Становление микробиоценоза кишечника, показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использовании новых пробиотических штаммов лактобацилл тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат биологических наук Петраков, Евгений Сергеевич

• Петраков, Евгений Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Петраков, Евгений Сергеевич

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Пищеварительная система молодняка крупного рогатого скота и её микрофлора.

1.2 Расстройства пищеварения у новорожденных телят и их профилактка.

1.3 Влияние нормальной лактофлоры на макроорганизм.

1.4 Адгезия лактобацилл к эпителиоцитам кишечника.

1.5 Влияние лактобактерий на иммунные реакции организма.

1.6 Антагонистическое влияние лактобактерий.

1.7 Продукция лактобациллами биологически активных веществ.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Выделение штаммов лактобацилл.

2.2 Изучение антагонистических свойств у лактобацилл.

2.3 Изучение физиолого-биохимических свойств лактобацилл.

2.4 Изучение острой токсичности лактобацилл.

2.5 Постановка научно - хозяйственных опытов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1 Биология гетероферментативных лактобацилл пищеварительного тракта телят.

3.1.1 Выделение лактобацилл из кишечника телят и их скрининг на антагонизм.

3.1.2 Кислотообразование как антагонистический фактор лактобацилл кишечника.

3.1.3 Адгезия лактобацилл.

3.1.4 Толерантность лактобацилл к неблагоприятным факторам пищеварительного тракта.

3.1.5 Ферментативная активность лактобацилл.

3.1.6 Чувствительность к антибиотикам.

3.1.7 Исследование острой токсичности штаммов Lactobacillus fer-mentum В238/06 и В395/06.

3.1.8 Характеристика отобранных штаммов лактобацилл.

3.2 Воздействие Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/ на организм телят - молочников.

3.2.1 Становление микрофлоры кишечника у телят.

3.2.2 Влияние лактобацилл на гематологические показатели, иммунную систему, расстройства функций пищеварения и рост животных.

3.2.3 Эффективность совместного применения штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 при выращивании телят.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ВЫВОДЫ.

6. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Становление микробиоценоза кишечника, показатели крови и неспецифическая резистентность у телят при использовании новых пробиотических штаммов лактобацилл»

Обоснование необходимости проведения исследований

После распада СССР в стране произошли значительные изменения-агропромышленного комплекса наиболее явно выразившиеся» в животноводстве. Существенно сократилось поголовье всех видов скота, что обусловило падение производства животноводческой продукции. По данным заместителя директора Департамента животноводства и племенного дела Минсельхоза РФ X. А. Амерханова, с 1991 по 2007 г. поголовье крупного рогатого скота в нашей стране сократилось с 55 до 21,5 млн. голов, в том числе мясного - с 1,5 млн. до 452 тыс. голов, производство говядины снизилось в 2,5 раза, импорт возрос до 45%.

Такая же ситуация наблюдается в молочном скотоводстве. С 1990 по 2008 г. численность коров снизилась с 20,7 до 9,2 млн голов. Их доля в общем поголовье крупного рогатого скота повысилась с 36,3 до 43,6%. Производство молока снизилось в 1,7 раза, а в пересчете на душу населения с 376 до 221 кг (Оксанич Н., 2009).

Снижение качества питания в последние годы обусловлено как недостаточным потреблением питательных веществ, в первую очередь полноценных белков животного происхождения и витаминов, так и контаминацией животноводческой продукции ксенобиотиками техногенной и биологической природы. Безопасность и качество продукции животного происхождения неразрывно связаны. Невозможно гарантировать качество продуктов питания, если игнорировать биологические, токсикологические и радиологические факторы риска (Панин А.Н., Малик Н.И1, 2006).

Значительно повысились требования к качеству получаемой сельскохозяйственной продукции, что обусловлено возрастающем уровнем загрязнения окружающей среды. Получение экологически чистой продукции является первостепенной задачей для животноводства.

Широко стал применяться термин «безопасность продуктов питания». Это связано с многочисленными публикациями о возможности накопления антибиотиков и целого ряда стимуляторов роста в-тканях животных при их использовании. Продукты убоя таких животных, при определенных условиях, могут быть источником не только различных пищевых токсикозов и ток-сикоинфекций, но и- вызывать нарушения обмена веществ, связанное' с повышенным уровнем в организме1 как самих стимуляторов? роста, так и продуктами'их метаболизма.

