Структура и специфические взаимодействия мембранных доменов белков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Бочаров Эдуард Валерьевич

• Бочаров Эдуард Валерьевич
• доктор наук
• 2024

Оглавление диссертации доктор наук Бочаров Эдуард Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Степень разработанности исследования

Цель и задачи исследования

Научная новизна диссертационной работы

Теоретическая и практическая значимость

Методология и методы диссертационного исследования

Основные положения, выносимые на защиту

Вклад автора

Степень достоверности и апробация результатов

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

Молекулярно-биофизическая платформа для исследования структурно-динамических свойств и взаимодействий мембранных доменов белков

Характерные мотивы спираль-спиральных взаимодействий в мембране

Термодинамические аспекты спираль-спиральных взаимодействия в мембране

Липид-опосредованный механизм передачи сигнала через мембрану рецепторами

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ АВТОРОМ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ (с указанием квартилей Q1 и Q2 для статей, опубликованных в 2014-2023 гг.)

ПЕРЕЧЕНЬ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

Благодарности

ВВЕДЕНИЕ

Клеточная мембрана является многокомпонентной системой, функция которой не ограничивается созданием барьера между содержимым клетки и внешней средой, а также напрямую связана с взаимодействием клеток с окружением. Многие биологические функции при нормальных и патологических состояниях организма инициируются и происходят именно на биологической мембране с участием белков, которые вовлечены во множество межмолекулярных взаимодействий. Либо разрушение, либо усиление таких взаимодействий может привести ко многим заболеваниям, связанным с дисфункцией различных тканей в организме. Установление структурно-функциональных взаимосвязей, а также рациональный дизайн новых типов лекарств, нацеленных на мембранные белки, требуют точной информации об их пространственной структуре и динамике в мембранном окружении. Работа посвящена биофизическим и структурно-динамическим исследованиям внутри- и межмолекулярных взаимодействий мембранных доменов белков на примере функционально важного класса мембранных белков, известных как битопные белки типа I, играющих значимую роль в норме и при патологии организма человека.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и специфические взаимодействия мембранных доменов белков»

Актуальность исследования

Мембранные белки составляют до трети всех белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в геномах прокариотических и эукариотических организмов. Мембранные белки вовлечены во множество жизненно важных процессов, включая, дыхание, транспорт питательных веществ, передачу сигналов и проведение ферментативных реакций, и таким образом непосредственно участвуют в поддержании гомеостаза клеток и рецепции ими внешних и межклеточных сигналов. Обработка поступающих извне сигналов в виде специфических молекулярных лигандов и действия физико-химических факторов (рН, свет, ионные концентрации и пр.), а также формирование клеточного ответа осуществляется обширным пулом интегральных и периферических мембранных белков, которые, прежде всего, представлены рецепторами (такими как битопные рецепторы типа I и политопные О-белок связанные рецепторы), ионными каналами, белками мембранного транспорта, внутри- и примембранными ферментами и разнообразными адаптерными примембранными белками.

В этой связи не удивительно, что множество заболеваний, таких как онкогенные, сердечнососудистые, нейродегенеративные, эндокринные, иммунные, хронические воспалительные процессы, фиброзы и дисплазии тканей, связаны с дисфункцией мембранных белков, и, в частности, с полиморфизмом и мутациях в их аминокислотных последовательностях. По прогнозам свыше половины всех мембранных белков человека представляют собой мишени для разработки новых лекарственных препаратов. Действительно, мембранные белки являются мишенями около 70% современных лекарственных препаратов.

Создание эффективных фармакологических соединений с направленной доставкой к определенным мембранным системам невозможно без детального понимания молекулярных механизмов функционирования мембранных белков, пространственного строения и разнообразных динамических межмолекулярных взаимодействий, обеспечивающих их биологическую активность в мембране. При этом низкомолекулярное содержимое клеточной мембраны необходимо рассматривать не просто как гидрофобный липидный бислой, позволяющий мембранным белкам принять «нативную» конформацию, но прежде всего как единую и тонко регулируемую среду, все разнообразные компоненты которой действуют согласованно [1, 2].

