Структура и особенности регуляции генов гомологов RFP2 у человека и мыши тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Скоблов, Михаил Юрьевич

• Скоблов, Михаил Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Скоблов, Михаил Юрьевич

1. Введение

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Научно-практическая значимость работы

1.5. Обоснование постановки темы диссертационной работы

2. Обзор литературы

2.1. Принципы регуляции экспрессии генов у эукариот.

Основные элементы

2.1.1. Промоторы

2.1.2. Энхансеры

2.1.3. Транскрипционные факторы

2.1.4. Регуляция экспрессии генов с помощью антисмысловых РНК

2.2. Сравнение регуляторных частей у гомологичных генов

3. Материалы и методы

3.1. Материалы и оборудование

3.2. Методы

4. Результаты и обсуждение

4.1. Определение нуклеотидной последовательности промоторной области гена человека RFP

4.2. Компьютерный анализ промоторной области гена человека RFP2.

4.3. Функциональная характеристика промоторного региона гена человека RFP

4.4. Потенциальные регуляторные элементы промоторной области гена человека RFP

4.5. Установление структуры гена мыши Rfp

4.6. Сравнительный анализ области гена RFP2 у человека и

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и особенности регуляции генов гомологов RFP2 у человека и мыши»

1.1. Актуальность проблемы. Опухолевые заболевания являются одной из ведущих по частоте групп болезней человека и одной из основных причин смертности взрослого населения. Вероятность возникновения и интенсивность прогрессии опухолей зависят от генотипа индивида и от соматических мутаций, возникающих в процессе индивидуального развития. Важным генетическим барьером на пути возникновения и прогрессии опухолей являются гены-супрессоры опухолей. Мутации в этих генах «запускают» опухолевый процесс и этапы его прогрессии. Изучение тонкой структуры и регуляции генов супрессоров у человека необходимы для понимания генетического контроля нормы, определяемой этими генами, и молекулярно-генетических механизмов возникновения и прогрессии опухолей. Поэтому проведение таких исследований является высоко актуальным. Такие исследования стали возможны в последние годы в результате реализации всемирной и российской программ геном человека. Исследование тонкой структуры и функционирование отдельных областей генома проводят сегодня путем сопоставления данных о структуре генома человека в норме с данными о его структуре при патологическом опухолевом процессе, а также на основе данных сравнительной геномики. Такой подход стал возможным лишь в самое последнее время, и бвл использован в ходе осуществления данной диссертационной работы. 1.2. Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось изучение структурнофункциональных особенностей регуляторного района гена RFP2 человека, как наиболее вероятного гена супрессора опухолевого роста, расположенного в области ql4 хромосомы 13. Для реализации поставленной цели решались следующие задачи: 1. Определить этого гена. 2. Провести биоинформатический анализ промоторной области и выявить потенциальные элементы регуляции транскрипции гена RFP2 3. Выявить и провести анализ спектра потенциальных и список сайтов самих связывания транскрипционных факторов нуклеотидную последовательность промоторного региона гена RFP2 человека и точку инициации транскрипции для транскрипционных факторов, взаимодействующих с регуляторной областью гена RFP2 у человека 4. Минимизировать промоторную область гена RFP2 человека и экспериментально элементы этого гена. 5. Определить региона гена сравнительный нуклеотидную RFP2 мыши анализ последовательность и провести последовательностей промоторного нуклеотидов биоинформатический локализовать потенциальные регуляторные промоторных районов гена RFP2 человека и мыши и, таким образом, выявить причины сходства спектров тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши. 1.3. Научная новизна. Впервые определена и зарегистрирована в GenBank (AF363782) последовательность промоторный нуклеотидов гена длиной 3,6 RFP2. т.п.н содержащая регион человека Экспериментально определено положение точки инициации транскрипции гена RFP2. Впервые проведен компьютерный анализ промоторной области гена RFP2 человека и вьывлены потенциальные элементы регуляции этого гена: GC-бокс и сайты связывания транскрипционных факторов. Выявлена уникальная особенность структуры промотора гена RFP2: в транскрибируемой асимметрия в нити ДНК перед ОС-боксом сайтов расположен связывания несовершенный повтор структуры GnA длиной 280 п.н. Выявлена распределении количества транскрипционных факторов в области несовершенного повтора: около 200 сайтов находятся в транскрибируемой нити ДНК, а в нити, комплементарной этому участку, сайты связывания отсутствуют. Впервые с помощью люциферазных конструкций локализованы четыре регуляторных элемента промотора гена RFP2: базальный промотор, энхансер, сайленсер и участок, отвечающий за стабильность мРНК гена RFP2. Определены потенциальные сайты промотора связывания гена RFP2, транскрипционных факторов в участках предположительно содержащих энхансер и сайленсер. Проведен сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов промоторной области гена RFP2 человека и мыши. Обнаружен разрыв синтении хромосом человека и мыши непосредственно перед белоккодирующей областью гена, которая остается гомологичной у человека и мыши. Экспериментально выявлены две изоформы гена мыши ортологичного гену RFP2 человека. Впервые с помощью биоинформатического анализа в регуляторной части гена RFP2 у мыши выявлен набор 20 потенциальных сайтов связывания для 18 факторов транскрипции, относящимися к 11 семействам. Проведен сравнительный анализ наборов сайтов связывания транскрипционных факторов и самих транскрипционных факторов в регуляторной области генов RFP2 у мыши и человека.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Скоблов, Михаил Юрьевич