Кроме этого, во всем мире отмечен рост количества мутантных штаммов микроорганизмов с высокой лекарственной устойчивостью. Их появление спровоцировало широкое и бесконтрольное применение антибиотиков. При изучении 187 культур, выделенных из различных йогуртов, производимых в странах Европейского Союза, была обнаружена устойчивость к кана-мицину у 79% изолятов, к ванкомицину у 65%, к тетрациклину у 26%, пенициллину у 23%, эритромицину у 16% и хлорамфениколу у 11%; при этом большая часть культур характеризовалась множественной лекарственной устойчивостью (Теттгетап Я., 2003). Снижение активности существующих антибиотиков ведет к созданию новых, более сильных, препаратов. Это создает порочный круг, появление новых штаммов резистентных к новым препаратам, и т. д.

Сейчас остро стоит вопрос скорейшего восстановления скотоводства, продиктованный жизненно важной потребностью в обеспечении продовольственной безопасности страны. Для увеличения количества выходной продукции животноводства, кроме внедрения новых схем по содержанию, кормлению и воспроизводству животных, широко применяют различные препараты стимуляторы роста. Нередко, в качестве таких стимуляторов используют антибиотики. Однако это влечет целый ряд негативных последствий.

При* нарушении условий содержания и кормления молодняка процессы сукцессии кишечных микроорганизмов нарушаются в негативную сторону. При этом в составе кишечного биоценоза устанавливается высокая концентрация стафилококков, протея, дрожжеподобных грибов и других микроорганизмов, снижен популяционный уровень бифидобактерий и молочнокислых бактерий, а структура популяции' эшерихий изменяется в сторону уменьшения ферментативной активности. Большую часть популяции лакто-бацилл и бифидобактерий представляют клоны с низкими колонизационными характеристиками и слабыми антагонистическими свойствами.

К основным причинам, вызывающим сдвиги в кишечном микробиоценозе, относятся первичные и вторичные иммунодефициты у молодняка, снижение колострального иммунитета, нарушение условий кормления и содержания матери и потомства, часто вакцинация (Малик К.И., Панин А.Н., 2001).

Под действием ряда экзогенных (антибиотики, вакцинация) и технологических факторов нарушается микроэкологическое равновесие кишечного биотопа, что приводит не только к доминированию потенциально патогенных микробов. Ускоряются темпы изменчивости условно - патогенных микроорганизмов, усиливаются генетический обмен и скорость формирования клонов, несущих плазмиды лекарственной устойчивости и нередко включающих гены, детерминирующие адгезивные, цитотоксические и энтероток-сические свойства условно - патогенных бактерий (Панин А.Н., Малик Н.И., 2006).

Это вызывает дисбактериозы, проявляющиеся в виде диареи, вялости и общего ослабления организма. Ранее, для лечения кишечных расстройств массово применялись антибиотики, но в 2003 году Европарламент и Совет Европы запретили использовать антибиотики в качестве стимуляторов роста в кормах животных и птицы. Тенденция по отказу от антибиотиков наблюдается и в России. Поэтому возникла необходимость в альтернативных препаратах, обладающих антимикробными и р о сто стимулирующими свойствами, быть безвредными и не депонироваться в организме (Долгов B.C., 2007).

Мировой опыт показывает, что наиболее полно этим целям отвечает заместительная терапия, направленная на восстановление кишечного биоценоза путем' регулярного- введения живых бактерий - представителей нормальной кишечной микрофлоры, под названиемпробиотики.

Помимо общего регуляторного воздействия на кишечный микробиоценоз,. пробиотики оказывают стимулирующее влияние на иммунологический статус. Увеличивается количество Т-лимфоцитов, активизируется функция В-лимфоцитов, повышается фагоцитарная активность нейтрофилов. Одновременно идет коррекция как кишечного микробиоценоза, так и иммуноде-фицитных состояний. Анализ иммунотропного действия пробиотиков показал, что основной мишенью для их стимулирующего действия является клеточное звено иммунитета (Малик Н.И., Панин А.Н., 2001).

