Структура и свойства липида А - компонента липополисахаридов YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Красикова, Инна Николаевна

• Красикова, Инна Николаевна
• кандидат химических наук
• 1984

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Красикова, Инна Николаевна

Заключение

Таким образом, в основе молекулы липида А псевдотуберкулезного микроба лежит дисахарид глюкозамина с j^-I^-c вязью. Его восстанавливающий конец имеет ol -конфигурацию и содержит фосфат при CI-атоме. Поскольку гидроксильные группы при СЗ^ и Сб-атомах не-восстанавливающего конца дисахарида не замещены, можно предположить, что второй остаток фосфорной кислоты находится при С4-атоме этого остатка глюкозамина. Восстанавливающий остаток глюкозамина, судя по величинам химического сдвига CI-, С2-атомов, имеет высокую степень ацилирования, хотя, в целом, молекул, липида А ацили-рована неполностью.

Липид А псевдотуберкулезного микроба иммуногенен, его иммуно-детерминантная группа представляет собой остаток глюкозамина, аци-лированный по аминогруппе 3-окситетрадекановой кислотой.

1У. ЭКСПЕРИМЕНТМШАЯ ЧАСТЬ

I. Общие экспериментальные условия

Общее содержание нейтральных моносахаридов определяли фенол-сернокислотным методом [211], используя в качестве стандарта Бгглю-козу. Для определения белка применяли метод Лоури [212] , нуклеиновые кислоты определяли по методу [213] , фосфор - по [214], КДО - по [215]. Общее содержание жирных кислот после предварительного кислотного гидролиза определяли весовым анализом.

Количественный жирнокислотный состав устанавливали с помощью газожидкостной хроматографии (колонка А) в виде метиловых эфиров методом внутреннего стандарта, в качестве которого использовали декановую или пентадекановую кислоты; калибровочный коэффициент додекановой кислоты равен 1,0, 3-окситетрадекановой - 1,29.

Количественное определение гексозаминов проводили по реакции Эльсона-Моргана [216] или с помощью газожидкостной хроматографии в виде ацетатов полиолов [217] методом внутреннего стандарта, в качестве которого использовали D-глюкозу; калибровочный коэффициент 2-ацетамидо-2-дезокси-Б-глюкозы равен 1,1.

Количество золы определяли нагреванием образцов до постоянного веса при 600°С.

Температуры плавления определяли на столике Бойетиуса и не корректировали. Углы вращения измеряли на спектрополяриметре Рег-kin-Eimer 141 (Швеция). Инфракрасные спектры записывали на спектрометре тж-20 (Karl Zeiss, Йена, Щ5). Ультрацентрифугирование липополисахаридов проводили на центрифуге vac-6oi (1ДР). Молекулярный вес определяли парометрическим методом на Hitachi Model 115 (Япония). Для анализа аминокислот и аминосахаров использовали аминокислотный анализатор lkb Biocal 3201 (Швеция) с колонками (45 х 0,6 см), упакованными смолой Aminex А5 . Элементный анализ проводили на С, Н, N -анализаторе Perkin Elmer Model 240.

Хроматографию в тонком слое проводили на силикагеле Woeim (ФРГ) в следующих системах растворителей: А - хлороформ : метанол : 25$ водный аммиак = 65 : 35 : 5 ( v/v/v), липид А; Б - хлороформ : метанол : 25$ водный аммиак = 90 : 1,0 : I капля ( v/v), метилированный липид А; В - гексан : эфир : уксусная кислота = 70 : 30 : I (v/v/v), жирные кислоты и их метиловые эфиры; Г -бутанол : этанол : вода : 25$ водный аммиак = 5:7:4: 0,5 (v/v/v/v),деградированный липид А; Д - хлороформ : метанол = 95 : 5 (v/v), продукты адетолиза хитина. Обнаружение пятен проводили 20$ серной кислотой в метаноле нагреванием при 120°С в течение 20 мин или 0,2$ раствором нингидрина в ацетоне.

Нисходящую хроматографию на бумаге проводили, используя бумагу Hwhatman-I" u "Filtrak fn-15" (1ДР) в системе растворителей бутанол : пиридин : вода : уксусная кислота = 6 : 4 : 3 : 0,3 (v/v/v/v). Электрофорез проводили на бумаге "Fiitrak fn-15" (ГДР) в пиридин-ацетатном буфере (пиридин : уксусная кислота : вода = 2 : 4 : 1000, v/v/v, рн 4,5 ;250jb/40 см, 0,6 мА). Обнаружение пятен осуществляли щелочным раствором окиси серебра [218] или 0,2$ раствором нингидрина в ацетоне.

