Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Захарова, Наталья Ильинична

• Захарова, Наталья Ильинична
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Захарова, Наталья Ильинична

Список условных обозначений Введение

Содержание

1. Протимозин альфа и гистон Н1. Их взаимодействие и роль в регуляции р53-зависимой транскрипции (обзор литературы)

1.1. Протимозин альфа

1.1.1. Структура протимозина альфа

1.1.2. Внутриклеточная локализация протимозина альфа

1.1.3. Протимозин альфа и клеточное деление

1.1.4. Протимозин альфа и апоптоз

1.1.5. Протимозин альфа как переключатель некроза на апоптоз

1.1.6. Протимозин альфа и опухолевая трансформация

1.1.7. Данные о влиянии протимозина альфа на экспрессию генов

1.2. Опухолевый супрессор р

1.2.1. Структура р

1.2.2.' Регуляция уровня и активности р53 в клетке

1.2.3. Субклеточная локализация р53. Роль посттрансляционных модификаций во внутриклеточном транспорте р

1.2.4. Особенности регуляции активности р53 в клетках НеЬа

1.3. Гистон Н

1.3.1. Гистон Н1. Структура и функции

1.3.2. Гистон Н1 специфически регулирует транскрипцию

1.3.3. Гистон Н1 и р

1.3.4. Гистон Н1 и протимозин альфа 41 2. Материалы и методы

2.1. Реактивы и материалы

2.2. Общие методы

2.3. Манипуляции с плазмидной ДНК

2.4. Конструирование плазмид

2.5. Манипуляции с клетками млекопитающих

2.6. Получение стабильной клеточной линии с пониженным уровнем протимозина альфа

2.7. Получение стабильной клеточной линии с повышенным уровнем протимозина альфа

2.8. Исследование взаимодействия гистона Н1, р53 и протимозина альфа

2.9. Иммунопреципитация хроматина (СЫР)

2.10. Определение уровня представленности транскриптов

2.11. ПЦР в реальном времени 68 3. Стимуляция активности опухолевого супрессора р53 протимозином альфа (результаты и их обсуждение)

3.1. Влияние уровня протимозина альфа на транскрипционную активность опухолевого супрессора р

3.2. Исследование механизма стабилизации и активации опухолевого супрессора р53 протимозином альфа

3.3. Локализация структурных детерминант протимозина альфа, ответственных за активацию р

3.4. Роль гистона Н1 в регуляции активности р53 протимозином альфа

3.5. Экспрессия тирозиновой протеинкиназы 1АК1 зависит от уровня протимозина альфа в клетках НеЬа

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стимуляция активности опухолевого супрессора p53 протимозином альфа»

В последние годы, пожалуй, ни один белок не изучался так интенсивно, как опухолевый супрессор р53. За треть века с момента его открытия р53 было посвящено более 50 тысяч научных работ, и их число неуклонно продолжает расти. Повышенное внимание к р53 определяется, прежде всего, тем, что он является ключевым регуляторным белком клетки, транскрипционным фактором, который активируется в ответ на различные клеточные стрессы, включая генотоксический стресс, и играет важную роль в защите от рака. Будучи «стражем целостности генома», р53 определяет дальнейшую судьбу клетки -произойдет ли остановка клеточного цикла для преодоления последствий стрессового воздействия или включится механизм программируемой клеточной смерти.

Объектом наших исследований также является жизненно важный белок позвоночных протимозин альфа (ПроТа). ПроТа - это мультикопийный ядерный белок, относящийся к интереснейшему классу природных неструктурированных белков. Оказалось, что даже такой относительно простой белок является многофункциональным, способным участвовать в самых разнообразных процессах жизни и смерти клеток. Традиционно ПроТа считается онкобелком, он ускоряет клеточную пролиферацию и защищает клетки от апоптоза. Однако, неожиданно было обнаружено, что ПроТа стимулирует транскрипционную активность опухолевого супрессора р53, и таким образом, потенциально способен к проявлению анти-онкогенной активности.

Онкобелки и онкосупрессоры иногда обладают дуалистическими функциями,, в разных системах проявляя либо онкогенную, либо анти-онкогенную активность. Настоящая работа посвящена выяснению молекулярного механизма, с помощью которого онкобелок протимозин альфа стимулирует р53-зависимую транскрипцию. Понимание механизмов функционирования таких белков необходимо как для выяснения всех путей регуляции активности опухолевого супрессора р53, так и для создания рациональных способов диагностики онкологических заболеваний и антираковой терапии.

