete stabilization of water-soluble hydrogenase from

47. RhodospiriIlium rubrum under air atmosphere with high concentration of chloride ions. J.Biochem.,1978,v.84,U 6, p.1649-1651.

48. Klibanov A.M.,Kaplan IT. 0., Kamen M.D.Chelating agents protect hydrogenase against oxygen inactivation. Biochim.

49. Biophys.Acta,1979,v.547,H 2,p.411-416.

50. Henry L.E.,Adams M.W.W.,Kao K.K.,Hall D.O.The effect of oxygen species on the enzymatic activity of hydrogenase. №BS Lett .,1980,v.122,IT 2,p.211-214.

51. Sadana J.C.,Morey A.V.Purification and properties of t he hydrogenase of Desulfovibrio desulfuricans. Biochim.Biophys.Acta, 1961 ,v.50,H 1,p.153-158.

52. Glick В.R., Martin W.G., Mar tin S.M.Purification and properties of the periplasmic hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans. Can.J.Microbiol.,1980,v.265,N 6, p.1214-1223.

53. Sadana J.C.,Jagannathan V.Purification and properties of the hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans. -Biochim.Biophys.Acta,1956,v.192,p.440-448.

54. Erbes D.L.,Burris R.H.The kinetics of methyl viologen oxidation and reduction of the hydrogenase from Clostridium pasteurianum. Biochim.Biophys.Acta,1978,v.525, U 1,p.45-54.

55. Карякин А.А.,Ярополов А.И.Кинетика реакции окисления водорода метилвиологеном с участием гидрогеназы из -муэмь WH^fWritinAt- в сб:Тезисы докладов Всесоюзной конференции "Фотокаталитическое преобразование солнечной энергии".Нов осибирск,1983,с.26-27.

56. Варфоломеев С.Д.,Гоготов И.Н.,Тоай Ч.Д.,Бачурин С.О.Ис-следование стационарной кинетики катализа гидрогеназой из ^.ъоыръъъшми. Молек.биол.,1978,т.12,№ I,с.63-69.

57. Schneider K.,Schlegel H.G.Purification and properties of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H16. Biochim.Biophys.Acta,1976,v.452,Ж 1,p.66-80.-136*

58. Schink B.,Schlegel H.G.The membrane-bound hydrogenase of Alcaligenes eutrophus.I.Solubilization,purification and biochemical properties. Biochim.Biophys.Acta,1979, v.567,N 2,p.315-324.

59. Aggag M.,Schlegel H.G.Studies on a gram-positive bacterium Nocardia opaca 1b.III.Purification,stability and some properties of the soluble hydrogen dehydrogenase. Arch.Microbiol., 1974,v. 100,IT 1,p.25-39.

60. Пинчукова E.E.Растворимая гидрогеназа водородной бактерии JUaUtfbyiM tufrwjthus Канд.дисс.М.,1979.

61. Пинчукова E.E.,Варфоломеев С.Д.,Кондратьева Е.Н.Выделение очистка и исследование стабильности растворимой гидрогеназы из k.uutHafhut'^1* Биохимия,1979,т.№ 4,с.605-615.

62. Пинчукова Е.Е.,Варфоломеев С.Д.,Березин И.В.Кислород -стабилизатор гидрогеназы водородной бактерии

63. ЫЯм/Жщ. Докл.АН СССР,1977,т.236,№ 5,с.1253-1255.

64. Egerer P.,Gunther Н.,Simon H.On the hydrogen-deuterium exchange reaction catalyzed by the soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H16 in the free and immobilized state. Biochim.Biophys.Acta,1982,v.703,IT 1,p. 149-157.

65. Egerer P.,Simon H.Isotopic and kinetic studies and influence of dicoumarol on the soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H16. Biochim.Biophys.Acta,1982, v.703,IT 1,p.158-170.

66. Schleicher E.,Simon H.The stereochemical course of the hydrogen transfer to NAD,catalyzed by bacterial glucose dehydrogenase and hydrogenase of Alcaligenes eutrophus H16. PEBS Lett.,1977,v.74,H 2,p.269-271.

67. Легасов В.А.Водородная энергетика. Природа,1977,т.3, ?M,c.3-37.

68. Егоров A.M.,Платоненкова Л.С.,Егорова О.А.,Березин И.В. Микробные ферменты систем окисления метанола для регенерации кофактора и получения водорода. В кн:Микробиоло-гия(Итоги науки и техники,ВИНИТИ АН СССР).М.,1979,т.9, с.134-169.

69. Попов В.0.,3акс A.M.,Рехарский,М.В.,Егоров А.М.,Гоготов И.Н.,Зорин Н.А.Получение водорода из формиата при помощи мультиферментных систем. Прикл.биохимия и микробиол., 1982,т.18,й 4,с.499-507.