Таким образом, установление взаимосвязи между структурой, динамикой и функцией мембранных белков представляет большое фундаментальное значение для понимания принципов функционирования макромолекул в сложных биологических системах со множеством межмолекулярных взаимодействий, таких как клеточная мембрана. Данная проблема современной структурной биологии и биофизики тесно связана со стратегически важной задачей медицины, а именно рационального конструирования высокоаффинных лигандов с заданным профилем специфичности для мембранных белков, с дисфункцией которых связано множество патологий организма человека.

Степень разработанности исследования

Мембранные белки остаются одними из наименее изученных объектов с точки зрения структурной биологии (из более чем 180,000 известных к 2023 году белковых структур менее 2% относятся к мембранным белкам). Сложность исследования мембранных белков связана как с трудностью их наработки и выделения, так и с особенностями их пространственной организации. При этом, мембранные белки могут обладать «нативной/активной» структурой из-за своих гидрофобных свойств только в присутствии биологической мембраны или миметика мембраны, в виде подходящей мембраномоделирующей среды. Помимо этого, большинство мембранных белков характеризуется значительной конформационной подвижностью, которая играет огромную роль, как в лиганд-рецепторных взаимодействиях и работе ионных каналов, так и в, например, цитотоксическом действии мембраноактивных белков и пептидов. При этом конформация, динамика и функция мембранных белков могут сильно зависеть от свойств липидного бислоя и специфических взаимодействий с его специфическими компонентами (заряженными фосфолипидами, ганглиозидами, сфинголипидами, холестерином и т.д.). Например, на данный момент существует ряд парадоксов, наблюдаемых при аллостерической активации мембранных рецепторов, которые объясняются только механизмом согласованных белок-липидных и белок-белковых взаимодействий в клеточной мембране.

Гидрофобные свойства и высокая конформационная пластичность затрудняют кристаллизацию мембранных белков, кроме того, кристаллизация ведет к потере существенной информации о динамике молекулы. Методы рентгеноструктурного анализа, которые позволили получить ряд структур высокого разрешения для Р-структурных и многоспиральных (политопных) полноразмерных мембранных белков обычно не имеющих больших отдельных водорастворимых доменов, не могут быть непосредственно применены для подвижных многодоменных мембранных белков, таких как битопные рецепторы типа I, функционально важным представителем которых являются рецепторные тирозинкиназы (РТК) и им подобные рецепторы из организма человека. Развитие методов криоэлектронной микроскопии позволило получить с высоким разрешением структуры для ряда мембранных белков, встроенных в липидное окружение. В то же время, например, несмотря на успехи криоэлектронной микроскопии, из-за высокой конформационной подвижности и гетерогенности системы для полноразмерных рецепторов типа I в целом достигается разрешение ~20 А, что соизмеримо с толщиной клеточной мембраны, хотя структура внеклеточных лиганд-связывающих эктодоменов данных рецепторов устанавливается обычно с высоким разрешением ~3-5 А.

При этом молекулярные механизмы функционирования мембранных белков, предположенные из пространственных структур, решенных методами рентгеноструктурного анализа или криоэлектронной микроскопии, существенно дополняются экспериментальными данными, полученными другими структурными методами, в особенности гетероядерной спектроскопией ядерного магнитного резонанса (ЯМР), что в результате позволяет детально