В ходе данной работы обнаружено, что в клетках человека линий НеЬа ПроТа регулирует транскрипционную активность опухолевого супрессора р53. Был картирован участок ПроТа, ответственный за усиление р53-зависимой транскрипции. Им оказался центральный «кислый» район ПроТа наряду с МЬБ (сигналом ядерной локализации), расположенным в С-концевой области. Центральный район протимозина альфа ответственен за его взаимодействие с гистоном Н1. На основании этого мы предложили и экспериментально подтвердили гипотезу, в соответствии с которой ПроТа стимулирует р53-регулируемую транскрипцию путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса с р53. В данной работе также впервые показано, что при снижении уровня 6

ПроТа в клетке происходит заметное снижение экспрессии тирозиновой протеинкиназы 1АК1. Активация 1АК1 протимозином альфа представляет большой интерес для выявления механизма иммуностимулирующего действия ПроТа, а также для теоретического обоснования его противоопухолевой активности при использовании в генной терапии.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Захарова, Наталья Ильинична

Выводы

1. Эктопическая экспрессия ПроТа стимулирует, а снижение уровня ПроТа с помощью интерференции РНК, наоборот, подавляет транскрипцию, регулируемую опухолевым супрессором р53.

2. Центральный «кислый» район ПроТа наряду с сигналом ядерной локализации, расположенным в С-концевой области, отвечает за способность этого белка стимулировать р53-зависимую транскрипцию.

3. ПроТа усиливает транскрипционную активность р53 путем вытеснения гистона Н1 из репрессорного комплекса р53-гистон Н1.

4. При снижении уровня ПроТа происходит снижение экспрессии протеинкиназы 1АК1 в клетках НеЬа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Захарова, Наталья Ильинична, 2011 год

1. Haritos A.A., Goodall G.J., Horecker B.L. Prothymosin alpha: isolation and properties of the major immunoreactive form of thymosin alpha 1 in rat thymus.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1984-V. 81 -P. 1008-1111.

2. Pineiro A., Cordero O.J., Nogueira M. Fifteen years of prothymosin alpha: contradictory past and new horizons.// Peptides. 2000 - V. 21 - P. 1433.

3. Vartapetian A.B., Uversky V.N. Prothymosin alpha: a simple yet mysterious protein.// Protein structures: kaleidoscope of structural properties and functions. India, Research Signpost.

4. Goodall G.J., Dominguez F., Horecker B.L. Molecular cloning of cDNA for human prothymosin alpha.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986 - V. 83 - P. 8926-8928.

5. Eschenfeldt W.H., Berger S.L. The human prothymosin alpha gene is polymorphic and induced upon growth stimulation: evidence using a cloned cDNA.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986 - V. 83 - P. 9403-9407.

6. Eschenfeldt W.H., Manrow R.E., Krug M.S., Berger S.L. Isolation and partial sequencing of the human prothymosin alpha gene family. Evidence against export of the gene products.// J. Biol. Chem. 1989 - V. 264 - P. 7546-7555.

7. Aniello F., Branno M., De Rienzo G., Ferrara D., Palmiero C., Minucci S. First evidence of prothymosin alpha in a non-mammalian vertebrate and its involvement in the spermatogenesis of the frog Rana esculenta.// Mech. Dev. 2002 - V. 110 - P. 213-217.

8. Gast K., Damaschun H., Eckert K., Schulze-Forster K., Maurer H.R., Muller-Frohne M., Zirwer D., Czarnecki J., Damaschun G. Prothymosin alpha: a biologically active protein with random coil conformation.// Biochemistry. 1995 - V.34 - P. 3211-3218.

9. Uversky V.N., Gillespie J.R., Fink A.L. Why are "natively unfolded" proteins unstructured under physiologic conditions?// Proteins. 2000 - V. 41 - P. 415-427.

10. Abiko T., Sekino H. Synthesis of an immunologically active fragment analog of prothymosin alpha with enhanced enzymatic stability.// Chem. Pharm. Bull. (Tokyo). 1991 - V. 39 - P. 752-756.

11. Bachmair A., Finley D., Varshavsky A. In vivo half-life of a protein is a function of its amino-terminal residue.// Science. 1986 - V. 234 - P. 179-186.

12. Sburlati A.R., De La Rosa A., Batey D.W., Kurys G.L., Manrow R.E., Pannell L.K., Martin B.M., Sheeley D.M., Berger S.L. Phosphorylation of human and bovine prothymosin alpha in vivo.// Biochemistry. 1993 - V. 32 - P. 4587-4596.

13. Tsitsiloni O.E., Yialouris P.P., Sekeri-Pataryas K., Haritos A.A. Prothymosin alpha is not a nuclear polypeptide.// Experientia. 1989 - V. 45 - P. 332-334.

14. Gomez-Marquez J., Segade F. Prothymosin alpha is a nuclear protein.// FEBS Lett. 1988 -V. 226-P. 217-219.

15. Watts J.D., Cary P.D., Crane-Robinson C. Prothymosin alpha is a nuclear protein.// FEBS Lett. 1989 - V. 245 - P. 17-20.

16. Watts J.D., Cary P.D., Sautiere P., Crane-Robinson C. Thymosins: both nuclear and cytoplasmic proteins.// Eur. J. Biochem. 1990 - V. 192 - P. 643-651.

