Структура и экспрессия ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Киселева, Лариса Леонидовна

• Киселева, Лариса Леонидовна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Киселева, Лариса Леонидовна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Глицеролипиды и жирные кислоты цианобактерий.

1.2. Адаптивные изменения жирнокислотного состава в клетках цианобактерий в зависимости от условий окружающей среды.

1.3. Клонирование генов десатураз цианобактерий.

1.4. Десатуразы жирных кислот цианобактерий: функции, структура, биохимические свойства.

1.5. Температурозависимая экспрессия генов десатураз цианобактерий.

1.6. Физико-химические особенности ферментов термофильных организмов.

Глава II. ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Работа со штаммами цианобактерий.

2.2. Конструирование геномной библиотеки.

2.3. Клонирование и секвенирование ДНК.

2.4. Экспрессия desC-гена в клетках Е. coli.

2.5. Выделение РНК и нозерн-блот анализ.

2.6. Получение антител против А9-десатуразы и вестерн-блоттинг.

2.7. Анализ липидов и жирных кислот.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Общая характеристика объекта.

3.1.1. Ростовые характеристики Synechococcus vulcanus.

3.1.2. Липидный состав Synechococcus vulcanus.

3.1.3. Жирнокислотный состав Synechococcus vulcanus.

3.2. Клонирование гена desC из Synechococcus vulcanus.

3.3. Особенности структуры гена desC из термофильной цианобактерии.

3.4. Экспрессия рекомбинантной А9-десатуразы в Е. coli.

3.5. Температурозависимая экспрессия гена Д9-десатуразы термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus.

3.5.1. Изменение уровня мРНК.

3.5.2. Изменение уровня белка.

3.6. Влияние температуры на состав мембранных липидов Synechococcus vulcanus.

3.7. Температурозависимые изменения общего содержания жирных кислот мембранных липидов.

3.8. Температурозависимые изменения жирнокислотного состава в различных классах липидов.

3.8.1. Температурозависимые изменения жирнокислотного состава нейтральных липидов Synechococcus vulcanus.

3.8.2. Температурозависимые изменения состава жирных кислот полярных липидов Synechococcus vulcanus.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структура и экспрессия ацил-липидной десатуразы из термофильной цианобактерии Synechococcus vulcanus»

Каждому, кто изучает биологию, известно, насколько зависят от температуры распространение вида, скорость физиологических процессов и в конечном счете само выживание организмов. К какому бы уровню биологической организации мы ни обратились, везде можно увидеть, какую важную, а иногда даже главную роль играет температура во взаимоотношении организма с внешней средой. Опасность температуры как фактора окружающей среды заключается, прежде всего, в ее нестабильности. Все живые организмы в большей или меньшей степени подвержены температурным перепадам. Животные могут использовать эффективные поведенческие, анатомические и физиологические пути с целью избегания вредных последствий температурного стресса. Даже эктотермные животные, чья температура тела изменяется в довольно близком соответствии с температурой окружающей среды, тем не менее обладают терморегуляторными поведенческими реакциями, благодаря которым они находят подходящую микросреду чтобы удержать температуру тела в оптимальном диапазоне. Растительные же организмы, лишенные возможности передвигаться, вынуждены использовать адаптивную стратегию иного рода, основанную на компенсаторных изменениях в биохимии клеток. Растения настолько часто бывают подвержены температурным стрессам, что имели бы мало шансов на выживание, если бы не тонкие механизмы молекулярной адаптации, незамедлительно включающиеся при изменении температуры окружающей среды. В последнее время интенсивно изучаются вопросы холодового шока у растений. Нижеизложенную работу также можно отнести к развитию этого направления научных исследований.

Вообще, низкие температуры вызывают значительную перестройку всего клеточного метаболизма (Лось, 1997). Изменения включают десатурацию жирных кислот, накопление голиолов, аминокислот, глицин-бетаина, сахарозы, специфических белков.

Низкие температуры активизируют гены, индуцируемые абсцизовой кислотой, гены дегидринов, белков позднего эмбриогенеза, липидпереносящих белков, некоторых рибосомных и других РНКсвязывающих белков (Лось, 1997). Тем не менее, считается, что ключевую роль в адаптации организмов к снижению температуры играет десатурация жирных кислот мембранных липидов. Приоритет изучению именно этих процессов, присходящих в клетке при снижении температуры, можно легко объяснить, вспомнив об исключительной важности биомембран в жизнедеятельности живых организмов. Ведущая роль мембран в поддержании гомеостаза клеток и одновременном осуществлении тонких изменений своей функциональной активности при действии внешних и внутренних сигналов обусловлена особенностями их физико-химической организации. Согласно общепринятой жидкостно-мозаичной модели

Singer and Nicolson, 1972), мембраны представляют собой динамическую систему, основными компонентами которой являются липидный бислой и белки с очень широким спектром функциональной активности. При снижении температуры окружающей среды из жидкокристаллической фазы мембраны переходят в фазу геля, при этом текучесть уменьшается примерно на два порядка. Структурные и динамические свойства бислоя, находящегося в фазе геля, совершенно не совместимы с организацией и правильным функционированием белковых компонентов в мембране.

Для того, чтобы при снижении температуры мембрана не затвердевала, она должна содержать достаточное количество ненасыщенных липидов: увеличение числа двойных связей приводит к понижению температуры, при которой жидкость превращается в гель. Такой способ сохранения текучего состояния мембраны был обнаружен у бактерий, растений и животных (White and Somero, 1982; Hazel, 1984). Исходя из этого очевидно огромное значение знаний о структуре, свойствах и регуляции десатураз жирных кислот -ферментов, отвечающих за образование двойных связей, и, следовательно, за изменение физических свойств биологических мембран.