В настоящее время стоит вопрос о поиске новых, экологически безопасных и не дорогих добавок для применения при выращивании молодняка крупного рогатого скота, которые смогут нормализовать микрофлору телят и повысить естественную резистентность организма, и за счет этого снизить заболеваемость животных и повысить их продуктивность. Несмотря на длительную историю использования таких добавок, многие аспекты этого вопроса остаются спорными и не до конца освещенными. Единая концепция пробиотикотерапии (включающая такие вопросы как происхождение и вид микроорганизмов, используемых в качестве пробиотических, оптимальное количество штаммов в препарате, дозировка живых микробных клеток на голову и др.) не выработана. Это указывает на необходимость проведения исследований нормальной микрофлоры пищеварительного тракта телят, с целью выявления и отбора штаммов, молочнокислых бактерий, обладающих пробиотическими свойствами.

Актуальность работы Перечень пробиотиков, зарегистрированных в Российской Федерации, насчитывает около 80 наименований отечественных и импортных пробиотических препаратов. Пробиотические культуры используются в составе кормовых добавок для молодняка животных, ими обогащают заменители цельного молока, витаминные, минеральные, ферментные кормовые добавки.

Однако Малик Н.И. и Панин А.Н.(2001),, показывают, что при мониторинге рынка пробиотиков; подавляющее число разработок не востребованы* практикой. Указанное обстоятельство дает основание авторам предполагать, что протективная; активность>многих пробиотических препаратов не обеспечивает заявленного авторами, эффекта. Они пришли-к выводу о том, что реальная потребность в экологически безопасных препаратах для профилактики же-лудочно - кишечных болезней, кажущаяся простота композиций пробиотика и снижение требований к содержанию и оформлению результатов научных и производственных испытаний привели к тому, что практически каждый научный или околонаучный коллектив считает способным реализовать себя в разработке пробиотических препаратов. При выборочном контроле пробио-тиков, выпускаемых различными производителями, авторы выявили основные причины, отрицательно влияющие на их качество: контаминация посторонней микрофлорой; замена одного пробиотического штамма другим; несоблюдение показателя жизнеспособности клеток в одной дозе препарата; несовершенство методов контроля качества; введение в препарат различных добавок без согласования с Ветфармбиосоветом; несоблюдение режимов хранения.

Одной из главных причин неэффективности пробиотиков может быть чужеродность используемых микроорганизмов реципиенту, которому они предназначаются (Коршунов В.М. и др., 1996).

Поэтому, для создания эффективных пробиотических препаратов для молодняка жвачных животных, необходим поиск новых штаммов микроорганизмов, являющихся представителями нормальной микрофлоры пищеварительного тракта телят, обладающих высокой антагонистической активностью по отношению* к патогенам и отвечающих требованиям, предъявляемым к пробиотикам.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы.являлось выделение новых штаммов лактобацилл с пробиотическими характеристиками и оценка их влияния на становление микробиоценоза пищеварительного тракта, морфологическую картину крови, неспецифическую резистентность и интенсивность роста у телят.

Были поставлены следующие задачи:

1. Выделить, из пищеварительного тракта телят лактобациллы и отобрать штаммы, наиболее полно отвечающие требованиям предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам;

2. Изучить становление микробиоценоза кишечника телят, при введении в рацион выделенных штаммов лактобацилл на протяжении первого месяца жизни;

3. Определить неспецифическую резистентность и морфологические показатели крови телят, после использования выделенных штаммов лактобацилл на протяжении первого месяца жизни;

4. Сравнить интенсивность роста телят, получающих добавку из пробио-тических лактобацилл, с их сверстниками.

Научная новизна работы. Впервые из пищеварительного тракта телят выделены гетероферментативные лактобациллы с высокой антагонистической активностью против потенциальных патогенов, устойчивые к неблагоприятным факторам кишечника и безвредные для животных. Изучены штаммы Ь. /егтепНап В238/06 и В395/06, использование которых обеспечивает оптимизацию нормального микробного баланса в кишечнике, ингибирование роста потенциальных патогенов, повышение неспецифической резистентности организма и снижение продолжительности расстройств функций пищеварения, сопровождающихся диарейным синдромом, у телят.

