Стимуляция роста нервных волокон стромальными клетками жировой ткани и дифференцировка этих клеток в нейральном направлении тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Лопатина, Татьяна Владимировна

• Лопатина, Татьяна Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лопатина, Татьяна Владимировна

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Физиологическое обновление нервной ткани: механизмы регуляции нейрогенеза

Генетические механизмы, запускающие нейрогенез

Пронейральные гены

Нейротрофические факторы

Рецепторы нейротрофических факторов

Рост и регенерация нервных окончаний

Рост периферических нервов

Регенерация нервного волокна.

Стромальные клетки жировой ткани как материал для стимуляции роста нервов

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выделение стромальных клеток из жировой ткани

Культивирование СКЖТ

Моделирование гипоксии

Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ

Выделение РНК из клеток

Синтез первой цепи ДНК на матрице РНК и ПЦР в реальном времени

Анализ содержания факторов роста в среде культивирования с помощью иммуноблоттинга

Имплантация СКЖТ в матригеле

Иммунофлуоресцентный анализ

Анализ содержания ТгкВ на СКЖТ с помощью проточной цитометрии

Оценка плотности нервных волокон в матригеле

Оценка выживаемости и миграции СКЖТ при трансплантации

Статистическая обработка данных

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

СКЖТ стимулируют рост нервных волокон в Матригеле

СКЖТ секретируют нейротрофические факторы роста

Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ

Индукция нейральной дифференцировки повышает экспрессию нейротрофических факторов в СКЖТ

Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ повышает их способность стимулировать рост нервных волокон в матригеле

Индукция СКЖТ повышает выживаемость этих клеток при трансплантации в нервную ткань

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ

Нейральная дифференцировка СКЖТ

Наличие в популяции СКЖТ нейральных предшественников

Секреторная активность СКЖТ регулирует дифференцировку нейральных и эндотелиальных предшественников, стимулирует рост нервных окончаний

Возможность применения СКЖТ для репарации нервной ткани

Планируемое развитие данного исследования

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стимуляция роста нервных волокон стромальными клетками жировой ткани и дифференцировка этих клеток в нейральном направлении»

Физиологическое обновление нервной ткани взрослого организма происходит благодаря пролиферации и дифференцировке нейральных стволовых клеток в центральной и периферической нервной системе. Однако при обширных повреждениях мозга в результате инсультов и травм, при нейродегенеративных заболеваниях, а также при утрате значительной части нерва, активности нейральных стволовых клеток оказывается недостаточно для полноценного восстановления нервной ткани. Так, повреждения нервного волокна протяженностью более 3 см индуцируют его дегенерацию [1], поэтому в таких случаях восстановления иннервации ткани-мишени не происходит. В свою очередь ткань, не получающая нервные импульсы в течение длительного времени, также подвергается дегенерации [2], поэтому скорость восстановления нервного волокна играет решающую роль в сохранении функциональной ткани. Поскольку существующие методы медикаментозной терапии и классической нейрохирургии не приносят желаемых результатов, а использование донорских нервных трансплантатов ограничено в связи с иммунологическими реакциями на чужеродные ткани, поиск подходов для стимуляции роста нервных волокон и восстановления клеток центральной нервной системы является актуальной темой в медицинской биологии.

Эффективным подходом для лечения неврологических заболеваний может оказаться трансплантация клеток, которые способны не только встроиться в поврежденную ткань, по и долговременно стимулировать репарацию этой ткани путем секреции нейротрофических и других факторов роста. В начале 80-х годов для леченияневрологических заболеваний была предложена клеточная терапия. В частности, для репарации поврежденного спинного мозга была использована трансплантация эмбриональных стволовых клеток, мезенхимальных клеток костного мозга, нейральных стволовых клеток [36]. Однако применение аллогенных клеток для трансплантации может приводить к переносу инфекций от донора реципиенту, а также вызывать реакцию отторжения со стороны иммунной системы реципиента. Поэтому возможно, более эффективной станет трансплантация аутологичных клеток. Терапия собственными (аутологичными) клетками уже находит применение для лечения ишемических заболеваний [7], невропатий [8], для замещения костных и хрящевых дефектов, а также для восстановления кожного покрова после ожогов. Исследования последних лет показали огромный потенциал клеточной трансплантологии для восстановления иннервации после повреждения периферических нервов [9]. Немаловажное значение иннервация имеет для ишемизированных тканей, так как известно, что рост сосудов зависит от роста нервов [10].

С точки зрения регенерации поврежденных нервных окончаний наиболее изученными в клеточной терапии являются эмбриональные стволовые клетки [11], гемопоэтические стволовые клетки [12], нейральные предшественники [13-15], мезенхимальные клетки костного мозга [16-18] и культивированные предшественники эндотелиальных клеток [19-21].