6. Выводы

1. Определена и зарегистрирована в GenBank (AF363782) последовательность нуклеотидов длиной 3,6 т.п.н содержащая промоторный региона и участок инициации транскрипции гена RFP2 человека. Положение точки инициации транскрипции гена RFP2 определено экспериментально.

2. Проведен компьютерный анализ промоторной области гена RFP2 человека и выявлены потенциальные элементы регуляции этого гена: GC-бокс и сайты связывания транскрипционных факторов. Проведенный анализ выявил порядка 300 потенциальных сайтов связывания, для 26 факторов транскрипции, относящимися к 17 семействам.

3. Выявлена уникальная особенность структуры промотора гена RFP2 человека: в транскрибируемой цепи ДНК перед GC-боксом расположен несовершенный повтор структуры GnA длиной 280 п.н. Выявлена асимметрия в распределении количества сайтов связывания транскрипционных факторов в области несовершенного повтора: около 200 сайтов находятся в транскрибируемой цепи ДНК, а в цепи, комплементарной этому участку, сайты связывания отсутствуют.

4. Получены 9 делеционных производных промоторного участка гена RFP2 человека в составе рекомбинантных плазмид с репортерным геном люциферазы. Экспериментально определена активность промотора каждого делеционного варианта и локализованы четыре регуляторных элемента промотора гена RFP2: базальный промотор, энхансер, сайленсер и участок, отвечающий за стабильность РНК гена RFP2.

5. Определены потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов в участках промотора гена RFP2 человека, предположительно содержащих энхансер и сайленсер.

6. Экспериментально выявлены две изоформы гена мыши ортологичного гену RFP2 человека определив тем самым возможные промоторные регионы. Проведен сравнительный компьютерный анализ последовательности нуклеотидов промоторной области гена RFP2 человека установленной в нашей работе и опубликованной в ходе нашей работы последовательности нуклеотидов промоторной области гена Rfp2 мыши. Обнаружен разрыв синтении хромосом человека и мыши непосредственно перед белок-кодирующей областью гена, которая остается гомологичной у человека и мыши.

7. Проведен биоинформатический анализ регуляторной части гена Rfp2 у мыши. Проведен сравнительный анализ регуляторных элементов выявленных в промоторных областях генов RFP2 у мыши и человека. Проанализированые регуляторные элементы транскрипции не имеют общих черт для объяснения сходства спектров тканеспецифичности экспрессии гена RFP2 у человека и мыши.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Скоблов, Михаил Юрьевич, 2004 год

1. Патрушев Л.И., Экспрессия генов., Москва, 2000.