Практическая значимость работы.Применение выделенных штаммов антагонистических лактобацилл в качестве пробиотических у телят первого месяца жизни позволило повысить среднесуточные приросты живой массы на 22% и сократить среднюю продолжительность расстройств пищеварительной системы в расчете на одну голову практически на 40%, что говорит о высокой эффективности применения данных штаммов у молодняка жвачных животных и перспективности разработки препаратов - пробиотиков на их основе.

Положения, выносимые на защиту

1. Из содержимого кишечника телят выделены новые штаммы L. fermentum В238/06 и В395/06, отвечающие всем требованиям, предъявляемым к про-биотическим микроорганизмам;

2. Введение в рацион телят этих штаммов лактобацилл, в физиологически оправданных дозировках, оказывает оптимизирующее действие на становление кишечной микрофлоры и неспецифическую резистентность у телят;

3. Совместное применение штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 существенно увеличивает их профилактическую эффективность при расстройствах функций пищеварения телят и прирост их живой массы в сравнении с раздельным использованием штаммов.

Апробация результатов исследования. Результаты исследований доложены: на региональной научно - практической конференции «Использование инновационных разработок НИУ региона для повышения эффективности сельскохозяйственного производства», (Калуга, 2010); международной научно - практической конференции «Физиологические механизмы становления и поддержания функций организма», (Сухум, 2010); XXI съезде физиологического общества им.И.П. Павлова, (Калуга, 2010).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Физиология», Петраков, Евгений Сергеевич

5. Выводы

1. Из пищеварительного тракта клинически здоровых телят выделены и изучены новые штаммы лактобацилл, идентифицированные как Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06, отвечающие требованиям предъявляемым к пробиотическим микроорганизмам.

2. Введение в рацион телят — молочников штаммов Lactobacillus' fermentum В238/06 и В395/06, в течение первого месяца жизни животных, оказывает оптимизирующее влияние на становление микробиоценоза их кишечника, стимулируя развитие молочнокислых и бифидобактерий и уменьшая численность популяций сальмонелл и кишечной палочки.

3. Штаммы Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 оказывают выраженное влияние на неспецифическую резистентность телят. Они достоверно повышают фагоцитарную активность нейтрофилов и макрофагов на 53%, общую бактерицидную активность сыворотки крови на 18,3% и более чем в два раза содержание лизоцима в крови. Отмечено достоверное увеличение содержание гемоглобина в крови животных опытных групп.

4. Повышение естественных защитных сил организма телят и оптимизация микробиоценоза кишечника приводит к сокращению продолжительности нарушений нормального функционирования пищеварительной системы. В совокупности с более полноценным использованием питательных веществ корма, за счет элиминации протеолитических микроорганизмов, это приводит к повышению среднесуточных приростов на 20,5%, в сравнении с контрольной группой.

5. Совместное применение штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 существенно увеличивают профилактическую эффективность к расстройствам функций пищеварения телят и прирост их живой массы в сравнении с раздельным использованием штаммов. При этом продолжительность расстройств пищеварения телят удалось снизить на 39,6% и повысить среднесуточные приросты на 22%.

6. Предложения производству

Предлагается использовать выделенные штаммы лактобацилл в качестве основы для создания нового пробиотика для телят-молочников, для оптимизации микрофлоры пищеварительного тракта, повышения неспецифической резистентности и улучшения процессов пищеварения в кишечнике, что обеспечивает высокую продуктивность животных.

Заключение

Как видно из вышеизложенного, лактобациллы являются постоянными представителями нормального микробиоценоза кишечника сельскохозяйственных животных. При этом их влияние на макроорганизм благотворно и многогранно. Так, они подавляют жизнедеятельность многих патогенных микроорганизмов, оказывают выраженное иммуномодулирующее воздействие, продуцируют многочисленные микронутриенты, участвуют в процессах пищеварения. В этой связи, лактобактерии представляются основным объектом для использования в качестве основы для пробиотических препаратов, а поиск новых высоко антагонистически активных штаммов, выделенных из пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных, является актуальной задачей для исследований.