Несмотря на воодушевляющие эффекты применения этих клеток сложность и болезненность их получения в достаточном количестве, а также препятствии их использования по этическим причинам (в случаеэмбриональных стволовых клеток) приводят к необходимости поиска других источников мультипотентных клеток.

Доступным источником аутологичных прогениторных клеток оказалась жировая ткань. Ее строма содержит клетки по своему фенотипу, экспрессии генов и дифференцировочным способностям сходные с хорошо изученными мезенхимальными прогениторными клетками костного мозга. Но в отличие от клеток костного мозга, стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ) возможно получить в достаточном количестве с помощью ферментативной обработки жировой ткани и последующего фракционирования полученной суспензии практически для каждого пациента. Полученные таким образом СКЖТ способны адгезировать на пластик и пролиферировать в культуре, а значит могут быть наращены а количестве, необходимом для трансплантации.

Стромальные клетки жировой ткани способны дифференцироваться во многие типы клеток и секретировать ангиогенные и антиапоптотические факторы [22], а также нейротрофические [23, 24] и другие факторы роста [25]. На различных моделях ангиогенеза in vitro и in vivo было показано, что эти клетки стимулируют рост сосудов [26]. Стимулирующий эффект СКЖТ на рост сосудов опосредован их секреторной активностью, а также способностью этих клеток встраиваться в периэндотелиальное пространство новообразованных сосудов [26].

В то же время, известно, что рост сосудов сопряжен с ростом нервов; эти процессы имеют общие сигнальные молекулы и механизмы регуляции [27]. Клетки эндотелия секретируют нейротрофический фактор BDNF и привлекают растущие нервные окончания [28], а шванновские клетки периферических нервов секретируют VEGF, тем самымактивизируя ангиогенез [29]. Сопряженность нервов и сосудов подтверждается и тем фактом, что все крупные сосуды иннервируются, а нервные волокна кровоснабжаются. Поэтому способность СКЖТ стимулировать ангиогенез дает основания предполагать, что эти клетки могут стимулировать и рост нервов.

В то же время, есть данные, что эти клетки могут дифференцироваться в нейральном направлении и способствуют репарации повреждений спинного мозга [30-32].

Цель данной работы заключалась в исследовании способности стромальных клеток жировой ткани стимулировать рост нервных волокон, экспрессировать нейротрофические факторы и их рецепторы, а также дифференцироваться в нейральном направлении.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:1. Проанализировать влияние стромальных клеток жировой ткани на рост нервных волокон in vivo в матригеле.

2. Оценить экспрессию нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

3. Изучить экспрессию рецепторов нейротрофических факторов роста стромальными клетками жировой ткани при культивировании в условиях нормального и сниженного содержания кислорода.

4. Подобрать условия индукции нейральной дифференцировки стромальных клеток жировой ткани in vitro.

5. Оценить влияние нейральной дифференцировки на экспрессию нейротрофических факторов роста in vitro, их способностьстимулировать рост нервных волокон в матригеле in vivo и жизнеспособность этих клеток при трансплантации в нервную ткань.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Лопатина, Татьяна Владимировна

выводы

1. Впервые обнаружено, что стромальные клетки жировой ткани (СКЖТ), известные активаторы ангиогенеза, стимулируют также рост нервных волокон.

2. Показано, что СКЖТ секретируют как ангиогенные, так и нейротрофические (ВБ№, N0?, СО№) факторы, причем гипоксия активирует как экспрессию этих факторов, так и стимулирующее влияние этих клеток на рост нервных волокон.

3. Выявлена субпопуляция СКЖТ, экспрессирующих маркерные гены нейральной дифференцировки. Эти клетки имеют на поверхности рецепторы к ряду нейротрофических факторов.

4. Культивирование СКЖТ с ВБОТ или ретиноевой кислотой в сочетании с ДНК-деметилируюгцим агентом 5-азацитидином повышает экспрессию маркеров нейральной дифференцировки в этих клетках.

5. Индукция нейральной дифференцировки СКЖТ, вызываемая этими факторами, повышает экспрессию нейротрофических факторов (ВОКР, N0?, ООИР), а также увеличивает жизнеспособность СКЖТ при трансплантации в головной мозг.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лопатина, Татьяна Владимировна, 2009 год

1. Koeppen, A.H., Wallerian degeneration: history and clinical significance. J Neurol Sci, 2004. 220(1-2): p. 115-7.

2. Padilla, F., et al., Upregulalion and redistribution of cadherins reveal specific glial and muscle cell phenotypes during wallerian degeneration and muscle denervation in the mouse. JNeurosci Res, 1999. 58(2): p. 270-83.