17. Robbins J., Dilworth S.M., Laskey R.A., Dingwall C. Two interdependent basic domains in nucleoplasmin nuclear targeting sequence: identification of a class of bipartite nuclear targeting sequence.// Cell. 1991 - V. 64 - P. 615-623.

18. Palvimo J., Linnala-Kankkunen A. Identification of a low-Mr acidic nuclear protein as prothymosin alpha.// FEBS Lett. 1990 - V. 277 - P. 257-260.

19. Enkemann S.A., Ward R.D., Berger S.L. Mobility within the nucleus and neighboring cytosol is a key feature of prothymosin-alpha.// J Histochem. Cytochem. 2000 - V. 48 - P. 13411355.

20. Wang J., Shiels C., Sasieni P., Wu P.J., Islam S.A., Freemont P.S., Sheer D. Promyelocyte leukemia nuclear bodies associate with transcriptionally active genomic regions.// J. Cell. Biol. 2004 - V. 164 - P. 515-526.

21. Clinton M., Frangou-Lazaridis M., Panneerselvam C., Horecker B.L. Prothymosin alpha and parathymosin: rhRNA and polypeptide levels in rodent tissues.// Arch. Biochem. Biophys. -1989-V. 269-P. 256-263.

22. Frillingos S., Tsolas O. Age- and sex-related differences in the content of prothymosin alpha in rat tissues.// Experientia. 1992 - V. 48 - P. 236-239.

23. Roson E., Garcia-Caballero G., Heimer E.P., Felix A.M., Dominguez F. Cellular distribution of prothymosin alpha and parathymosin in rat thymus and spleen.// J. Histochem. Cytochem. -1990-V. 38-P. 1889-1894.

24. Roson E., Gallego R., Garcia-Caballero T., Heimer E.P., Felix A.M., Dominguez F. Prothymosin alpha expression is associated to cell division in rat testis.// Histochemistry. -1990-V. 94-P. 597-599.

25. Garcia-Caballero T., Dominguez F., Roson E., Gallego R., Zalvide J., Forteza J., Beiras A. Distribution of prothymosin alpha in rat and human adrenal cortex.// Anat. Rec. 1994 - V. 239 - P. 88-94.

26. Gomez-Marquez J., Segade F., Dosil M., Pichel J.G., Bustelo X.R., Freire M. The expression of prothymosin alpha gene in T lymphocytes and leukemic lymphoid cells is tied to lymphocyte proliferation.// J. Biol. Chem. 1989 - V. 264 - P. 8451-8454.

27. Dosil M., Freire M., Gomez-Marquez J. Tissue-specific and differential expression of prothymosin alpha gene during rat development.// FEBS Lett. 1990 - V. 269 - P. 373-376.

28. Bustelo X.R., Otero A., Gomez-Marquez J., Freire M. Expression of the rat prothymosin alpha during T-Lymphocyte proliferation and liver regeneration.// J. Biol. Chem. 1991 - V. 266 - P. 1443-1447.

29. Mori M., Barnard G.F., Staniunas R.J., Jessup J.M., Steele G.D.Jr., Chen L.B. Prothymosin alpha mRNA expression correlates with that of c-myc in human colon cancer.// Oncogene. -1993 -V. 8-P. 2821-2826.

30. Magdalena C., Dominguez F., Loidi L., Puente J.L. Tumour prothymosin alpha content, a potential prognostic marker for primary breast cancer.// Br. J. Cancer. — 2000 V. 82 - P. 584590.

31. Mitani M., Kuwabara Y., Kawamura H., Sato A., Hattori K., Fujii Y. Significance of plasma thymosin alphal measurements in gastric cancer patients.// World J. Surg. 2000 - V. 24 - P. 455-458.

32. Wu C.G., Habib N.A., Mitry R.R., Reitsma P.H., van Deventer S.J., Chamuleau R.A. Overexpression of hepatic prothymosin alpha, a novel marker for human hepatocellular carcinoma.// Br. J. Cancer. 1997 - V. 76 - P. 1199-1204.

33. Sasaki H., Nonaka M., Fujii Y., Yamakawa Y., Fukai I., Kiriyama M., Sasaki M. Expression of the Prothymosin a as a Prognostic Factor in Lung Cancer.// Surg. Today. 2001 - V. 31 -P. 936-938. •

34. Sburlati A.R., Manrow R.E., Berger S.L. Prothymosin alpha antisense oligomers inhibit myeloma cell division.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991 - V. 88 - P. 253-257.

35. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Gomez-Marquez J. Prothymosin alpha antisense oligonucleotides induce apoptosis in HL-60 cells.// Cell. Death. Differ. 1999 - V. 6 -P. 3-5.

36. Rodriguez P., Vinuela J.E., Alvarez-Fernandez L., Buceta M., Vidal A., Dominguez F., Gomez-Marquez J. Overexpression of prothymosin alpha accelerates proliferation and retards differentiation in HL-60 cells.// Biochem. J. 1998 - V. 331 - P. 753-761.