2. Abbott A., Abu-Threideh J., Ahrens С., et al. Genome Sequence of the Nematode Caenorhabditis elegans. A Platform for Investigating Biology // Science. 1998. V. 282. P. 2012-2018.

3. Adams MD, Celniker SE, Holt RA., et al. The genome sequence of Drosophila melanogaster// Science. 2000. V. 287. P. 2185-95.

4. Aravin AA., Naumova NM, Tulin AV, Vagin VV, Rozovsky YM, Gvozdev VA. Double-stranded RNA-mediated silencing of genomic tandem repeats and transposable elements in the D. melanogaster germline.// Curr. Biol. 2001. V. 11, P. 1017-1027.

5. Banerji J., Olson L., Schaffher W. A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes // Cell. 1983. V. 33, P. 729-740.

6. Baranova AV, Lobashev AV, Ivanov DV, Krukovskaya LL, Yankovsky NK, Kozlov AP. In silico screening for tumour-specific expressed sequences in human genome. // FEBS Lett. 2001. V. 508 P. 143-8.

7. Bass BL. RNA editing by adenosine deaminases that act on RNA. //Annu. Rev. Biochem. 2002. V. 71, P. 817-846.

8. Baylin SB, Herman JG. Epigenetics and loss of gene function in cancer. In DNA Alterations in Cancer (Ehrlich, M., ed.). Eaton publishing, MA, USA. 2000. P. 293-309.

9. Blackwood EM, Kadonaga JT. Going the Distance: A Current View of Enhancer Action. // Science., 1998., V. 281. P.60.

10. Blackwood MA, Weber BL. BRCA1 and BRCA2: from molecular genetics to clinical medicine. //J Clin Oncol. 1998. V. 16. P. 1969-77.

11. Burke LJ, Zhang R, Lutz M, Renkawitz R. The thyroid hormone receptor and the insulator protein CTCF: two different factors with overlapping functions. // J Steroid Biochem Mol Biol. 2002. V. 83. P. 49-57.

12. Castresana J. Genes on human chromosome 19 show extreme divergence from the mouse orthologs and a high GC content // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P.1751 1757.

13. Chinwalla AT, Cook LL, Delehaunty KD, et al. Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome // Nature. 2002. V. 420. P. 520-562.

14. Ehrlich M. DNA hypomethylation and cancer. // In: DNA Alterations in Cancer. (Ehrlich, M., ed.). Eaton Publishing, MA, USA. 2000. P. 273-291.

15. Emes RD, Goodstadt L, Winter EE, Ponting CP. Comparison of the genomes of human and mouse lays the foundation of genome zoology. // Hum Mol Genet. 2003 Apr 1; 12(7): 701-9.

16. Feng Q., Zhang Y., Hao P., et al. Sequence and analysis of rice chromosome 4// Nature. 2002. V. 420. P. 316-20.

17. Gibbs RA, Weinstock GM, Metzker ML, Muzny DM, Sodergren EJ, Scherer S, Scott G. Genome sequence of the Brown Norway rat yields insights into mammalian evolution. //Nature. 2004. V. 428. P. 493-521.

18. Gilles SD, Tonegawa S., Expression of cloned immunoglobulin genes introduced into mouse L cells. // Nucleic Acids Res. 1983. V. 11. P. 7981-97.

19. Goffeau A., Barrell B.G., Bussey H., et al. Life with 6000 genes // Science. 1996. V. 274. P. 563-7.

20. Gray M.D., Shen J.C., Kamath-Loel A.S. et al. The Werner syndrome protein is a DNA helicase. // Nature Genet. 1997. V. 17. P. 100103.