Для колоночной хроматографии использовали силикагель б, (63-90 МКМ, ЧССР), сефадекс LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals) и смолу амберлит CG-I20, тип П (200-400 меш, Н+).

Газожидкостную хроматографию проводили, используя хроматографы Pye Unicam-104 (Англия) или Цвет-100 (г. Дзержинск) с пламенно-ионизационным детектором и двойной системой стеклянных колонок (1,5 х 0,4 см). Жирные кислоты в виде метиловых эфиров анализировали на колонке А (10$ sf-зо на Gas-Chrom Q, 100-120 меш) при 150—*£50°, 10°/мин. Хроматографию моносахаридов проводили в виде ацетатов полиолов [217] на колонках А и Б (3$ qf-i на

Gas-Chrom Q, 100-120 меш) при 175°—*225°, 5°/мин.

Хромато-масс-спектрометрию метиловых эфиров жирных кислот проводили на приборе ъкв 9000s (Швеция), используя колонку с Ъ% se-зо на хроматоне (100-120 меш).

Спектры ^С-ЯМР получены на спектрометре Bruker-Physik wm -250 с рабочей частотой 0 = 62,9 Мщ при 30°С в условиях подавления спин-спинового взаимодействия с протонами, время задержки импульса 2 сек., ширина развертки 15 Кщ в CI)Ci3 : cd3od (2 : i) - метилированный липид А; на Bruker-Physik нх 90Е с рабочей частотой 22,6 Мщ и шириной развертки 2 Кщ в d2o (соединения 1-У1 и деградированный липид а), cdci^ (производные 3-окситетрадека-новой кислоты) и cd^cood L2-(R, s-3-ацетокситетрадеканоил) амино--2-дезокси-Б-глюкопираноза]. В качестве внутреннего стандарта использовали тетраметилсилан (tms) или метанол ( £ + 49,6 м.д.). от

Спектры Р-ЯМР получены на спектрометре Bruker-Physik нх 90Е с рабочей частотой л> = 36,4 Мщ. В качестве внешнего стандарта использовали 85%-ю н^ро^.

2. Образцы жирных кислот

Для идентификации нормальных жирных кислот использовали наборы метиловых эфиров жирных КИСЛОТ (Applied Science Laboratori-е s, Inc.).

R, s-3-Окситетрадекановая кислота была получена в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета, Т пл. 77-78°С [145]. д ^-Тетрадеценовая кислота была получена нагреванием r,s-3-окситетрадекановой кислоты (76 мг) со смесью пиридин : уксусный ангидрид (2 : I; 3 мл) при I00°C, I час. Реакционную смесь упаривали, растворяли в хлороформе, проводили экстракцию водой. Хлороформный слой сушили над сульфатом натрия, упаривали (71,8 мг) и метилировали диазометаном. Сухой остаток после обработки диазо-метаном загружали на колонку с силикагелем (15 см х I см) в гек-сане. Элюцию проводили в системах растворителей: гексан (20 ш); гексан : эфир, 10$ (20 мл); гексан : эфир, 20$ (20 мл). Метиловый эфир д ^-тетрадеценовой кислоты элюируется'гексаном (выход 21,2 мг). Идентификацию кислоты проводили с помощью хромато-массто спектрометрии и спектроскопии Х С-ЯМР. в,s-3-Ацетокситетрадекановая кислота была получена [219] смешиванием н, s-3-окситетрадекановой кислоты (99 мг) с 5 мл аце-тилирущего агента. Последний был получен следующим образом. К 57$ хлорной кислоте (0,63 мл) добавляли 30 мл этилацетата и 1,6 мл уксусного ангидрида. Через 30 мин. при комнатной температуре раствор охлаждали до 5°С, добавляли ещё 8,4 мл уксусного ангидрида и выдерживали при 5°С I час.

Через 5 мин. после добавления ацетилирущего агента к реакционной смеси добавляли 15 мл Н^О и 15 мл серного эфира; водный слой отделяли, раствор кислоты в эфире промывали водой (15 мл х 3), сушили над сульфатом натрия и упаривали. Выход 113,4 мг (97,7$).