37. Evstafieva A.G., Belov G.A., Kalkum M., Chichkova N.V., Bogdanov A.A., Agol V.I., Vartapetian A.B. Prothymosin alpha fragmentation in apoptosis.// FEBS Lett. 2000 - V. 467 -P. 150-154.

38. Evstafieva A.G., Chichkova N.V., Makarova T.N., Vartapetian A.B., Vasilenko A.V., Abramov V.M., Bogdanov A.A. Overproduction in Escherichia coli, purification and properties of human prothymosin alpha.// Eur. J. Biochem. — 1995 V. 231 - P. 639-643.

39. Jiang X., Kim H.E., Shu H., Zhao Y., Zhang H., Kofron J., Donnelly J., Burns D., Ng S.C., Rosenberg S., Wang X. Distinctive roles of PHAP proteins and prothymosin-alpha in a death regulatory pathway.// Science. 2003 - V. 299 - P. 223-226.

40. Qi X., Wang L., Du F. Novel small molecules relieve prothymosin a-mediated inhibition of apoptosome formation by blocking its interaction with Apaf-1.// Biochemistry. 2010 - V. 49 -P. 1923-1930.

41. Kim H.E., Du F., Fang M., Wang X. Formation of apoptosome is initiated by cytochrome c-induced dATP hydrolysis and subsequent nucleotide exchange on Apaf-1.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005 - V. 102 - P. 17545-17550.

42. Lai A., Kawai T., Yang X., Mazan-Mamczarz K., Gorospe M. Antiapoptotic function of RNA-binding protein HuR effected through prothymosin alpha.// EMBO J. 2005 - V. 24 - P. 1852-1862.

43. Ueda H., Fujita R., Yoshida A., Matsunaga H., Ueda M. Identification of prothymosin-alphal, the necrosis-apoptosis switch molecule in cortical neuronal cultures.// J. Cell. Biol. 2007 -V. 176-P. 853-862.

44. Fujita R., Ueda H. Prothymosin-alphal prevents necrosis and apoptosis following stroke.// Cell. Death. Differ. 2007 - V. 14 - P. 1839-1842.

45. Fujita R., Ueda M., Fujiwara K., Ueda H. Prothymosin-a plays a defensive role in retinal ischemia through necrosis and apoptosis inhibition.// Cell. Death. Differ. 2009 - V. 16 - P. 349-358.

46. Fujita R, Ueda H. Protein kinase C-mediated cell death mode switch induced by high glucose.// Cell. Death. Differ. 2003 - V. 10 - P. 1336-1347.

47. Matsunaga H., Ueda H. Stress-induced non-vesicular release of prothymosin-a initiated by an interaction with S100A13, and its blockade by caspase-3 cleavage.// Cell. Death. Differ. -2010-V. 17-P. 1760-1772.

48. Orre R.S., Cotter M.A., Subramanian C., Robertson E.S. Prothymosin alpha functions as a cellular oncoprotein by inducing transformation of rodent fibroblasts in vitro.// J. Biol. Chem. -2000-V. 17-P. 1794-1799.

49. Letsas K.P., Frangou-Lazaridis M., Skyrlas A.s Tsatsoulis A., Malamou-Mitsi V. Transcription factor-mediated proliferation and apoptosis in benign and malignant thyroid lesions.// Pathol. Int. 2005 - V. 55 - P. 694-702.

50. Sasaki H., Sato Y., Kondo S., Fukai I., Kiriyama M., Yamakawa Y., Fujii Y. Expression of the prothymosin alpha mRNA correlated with that of N-myc in neuroblastoma.// Cancer Lett. -2001 -V. 168-P. 191-195.

51. Li K.J, Shiau A.L., Chiou Y.Y., Yo Y.T., Wu C.L. Prothymosin a overexpression induces polycystic kidney disease.// Kidney Int. 2005 - V. 67 - P. 1710-1722.

52. Копнин Б.П. Молекулярные механизмы канцерогенеза.// Энциклопедия клинической онкологии» М.: РЛС, 2004. - С. 34-53.

53. Cotter М.А, Robertson E.S. Modulation of histone acetyltransferase activity through interaction of epstein-barr nuclear antigen 3C with prothymosin alpha.// Mol. Cell. Biol. — 2000-V. 20-P. 5722-5735.

54. Allday M.J., Farrell P.J. Epstein-Barr virus nuclear antigen EBNA3C/6 expression maintains the level of latent membrane protein 1 inGl-arrested cells.// J. Virol. 1994 - V. 68 - P. 34913498.

55. Karetsou Z., Kretsovali A., Murphy C., Tsolas O., Papamarcaki T. Prothymosin alpha interacts with the CREB-binding protein and potentiates transcription.// EMBO Rep. 2002 -V. 3 - P. 361-366.