70. Рехарский М.В.Термохимическое исследование некоторых ферментативных реакций с участием никотинамидаденинди-нуклеотида(НАД).Канд.дисс.,М.,1982.

71. Sgorov A.M.,Avilova T.V.,Dikov M.M.,Popov V.O.,Rodionov Y.V.,Berezin I.V.NAD-dependent formate dehydrogenase from methylоtrophic bacterium strain 1. Eur.J.Biochem.,1979,v.99,Ы 3,p.569-578.

72. Jhojyhus, .-Прикл.биохим.микробиол.,1981,т.17(4),545-554,

73. Кирстайн Д.,Шеллер Ф.,Шуберт Ф.Регенерация пиридиннук-леотидных кофакторов. Прикл.биохим.микробил.,1982, т.18,№ 4,с.471-480.

74. Tischer W.,Tiemeyer W.,Simon H.Stereospecific hydrogena-tion with immobilized microbial cells or enzymes. Biochemie, 1980,v.62,1" 2,p.331-339.

75. Krasna A.I.Hydrogenase:properties and application. Enz. Microbiol.Technol., 1979, v.1,IT 1,p.165-172.

76. Kremmer T.,Boross L.Gel-chromatography.Theory,methodology, application.Budapest,Acad.Kiado,1979,p.195-197.

77. Bot G.,Gergely P.Formation of tetramer phosphorilase A in vivo. FEBS Lett.,1972,v.24,N 1,p.7-12.

78. Metzger B.E.,Glazer L.,Helmreich E.Purification and properties of frog skeletal muscle phosphorilase. Biochemistry, 1968, v.7,IT 1,p.2021-2028.

79. Metzger B.,Helmreich E.,Glaser L.Mechanism of activation of skeletal muscle phophorilase A by glycogen. Proc. Uatl.Acad.Sci USA, 1967,v.57,IT 4,p.994-999.

80. Le John H.B.,McCrea B.E.,Suzuki I.,Jackson S.Association-dissociation reactions of mitochondrial isocitric dehyd-rigenase induced by protons and various ligands. J.Biol. Chem.,1969,v.244,N 9,p.2484-2489.

81. Halford S.E.,Schlezinger M.J.,Gutfreund H.Escherichia coli alcaline phophatase kinetic studies with the tetrameric enzyme. Biochem.J.,1972,v.126,IT 4,p.1081-1089.

82. Zimmermann G.,Wenzel IC.-W.,Gauer J.,Hofmann E.Association behavior of human erythrocyte phosphofructokinase. Eur.J.Biochem., 1973,v.40,IT 2,p.501-506.

83. Курганов Б.И.Кинетический расчет константы ассоциации белковой молекулы.-Молек.биол.,1967,т.1,№ I,с.17-23.

84. Bernfeld P.,Bernfeld Н.С.,Nisselbaum J.S.,Fishman W.H. Dissociation and activation of ^-glucuronidase. J. Am.Chem.Soc.,1954,v.76,N 19,p.4872-4877.

85. Силонова Т.В.,Курганов Б.И.Исследование ассоциации фосфорилазы Б из мыщц кролика кинетическим методом. Молек. биол.,1970,т.4,№ 2,с.445-449.

86. Курганов Б.И.Аллостерические ферменты.М.,Наука,1978, . с.132-133. •

87. Feldberg R.S.,Datta P.«£-threonindehydrotase ox Rhodo-spirilliurn rub rum. Purification ana characterization. -Eur.J.Biochem.,1971,v.212,p.447-454.

88. Курганов Б.И.Кинетика процессов диссоциации-ассоциации аллостерических ферментов.1.Ферментные системы типа2р£Р.-Бпоорг.химия,1977,т.3,№ 3,с.681-689.

89. Wrigley H.G.,Heather J.V.,Bonsignore A.,de Flora A. Human erythrocyte glucose-6-phosphate dehydrogenase. Electron microscope studies on structure and intercon-version of tetramers,dimers and monomers. J.Liol.Biol., 1972,v.68,11 2,p.483-437.

90. Umezurike G.M.Subunit structure of ^-glucosidase from. Botrydiplodia theobromae. Biochem.J.,1975,v.145,11 2, p.361-363.

91. Adamson E.D.,Ayers S.E.,Denssen Z.A.,Graham С.P.Analysis of the forms of acetylcholinesterase from adult mouse brain. Biochem.J.,1975,v.147,И" 1,p.205-208. .