Хотя изучение десатурации жирных кислот и структуры ферментов, ее осуществляющих, ведется достаточно давно и интенсивно, исследования проводятся лишь на объектах, живущих в так называемых нормальных условиях. ЗадумыЕ,ая же нижеизложенную работу, нам было интересно узнать, а какие же механизмы лежат в основе адаптации к низкой температуре у термофильных организмов? Насколько сходны механизмы температурной адаптации термофилов и мезофилов? Вторым аспектом, представляющим не только академический, но и практический интерес, явилось приобретение знаний о структуре "термофильных" десатураз. Что лежит в основе термостабильности этих ферментов? Насколько сильны изменения структуры генов, кодирующих десатуразы в термофильных организмах?

Проследить изменения в структуре десатураз от мезофильных к термофильным организмам и предсказать аминокислотные замены, приводящие к термоустойчивости - значит сделать шаг на пути конструирования рекомбинантных белков с заданными физико-химическими свойствами.

Таким образом, наша работа должна была коснуться не только вопросов быстрой адаптации организмов к снижению температуры, но и вопросов эволюционной стратегии в приспособлении к жизни при экстремально высоких температурах.

В качестве объекта исследования мы выбрали цианобактериальный штамм $упескососст уи1сапш. Известно, что некоторые штаммы цианобактерий {БупесНосузйз Бр. РСС 6803,

Бупескососст эр. РСС 7942 и Зупескососст Бр. РСС 7002) обладают способностью включать в свой геном чужеродную ДНК, что делает их важнейшими объектами для изучения принципиальных проблем генетической инженерии, молекулярной и клеточной биологии. Важной для нас особенностью является то, что структура плазматической и тилакоидных мембран цианобактерий по своему липидному составу сходна с таковой мембран хлоропластов высших растений.

Таким образом, цианобактерии очень удобны как модельная система для изучения молекулярных механизмов адаптации к различного рода стрессам, в том числе и к снижению температуры окружающей среды.

Целью нашей работы явилось клонирование генов десатураз из термофильной цианобактерии Зупескососсш мгйсапт, изучение их экспрессии в условиях снижения температуры окружающей среды. Исходя из цели работы, были поставлены следующие задачи:

1. Клонировать ген ацил-липидной десатуразы из Бупескососст \и1сапт.

2. Выявить особенности аминокислотной последовательности десатуразы из термофильной цианобактерии Бупескососсш \>и1сапт.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Киселева, Лариса Леонидовна

выводы

1. Впервые клонирован ген десатуразы жирных кислот из термофильного организма и исследована температурозависимая экспрессия этого гена на уровне мРНК, соответствующего белка и продуктов десату рации. Показано, что с/еяС является единственным геном в геноме Бупескососст уикапш, кодирующим десатуразу жирных кислот.

2. Показано, что снижение температуры окружающей среды может вызывать индукцию экспрессии гена ¿/е^С, а также, возможно, увеличение активности предсуществующей А9-десатуразы.

3. Впервые детально исследованы адаптивные изменения жирнокислотного состава в индивидуальных классах липидов термофильной цианобактерии.

4. Впервые обнаружено, что, в отличие от мезофильных цианобактерий, в которых при снижении температуры наблюдается десатурация нейтральных липидов мембран, в основном МГДГ, у термофильной цианобактерии десагурации подвергаются преимущественно заряженные анионные липиды (сульфо- (СХДГ) и фосфо-(ФГ) липиды).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Как известно, состав мембранных липидов клеток растений значительно варьирует взависимости от условий окружающей среды. Это связано с исключительной важностью биомембран в жизнедеятельности живых организмов, в том числе и в их адаптации к разнообразным экологическим ситуациям, в частности к широкому диапазону температур, включая экстремальные.

Свойства липидного бислоя мембран определяются главным образом его гидрофобной частью, состоящей из жирнокислотных цепей ("хвостов") липидов, подвижность которых зависит от степени ненасыщенности. Последняя же определяется функционированием десатураз жирных кислот - добавляющих двойные связи в ацильные цепи. Показано, что при снижении температуры окружающей среды в клетках усиливается экспрессия генов, кодирующих десатуразы жирных кислот. До настоящего времени структура этих генов и их адаптивная экспрессия изучалась лишь на мезофильных организмах. Целью нашей работы было изучение структуры гена ацил-липидной десатуразы и его адаптивной экспрессии из термофильного организма - цианобактерии Бупескососст уи1сапш.

Проведённые нами исследования показали, что снижение температуры окружающей среды приводит к десатурации полярных липидов (СХДГ и ФГ) в Бупескососст угйсапт, в то время как у мезофильных цианобактерий десатурации подвергается в основном нейтральный МГДГ.

Интересны и сами принципы адаптивной регуляции десатурации у термофильной цианобактерии. Снижение температуры на 10°С вызывает индукцию экспрессии гена, кодирующего А9-десатуразу, вследствие чего усиливается синтез фермента, что, в свою очередь, ведёт и к ускорению синтеза мононенасыщенных жирных кислот мембранных липидов. Аналогичные процессы ведут и к восстановлению исходной текучести мембран и в мезофильных цианобактериях.