56. Goodman R.H., Smolik S. CBP/p300 in cell growth, transformation, and development.// Genes. Dev. 2000 - V. 14 - P. 1553-1577.

57. Hartzog G.A., Winston F. Nucleosomes and transcription: recent lessons from genetics.// Curr. Opin. Genet. Dev. 1997 - V. 7 - P. 192-198.

58. Freedman S.J., Sun Z.Y., Poy F., Kung A.L., Livingston D.M., Wagner G., Eck M.J. Structural basis for recruitment of CBP/p300 by hypoxia-inducible factor-1 alpha.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2002 - V. 99 - P. 5367-5372.

59. Knight J.S., Lan K., Subramanian C., Robertson E.S. Epstein-Barr virus nuclear antigen 3C recruits histone deacetylase activity and associates with the corepressors mSin3A and NCoR in human B-cell lines.// J. Virol. 2003 - V. 77 - P. 4261-4272.

60. Xue F., Cooley L. Kelch encodes a component of intercellular bridges in Drosophila egg chambers.// Cell. 1993 - V. 72 - P. 681-693.

61. Kang M.L., Kobayashi A., Wakabayashi N., Kim S.G., Yamamoto M. Scaffolding of Keapl to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004 - V. 101 - P. 2046-2051.

62. Zhang D.D., Hannink M. Distinct cysteine residues in Keapl are required for Keapl-dependent ubiquitination of Nr£2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress.// Mol. Cell. Biol. 2003 - V. 23 - P. 8137-8151.

63. Itoh К., Wakabayashi N., Katoh Y., Ishii Т., Igarashi K„ Engel J.D., Yamamoto M. Keapl. repress nuclear activation of antioxidant responsive elements by Nrf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain.// Genes Develop. 1999 - V. 13 - P. 76-86.

64. Мельников C.B. Взаимодействие протимозина а с адаптером убиквитин-лигазы белком Keapl: Автореф. дис. канд. хим. Наук. М., 2008. -19с.

65. Niture S.K., Jaiswal А.К. Prothymosin-alpha mediates nuclear import of the INrf2/CuI3 Rbxl complex to degrade nuclear Nrf2.// J. Biol. Chem. 2009 -V. 284(20) - P. 13856-13868.

66. Johnson R.A., Ince T.A., Scotto K.W. Transcriptional repression by p53 through direct binding to a novel DNA element.// J. Biol. Chem. 2001 - V. 276 - P. 27716-27720.

67. Attardi L.D., DePinho R.A. Conquering the complexity of p53.// Nature Genetics 2004 - V. 36-P. 7-8.

68. Romer L., Klein C., Dehner A., Kessler H., Buchner J. p53 a natural cancer killer: structural insights and therapeutic concepts.// Angew Chem. Int. Ed. Engl. - 2006 - V. 45(39) - P. 6440-6460.

69. Scoumanne A., Harms K.L., Chen X. Structural basis for gene activation by p53 family members.// Cancer Biol. Ther. 2005 - V. 4(11) - P. 1178-1185.

70. Harms K.L., Chen X. The functional domains in p53 family proteins exhibit both common and distinct properties.// Cell. Death. Differ. 2006 - V. 13(6) - P. 890-897.

71. Kubbutat M.H., Ludwig R.L., Ashcroft M., Vousden K.H. Regulation of Mdm2-directed degradation by the С terminus of p53.// Mol. Cell Biol. 1998 - V. 18 - P. 5690-5698.

72. Haupt Y., Maya R., Kazaz A., Oren M. Mdm2 promotes the rapid degradation of p53.// Nature. 1997 - V. 387 - P. 296-299.

73. Kubbutat M.H., Jones S.N., Vousden K.H. Regulation of p53 stability by Mdm2.// Nature. -1997-V. 387-P. 299-303.

74. Fang S., Jensen J.P., Ludwig R.L., Vousden K.H., Weissman A.M. Mdm2 is a RING finger-dependent ubiquitin protein ligase for itself and p53.// J. Biol. Chem. 2000 - V. 275 - P. 8945-8951.

75. Honda R., Yasuda H. Activity of MDM2, a ubiquitin ligase, toward p53 or itself is dependent on the RING finger domain of the ligase.// Oncogene. 2000 - V. 19 - P. 1473-1476.

76. Siepe D., Jentsch S. Prolyl isomerase Pinl acts as a switch to control the degree of substrate ubiquitylation.// Nat. Cell. Biol. 2009 - V. 11 - P. 967-972.

77. Barak Y., Juven Т., Haffher R., Oren M. Mdm2 expression is induced by wild type p53 activity.// EMBO J. 1993 - V. 12 - P. 461-468.

78. Wu X., Bayle J.H., Olson D., Levine A.J. The p53-mdm-2 autoregulatory feedback loop.// Genes Dev. 1993 - V. 7 - P. 1126-1132.

79. Shieh S.Y., Ikeda M., Taya Y., Prives C. DNA damage-induced phosphorylation of p53 alleviates inhibition by MDM2.// Cell. 1997 - V. 91 - P. 325-334.