Идентификацию кислоты проводили с помощью хромато-масс-спектротя метрии и спектроскопии С-ЯМР.

3. Получение производных D-глюкозамина

Коммерческий препарат 2-ацетамидо-2-дезокси-о-глюкозы был очищен кристаллизацией, Т пл. 196°С; М^д + 40° (вода).

2-Ацетамидо-2-дезокси-Б-сорбит был получен восстановлением 2-ацетамидо-2-дезокси-Б.-глюкозы боргидридом натрия. Для этого N-ацетил вкглюкозамин (240,6 мг) растворяли в 2 мл Н20, рН раствора доводили до 9-10 0,75$ водным раствором едкого натра, добавляли двойной избыток боргидрида натрия. После стояния в течение ночи и подкисления раствор упаривали несколько раз с метанолом, обессоливали на смоле амберлит cg-120 (Н+). Выход хроматографически чистого образца (система Г) - 225 мг (93,5%). Его струк

13 тура была подтверждена с помощью спектроскопии С-ЯМР.

2-Амино-2-дезокси-б-сорбит получен обработкой безводным гидразином (20 мл) 2-ацетамидо-2-дезокси-о-сорбита (150 мг) при Ю5°С в течение 2-х суток. По окончании реакции гидразин упаривали с ацетоном. Выход электрофоретически и хроматографически (система Г) чистого образца 117 мг (96,3$). Его структура была

TQ подтверждена спектроскопией С-ЯМР.

2-Ацетамидо-4-0-(2-ацетамидо-3,4,6-три~0-ацетил-2-дезокси-jS -d-глюкопиранозил)-1,3,4-три-0-ацетил-2-дезокси-^ -d-глюкопи-раноза получена ацетолизом хитина [220]. Хитин (500 г, завод им. Войкова) обрабатывали 2 н. соляной кислотой (4 л) при комнатной температуре в течение ночи. Кислоту сливали, хитин промывали водой до нейтральной реакции и нагревали с 6% едким натром (3,5 л) 2 раза по 3 час. Затем щелочь сливали, хитин промывали водой до нейтральной реакции, сушили на воздухе в течение 2-х суток. Выход 420 г.

Хитин (7,6 г) заливали охлажденной смесью уксусный ангидрид : серная кислота (7,6 мл : 10,4 мл), перемешивали в течение 2-х суток при комнатной температуре, затем нагревали с обратным холодильником 5 час. при Ю0°С. После стояния на холоду в течение ночи реакционную смесь выливали в охлажденный раствор ацетата натрия. Через несколько часов проводили нейтрализацию бикарбонатом натрия. Продукты ацетолиза извлекали экстракцией хлороформом (200 мл х 3 р.), объединенный хлороформный экстракт промывали водой, насыщенной бикарбонатом натрия (200 мл х 3 р.), сушили над безводным сульфатом натрия, упаривали. Выход I г.

Продукты ацетолиза (506 мг) растворяли в 2 мл смеси хлороформ : бензол (I : I) и загружали на колонку (35 см х 2 см) с си-ликагелем. Элшцию проводили следущиш системами растворителей:

Собирали фракции по 5 мл. За элюцией следили с помощью хроматографии в тонком слое (система Д). Октаацетат хитобиозы элюи-руется системой бензол : этилацетат = 1:3. Выход 65,8 мг (13,2$). После кристаллизации из спирта Т пл."296°С, 64,5° (С 1,0 ,

СНдСООН). Анализ: найдено для G28^0°I7N2 ? с = 49>б9$; н = 6,1$; N =3,98$; рассчитано: С = 49,71$; н = 5,92$; N = 4,15$.