Понижение температуры на 20°С затармаживает процессы синтеза РНК на ДНК-матрице и, соответственно, синтез белков, в том числе и десатураз, но при этом наблюдаются значительные изменения в жирнокислотном составе мембранных липидов Зупескососст уи1сапт: снижается содержание насыщенных и увеличивается содержание мононенасыщенных жирных кислот. Этот беномен наводит на мысль о возможном увеличении активности фермента при резком снижении температуры. Подобный путь адаптации к снижению температуры на уровне десатурации липидов мембран впервые обнаружен у цианобактерий.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Киселева, Лариса Леонидовна, 2000 год

1. Владимирова М.Г., Семененко В.Е. (1962) Интенсивная культура одноклеточных водорослей. М. : Изд-во АН СССР. 59 с.

2. Квеситадзе Г. И. (1990) Ферменты микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях //42-е Баховское чтение: М.: Наука. 54 С.

3. Клячко-Гурвич, Г.Л. и Семенова, А.Н. (1976) Содержание и жирнокислотный составмоногалактозилтриглицеридов в зависимости от освещенности и фазы роста в накопительной культуре. Физиология растений 23, 726-733.

4. Клячко-Гурвич, Г.Л. и Семенова, А.Н. (1977) Изменение содержания и жирнокислотного состава моногалактозилдиглицеридов (МГДГ) при повышении освещенности клеток хлореллы. Физиология растений 24, 75-82.

5. Клячко-Гурвич, Г.Л., Семенова, А.Н., и Семененко, В.Е. (1980) Липидный обмен хлоропластов при адаптации клеток хлореллы к снижению освещенности. Физиология растений 27, 370-379.

6. Клячко-Гурвич, Г. JI., Цоглин, Л.Н., и Можайцева, Г.И.(1981а) Обмен липидов в ходе онтогенеза хлореллы в связи с активностью фотосинтетического аппарата. Физиология растений 28, 421--429.

7. Клячко-Гурвич, Г.Л., Цоглин, Л.Н., и Семенова, А.Н.(19816) К вопросу об участиимоногалактозилдиглицеринов (МГДГ) с различным составом жирных кислот в организации мембран хлоропласта. Физиология растений 28, 510-518.

8. Лось, Д.А. и Мурата, Н. (1994) Накопление транскрипта desA в Synechocystis РСС68 03 при низких температурах является результатом активации транскрипции и увеличения стабильности РНК. Физиология растений 41, 170-175.

9. Семененко, В.Е. (1985) Саморегулированиефизиологических функций и управление биосинтезом фотосинтезирующих клеток. В кн. Новые направления в физиологии растений. М. Наука. с. 8 4-10 4 .

10. Шульц Г., Ширмер Р. (1982) Принципы структурной организации белков //М.: Мир. С. 354.

11. Юрьева, М.И. (1988) Физиолого-биохимическиеособенности одноклеточной красной водоросли Porphyridium cruentum как продуцентаполиненасыщенных жирных кислот. Дисс. канд. биол. наук. Владивосток, 1988. 165 с.

12. Al-Hasan, R.H., Ali, A.M., and Radwan, S.S. (1989) Effects of light and dark incubation on the lipid and fatty acid composition of marine cyanobacteria. J Gen Microbiol 135, 865-872.

13. Avelange-Macherel, M.H., Macherel, D., Wada, H., and Murata, N. (1995) Site-directed mutagenesis of histidine residues in the delta 12 acyl-lipid desaturase of Synechocystis. FEBS Lett. 361, 111114 .

14. Bendzko P., Hintsche R. (1978) //Proc. XII FEBS Meet. Dresden. P. 3727.

15. Biffen J. H. F., Williams R. A. D. (1976) Enzymes and proteins from thermophilic microorganisms //Ed. H. Zuber. Basel: Brikhauser Verl. P. 187 -197 .

16. Boccu E., Veronese F. M., Fontana A. (1976) Enzymes and proteins from thermophilic microorganisms //Ed. Zuber. Basel H.: Birk.hauser Verl. P. 229 236.

17. Browse, J., McCourt, P.J., and Somerville, C.R. (1986a) Fatty acid composition of leaf lipids determined after combined digestion and fatty acid methyl ester formation from fresh tissue. Anal. Biochem. 152, 141-145.

18. Browse, J., Warwick, N., Somerville, C.R., and Slack, C.R. (1986b) Fluxes through the prokaryotic and eukaryotic pathways of lipid synthesis in the '16:3' plant Arabidopsis thaliana. Biochem. J. 235, 25-31.

19. Bryant D.A. (ed.) (1995) Molecular Biology of Cyanobacteria. Kluwer Acad. Publ. N.Y. 1995, 765 P

20. Charbonnier, F. and Forterre, P. (1994) Comparison of plasmid DNA topology among mesophilic and thermophilic eubacteria and archaebacteria. J. Bacteriol. 1760, 1251-1259.

21. Constantopoulos, G. and Bloch, K. (1967) Effect of light intensity on the lipid composition of Euglena gracilis. J. Biol. Chem. 242, 3538-3542.

22. Cossins, A.R. and Prosser, C.L.(1978) Evolutionary adaptation of membranes to temperature. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 75, 2040-2043.

23. Cossins, A.R. ed. (1994) Temperature adaptation of biological membranes. London, Portland, 227p.

24. Cossins, A.R. (1977) Evolutionary and seasonal adaptation of membranes to temperature. Biochem. Soc. Trans. 5, 106-107.

25. Cossins, A.R.(1983) Adaptive responses of fish membranes to altered environmental temperature. Biochem. Soc. Trans. 11, 332-333.

26. Cossins, A.R. (1991) Physiology. Cold facts and naked truth. Nature 353, 699

27. Cossins, A.R., Behan, M., Jones, G., and Bowler, K.(1987) Lipid-protein interactions in the adaptive regulation of membrane function. Biochem. Soc. Trans. 15, 77-81.