92. Курганов Б.И.,Яковлев В.А.Кинетический анализ диссоциирующих ферментных систем типа- мономер^димер^ тетрамер.- Молек.биол.,1973,т.72,с.429-437.

93. Hoagland V.D.,'Teller D.С.Influence of substrates on the dissociation of rabbit muscle D-glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase. Biochemistry,1969,v.8,1 2,p.594--599.

94. BraafordM.M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protean utilizing the principle of protein-dye binding. Analyt.Biochem., 1976,v.34,N 1,p.72-74.

95. Spector T.Refinement of the Goomassie blue method of protein quantitation. Analyt.Biochem.,1978,v.36,IT 1, p.142-144.

96. Peshek G.A.Evidence for two functionally distinct hydrogenases in Anacytis nidulans. Arch.Microbiol.,1979, v.123,N 1,p.81-92.

97. Polyacrylamide gel electrophoresis.Laboratory techniques, Pharmacia Pine Chemicals,Kahms i Lund,1980,p.26.

98. Calibration kite for molecular weight determination using electrophoresis.Pharmacia Pine Chemicals,1980.115.baemmli U.K.Cleavage of protein structure during the assembly of the head of bacteriophage T4. ITature, v.222,IT 5212,p.680-684.

99. Margolis S .A. ,Plowell B.P.,Shaffen R. Purification and analysis of the purity ITADH. Clin.Chem.,1976,v.22, N 7,p.1322-1329.

100. Попов В.0.Изучение структуры и механизма действия бактериальной формиатдегидрогеназы.Канд.дисс.,М.,1978.

101. Schneider K.,Schlegel H.G.Identification and quantitative determination of the flavin component of the soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. Biochim. Biophys.Acta,1978,v.84,N 3,p.564-571.

102. Singer T.P.Plavoprotein dehydrogenases of electron-transport chain.In:The Enzymes,2nd ed./Ed.Boyer P.D. U.-Y.,Acad.Press,1963,v.7,p.345-412.

103. Singer T.P.,Gutman M.The DPNH-dehydrogenase of the mitochondrial respiratory chain. Adv.Enzymol.,1971,v.34, p.79-153.

104. Hatefi Y.,Stiggal D.L.Metal-containing flavoprotein dehydrogenases. In:The Enzymes,3nd ed./Ed.Boyer P.D., IT.-Y., Acad.Press, 1976, v. 13, p. 175-295.

105. Ghisla S.,Mayhew S.G.Identification and structure of a novel flavin prosthetic group,associated with NADH-de-hydrogenase from Peptostreptococcus elsdenii. J.-^iol. Chem.,1973,v.248,H 17,p.6568-6574.

106. Whitfield C.D.,Mayhew S.G.Evidence that apo-reduced ni-cotinamideadenin dinucleotide dehydrogenase and apo-electron transferring fla/voprotein from Peptostreptococ-cus elsdenii are identical. J.Biol.Chem.,1974,v.249,1. 8,p.2811-2817.

107. Hochtein L.I.,Dalton B.P.Studies of halophilic ITADH-de-hydrogenase.I.Purification and properties of the enzyme. Biochim.Biophys.Acta, 1973,v.302,1T1,p.216-221.

108. Jinks D.C.,Matz L.Z.Purification of the ITADH-dehydro-- genase of Alholeplasma laidlawii. Biochim.Biophys.

109. Acta, 1976, v.452,IT 1,p.30-37. 129.Imagawa T.,Nakamura T.Properties and kinetics of salt activation of a membrane-bound ITADH-dehydrogenase from marine bacterium Photobacterium phophoreum. J.Biochem., 1978,v.84,N 2,p.547-553.

110. Жукова И.Г.Даратьян Е.Ф.,Островский Д.Н.Белки бактериальных мембран.Свойства НАДН-дегидрогеназы из Mittotoc-tus .-Биохимия,1979,т.44,№ 5,с.8II-8I5.

111. Barthliolmes P.,Durchschlag H.,Jaenicke R.Molecular pro-vperties of lactic dehydrogenase under the conditions of the enzymatic test.Sedimentation analysis and gel-filtration in the microgram and nanogram range. Eur.J.

112. Biochem.,1973,v.39,H 1,p.101-108.

113. Colowick S.P.,Kaplan И.О.Enzyme kinetics and mechanism. Part A. InsMetbods in Enzymology./Ed.D.L.Purich,N.-Y., Acad.Press,1979,v.63,p.502-503.

114. Пикчукова E.E.,Варфоломеев С.Д.Обратимое окисление-восстановление НАД водородом,катализируемое растворимой гидрогеназой J-tuUcgmts tu^ojJxus 2-1. Биохимия ,1980,т.45,№ 8,с.I405-I4I0.