21. Grosschedl R, Birnstiel M. Spacer DNA sequences upstream of the TATA sequence are essential for promotion of H2a gene transcription in vivo. // Proc.Nat.Acad.Sci.USA. 1980. V. 77, P. 7102 7106.

22. Ham J, Steger G, Yaniv M., How do eukaryotic activator proteins stimulate the rate of transcription by RNA polymerase II? // FEBS Lett. 1992. V. 307. P. 81-6.

23. Hannon, G.J. RNA interference. // Nature. 2002. V. 418, 244-251

24. Holt RA., Subramanian GM, Halpern A, et al. The genome sequence of the malaria mosquito Anopheles gambiae // Science. 2002. V. 298. P. 129-49.

25. Kennerdell JR, Yamaguchi S, Carthew RW. RNAi is activated during Drosophila oocyte maturation in a manner dependent on aubergine and spindle-E. //Genes Dev. 2002 V. 16, P. 1884-1889.

26. Kim J, Iyer VR., Global role of TATA box-binding protein recruitment to promoters in mediating gene expression profiles. // Mol Cell Biol. 2004. V. 24. P. 8104-12.

27. Kiyosawa H, Yamanaka I, Osato N, Kondo S, Hayashizaki Y; RIKEN GER Group; GSL Members. .Antisense transcripts with FANTOM2 clone set and their implications for gene regulation. // Genome Res. 2002. V. 13, P. 1324-1334.

28. Koop B.F., Hood L. Striking sequence similarity over almost 100 kilobases of human and mouse T-cell receptor DNA // Nat Genet. 1994. V. 7. P. 48-53.

29. Kumar M. and Carmichael GG. Nuclear antisense RNA induces extensive adenosine modifications and nuclear retention of target transcripts. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1997. V. 94, P. 3542-3547.

30. Kuo S, Chesrown SE, Mellott JK, Rogers RJ, Hsu JL, Nick HS. In vivo architecture of the manganese superoxide dismutase promoter. II J Biol Chem. 1999. V. 274 P.3345-54.

31. Lamerdin JE, Montgomery MA, Stilwagen S.A., Scheidecker LK, Tebbs RS, Brookman KW, Thompson LH, Carrano AV. Genomic sequence comparison of the human and mouse XRCC1 DNA repair gene regions. // Genomics. 1995. V. 25. P. 547-54.

32. Lander E.S., Linton L.M., Birren В., et al. Initial sequencing and analysis of the human genome // Nature. 2001. V. 409. P. 860-921.

33. Lavorgna G., Dahary D, Lehner B, Sorek R, Sanderson C.M., Casari G. In search of antisense. // Trends in Biochemical Sciences 2004. V.29.P. 15-21.

34. Lehner, B. et al. Antisense transcripts in the human genome. //Trends Genet. 2002. V. 18, P. 63-65.

35. Lieberman PM, Berk AJ. A mechanism for TAFs in transcriptional activation: activation domain enhancement of TFIID-TFIIA--promoter DNA complex formation. // Genes Dev. 1994 V.8. P.995-1006.

36. Magoulas C, Fried M. Isolation and genomic analysis of the human surf-6 gene: a member of the Surfeit locus // Gene. 2000. Vol. 8. P. 115-23.

37. Munroe, SH, Lazar MA. Inhibition of c-erbA mRNA splicing by a naturally occurring antisense RNA. // J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 2208322086.

38. Nordhoff V., Hubner K., Bauer A., et al. Comparative analysis of human, bovine, and murine Oct-4 upstream promoter sequences // Mamm Genome. 2001. Vol. 12. P. 309-17.

39. Oeltjen J., Malley Т., Muzny D., et al. Large-scale comparative sequence analysis of the human and murine bruton's tyrosine kinase loci reveals conserved regulatory domains // Genome Research. 1997. V. 7. P. 315-329.

40. Okazaki Y., M. Furuno, T. Kasukawa, J. Adachi, H. Bono, S. Kondo, et al., Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. // Nature., 2002 V. 420, P. 563-73.