28. Cowan D. A., Daniel R. M. (1982) //Biochem. Et biophys. Acta. V. 705. P. 293 305,

29. Crabb J. W., Murdock A.L., Amelunxen R. E. (1977) //Ibid. V. 16. P. 4840 4847.

30. Distel, R.J., Robinson, G.S., and Spiegelman, B.M. (1992) Fatty acid regulation of gene expression: transcriptional and posttranscriptional mechanisms. J. Biol. Chem. 267, 5937-5941.

31. Douce, R. & Joyard, J. (1990). Biochemistry and function of the plastid envelope. Annu Rev Cell Biol 6, 173-216.

32. Eguchi, H., Wakagi, T., and Oshima, T. (1989) A highly stable NADP-dependent isocitratedehydrogenase from Termus thermophilus HB8: purification and general properties. Biochim. Biophys. Acta. 990, 133-137.

33. Farkas, T. (1984) Adaptation of fatty acid composition to temperature--a study on carp (Cyprinus carpio L.) liver slices. Comp. Biochem. Physiol. B. 79, 531-535.

34. Ferguson, J.H.(1977) Effect of photoperiod and cold acclimation upon plasma free fatty acid levels in the white rat. Comp. Biochem. Physiol. B. 56, 265-266.

35. Fontana J. (1986) Biochemistry, genetics and technology of extremophilis microorganisms //Padua (Itali): Univ. Press. 261 p.

36. Foot, M., Jeffcoat, R., Barratt, M.D., and Russell, N.J. (1983a) The effect of growth temperature on the membrane lipid environment of the psychrophilic bacterium Micrococcuscryophilus. Arch. Biochem. Biophys. 224, 718-727.

37. Foot, M., Jeffcoat, R., and Russell, N.J. (1983b) Some properties, including the substrate in vivo,of the delta 9-desaturase in Micrococcus cryophilus. Biochem. J. 209, 345-353.

38. Fox, B.G., Shanklin, J., Ai, J., Loehr, T.M., and Sanders-Loehr, J. (1994) Resonance Raman evidence for an Fe-O-Fe center in stearoyl-AITB desaturase. Primary sequence identity with other diiron-oxo proteins. Biochemistry 33, 12776-12786.

39. Fox, B.G., Shanklin, J., Somerville, C., and Munck, E.(1993) Stearoyl-acyl carrier protein delta 9 desaturase from Ricinus communis is a diiron-oxo protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 2486-2490.

40. Furuki,M., Tanaka,N., Hiyama,N., and

41. Nakamoto,H.(1996) Cloning, characterization andfunctional analysis of groEL-like gene from thermophilic cyanobacterium Synechococcusvulcanus, which das not form an operon with groES. Biochim. Biophys. Acta.1294, 106-110.

42. Gibson, S., Arondel, V., Iba, K., and Somerville, C.(1994) Cloning of a temperature-regulated gene encoding a chloroplast omega-3 desaturase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 106, 16151621.

43. Gombos, Z., Kis, M., Pali, T., and Vigh, L. (1987) Nitrate starvation induces homeoviscous regulation of lipids in the cell envelope of the blue-green alga, Anacystis nidulans. Eur J Biochem 165, 461465 .

44. Gombos, Z., Wada, H., and Murata, N. (1994) The recovery of photosynthesis from low-temperature photoinhibition is accelerated by the unsaturation of membrane lipids: A mechanism of chilling tolerance. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 8787-8791.

45. Gombos, Z., Wada, H., Varkonyi, Z., Los, D.A., and Murata, N. (1996) Characterization of the Fadl2mutant of Synechocystis that is defective in delta 12 acyl-lipid desaturase activity. Biochim. Biophys. Acta 1299, 117-123.

46. Gounot, A.M. (1986) . Psychrophilic andpsychrotrophic microorganisms. Experientia 42, 1192-1197.

47. Grau, R. and de Mendoza, D. (1993) Regulation of the synthesis of unsaturated fatty acids by growth temperature in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 8, 535-542.

48. Grau, R., Gardiol, D., Glikin, G.C., and de Mendoza, D.(1994) DNA supercoiling and thermal regulation of unsaturated fatty acid synthesis in Bacillus subtilis. Mol. Microbiol. 11, 933-941.

49. Grayburn, W.S., Collins, C.G., and Hildebrand, D.F.(1992) Fatty acid alteration by A9 desaturase in transgenic tobacco tissue. Biotechnology 10, 675-678.

50. Guler, S., Seeliger, A., Hartel, H., Renger, G. & Benning, C. (1996). A null mutant of Synechococcus sp. PCC7942 deficient in the sulfolipidsulfoquinovosyl diacylglycerol. J Biol Chem 271, 7501-7507.

51. Gurr, M.I.(1971) The biosynthesis ofpolyunsaturated fatty acids in plants. Lipids 6, 266-273.

52. Hamada, T., Kodama, H., Nishimura, M., and Iba, K. (1994) Cloning of a cDNA encoding tobacco omega-3 fatty acid desaturase. Gene 147, 293-294.

53. Harris, P. and James, A. T. (1969) The effect of low temperatures on fatty acid biosynthesis in plants. Biochem. J. 112, 325-330.

54. Harwood, J.L. (1988) Fatty acid metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 39, 101-138.

55. Harwood, J.L. (1980) Plant acyl lipids: structure, distribution, and analysis. In The Biochemistry of Plants. Stumpf, P. K. ed. Vol. 4, 1-55. New York, Academic Press, 693p.

56. Hasegawa A., Amahori K. (1976) //J. Biochem. V. 79, 469 477.

57. Higasi, S. and Murata, N. (1993) An in vivo study on substrate specificities of acyl-lipid desaturases and acyltransferases in lipid synthesis in Synechocystis PCC6803. Plant Physiol., 102, 1275-1278.