описать структурно-динамические процессы, происходящие в биологических мембранах живых организмов. Метод ЯМР позволяет определять пространственную структуру и исследовать внутримолекулярную динамику мембранных белков с практически атомным разрешением напрямую в мембраномоделирующих средах. Быстрое развитие методов и технических возможностей гетероядерной ЯМР-спектроскопии для увеличения чувствительности и спектрального разрешения в последние десятилетия сделало возможным структурно-динамические исследования сравнительно больших мембранных белков, их фрагментов и комплексов, встроенных в мембраноподобные частицы (в виде мицелл, бицелл и липид-белковых нанодисков с массой комплекса более ~50 кДа), а также в гидратированные липидные бислои. Например, методом ЯМР были определены пространственные структуры бактериальных родопсинов, исследована внутримолекулярная динамика и механизмы активации калиевых каналов, активно изучаются структура и подвижность О-белок сопряженных рецепторов, а также функциональных фрагментов битопных рецепторов типа I, таких как РТК и РТК-подобные рецепторы. При этом необходимо отметить, что до начала выполнения данной диссертационной работы была установлена только единственная структура для димера мембранного домена битопного белка Гликофорин А, GpA, постоянно существующего в виде нековалентного димера в клеточной мембране. На основе совокупности экспериментальных структурно-динамических и биохимических данных об отдельных доменах и функциональных фрагментах мембранных белков (в том числе мутантных форм) с помощью компьютерного моделирования создаются модели полноразмерных мембранных белков и детально изучаются их взаимодействия с мембранным окружением и прототипами лекарственных соединений. Раскрытие молекулярных механизмов функционирования мембранных белков уже помогло создать целый ряд таргетных фармакологических препаратов против ряда заболеваний, в том числе онкологических, нейродегенеративных и аутоиммунных.

Тем не менее, несмотря на значимость для фундаментальной науки и практический интерес со стороны медицины, до сих пор молекулярные механизмы функционирования большинства мембранных белков остаются не совсем ясными, в том числе из-за отсутствия детальной экспериментальной информации об их пространственной структуре, конформационной подвижности и межмолекулярных взаимодействиях.

Цель и задачи исследования

Цель работы - установление пространственной структуры и выявление специфических взаимодействий мембранных доменов белков для раскрытия молекулярных механизмов и общих физических принципов функционирования белков в клеточных мембранах с помощью комплексного подхода на основе взаимодополняющих методов структурной биологии, биофизики и биохимии.

Основной объект исследования - функционально важный класс интегральных мембранных белков с одним трансмембранным (ТМ) а-спиральным сегментом, известный как битопные белки типа I, играющие значимую роль в норме и при патологиях организма человека. К представителям данного широкого класса белков в том числе относятся интегрины, иммунорецепторы, проапоптозные белки, мембранные протеазы, сигнальные рецепторы, такие как рецепторные тирозинкиназы (РТК) и РТК-подобные рецепторы.

Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Создать оригинальный комплексный подход - молекулярно-биофизическую платформу - объединяющую взаимодополняющие физико-химические методы исследования мембранных белков на основе гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

2. С помощью разработанной платформы исследовать структурно-динамические свойства и межмолекулярные взаимодействия мембранных доменов белков в мембраноподобных средах.

3. Выявить характерные структурно-функциональные детерминанты мембранных доменов белков, отвечающие за межмолекулярные взаимодействия и биологическую активность.

4. Описать возможные конформационные перестройки и межмолекулярные взаимодействия мембранных доменов белков при их функционировании в мембране клетки в норме и при патологиях организма.

5. Установить молекулярные механизмы и обобщить биофизические принципы функционирования исследуемых мембранных белков для выявления взаимосвязи «структура-функция-патогенез» и создания новых способов направленного воздействия на их биологическую активность.

Научная новизна диссертационной работы

В работе получены следующие фундаментальные научные результаты:

1. Для структурно-динамических исследований мембранных белков и их комплексов, разработана и успешно апробирована универсальная молекулярно-биофизическая платформа, объединяющая разнообразные физико-химические методы исследования на основе гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

2. Для детекции межмолекулярных взаимодействий, описания конформационной динамики, измерения свободной энергии взаимодействий и картирования межмолекулярных интерфейсов мембранных доменов белков разработаны новые методики гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, которые могут быть применены к белкам и их комплексам из различных семейств.

3. С помощью разработанной молекулярно-биофизической платформы проведены структурно-динамические исследования мембранных доменов и примембранных участков разнообразных белков (в том числе проапоптозный белок В№р3 из семейства Вс1-2, нейраминидаза №и1, белок-предшественник Р-амилоида АРР, рецепторные протеинкиназы и их лиганды из семейств EGFR/ErbB/HER, FGFR, EphA, PDGFR, InsR/ЮF1RЛRR, GHR, TpR-TGFp и др.) в мономерном, гомо- и гетеродимерном состояниях в различных мембраноподобных средах.