80. Shieh S.Y., Taya Y., Prives C. DNA damage-inducible phosphorylation of p53 at N-terminal sites including a novel site, Ser20, requires tetramerization.// EMBO J. 1999 - V. 18 - P. 1815-1823.

81. Sakaguchi K., Herrera J.E., Saito S., Miki T., Bustin M., Vassilev A., Anderson C.W., Appella E. DNA damage activates p53 through a phosphorylation-acetylation cascade.// Genes. Dev. 1998-V. 12-P. 2831-2841.

82. Liu L., Scolnick D.M., Trievel R.C., Zhang H.B., Marmorstein R., Halazonetis T.D., Berger S.L. p53 sites acetylated in vitro by PCAF and p300 are acetylated in vivo in response to DNA damage.// Mol. Cell. Biol. 1999 - V. 19 - P. 1202-1209.

83. Xu Y. Regulation of p53 responses by post-translational modifications.// Cell. Death. Differ. -2003-V. 10-P. 400-403.

84. Vousden K.H. Outcomes of p53 activation-spoilt for choice.// J. Cell. Sci. — 2006 V. 119(24)-P. 5015-5020.107. zur Hausen H. Viruses in human cancers.// Science. 1991 - V. 254(5035) - P. 1167-1173.

85. Werness B.A., Levine A. J., Howley P.M. Association of human papillomavirus types 16 and 18 E6 proteins with p53.// Science. 1990 - V. 248(4951) - P. 76-79.

86. Hawley-Nelson P., Vousden K.H., Hubbert N.L., Lowy D.R., Schiller J.T. HPV 16 E6 and E7 proteins cooperate to immortalize human foreskin keratinocytes.// EMBO J. 1989 V. 8 - P. 3905-3910.

87. Munger K., Phelps W.C., Bubb V., Howley P.M., Schlegel R. The E6 and E7 genes of the human papillomavirus type 16 together are necessary and sufficient for transformation of primary human ceratinocytes.// J. Virol. 1989 - V. 63 - P. 4417-4421.

88. Schneider-Gadicke A., Schwarz E. Different human cervical carcinoma cell lines show similar transcription patterns of human papillomavirus type 18 early genes.// EMBO J. 1986 - V. 5 -P. 2285-2292.

89. Vogelstein B., Kinzler K.W. p53 function and dysfunction.// Cell. 1992 - V. 70(4) - P. 523526.

90. Scheffner M., Whitaker N.J. Human papillomavirus-induced carcinogenesis and the ubiquitin-proteasome system.// Semin. Cancer Biol. 2003 - V. 13 - P. 59-67.

91. Huibregtse J.M., Scheffner M., Beaudenon S., Howley P.M. A family of proteins structurally and functionally related to the E6-AP ubiquitin-protein ligase.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA -1995) V. 92 - P. 2563-2567.

92. Huibregtse J.M., Scheffner M., Howley P.M. Localization of the E6-AP regions that direct human papillomavirus E6 binding, association with p53, and ubiquitination of associated proteins.// Mol. Cell. Biol. 1993 - V. 13 - P. 4918-4927.

93. Hengstermann A., Linares L.K., Ciechanover A., Whitaker N.J., Scheffner M. Complete switch from Mdm2 to human papillomavirus E6-mediated degradation of p53 in cervical cancer cells.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 - V. 98 - P. 1218-1223.

94. Munger K., Basile J.R., Duensing S., Eichten A., Gonzales S.L., Grace M., Zacny V.L. Biological activities and molecular targets of the human papillomavirus E7 oncoprotein.// Oncogene. 2001 - V. 20 - P. 7888-7898.

95. Boyer S.N., Wazer D.E., Band V. E7 protein of human papillomavirus-16 induces degradation of retinoblastoma protein through through ubiquitin-proteasome pathway.// Cancer. Res. -1996 V. 56 - P. 4620-4624.

96. Wang J., Sampath A., Raychaudhuri P., Bagchi S. Both Rb and E7 are regulated by the ubiquitin proteasome pathway in HPV-containing cervical tumor cells.// Oncogene. 2001 -V. 20-P. 4740-4749.

97. Stevaux O., Dyson NJ. A revised picture of the E2F transcriptional network and RB function.// Curr. Opin. Cell. Biol. 2002 - V. 14 - P. 684-691.

98. Longworth M.S., Laimins L.A. The binding of histone deacetylases and the integrity of zinc finger-like motifs of the E7 protien are essential for the life cycle of human papillomavirus type 31.// J. Virol. 2004 - V. 78 - P. 3533-3541.

99. Kornberg R.D., Lorch Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryote chromosome.// Cell. 1999 - V. 98(3) - P. 285-294.