3. Meng, X.T., et al., Co-transplantation of bFGF-expressing amniotic epithelial cells and neural stem cells promotes functional recovery in spinal cord-injured rats. Cell Biol Int, 2008. 32(12): p. 1546-58.

4. Deda, H., et al., Treatment of chronic spinal cord injured patients with autologous bone marrow-derived hematopoietic stem cell transplantation: 1-year follow-up. Cytotherapy, 2008. 10(6): p. 565-74.

5. Kim, K.N., et al., Effect of human mesenchymal stem cell transplantation combined with growth factor infusion in the repair of injured spinal cord. Acta Neurochir Suppl, 2006. 99: p. 133-6.

6. Howard, M.J., et al., Transplantation of apoptosis-resistant embryonic stem cells into the injured rat spinal cord. Somatosens Mot Res, 2005. 22(1-2): p. 37-44.

7. De Vriese, A.S., et al., Autologous transplantation of bone marrow mononuclear cells for limb ischemia in a caucasian population with atherosclerosis obliterans. J Intern Med, 2008. 263(4): p. 395-403.

8. Burt, R.K., et al., T cell-depleted autologous hematopoietic stem cell transplantation for multiple sclerosis: report on the first three patients. Bone Marrow Transplant, 1998. 21(6): p. 537-41.

9. Guenard, V., et al., Syngeneic Schwann cells derived from adult nerves seeded in semipermeable guidance channels enhance peripheral nerve regeneration. J Neurosci, 1992. 12(9): p. 3310-20.

10. Taylor, G.I., M.P. Gianoutsos, and S.F. Morris, The neurovascular territories of the skin and muscles: anatomic study and clinical implications. Plast Reconstr Surg, 1994. 94(1): p. 1-36.

11. Cui, L., et al., Transplantation of embryonic stem cells improves nerve repair and functional recovery after severe sciatic nerve axotomy in rats. Stem Cells, 2008. 26(5): p. 1356-65.

12. Schalow, G., Stem cell therapy and coordination dynamics therapy to improve spinal cord injury. Electromyogr Clin Neurophysiol, 2008. 48(5): p. 233-53.

13. Shi, Y., et al., Transplantation of neural stem cells overexpressing glia-derived neurotrophic factor promotes facial nerve regeneration. Acta Otolaryngol, 2008: p. 19.

14. Nogradi, A. and A. Szabo, Transplantation of embryonic neurones to replace missing spinal motoneurones. Restor Neurol Neurosci, 2008. 26(2-3): p. 215-23.

15. Kulbatski, I., et al., Glial precursor cell transplantation therapy for neurotrauma and multiple sclerosis. Prog Histochem Cytochem, 2008. 43(3): p. 123-76.

16. Tohill, M., et al., Rat bone marrow mesenchymal stem cells express glial markers and stimulate nerve regeneration. Neurosci Lett, 2004. 362(3): p. 200-3.17.18.19.20.21.22.23.24.25.26.27.28.29.30.31.32.33,34.35.36,

17. Dezawa, M., et al., Sciatic nerve regeneration in rats induced by transplantation of in vitro differentiated bone-marrow stromal cells. Eur J Neurosci, 2001.14(11): p. 17716.

18. Dezawa, M., Central and peripheral nerve regeneration by transplantation of Schwann cells and transdifferentiated bone marrow stromal cells. Anat Sci Int, 2002. 77(1): p. 12-25.

19. Assmus, B., et al., Transplantation of Progenitor Cells and Regeneration Enhancement in Acute Myocardial Infarction (TOPCARE-AMI). Circulation, 2002. 106(24): p. 3009-17.

20. Rehman, J., et al., Secretion of angiogenic and antiapoptotic factors by human adipose stromal cells. Circulation, 2004. 109(10): p. 1292-8.

21. Nambu, M., et al., Accelerated wound healing in healing-impaired db/db mice by autologous adipose tissue-derived stromal cells combined with atelocollagen matrix. Ann Plast Surg, 2009. 62(3): p. 317-21.

22. Rubina, K., et al., Adipose Stromal Cells Stimulate Angiogenesis via Promoting Progenitor Cell Differentiation, Secretion of Angiogenic Factors, and Enhancing Vessel Maturation. Tissue Eng Part A, 2009.

23. Altman, J. and G.D. Das, Post-natal origin of microneurones in the rat brain. Nature, 1965. 207(5000): p. 953-6.

24. Reynolds, B.A. and S. Weiss, Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science, 1992. 255(5052): p. 1707-10.

25. Kocsis, J.D. and S.G. Waxman, Schwann cells and their precursors for repair of central nervous system myelin. Brain, 2007. 130(Pt 8): p. 1978-80.37.38.39.40.41.42.43.44.45,46,47.4849