4. Детально картированы интерфейсы белок-белок и белок-липид взаимодействий, что позволило охарактеризовать и систематизировать структурно-функциональные детерминанты, отвечающие за межмолекулярные взаимодействия и биологическую активность данных мембранных белков в организме.

5. Установлены новые аспекты механизмов латерального взаимодействия мембранных доменов белков, в том числе показана конформационная роль примембранных участков битопных белков, а также важность специфических взаимодействий и энтропийного вклада липидов в процессах димеризации (олигомеризации) и переключения между интерфейсами белок-белок и белок-липид взаимодействий.

6. В мембранных доменах белков, в том числе битопных рецепторов типа I, картировано и объяснено характерное положение патогенных мутаций, приводящих к дисфункции мембранных белков и ассоциированных с социально-значимыми заболеваниями организма человека, прежде всего, такими как онкогенные, нейродегенеративные и пороки развития.

7. На основе сопоставления полученных результатов и литературных данных для ряда мембранных и мембраноактивных белков разных классов предложены молекулярные механизмы их функционирования в мембране клетки, описаны возможные конформационные перестройки и межмолекулярные взаимодействия в норме и при патологиях организма для установления взаимосвязи «структура-функция-патогенез».

8. Для управления клеточными процессами и терапии заболеваний человека, связанных с дисфункцией мембранных белков, предложены новые способы направленного воздействия на биологическую активность мембранных белков посредством пептидов, модулирующих свойства их функциональных олигомерных состояний.

9. На основе совокупности экспериментальных и литературных данных предложен оригинальный липид-опосредованный механизм передачи сигнала рецепторами через мембрану, рассматривающий лиганд-рецепторные комплексы как самосогласованную систему в гетерогенном липидном окружении.

Теоретическая и практическая значимость

Установления взаимосвязи между структурой, динамикой и функцией мембранных белков, которые являются главными посредниками в обмене материей, энергией и информацией живой клетки с окружающей средой, представляет большое фундаментальное значение для понимания принципов функционирования макромолекул в сложных биологических системах, таких как клеточная мембрана, и имеет огромное практическое значение для медицины и биотехнологии.

Создание универсальной молекулярно-биофизической платформы для исследования структурно-динамических свойств и межмолекулярных взаимодействий мембранных доменов белков является новым этапом в развитии методов структурной биологии и иллюстрирует постепенное смещение акцентов с ранее принятой парадигмы «структура-функция», на современную систему взглядов, принимающую во внимание неотъемлемую роль конформационной пластичности и мембранного окружения в функционировании мембранных белков. В частности, описаны новые механизмы и закономерности латерального взаимодействия мембранных доменов белков, в том числе показана конформационная роль примембранный участков белков, а также важность специфических взаимодействий и энтропийного вклада липидов в процессах димеризации (олигомеризации) и переключения между интерфейсами белок-белок и белок-липид взаимодействий при функционировании белков в мембране. В результате, была разработана новая биофизическая концепция липид-опосредованного механизма передачи сигнала белками через мембрану клетки, рассматривающая функционирование мембранного рецептора в самосогласованной белок-липидной системе, в которой наряду с белок-белок взаимодействиями необходимо учитывать специфические белок-липид взаимодействия наряду с энтропийным вкладом липидов, величина которого зависит от локальных свойств мембранного окружения.

Вместе с тем, в мембранных доменах белков картировано и объяснено характерное положение патогенных мутаций, приводящих к дисфункции мембранных белков и ассоциированных с социально-значимыми заболеваниями организма человека, прежде всего, такими как онкогенные, нейродегенеративные и пороки развития. Таким образом, применение комплексного подхода, реализованного в молекулярно-биофизической платформе, обеспечило получение принципиально новой информации о фундаментальной взаимосвязи «структура-функция-патогенез» для ряда мембранных белков как перспективных классов фармакологических мишеней, что позволило предложить новые способы направленного воздействия на биологическую активность мембранных белков.