58. Hirayama, 0. and Kishida, T.(1991) Temperature-induced changes in the lipid molecular species of a thermophilic cyanobacterium, Mastigocladus laminosus. Agric Biol Chem 55, 781-785.

59. Hitz, W. D., Carlson, T. J., Booth, J. R., Kinney, A. J., Stecca, K. L., and Yadav, N. S.(1994) Cloning of a higher-plant plastid omega-6 fatty acid desaturase cDNA and its expression in a cyanobacterium. Plant Physiol. 105, 635-641.

60. Holloway, P.W. (1983) Fatty acid desaturation. In The Enzymes. Ed. Boyer, P.D., 16, 63-83. New York, Academic Press, 783p.

61. Holmes M. A., Matthews B. W. (1982) //J. Mol. Biol. 160, 623 639.

62. Horvath, I., Torok, Z., Vigh, L., and Kates, M.(1991) Lipid hydrogenation induces elevated 18:l-CoA desaturase activity in Candida lipolytica microsomes. Biochim. Biophys. Acta 1085, 126-130.

63. Jaworski, G.G.(1987) Biosynthesis of monoenic and polyenoic fatty acids. In Stumpf, P.K., ed. The Biochemistry of Plants. Vol.9, 159-174. Orlando, Academic Press, 363p.

64. Jaworski, J.G. and Stumpf, P.K. (1974) Fat metabolism in higher plants. Properties of a soluble stearyl-acyl carrier protein desaturase from maturing Carthamus tinctorius. Arch. Biochem. Biophys. 162, 158-165.

65. Jody W. Deming (1986) //Microbiol. Ecol. V. 12. P. Ill 119.

66. Jones, A.L., Hann, A.C., Harwood, J.L., and Lloyd, D.(1993a) Temperature-induced membrane-lipid adaptation in Acanthamoeba castellanii. Biochem. J. 290, 273-278.

67. Jones, A.L., Lloyd, D., and Harwood, J.L. (1993b) Rapid induction of microsomal delta 12(omega 6)-desaturase activity in chilled Acanthamoeba castellanii. Biochem. J. 296, 183-188.

68. Kasai, R., Kitajima, Y., Martin, C. E., Nozawa, Y., Skriver, L., and Thompson, G.A.(1976) Molecular control of membrane properties during temperature acclimation. Membrane fluidity regulation of fatty acid desaturase action? Biochemistry 15, 5228-5233.

69. Kenyon, C.N. and Stanier, R.Y.(1970) Possible evolutionary significance of polyunsaturated fatty acids in blue-green algae. Nature 227, 1164-1166.

70. Kenyon, C.N. (1972) Fatty acid composition of unicellular strains of blue-green algae. J. Bacterid. 109, 827-834.

71. Kenyon, C.N., Rippka, R., and Stanier, R.Y.(1972) Fatty acid composition and physiological properties of some filamentous blue-green algae. Arch. Microbiol. 83, 216-236.

72. Kiseleva, L.L., Horvath, I., Vigh, L., and Los,D.A.(1999) Temperature-induced specific lipid desaturation in the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. FEMS Microbiol. Lett. 175, 179-183.

73. Kiseleva, L.L., Serebriiskaya, T.S.,Horvath,I., Vigh, L., and Los, D.A. (2000) Expression of the gene for the A9 acyl-lipid desaturase in the thermophilic cyanobacterium. J.Mol.

74. Microbiol.Biotechnol. 2: in press.

75. Macartney, A., Maresca, B. and Cossins, A.R, (1994) Acyl-CoA desaturases and the adoptive regulation of membrane lipid composition. In Cossins A.R. ed, Temperature Adaptation of Biological Membranes. Portland Press. London, pp.129-139.

76. Maresca, B. and Cossins, A.R. (1993) Cell physiology. Fatty feedback and fluidity. Nature 365, 606-607.

77. Martin, C.E. and Thompson, G.A.(1978) Use of fluorescence polarization to monitor intracellular membrane changes during temperature acclimation. Correlation with lipid compositional and ultrastructural changes. Biochemistry 17, 35813586.

78. McKeon, T.A. and Stumpf, P.K. (1982) Purification and characterization of the stearoyl-acyl carrier protein desaturase and the acyl-acyl carrier protein thioesterase from maturing seeds of safflower. J. Biol. Chem. 257, 12141-12147.

79. Merkler D. J. Farrington C. K., Wedler F. C. (1981) //Intern. J. Peptide and Protein Res. 18, 430 442.

80. Miquel, M. and Browse, J. (1992) Arabidopsis mutants deficient in polyunsaturated fatty acid synthesis. Biochemical and geneticcharacterization of a plant oleoylphosphatidylcholine desaturase. J. Biol. Chem. 267, 1502-1509.

81. Miquel, M., James, D., Dooner, H., and Browse, J. (1993) Arabidopsis requires poliunsaturatedlipids for low-temperature survival. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90, 6208-6212.

82. Murata N., Wada H. (1995a) Acyl-Lipid Desaturases and Their Importence in the Tolerance and Acclimatization to Colg of Cyanobacteria //Biochem J. 308, 1-8.

83. Murata, N. & Los, D. A. (1997). Membrane fluidity and temperature perception. Plant Physiol 115, 875-879.

84. Murata, N. and Nishida, 1.(1987) Lipids of blue-green alga (cyanobacteria). In Biochemistry of Plants Stumpf, P.K. ed. Vol. 9, 315-347. Orlando, Academic Press, 363p.