100. Luger K., Richmond T.J. The histone tails of the nucleosome.// Curr. Opin. Genet. Dev. -1998-V. 8(2)-P. 140-146.

101. Workman J.L., Kingston R.E. Alteration of nucleosome structure as a mechanism of transcriptional regulation.// Annu. Rev. Biochem. 1998 - V. 67 - P. 545-79.

102. Bustin M., Catez F., Lim J. The dynamics of histone HI function in chromatin.// Molecular Cell. 2005 - V. 17 - P. 617-620.

103. Parseghian M.H., Hamkalo B.A. A compendium of the histone HI family ofsomatic subtypes: An elusive cast of characters and their characteristics.// Biochem. Cell. Biol. 2001 - V. 79 -P.289-304.

104. Ponte I., Vila R., Suau P. Sequence complexity of histone HI subtypes.// Mol. Biol. Evol. -2003 V. 20(3) - P. 371-380.

105. Khochbin S. Histone HI diversity: bridging regulatory signals to linker histone function.// Gene. 2001. V. 271(1)-P. 1-12.

106. Vignali M., Workman J.L. Location and function of linker histones.// Nat. Struct. Biol. 1998 -V. 5(12)-P. 1025-1028.

107. Thomas J.O. Histone HI: location and role.// Curr. Opin. Cell. Biol. 1999 - V. 11(3) - P. 312-317.

108. Lusser A., Kadonaga J.T. Strategies for the reconstitution of chromatin.// Nat. Methods. -2004-V. 1(1)-P. 19-26.

109. Thoma F., Koller T., Klug A. Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt-dependent superstructures of chromatin.// J. Cell. Biol. 1979 - V. 83-P. 403-427.

110. Pennings S., Meersseman G., Bradbury E.M. Linker histones HI and H5 prevent the mobility of positioned nucleosomes.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994 - V. 91(22) - P. 1027510279.

111. Shimamura A., Sapp M., Rodriguez-Campos A., Worcel A. Histone HI represses transcription from minichromosomes assembled in vitro.// Mol. Cell. Biol. 1989 -V. 9(12) -P. 5573-5584.

112. Laybourn P.J., Kadonaga J.T. Role of nucleosomal cores and histone HI in regulation of transcription by RNA polymerase II.// Science. 1991 - V. 254(5029) - P. 238-245.

113. Brown, D.T., Alexander, B.T., Sittman, D.B. Differential effect of HI variant overexpression on cell cycle progression and gene expression.// Nucleic Acid Res. 1996 V. 24 - P. 486-493.

114. Shen X., Gorovsky M.A. Linker histone HI regulates specific gene expression but not global transcription in vivo.// Cell. 1996 - V. 86 - P. 475-483.

115. Ni J.Q., Liu L.P., Hess D., Rietdorf J., Sun F.L. Drosophila ribosomal proteins are associated with linker histone HI and suppress gene transcription.// Genes. Dev. 2006 - V. 20(14) - P. 1959-1973.

116. Shen X., Yu L., Weir J.W., Gorovsky M.A. Linker histones are not essential and affect chromatin condensation in vivo.// Cell. 1995 - V. 82(1) - P. 47-56.

117. Ushinsky S.C., Bussey H., Ahmed A.A., Wang Y., Friesen J., Williams B.A., Storms R.K. Histone HI in Saccharomyces cerevisiae.// Yeast. 1997 - V. 13(2) - P. 151-161.

118. Patterton H.G., Landel C.C., Landsman D., Peterson C.L., Simpson R.T. The biochemical and phenotypic characterization of Hholp, the putative linker histone HI of Saccharomyces cerevisiae.// J. Biol. Chem. 1998 - V. 273(13) - P. 7268-7276.

119. Ramón A., Muro-Pastor M.I., Scazzocchio C., Gonzalez R. Deletion of the unique gene encoding a typical histone HI has no apparent phenotype in Aspergillus nidulans.// Mol. Microbiol. 2000 - V. 35(1) - P. 223-233.

120. Rupp R.A., Becker P.B. Gene regulation by histone HI: new links to DNA methylation.// Cell. 2005 - V. 123(7) - P. 1178-1179.

121. Kim K., Choi J., Heo K., Kim H., Levens D., Kohno K., Johnson E.M., Brock H.W., An W. Isolation and characterization of a novel HI.2 complex that acts as a repressor of p53-mediated transcription.// J. Biol. Chem. 2008 - V. 283(14) - P. 9113-9126.

122. Nishiyama M., Nakayama K., Tsunematsu R., Tsukiyama T., Kikuchi A., Nakayama K.I. Early embryonic death in mice lacking the beta-catenin-binding protein Duplin.// Mol. Cell. Biol. 2004 - V. 24(19) - P. 8386-8394.

123. An W., Palhan V.B., Karymov M.A., Leuba S.H., Roeder R.G. Selective requirements for histone H3 and H4 N termini in p300-dependent transcriptional activation from chromatin.// Mol. Cell. 2002 - V. 9(4) - P. 811-821.