2-Аце тамидо-6-0- (2-ацетамидо-3,4,6-три-0-аце тил-2-де з окси-JL -D-глюкопиранозил)-1,3,4-три-0-ацетил-2-дезокси- d -D-глюкопира-ноза была синтезирована С 221] в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета: Т пл. 250-251°С, + 43?6 -с 1,16 , хлороформ). Анализ: найдено для c28h40oI7n2", с =

48,91$ ; н = 5,79$ ; N = 3,88$ ; рассчитано: с = 49,71$; Н ='5,92$; N= 4,15$. ' '

2-Ацетамидо-4-0-и 2-ацетамидо-6-0-(2-ацетамидо-2-дезокси-J>-в^глюкопиранозил)-2-дезокси-Б-сорбиты были приготовлены дез-0--ацетилированием соответствующих октаацетатов (50 мг) 0,01 н. мети-латом натрия (2 час., 0 °С, 3 мл) с последующим восстановлением бензол : этилацетат =1:1 бензол : этилацетат = 1:3 этилацетат бензол этилацетат : метанол (2$) этилацетат : метанол (5$) этилацетат : метанол (10$) этилацетат : метанол (20$) этилацетат : метанол (50$) метанол

- 100 мл

- 100 мл

- 100 мл ■-"100 мл

- 100 мл

- 100 МП

- 100 МП

- 100 мл

- 100 мл

- 100 мп боргидридом натрия (рй 9-10, 12 час., 20 °С). После обессолива-ния на смоле амберлит cg-120 (Н+) выход хроматографически чистых образцов (система Г) составил 54,0 и 92,5$, соответственно.

2-Амино-4-0- и 2-амино-6-0-(2-амино-2~дезокси-уЗ -d-глюкопи-ранозил)-2-дезокси-п-сорбиты были получены обработкой безводным гидразином (2 шг, 48 час., 100 °С) соответствующих ди-и-ацетатов Jj-l',4- иJS-lU-глюкозаминобиоз (10 мг). После упаривания гидразина с ацетоном сухой остаток делили на колонке со смолой амберлит cg-120 (Н+, 1,2 см х 0,2 см). Собирали фракции по 2 мл. £йю-цию проводили следующей системой: н2о (Ю мл), I н. hci (10 мл), 2 н. hci (10 мл), 4 н. hci (10 мл). За элюцией следили с помощью хроматографии в тонком слое (система Г). Хроматографически чистые образцы элюируются 2 н. hgi, выход составил 80 и 90$, соответственно.

2-(R, s- 3-Ацетокситетрадеканоил)амино-2-дезокси-£-глюкоза получена в лаборатории молекулярных основ антибактериального иммунитета [221] , Анализ: найдено для C22H3gOgNi , с =56, 4$; н =8,8$; n = 2,7$; рассчитано: с= 58,21$; н= 9,0$; n=3,09$. ol -1-Ди-0-метилфосфат 2,3,4,6-тетра-0-ацетйл-1>-гл10копиранозы был получен ацетилированием JL -I-фосфата (дикалиевой соли) п-глю-козы (150 мг) уксусным ангидридом (2 мл) в пиридине (4 мл) в течение ночи в присутствии р-диметиламинопиридина (100 мг) с последующим метилированием фосфатных групп диазометаном и хроматографией на силикагеле (12 х I см) в системе растворителей хлороформ (25 мл), хлороформ : метанол (9:1, 25 мл; 8:2,25 мл; 3:2,25 мл; 1:1,25 мл). Собирали фракции по I шг/5 мин. За элюцией следили с помощью тонкослойной хроматографии (система Б). Выход хроматографически чистого d-1-ди-0-метилфосфата 2,3,4,6-тетра-0-ацетил-Б-глюкопиранозы (хлороформ : метанол = 8:2) составил 107 мг. Структуру подтверждали спектроскопией *3С-ЯМР.

4. Выделение липополисахарида [194]

Сухие микробные клетки (90 г) Y. pseudotuberculosis IA (штамм 341) и IB (штамм 598) сероваров обрабатывали смесью хлороформ : метанол = 2:1 (v/v) при комнатной температуре (600 мл х 3). Клетки отделяли центрифугированием (5000 об./мин, 30 мин), хлороформный слой упаривали (выход сухого остатка - 2,31 г). Высушенные клетки (87,5 г) делили на четыре равные части и каждую суспендировали в воде (300 мл) при температуре 65-68 °С. Затем добавляли по 300 мл 90$ водного фенола, предварительно нагретого до 65 °С, и суспензию перемешивали 10 мин при вышеуказанной температуре. После стояния в течение ночи на холоду водный слой отделяли центрифугированием (5000 об./мин, 30 мин). Фенольный слой и остаток клеток доводили водой до объёма 600 мл, повторяли обработку при 65-68 °С ещё два раза.