85. Murata, N. and Nishida, 1.(1987) Lipids of blue-green alga (cyanobacteria). In Biochemistry of

86. Plants Stumpf, P.K. ed. Vol. 9, 315-347. Orlando, Academic Press, 363p.

87. Murata, N. and Nishida, 1.(1990) Lipids in relation to chilling sensitivity of plants. In Chilling Injury of Crops. Wang, C.Y. ed. pp. 181199, Boca Raton, FL, CRC Press, 313p.

88. Murata, N. and Wada, H. (1995) Acyl-lipid desaturases and their importance in the tolerance and acclimatization to cold of cyanobacteria. Biochem. J. 308, 1-8.

89. Murata, N.(1983) Molecular species composition of phosphatidylglycerols from chilling-sensitive and chilling-resistant plants. Plant Cell Physiol. 24, 81-86.

90. Murata, N.(1989) Low-temperature effects on cyanobacterial membranes. J. Bioenerg. Biomembr. 21, 61-75.

91. Murata, N., Deshnium, P. and Tasaka, Y.(1996) Biosynthesis of gamma-linoleic acid in the cyanobacterium Spirulina platensis. In Gamma-Linolenic Acid: Metabolism and role in Nutritionand Medicine. Champaign, IL. Am. Oil Chem. Soc. pp 22-32.

92. Murata, N., Ishizaki-Nishizawa, O., Higashi, S., Hayashi, H., Tasaka, Y., and Nishida, I. (1992b) Genetically engineered alteration in the chilling sensitivity of plants. Nature 356, 710-713.

93. Murata, N., Wada, H., and Gombos, Z.(1992) Modes of fatty-acid desaturation in cyanobacteria. Plant Cell Physiol. 33, 933-941.

94. Nakamura S., Ohta S., Arai K. (1978) //Europ. J. Biochem. 92, 533 543.

95. Nishida, I. and Murata, N.(1996) Chilling sensitivity in plants and cyanobacteria: the crucial contribution of membrane lipids. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47, 541-568.

96. Nishida, I., Beppu, T., Matsuo, T., and Murata, N.(1992) Nucleotide sequence of a cDNA clone encoding a precursor to stearoyl- (acyl-carrier-protein) desaturase from spinach, Spinacia oleracea. Plant Mol. Biol. 19, 711-713.

97. Nishiuchi, T., Nishimura, M., Arondel, V., and Iba, K.(1994). Genomic nucleotide sequence of a gene encoding a microsomal omega-3 fatty acid desaturase from Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 105, 767-768.

98. Norman, H. A., Smith, L. A., Lynch, D.V., and Thompson, G.A. (1985) Low-temperature-induced changes in intracellular fatty acid fluxes in Dunaliella salina. Arch. Biochem. Biophys. 242, 157-167.

99. Norman, H.A. and Thompson, G.A. (1985) Effects of low-temperature stress on the metabolism of phosphatidylglycerol molecular species in Dunaliella salina. Arch. Biochem. Biophys. 242, 168-175.

100. Norman, H. A. and Thompson, G.A. (1985) Effects of low-temperature stress on the metabolism of phosphatidylglycerol molecular species in Dunaliella salina. Arch. Biochem. Biophys. 242, 168-175.

101. Nussberger, S., Dorr, K., Wang, D. N. & Kuhlbrandt, W. (1993). Lipid-protein interactions in crystals of plant light-harvesting complex. J Mol Biol 234, 347-356.

102. Ogasahara K., Imanishi A., Isemura T. (1970) //J. Biocem. 67, 65 67.

103. Ohki, K., Kasai, R., and Nozawa, Y.(1979) Correlation between fluidity and fatty acid composition of phospholipid species in Tetrahymena pyriformis during temperature acclimation. Biochim. Biophys. Acta 558, 273-281.

104. Omata, T. and Murata, N. (1986) Glycolipid synthesis activities in cytoplasmic and thylakoid membranes from the cyanobacterium Anacystis nidulans. Plant Cell Physiol. 27, 485-490.

105. Orrcut, D.M. and Patterson, G.W.(1974) Effect of light intensity upon lipid composition of Nitschia closterium (Cyclindrotheca fusiformis). Lipids 9, 1000-1003.

106. Oshima T. (1978) Enzymes engineering //Ed. Broun G. B. et al. N. Y.; L.: Plenum press. 4, 41 46.

107. Panpoom, S., Los, D.A., and Murata, N.(1998) Biochemical characterization of a A12 acyl-lipid desaturasw after overexpression of the enzyme in Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 1390, 323-332.

108. Paton, J.C., McMurchie, E.J., May, B.K., and Elliott, W.H.(1978) Effect of growth temperature on membrane fatty acid composition and susceptibility to cold shock of Bacillus amyloliquefaciens. J. Bacterid. 135, 754-759.

109. Piorreck, M. and Pohl, P.(1984) Formation of biomass, total protein, chlorophylls, lipids and fatty acids in green and blue-green algae during one growth phase. Phytochemistry 23, 217-223.

110. Polashock, J.J., Chin, C-K., and Martin, C.E. (1992) Expression of the yeast A-9 fatty acid desaturase in Nicotiana tabacum. Plant Physiol. 100, 894-901.

111. Quinn, P.J., Joo, F., and Vigh, L.(1989) The role of unsaturated lipids in membrane structure and stability. Prog.Biophys. Molec. Biol. 53, 71-103.

112. Rainer J. (1981) //Annu. Rev. And Bioeng. 10, 1 -59.

113. Raison, J. K.(1973) The influence of temperature-induced phase changes on kinetics of respiratory and other membrane-associated enzymes. J. Bioenerg. 4, 258-309.