41. Pedersen AG, Baldi P, Chauvin Y, Brunak S., The biology of eukaryotic promoter prediction—a review. // Comput Chem. 1999. V. 23. P. 191-207.

42. Peters, NT, Rohrbach JA, Zalewski BA, Byrkett CM, Vaughn JC. RNA editing and regulation of Drosophila 4frnp expression by sas-10 antisense readthrough mRNA transcripts. // RNA. 2002. V. 9. P. 698-710.

43. Prescott EM. Proudfoot NJ. Transcriptional collision between convergent genes in budding yeast. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. V. 99. P. 8796-8801.

44. Ptashne M. How eukaryotic transcriptional activators work. II Nature. 1988. V.335. P. 683-9.

45. Ptashne M, Gann AA. Activators and targets. //Nature. 1990. V. 346. P. 329-31.

46. Queen C, Baltimore D. Immunoglobulin gene transcription is activated by downstream sequence elements. //Cell. 1983. V. 33. P. 741-8.

47. Reik W, Walter, J. Genomic imprinting: parental influence on the genome. // Nat. Rev. Genet. 2001. V. 2. P. 21-32.

48. Risitano A, Fox KR. Stability of intramolecular DNA quadruplexes: comparison with DNA duplexes. // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 6507-13.

49. Runte M, Huttenhofer A, Gross S, Kiefmann M, Horsthemke B, Buiting K. The IC-SNURF-SNRPN transcript serves as a host for multiple small nucleolar RNA species and as an antisense RNA for UBE3A. // Hum. Mol. Genet. 2001. V. 10. P. 2687-2700.

50. Salanoubat M., Lemcke K., Rieger M., et al. Sequence and analysis of chromosome 3 of the plant Arabidopsis thaliana. // Nature. 2000. V. 408. P. 820-2.

51. Sanchez M., Queralt R., Bruguera M., Rodes J., Oliva R. Cloning, sequencing and characterization of the rat hereditary hemochromatosis promoter: comparison of the human, mouse and rat HFE promoter regions // Gene. 1998. Vol. 225. P. 77-87.

52. Sasaki Т., Matsumoto Т., Yamamoto K., et al. The genome sequence and structure of rice chromosome 1 // Nature. 2002. V. 420. P. 3126.

53. Scadden AD, Smith CW. Specific cleavage of hyper-edited dsRNAs. // EMBO J. 2001. V. 20. P. 4243-4252.

54. Schild-Poulter C, Shih A, Yarymowich NC, Hache RJ. Down-regulation of histone H2B by DNA-dependent protein kinase in response to DNA damage through modulation of octamer transcription factor 1. // Cancer Res. 2003. V. 63. P. 7197-205.

55. Schramke V, Allshire, R. Hairpin RNAs and retrotransposon LTRs affect RNAi and chromatin-based gene silencing. // Science. 2003. V. 301. P. 1069-1074.

56. Shendure J, Church G.M. Computational discovery of sense-antisense transcription in the human and mouse genomes. // Genome Biol. 2002, V.3. P.l-14.

57. Shenk T. Transcriptional control regions: nucleotide sequence requirements for initiation by RNA polymerase II and Ш. // Curr Top Microbiol Immunol. 1981. V. 93 P. 25-46.

58. Sorek R, Safer, HM. A novel algorithm for computational identification of contaminated EST libraries. // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 1067-1074.

59. Stamm S, Zhu J, Nakai K, Stoilov P, Stoss O, Zhang M. An alternative-exon database and its statistical analysis. // DNA Cell Biol. 2002. V. 19. P. 739-756.

60. Suzuki Y, Yamashita R, Shirota M, Sakakibara Y, Chiba J, Mizushima-Sugano J, Nakai K, Sugano S. Sequence comparison of human and mouse genes reveals a homologous block structure in the promoter regions. // Genome Res. 2004. V. 14. P. 1711-8.