Водные экстракты, полученные из четырех порций микробных клеток, объединяли по порядку экстракции, обрабатывали серным эфиром ( i:i, v/v), диализовали против дистилированной воды (3-е суток) и концентрировали упариванием. Для отделения нуклеиновых кислот проводили трехкратное ультрацентрифутирование (105 000 g, 3 час). Осадок липополисахарида сушили лиофильно. Выход ЛПС составил 1,1$.

5. Выделение липида А

Липополисахарид (300 мг) Y. pseudotuberculosis IA или IB серовара гидролизовали 1-процентной уксусной кислотой (30 мл, 2 час, 100 °С) или ацетатным буфером (рй 3,75 , 30 мл, 3 час, 100 °С). Выпавший осадок отделяли центрифугированием (8000 об./мин, 15 мин), растворяли в хлороформе (50 мл) и промывали водой (2 х

50 мл). Хлороформный раствор высушивали над безводным сульфатом натрия, упаривали досуха. Остаток растворяли в минимальном объёме хлороформа (3 мл) и добавляли пятикратный объём ацетона. После стояния на холоду в течение ночи осадок липида А отделяли центрифугированием (8000 об./мин, 15 мин), промывали ацетоном (2 х 25 мл) и высушивали в вакууме над хлористым кальцием. Выход 87,5 мг (29$ от веса ЛПС).

Надосадочную жидкость, содержащую свободные жирные кислоты, упаривали досуха и высушивали в вакууме над хлористым кальцием. Выход 8,3 мг (9,5$ от веса липида А).

Сухой липид А (65,5 мг) растворяли при комнатной температуре в безводном пиридине (I мл) [32]. Через полчаса проводили центрифугирование (8000 об./мин, 30 глин), супернатант упаривали и сушили в вакууме до постоянного веса. Выход липида А 55,4 мг (24,6$ от веса ЛПС).

Пиридиновый осадок, содержащий глико- и липопротеины, высушивали до постоянного веса. Выход 9,2 мг (14$ от веса липида А).

Образцы липида А Ш, У, У1 сероваров были получены из лаборатории химии углеводов Тихоокеанского института биоорганической химии ДВНЦ АН СССР в виде лиофильно высушенных препаратов и подвергались очистке, как описано выше.

Меченный ^С липид А был получен гидролизом 1-процентной уксусной кислотой ЛПС, выделенного из меченных ^С бактериальных клеток псевдотуберкулезного микроба С222] фенол-водной экстракцией [194].

6. Выделение деградированного липида А

Липид А (140 мг) надевали в течение двух часов с 0,1 н. HCI (15 мл). После охлаждения осадок отделяли центрифугированием

8000 об./мин), промывали водой и суспендировали в воде (10 мл) в присутствии триэтиламина (рй 10). К суспензии добавляли борги-дрид натрия (300 мг) и оставляли на ночь при температуре 60 °С. По окончании восстановления избыток боргидрида разрушали кислотой, смесь упаривали, метилборат удаляли многократным упариванием с метанолом. Сухой остаток нагревали с безводным гидразином (10 мл) при 100 °С в течение 48 час. После удаления гидразина упариванием с ацетоном к остатку добавляли воду (20 мл) и проводили экстракцию хлороформом (20 мл х 3). Водный слой отделяли, упаривали. Выход деградированного липида А 29,8 мг (21,1$).

Хлороформный слой, содержащий гидразиды жирных кислот, сушили над сульфатом натрия, упаривали и гидролиз овали 0,1 н. HCI (I час, 100 °С). Выход свободных жирных кислот 86 мг (61,4$),

7. n-Ацетилирование деградированного липида А

Деградированный липид А (29,8 мг) растворяли в воде (2 мл), добавляли насыщенный раствор бикарбоната натрия (рН 9, 10)'и 100 мкл уксусного ангидрида. Через 10 мин реакционную смесь обраба- " тывали смолой амберлит cg-I2 0 (Н*), фильтровали, упаривали. Выход 25 мг.