114. Reddy, A.S., Nuccio, M.L., Gross, L.M., and Thomas, T.L.(1993) Isolation of a delta 6-desaturase gene from the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC 6803 by gain-of-function expression in Anabaena sp. strain PCC 7120. Plant Mol. Biol. 22, 293-300.

115. Reifarth, F., Christen, G., Seeliger, A. G., Dormann, P., Benning C. & Renger, G. (1997).

116. Modification of the water oxidizing complex in leaves of the dgdl mutant of Arabidopsis thaliana deficient in the galactolipiddigalactosyldiacylglycerol. Biochemistry 36,11769-11776.

117. Ritter, D. and Yopp, J.H. (1993) Plasma membrane lipid composition of the halophilic cyanobacterium Aphanothece halophyca. Arch Microbiol 159, 435439.

118. Roughan, P.G. and Slack, C.R. (1982) Cellular organization of glycerolipid metabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. 33, 97-132.

119. Roughan, P.G. (1987) On the control of fatty acid compositions of plant glycerolipids. In Metabolism, Structure, and Function of Plant Lipids. Stumpf, P.K., Mudd, J.B. and Nes, W.D. eds. pp. 247-254. Plenum Press, New York.

120. Sakamoto, T., Los, D.A., Higashi, S., Wada, H., Nishida, I., Ohmori, M., and Murata, N.;i994a) Cloning of omega 3 desaturase from cyanobacteria and its use in altering the degree of membrane-lipid unsaturation. Plant Mol. Biol. 26, 249-263.

121. Sakamoto, T., Wada, H., Nishida, I., Ohmori, M., and Murata, N. (1994c) Identification of conserved domains in the delta 12 desaturases of cyanobacteria. Plant Mol. Biol. 24, 643-650.

122. Sambrook, J., Fritsch, E.T., and Maniatis, T.(1989) Molecular cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edn. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

123. Sato S., Nakazawa K. (1978) //J. Biochem. 83, 1165 1171.

124. Sato, N. and Murata, N. (1980) Temperature shift-induced responses in lipids in the blue-green alga, Anabaena variabilis : the central role of diacylmonogalactosylglycerol in thermo-adaptation. Biochim. Biophys. Acta 619, 353-366.

125. Sato, N. and Murata, N. (1981) Studies en the temperature shift induced desaturation of fatty acids in monogalactosyl diacylglycerol in the blue-green alga (cyanobacterium), Anabaena variabilis. Plant Cell Physiol., 22, 1043-1050.

126. Sato, N. and Murata, N. (1982a) Lipid biosynthesis in the blue-green alga, Anabaena variabilis. I. Lipid classes. Biochim. Biophys. Acta 710, 271278 .

127. Sato, N. and Murata, N. (1982a) Lipid biosynthesis in the blue-green alga, Anabaena variabilis. I. Lipid classes. Biochim. Biophys. Acta 710, 271278 .

128. Sato, N. and Murata, N. (1982b) Lipid biosynthesis in the blue-green alga, Anabaena variabilis. II. Fatty acids and lipid molecular species. Biochim. Biophys. Acta 710, 279-289.

129. Sato, N. (1995) A family of cold-regulated RNA-binding protein genes in the cyanobacterium Anabaena variabilis M3. Nucleic Acids Res. 23, 2161-2167.

130. Sato, N., and Murata, N.(1988) Membrane lipids. Meth. Enzymol. 167, 251-259.

131. Sato, N., Murata, N., Miura, Y., and Ueta, N. (1979) Effect of growth temperature on lipid and fatty acid compositions in the blue-green algae, Anabaena variabilis and Anacystis nidulans. Biochim. Biophys. Acta 572, 19-28.

132. Schneider, G., Lindqvist, Y., Shanklin, J., and Somerville, C.(1992) Preliminary crystallographic data for stearoyl-acyl carrier protein desaturase from castor seed. J. Mol. Biol. 225, 561-564.

133. Selstam, E. & Campbell, D. (1996) . Membrane lipid composition of the unusual cyanobacterium Gloeobacter violaceus sp. PCC 7421, which lacks sulfoquinovosyl diacylglycerol. Arch Microbiol 166, 132-135.

134. Shimizu, T., Hiyama, T., Ikeuchi, and Incue, Y. (1992a) Nucleotide sequences of the psaA and psaB genes encoding the photosystem I core proteins from the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Plant Mol. Biol. 18,785-791.

135. Shimizu, T., Hiyama, T., Ikeuchi, and Inoue, Y. (1992b) Nucleotide sequences of a metallothionein gene of the thermophilic cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Plant Mol. Biol. 20, 565567 .

136. Shimizu, T., Hiyama, 1., Ikeuchi, M.,Koike, H., and Inoue, Y. (1990) Nucleotide sequence of the psaC gene of the cyanobacterium Synechococcus vulcanus. Nucl. Acids Res. 18, 3644-3646.

137. Singer, S. J., Nicolson, G. L. (1972) The fluid mosaic model of the structure of cell membranes. Science, 175, 720-731.

138. Skriver, L. and Thompson, G.A. (1979) Temperature-induced changes in fatty acid unsaturation of

139. Tetrahymena membranes do not require induced fatty acid desaturase synthesis. Biochim. Biophys. Acta 572, 376-381.

140. Somerville, C.R. (1995) Direct tests of the role of membrane lipid composition in low-temperature-induced photoinhibition and chilling sensitivity in plants and cyanobacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92, 6215-6218.