2. Материалы и методы исследований 2.1. Выделение штаммов лактобацилл

Для выделения чистых культур Lactobacillus spp. использовали фекалии из кишечника телят, взятые в возрасте-до 30 дней при акте вынужденной дефекации. Отбор фекалий производили в опытном» хозяйстве «Ермолино», Калужской области, в мае 2008 года в стерильные чашки Петри. Из 10 — граммовых навесок фекалий готовили серийные десятикратные разведения на стерильном изотоническом растворе хлорида натрия и производили посев в агаризованную среду Рогозы в модификации Тараканова, элективную для лактобацилл (Тараканов Б.В., 2006). Среда содержит: триптический гидроли-зат казеина - 10 г; дрожжевой экстракт - 5 г; КН2Р04 - 6 г; цитрат аммония двухзамещенный - 2 г; солевой раствор - 5 мл; глюкозу - 20 г; твин 80 - 1 мл; ацетат натрия - 25 г; ледяную уксусную кислоту (99,5%) - 1,32 мл; мясо -пептонный бульон - 100 мл; цистеин солянокислый - 0,5 г; агар-агар - 20 г; капустный отвар - 900 мл; рН среды 5,4. Среда обладает высокой селективностью и применяется для первичного выделения лактобацилл из пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. После культивирования в термостате в течение 72 часов при температуре 39°С пересевали выросшие изолированно колонии в жидкую среду МРС, приготовленную по прописи Де Манна с соавторами (De Mann J.С., Rogosa М., Sharpe М.Е., 1960). Среда содержит: пептон - 1г; мясной экстракт - 1 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; глюкоза - 2 г; твин 80-0,1 г; К2НР04 - 0,2 г; CH3C00Na-3H20 - 0,5 г; триаммонийцитрат - 0,2 г; MgS04-7H20 - 0,02 г; MnS04-4H20 - 0,005 г; дистиллированная вода - 100 мл; рН среды 6,0 - 6,5; культивировали при 39°С в течение 24 часов.

Одним из важных дифференцирующих признаков при идентификации лактобацилл является отсутствие у них каталазы. Для изучения использовали набор для микробиологических исследований для определения каталазы (производство НИЦФ, г. Санкт-Петербург). Метод основан на способности каталазы расщеплять перекись водорода с образованием пузырьков газа. Ход исследования: на поверхность предметного > стекла, с помощью петли, переносили суточную культуру, выращенную на лактобакагаре, среде для выделениями культивирования лактобацилл (производство ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии; г. Оболенск). Сверху наносили каплю 1-3% перекиси водорода. Положительная реакция - появление пузырьков газа.

Все выделенные культуры были первично идентифицированы как Lactobacillus spp. по морфологии клеток при микроскопии (неподвижные, грам-положительные палочки), отсутствии спорообразования и каталазы, потребности в ростовых веществах.

Штаммы молочнокислых микроорганизмов, которые непосредственно использовали в исследованиях, поддерживали и сохраняли методом пересева в среду Рогозы в модификации Тараканова ежемесячно. Между пересевами культуры хранили в холодильнике при температуре 4-8°С.

2.2. Изучение антагонистических свойств у лактобацилл

Изучение антибактериальных свойств лактобацилл проводили методом отсроченного антагонизма в двухслойном агаре. На плотную среду МРС высевали методом укола бактериологической петлей 1-4 культуры лактобацилл на одну чашку Петри и культивировали при температуре 39°С в течение 72 часов. Далее, на крышку наносили несколько капель хлороформа и оставляли чашки перевернутыми на 30 минут. Убитые в парах хлороформа бактерии помещали на 30 мин в термостат для испарения хлороформа. Затем на чашки наслаивали слой 0,7%-ного полужидкого питательного агара с равномерно распределенной в нем тест-культурой и вновь культивировали при 39°С в течение ночи. Положительный результат учитывали по появлению вокруг инактивированных колоний лактобацилл зон отсутствия роста тест - культур.