8. Выделение метилированного липида А

Липид А (104,5 мг) растворяли в хлороформе (10 мл) и добавляли насыщенный раствор диазометана в серном эфире (10 мл х 2). По окончании метилирования реакционную смесь упаривали (108,2 мг), растворяли в минимальном объёме хлороформа (2 мл), осаждали пятикратным объёмом ацетона . Осадок (20,1 мг) отделяли центрифугированием (8000 об./глин, 15 мин). Супернатант после упаривания

80,2 мг) загружали в хлороформе на колонку с силикагелем (12 см х 0,8 см). Элюцию проводили системой растворителей: хлороформ (25 мл); хлороформ : метанол (9:1, 25 мл; 8:2, 25 мл; 3:2, 25 мл; 1:1, 25 мл); хлороформ : метанол : вода = 65:35:5, 40 мл. Собирали фракции по I мл/5 мин. Следили за элюцией с помощью тонкослойной хроматографии в системе Б. Выход фракции (см. стр. 54): I - 10 мг; П - 12 мг; Ш - 37,5 мг; 1У - 16 мг; 7 - 13,7 мг; 71 -18 мг.

Ацетилирование метилированного липида А (10 мг) проводили уксусным ангидридом (0,2 мл) в пиридине (0,4 мл) при нагревании (100 °С) 6 час. Выход продукта ацетилирования составил 8,5 мг.

9. Выделение r-3-окситетрадекановой кислоты

Смесь свободных жирных кислот (103 мг) в гексане загружали на колонку с силикагелем (18 х 0,8 см). Элюцию проводили системой растворителей: гексан (25 мл); гексан : серный эфир (9:1, 25 мл; 8:2, 25 мл; 1:1, 25 мл). Собирали фракции по 5 мл/2 мин, за элюцией следили с помощью тонкослойной хроматографии в системе В. r-3-Окситетрадекановая кислота выходит в системе гексан : серный эфир = 1:1. Выход 50 мг, Т пл. 67-70 = -13° с 0,83$, хлороформ). Анализ: найдено для с14н28о3 , с = 68,41$, н = 11,42$; рассчитано: с = 68,82$, н = ц,47$.

10. Выделение R-3-додеканоилокситетрадекановой кислоты 1903

Липид А (150 мг) растворяли в 30 мл 0,25 н. едкого натра, нагревали 10 мин при 56 °С. После охлаждения раствор подкисляли, добавляли хлороформ. Хлороформный слой отделяли, обработку щёлочью повторяли ещё два раза. Хлороформные экстракты объединяли, сушили над сульфатом натрия, упаривали. Остаток (13,9 мг) в гек-сане загружали на колонку с силикагелем (12 см х I см). Элюцию проводили системой растворителей: гексан, 25 мл; гексан : серный эфир = 99:1, 20 мл; 98:2, 20 мл; 95:5, 20 мл; 90:10, 20 мл; 50:50, 20 мл. Собирали фракции по 2 мл/2 мин, следили за элюцией с помощью тонкослойной хроматографии (система В). н-З-Додеканоилок-ситетрадекановая кислота элюируется системой гексан : серный . эфир = 90:10 (1,6 мг). Структуру подтверждали хромато-масс-спек-трометрией (рис. 15, стр. 50).

11. Кислотный гидролиз [90]

Липид А (10 мг) гидролизовали 4 н. соляной кислотой (I мл) 6 или 12 час при 100 °С. Жирные кислоты удаляли экстракцией хло-po$ojMyfl,5 мл х 3) с последующим упариванием и метилированием диазометаном. Водный слой гидролизата упаривали, аминосахара и аминокислоты идентифицировали с помощью аминокислотного анализатора.

12. Щелочной гидролиз [90]

Липид А (10 мг) обрабатывали 4 н. едким натром (I мл) 6 час при 100 °С. После охлаждения смесь подкисляли соляной кислотой до рН I, жирные кислоты экстрагировали хлороформом (1,5 мл х 3) с последующим метилированием диазометаном.

13. Гидроксиламинолиз [90]

Липид А (19,7 мг) обрабатывали 2% гидроксиламином в 4$ спиртовом растворе щелочи (5 мл) в течение 3 глин при 63 °С. Осадок дез-0-ацшшрованного липида а (липид a-nh2oh) отделяли центрифугированием (8000 об./мин) и после диализа гидролиз овали (4 н. едкий натр, 4'час, 100 °С). Гидроксаматы жирных кислот, находящиеся в супернатанте, после подкисления соляной кислотой (рй I) грели I час при 100 °С. Жирные кислоты извлекали экстракцией хлороформом. Хлороформные экстракты сушили над сульфатом натрия, упаривали, метилировали диазометаном.