141. Somerville, C.R. and Browse, J. (1991) Plant lipids: metabolism, mutant, and membranes. Science 252, 80-87.

142. Soutschek-Bauer, E., Scholz, W., Grill, E., and Staudenbauer, W.L.(1987) Thermostability and superhelicity of plasmid DNA in Bacillus stearothermophilus. Mol. Gen. Genet. 209, 575-579.

143. Spinedi, A., Rufini, S., and Luly, P. (1987) Lipid composition and temperature adaptation of the nervous system of the leech Hirudo medicinalis L. J. Neurochem. 49, 45-49.

144. Stanier, R.Y., Kunisawa, R., Mandel, M., and Cohen-Bazire, G.(1971) Purification and propertiesof unicellular blue-green algae (order

145. Chroococcales). Bacteriol.Rev. 35, 171-205.

146. Stubbs, C. and Smith, A. D. (1984) The modification of mammalian membrane polyunsaturated fatty acid composition in relation to membrane fluidity and function. Biochim. Biophys. Acta, 779, 89-137.

147. Stumpf, P.K. (1980) Biosynthesis of saturated and unsaturated fatty acids. In Biochemistry of Plants. Stupmf, P.K. ed. Vol. 4, 177-204. New York, Academic Press, 693p.

148. Tanford C. (1980) The Hydrophobic effect: Formation of micelles and biological membranes //N. Y.: Wiley. P. 310.

149. Thomas K. N. J., William R., Kenealy J. (1987) Industrial application of thermostable enzymes //Wilmington (Del). P. 197 213.

150. Thompson, G. A., Jr. (1980) in The Regulation of Membrane Lipid Metabolism (CRC, Boca Raton, FL) , pp. 171-196.

151. Trayhurn, P. (1979) Fatty acid synthesis in vivo in brown adipose tissue, liver and white adipose tissue of the cold-acclimated rat. FEBS Lett. 104, 13-16.

152. Trayhurn, P. (1980a) Fatty acid synthesis in brown adipose tissue in relation to whole body synthesis in the cold-acclimated golden hamster (Mesocricetus auratus). Biochim. Biophys. Acta 620, 10-17.

153. Trayhurn, P. (1980b) Fatty acid synthesis in brown adipose tissue of cold-acclimated mice and golden hamsters (Mesocricetus auratus) . Biochem. Soc. Trans. 8, 375

154. Wada, H. and Murata, N. (1989) Synechocystis PCC6803 mutants defective in desaturation of fatty acids. Plant Cell Physiol. 30, 971-978.

155. Wada, H. and Murata, N.(1990) Temperature-induced changes in the fatty acid composition of the cyanobacterium, Synechocystis PCC6803. Plant Physiol. 92, 1062-1069.

156. Wada, H., Avelange-Macherel, M.-H., and Murata, N.(1993a) The desA gene of the cyanobacterium Synechocystis sp. strain PCC6803 is the structuralgene for delta 12 desaturase. J. Bacterid. 175, 6056-6058.

157. Wada, H., Gombos, Z., and Murata, N.(1990) Enhancement of chilling tolerance of a cyanobacterium by genetic manipulation of fatty acid desaturation. Nature 347, 200-203.

158. Wada, H., Gombos, Z., and Murata, N.(1994) Contribution of membrane lipids to the ability of the photosynthetic machinery to tolerate temperature stress. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 4273-4277.

159. Wada, H., Gombos, Z., Sakamoto, T., and Murata, N.(1992a) Genetic manipulation of the extent of desaturation of fatty acids in membrane lipids in the cyanobacterium Synechocystis PCC6803. Plant Cell Physiol. 33, 535-540.

160. Wada, H., Gombos, Z., Sakamoto, T., Higashi, S., Los, D. A., Heinz, E., Schmidt, H., Nishida, I., and Murata, N. (1992b) Fatty acid desaturation in cyanobacteria. In: Biochemistry and Molecular Biology of Membrane and Storage Lipids of Plants.

161. Murata,N. and Somerville,S.R. eds. The American Society of Plant Physiologists, pp. 67-78.

162. Walker J. E., Wonacott A.J., Harris J. (1980) //Europ. J. Biochem.,108, 581 586.

163. Watahiki, M.K. and Yamamoto, K.T.(1994) A new isozyme of plasmid omega-3 fatty acid desaturase in Arabidopsis thaliana. Plant Physiol. 105, 14511452 .

164. Wedler F. C., Farrington C. K., Merkler D. J. (1981) //Fed. Proc. 40, 1839.

165. Wedler F. C., Hoffman F. M. (1974) //Biochemistry. 13, 3207 3214.

166. Wedler F. C., Hoffman F. M. (1974) //Biochemistry. 13, 3207 3214.

167. Williams, J.G.K.(1988) Construction of specific mutations in photosystem II photosynthetic reaction center by genetic engineering methods in Synechocystis PCC6803. Meth Enzymol. 167, 766-778.

168. Williams, J.P., Khan, M.U., and Wong, D. (1992a) Low temperature-induced fatty acid desaturation in Brassica . napus: thermal deactivation and reactivation of the process. Biochim. Biophys. Acta 1128, 275-279.

169. Williams, J.P., Williams, K., and Khan, M.U.(1992b) Low temperature-induced fatty acid desaturation in Brassica napus: thermal lability of the process. Biochim. Biophys. Acta 1125, 6267 .

170. Yadav, N.S., Wierzbicki, A., Aegerter, M., Caster, C.S., Perez-Grau, L., Kinney, A.J., Hitz, W.D., Booth, J.R., Schweiger, B., and Stecca, K.L. (1993) Cloning of higher plant omega-3 fatty acid desaturases. Plant Physiol. 103, 467-476.