Методология и методы диссертационного исследования

Для получения детальной информации о пространственной структуре и межмолекулярных взаимодействий мембранных доменов белков был разработан комплексный подход, реализованный в универсальной молекулярно-биофизической платформе, в которой метод гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения интегрируется с различными физико-химическими методами и молекулярным моделированием (Рисунок 1). Таким образом, данный подход, включает в себя комбинированное применение современных экспериментальных методов структурной биологии и биофизики (ЯМР, криоэлектронная и атомно-силовая микроскопии, рентгеновская кристаллография, круговой дихроизм, динамическое светорассеяние, флуоресцентная конфокальная микроскопия, малоугловое рентгеновское рассеяние, микроскопический термофорез, дифференциальная сканирующая и изотермическая титрационная калориметрия, и др.), методов биоинженерии и высокопроизводительных вычислительных технологий для молекулярного моделирования.

Данный междисциплинарный подход позволяет получить экспериментальные структурно-динамические данные для мембранных белков и их комплексов олигомеров в окружении, имитирующее клеточную мембрану (таких как мицеллы из детергентов, липидные бицеллы или белок-липидные нанодиски), с последующей детализацией взаимодействий в сложной белок-липидной системе методом молекулярной динамики в явно заданной мембране. В результате это дает возможность получить детальную информацию о внутри- и межмолекулярных взаимодействиях на атомном уровне, установить с высоким разрешением пространственную структуру и описать внутримолекулярную динамику мембранных белков и их комплексов, а также оценить влияние патогенных мутаций и взаимодействие с лигандами, в том числе с перспективными лекарственными соединениями.

В итоге, анализ полученных результатов и обобщение их с литературными данными дает возможность описать молекулярные механизмы функционирования белков в мембране клетки, при этом выявить возможные конформационные перестройки (в том числе аллостерические) и межмолекулярные взаимодействия в норме и при патологиях организма для установления взаимосвязи «структура-функция-патогенез».

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для описания структурно-динамических свойств и установления молекулярных механизмов специфических взаимодействий мембранных доменов белков в средах, имитирующих мембранное окружение, создан и методически отработан оригинальный комплексный подход в виде молекулярно-биофизической платформы, объединяющей взаимодополняющие физико-химические методы исследования на основе гетероядерной ЯМР-спектроскопии высокого разрешения.

2. В рамках комплексного подхода разработаны новые методики гетероядерной ЯМР-спектроскопии для детекции межмолекулярных взаимодействий, описания конформационной динамики, картирования межмолекулярных интерфейсов и измерения свободной энергии взаимодействий мембранных доменов белков.

3 . Определены с высоким разрешением пространственные структуры и описана конформационная динамика мембранных доменов для ряда белков (включая представителей битопных рецепторов типа I), в различных олигомерных состояниях и комплексах, в том числе с прототипами перспективных лекарственных средств, что указывает на универсальность и эффективность комплексного подхода.

4. Для мембранных белков (включая представителей битопных рецепторов типа I из организма человека) детально картированы интерфейсы белок-белок и белок-липид взаимодействий мембранных доменов в имитирующем клеточную мембрану окружении, что позволило охарактеризовать и систематизировать структурно-функциональные детерминанты, отвечающие за межмолекулярные взаимодействия и биологическую активность данных мембранных белков в организме.

5. В основе межмолекулярных взаимодействий и, в частности, механизмов латерального взаимодействия мембранных доменов белков лежат характерные структурные мотивы, определяющие геометрию комплексов в зависимости от липидного окружения. Специфичность взаимодействия ТМ доменов белков определяют остатки как непосредственно в структурных мотивах, так и остатки, участвующие в белок-липидных взаимодействиях.

6. Мембранные домены битопных белков обычно имеют несколько димеризационных (олигомеризационных) мотивов, отвечающих за различные моды их специфической ассоциации, которые могут соответствовать разным функциональным состояниям белка. Переключения между мотивами лежат в основе биологической функции мембранного белка, при том что белок-белок и белок-липид взаимодействия согласованы друг с другом.

7. В процессах димеризации и переключении между интерфейсами белок-белок и белок-липид взаимодействий определяющую роль играют как специфические белок-липид взаимодействия, так и энтропийный вклад липидов, величина которого зависит от локальных свойств мембранного окружения. В свою очередь, конформация внемембранных доменов и подвижных примембранных участков белка, а также их взаимодействие с поверхностью мембраны влияет на локальные свойства липидного бислоя и, соответственно, индуцирует определенную ассоциацию мембранных доменов. И наоборот, конформация мембранных доменов влияет как на мембранной окружение, так и на конформацию внемембранных доменов и примембранных участков белка.