61. Tabata S., Kaneko Т., Nakamura Y., et al. Sequence and analysis of chromosome 5 of the plant Arabidopsis thaliana. // Nature. 2000. V. 408. P. 823-6.

62. The Arabidopsis Genome Initiative. Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V. 408. P. 796-815.

63. Theologis A, Ecker JR, Palm CJ et al. Sequence and analysis of chromosome 1 of the plant Arabidopsis thaliana // Nature. 2000. V.408. P. 816-20.

64. Tufarelli C., Stanley JA, Garrick D, Shaipe JA, Ayyub H, Wood WG, Higgs DR. Transcription of antisense RNA leading to gene silencing and methylation as a novel cause of human genetic disease. // Nat. Genet. 2003. V. 34. P. 157-165.

65. Venter J.C., Adams M.D., Myers E.W., et. al. The sequence of the human genome // Science. 2001. V. 291. P. 1304-1351.

66. Volpe ТА, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SI, Martienssen RA. Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi. Science. 2002. V. 297 P. 1833-1837.

67. Weaks RL, Ramsoondar JJ, Gallagher DS Jr, Nogues C, Piedrahita JA. Isolation, characterization and chromosomal localization of the porcineciliary neurotrophic factor (CNTF) gene 11 Anim Genet. 1997. Vol. 28. P. 354-7.

68. Westman В J, Mackay JP, Gell D. Ikaros: a key regulator of haematopoiesis. // Int J Biochem Cell Biol. 2002. V. 34. P. 1304-7.

69. Wingender E, Dietze P, Karas H, Knuppel R. TRANSFAC: a database on transcription factors and their DNA binding sites. // Nucleic Acids Res. 1996. V. 24. P. 238-41.

70. Wutz A. Barlow DP. Imprinted expression of the Igf2r gene depends on an intronic CpG island. // Mol Cell Endocrinol. 1998. V.140, 914.

71. Zhang Z, Carmichael GG. The fate of dsRNA in the in the human genome. // Nat. Biotechnol. 2001. V. 21. P. 379-386.

72. Zhu H, Joliot V, Prywes R., Role of transcription factor TFIIF in serum response factor-activated transcription // J Biol Chem. 1994. V. 269. P.3489-97.

73. Список работ, опубликованных по темедиссертации.

74. Иванов Д.В., Бородина Т.А., Скоблов М.Ю., Пестова А.А., Капанадзе Б.И., Сангфельдт У., Эйнхорн С., Баранова А.В., Янковский Н.К.

75. Структурное и функциональное исследование нового гена человека RFP2. Постерное сообщение на 10-й итоговой конф. "Геном Человека-2000", г.Черноголовка, 18-22 декабря 2000 г.

76. M.Yu. Skoblov, D.V. Ivanov, K.S.Shachbasov, A.V.Baranova, N.K.Yankovsky Promoter region structure of human gene RFP2 Molecular mechanisms of genetic processes and biotechnology International symposium, 2001, Novemberl 8-24, Moscow-Minsk

77. Я благодарю всех людей, которые помогли мне выполнить эту работу, а также тех, кто мне в этом не мешал:

78. Николая Казимировича Янковского за научное и административное руководство, и существование замечательной лаборатории анализа генома.

79. Анчу Баранову за то, что благодаря ей сложилось моё научное мировоззрение, и я ощутил свободу научной деятельности. Спасибо за все, за эту маленькую жизнь, которую мы прожили.

80. Аню Гуськову и Костю Шахбазова идти вперед, в неизвестность, тяжелее всего. Спасибо, что вы были со мной.

81. Спасибо Андрею Лобашеву за его общение, воспоминание о котором мне очень приятны.

82. Всех сотрудников, аспирантов и студентов лаборатории анализа генома, бывших и нынешних, за приятную человеческую атмосферу.

83. Моих родителей, за их постоянную поддержку и понимание.