124. Papamarcaki T., Tsolas O. Prothymosin alpha binds to histone HI in vitro.// FEBS Lett. — 1994-V. 345 -P. 71-75.

125. Diaz-Jullien C., Perez-Estevez A., Covelo G., Freire M. Prothymosin alpha binds histones in vitro and shows activity in nucleosome assembly assay.// Biochim. Biophys. Acta. 1996 - V. 1296 - P. 219-227.

126. Karetsou Z., Sandaltzopoulos R., Frangou-Lazaridis M., Lai C.Y., Tsolas O., Becker P.B., Papamarcaki T. Prothymosin alpha modulates the interaction of histone HI with chromatin.// Nucleic Acids Res. 1998 - V. 26 - P. 3111-3118.

127. Gomez-Marquez J., Rodriguez P. Prothymosin alpha is a chromatin-remodelling protein in mammalian cells.// Biochem. J. 1998 - V. 333 - V. 1-3.

128. Karetsou Z., Martic G., Tavoulari S., Christoforidis S., Wilm M., Gruss C., Papamarcaki T. Prothymosin alpha associates with the oncoprotein SET and is involved in chromatin decondensation.// FEBS Lett. 2004 - V. 577 - P. 496-500.

129. Martic G., Karetsou Z., Kefala K., Politou A.S., Ciapier C.R., Straub Т., Papamarcaki Т. Parathymosin affects the binding of linker histone HI to nucleosomes and remodels chromatin structure.// J. Biol. Chem. 2005 - V. 280 - P. 16143-16150.

130. Mamoon N.M., Song Y. Wellman S.E. Binding of histone HI to DNA is described by an allosteric model.// Biopolymers. 2005 - V. 77 - P. 9-17.

131. Catez F., Ueda T. Bustin M. Determinants of histone HI mobility and chromatin binding in living cells.// Nat. Struct. Mol. Biol. -2006 V. 13 - P. 305-310.

132. Park YJ. Luger K. Histone chaperones in nucleosome eviction and histone exchange.// Curr. Opin. Struct. Biol. 2008 - V. 18 - P. 282-289.

133. George E.M., Brown D.T. Prothymosin a is a component of a linker histone chaperone.// FEBS Letters. 2010 - V. 584 - P. 2833-2836.

134. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature. 1970 - V. 227 - P. 680-685.

135. Гурьянова O.A., Маханов M., Ченчнк A.A., Чумаков П.М., Фролова Е.И. Оптимизация полногеномной неупорядоченной клонотеки коротких шпилечных РНК на основе лентивектора.// Молекулярная биология. 2006 - V. 40 - Р. 448-459.

136. Chichkova N.V., Evstafieva A.G., Lyakhov I.G., Tsvetkov A.S., Smirnova T.A., Karapetian R.N., Karger E.M., Vartapetian A.B. Divalent metal cation binding properties of human prothymosin cc.// Eur. J. Biochem. 2000 - V. 267 - P. 4745-4752.

137. Cai J.H., Deng S., Kumpf S.W., Lee P.A., Zagouras P., Ryan A., Gallagher D.S. Validation of rat reference genes for improved quantitative gene expression analysis' using low density arrays.// Biotechniques. 2007 - V. 42(4) - P. 503-512.

138. Kobayashi Т., Wang Т., Maezawa M., Kobayashi M., Ohnishi S., Hatanaka K., Hige S., Shimizu Y., Kato M., Asaka M., Tanaka J., Imamura M., Hasegawa K., Tanaka Y.,

139. Brachmann R.K. Overexpression of the oncoprotein prothymosin alpha triggers a p53 response that involves p53 acetylation.// Cancer Res. 2006 - V. 66 - P. 3137-3144.

140. Shiau A.L., Lin P.R., Chang M.Y., Wu C.L. Retrovirus-mediated transfer of prothymosin gene inhibits tumor growth and prolongs survival in murine bladder cancer.// Gene Ther. — 2001 V. 8(21) - P. 1609-1617.1. Благодарности

141. Выражаю искреннюю благодарность своему научному руководителю Александре Георгиевне Евстафьевой за организацию работы, грамотное руководство и всестороннюю поддержку.

142. Хочется выразить глубокую благодарность моим коллегам, которые принимали участие в данной работе: Суворовой А., Соколову В., Рудько В.

143. Искренне признательна своим учителям Фатеевой Т., Мельникову С., Филонову Г. за обучение методам, обсуждение результатов и всевозможную помощь в выполнении и написании работы.

144. Выражаю отдельную благодарность Хуторненко А., Тужикову А., Трусовой С. -сотрудникам нашей лаборатории — за обсуждение результатов, ценные советы и поддержку.

145. Отдельная благодарность И.М.Теренину за помощь в написании диссертации, а также Андрееву Д.Е. и Дмитриеву С.Е. за теоретическую поддержку и стимуляцию научной деятельности.

146. И эта работа не была бы возможна без неоценимого содействия П.М.Чумакова.