8. В мембранных доменах белков (в том числе битопных рецепторов типа I из организма человека) картировано характерное положение патогенных мутаций, аминокислотных замен, приводящих к дисфункции мембранных белков и ассоциированных с социально-значимыми заболеваниями организма человека, прежде всего, такими как онкогенные, нейродегенеративные и пороки развития. Патогенные мутации имеют тенденцию группироваться в областях структурно-функциональных детерминант и влияют на структурно-динамические свойства и специфическую ассоциацию мембранных доменов, модулируя биологическую функцию мембранных белков.

9. Для ряда мембранных и мембраноактивных белков разных классов предложены молекулярные механизмы их функционирования в мембране клетки, описаны возможные конформационные перестройки (в том числе аллостерические) и межмолекулярные взаимодействия в норме и при патологиях организма, что позволяет установить взаимосвязь «структура-функция-патогенез».

10. Направленное воздействие на биологическую активность мембранных белков возможно посредством соединений (в том числе пептидов), модулирующих структурно-динамические свойства и специфическую ассоциацию мембранных доменов и примембранных участков белков.

11. Для описания сложных механизмов сигнальных процессов, в том числе аллостерических конформационных перестроек, наблюдаемых при активации мембранных рецепторов, разработана новая биофизическая концепция липид-опосредованного механизма передачи сигнала белками через мембрану клетки, рассматривающая функционирование мембранного рецептора в самосогласованной белок-липидной системе и объясняющая ряд парадоксов, наблюдаемых при активации рецепторов дикого типа и с патогенными мутациями.

Вклад автора

Все экспериментальные исследования и теоретические расчеты, вошедшие в данную работу, были выполнены либо самим диссертантом, либо совместно с коллегами, либо под его непосредственным руководством, в том числе в рамках дипломных работ, магистерских и кандидатских диссертаций студентов, аспирантов и соискателей.

Степень достоверности и апробация результатов

Положения, выводы и результаты диссертации были представлены в докладах на профильных международных и российских конференциях. Результаты работы опубликованы в высокорейтинговых международных и отечественных научных изданиях:

74 научные публикации, из которых 58 в изданиях первого и второго квартилей (Q1, Q2).

С помощью разработанной молекулярно-биофизической платформы, объединяющей взаимодополняющие физико-химические методы исследования, установлены с высоким разрешением и размещены в международной базе данных Protein Data Bank более 20 новых пространственных структур мембранных белков и их функциональных фрагментов в различных олигомерных состояниях и комплексах, в том числе с прототипами перспективных лекарственных средств.

Материалы диссертации были многократно представлены в стендовых и устных докладах, на более чем 30 конференциях и симпозиумах, в том числе на конгрессах Американского Биофизического Сообщества, Biophysical Society Annual Meeting (Балтимор, США, 2011; Сан-Диего, США, 2020), на конгрессах Федерации Европейских Биохимических Обществ, FEBS (Санкт-Петербург, Россия, 2013; Иерусалим, Израиль, 2017; Прага, Чехия, 2018; Краков, Польша, 2019: Любляна, Словения, 2021), на международных конгрессах по магнитному резонансу, EUROMAR (Санкт-Петербург, Россия, 2008; Гётеборг, Швеция, 2009; Франкфурт-на-Мане, Германия, 2011; Цюрих, Швейцария, 2014; Прага, Чехия, 2015), SPINUS (Санкт-Петербург, Россия, 2013), "NMR: a tool for biology" (Париж, Франция, 2017) и ISMRBS 2018 (Дублин, Ирландия, 2018), на конференции «Биоинформатика геномной регуляции и структурной/системной биологии» BGRS/SB-2022 (Новосибирск, Россия, 2022), на съездах биохимиков России (Дагомыс, Россия, 2016 и 2019; Сочи, Россия, 2022) и на съезде биофизиков России (Краснодар, Россия, 2023).