14. Обработка метилатом натрия [90]

Липид А (6,8 мг) обрабатывали 0,2 н. метилатом натрия (I мл) при комнатной температуре. Осадок дез-О-ацилированного липида А (3,5 мг) отделяли центрифугированием (8000 об./мин, 15 мин), промывали водой, гидролизовали кислотой (1,5 мг липида А, 4 н. соляная кислота, 0,2 мл, 4 час, 100 °С) и'щелочью (2,0 мг липида А, 4 н. едкий натр, 0,2 мл, 4 час, 100 °С). Обработку гидролизатов проводили, как описано в пл. II, 12. Жирные кислоты после метилирования диазометаном исследовались газожидкостной хроматографией.

Свободные жирные кислоты, получающиеся из липида А после обработки метилатом натрия (3,3 мг, 48,5$), после подкисления извлекались хлороформом и изучались методом газожидкостной хромат ографии до и после метилирования диазометаном.

15. Получение антисыворотки к липиду А

Сухие бактерии s-формы Y. pseudotuberculosis IA (или IB) серовара (10 г) гидролизовали 1-процентной уксусной кислотой. (100 мл, 2 час, 100 °С), промывали дистилированной водой (100 мл х 2) , лиофильно высушивали. Суспензию липида А (3 мг в 1,5 мл физиологического раствора, содержащего 1,5 мкл ТЭА) смешивали с суспензией гидролизованных бактерий (3 мг в 1,5 мл физиологического раствора) или альбумина бычьей сыворотки (3 мг в 1,5 мл физиологического раствора). Каждому кролику вводили внутривенно 4 увеличивающиеся дозы антигена (100, 200, 300, 500 мкг), используя четырехдневные интервалы между инъекциями. Кровь брали на 16-25 день. Сыворотку разливали в ампулы по I мл и лиофильно высушивали. Хранили при +4 °С. Перед использованием сыворотку растворяли в дистилированной воде, обрабатывали бараньими эритроцитами (30 мин, комнатная температура) с последующим центрифугированием (3000 об./мин, 5 мин) и нагревали при 56 °С 30 мин.

16. Пассивный гемолиз (ИГГ) и реакция ингибирования пассивного гемолиза

Титры антисыворотки к липиду А определяли реакцией пассивного гемолиза [224]. Во всех экспериментах использовали верона-ловый буфер (рй 6,95) в присутствии БСА [223]. Кровь от баранов хранили в растворе Ольсевера при +4 °С не более двух недель. Перед использованием клетки отмывали раствором Ольсевера 3 раза, центрифугируя при 3000 об./мин. Отмытые бараньи эритроциты (0,1 мл) сенсибилизировали суспензией липида А (300 мкг в I мл буфера в присутствии I мкл ТЭА) 2 час при 37 °С. После отмывания (10 мл х 3) сенсибилизированные эритроциты суспендировали в 10 мл'буфера, использовали в течение недели.

Реакцию ингибирования пассивного гемолиза проводили по сле-дущей схеме [223]: 0,2 мл ингибитора в 0,2 мл вероналового буфера (рН 6,95) с 0,1 мл антисыворотки (в разведении 1:20) инкубировали при 37 °С в течение 30 мин. После инкубации добавляли 0,1 мл комплемента (сухая сыворотка морских свинок в разведении 1:20) и 0,1 мл 0,25$ суспензии бараньих эритроцитов, сенсибилизированных липидом А, инкубацию повторяли (30 мин, 37 °С), смесь центрифугировали. Поглощение супернатанта измеряли при 413 им.

17. Реакция энзиммеченных антител (РЭМ)

Нерастворимой основой в РЭМА, служили планшеты для иммунологических реакций из полистирола (фирма Linbro). В работе использовали конъюгат пероксидазы из хрена (RZ = 3,0) с афинными антителами из антисывороток барана к гамма-глобулинам кролика. Субстратом для пероксидазы является н202, в качестве хромогена использовали ортофенилендиамин. Регистрацию реакции проводили непосредственно в планшетах на фотометре Multiskan (Flow) при 450 нм. Сенсибилизацию планшетов проводили липидом A IB серова-ра (1,5 мкг/мл, +4 °С, 20 час). Рабочее разведение сыворотки -1:1000, конъюгата - 1:500. Ингибирование РЭМ проводили с антисывороткой к липиду А псевдотуберкулезного микроба IB серовара, предварительно инкубированной с образцами липида А различного происхождения (+4 °С, 12 час).