Для. установления штаммов, продуцирующих в качестве антибактериальных веществ микроцины (бактериоцины с низкой молекулярной массой), использовали методику, описанную Хмель И.А. с соавторами (Хмель И.А., Манохина И.М., Басюк Е.И. и др., 1993). На поверхность плотной среды МРС с нанесенными, выросшими и обработанными в парах хлороформа-колониями, накладывали стерильный целлофан. Сверху на целлофан наносили 0,7%-ный питательный агар с равномерно распределенной тест - культурой. Инкубировали* в течение суток при температуре 39°С. Вокруг колоний, продуцирующих микроцины, появлялись зоны задержки роста. Метод основан на способности веществ с низкой молекулярной массой проникать через поры в целлофане.

В качестве индикаторных культур использовали штаммы дикого типа: 10 штаммов Escherichia coli spp. и 9 штаммов Salmonella spp., выделенных от свиней, 10 штаммов Staphylococcus spp. и 10 штаммов Enterococcus spp., выделенных от мышей, а также музейные штаммы: Salmonella rostock, S.derby, S.typhimurium colEl, S.utrecht, S.london 1446, S.dublin 42, S.bovis morbipicans 988, S.give, S.heidelberg 287, S.kirkae, S.stanly, Escherichia coli 113-3, E.coli K-12 W-3350, E.coli K-88, E.coli 817-020, Micrococcus luteus, Staphylococcus aureus, Streptococcus faecalis OG-1.

2.3. Изучение физиолого-биохимических свойств лактобацилл

Для изучения ферментативных свойств выделенных культур по отношению к различным углеводам готовили жидкую среду МРС, в которую в отличие от оригинальной прописи не вносили глюкозу, а добавляли изучаемые углеводы в количестве 1 грамм на 100 мл среды. В качестве индикатора использовали бромкрезолпурпур в виде 1,6%-ного спиртового раствора. Культивировали при температуре 39 °С до 5 суток. О ферментировании углеводов судили по изменению окраски среды. Проверена ферментативная активность в отношении 25 углеводов, из которых 16 приведены в определителе бактерий Берджи: арабиноза, целлобиоза, фруктоза, галактоза, лактоза, мальтоза, манит, манноза, мелецитоза, рафиноза, рамноза, салицин, сорбит, сахароза, трегалоза, ксилоза, а 9 дополнительно использованы нами, это: лак-тулоза, сорбоза, арабино-галактан, фукоза, нутроза, тураноза, инулин, raftilose Р-95, raftiline ST.

В зависимости от того, какие продукты образуются при1 сбраживании глюкозы - только молочная кислота* или также другие органические продукты и СОз, молочнокислые бактерии принято подразделять на гомофермента-тивные и гетероферментативные (Шлегель Г., 1987). Это деление отражает коренные различия в путях катаболизма Сахаров. Основным дифференцирующим признаком является газообразование гетероферментативными бактериями при ферментации глюкозы. Для выявления газообразования засевали исследуемые культуры методом укола бактериологической петлей в пробирку с 5 мл полужидкого 0,7%-ного лактобакагара и сверху заливали 1 мл голодного агара. О способности к газообразованию судили через 24 часа выдержки в термостате при 39°С, по образованию выделяющимся углекислым газом разрывов в агаровом столбике в пробирке.

Энергию кислотообразования определяли по количеству титруемой молочной кислоты (Кугенев П.В., Барабанщиков Н.В., 1978), накопленной бактериями при посеве на обезжиренное 10%-ное молоко за 24 часа. Ход определения: в колбу емкостью 100мл отмеряли пипеткой 10мл исследуемого молока и 20мл дистиллированной воды (воду добавляли для того, чтобы отчетливее уловить розовый оттенок при титровании), в смесь добавляли 3 капли 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина; из бюретки по каплям добавляли в колбу при постоянном помешивании 0,1н раствор едкого натра до появления слабо-розового окрашивания, не исчезающего в течение минуты. Результат выражали в градусах Тернера (Т°). Под условными градусами понимается количество миллилитров точно 0,1н раствора щелочи (КОН или №ОН), необходимое для нейтрализации 100мл молока, разбавленного вдвое дистиллированной водой, при индикаторе фенолфталеине. Так же устанавливали коэффициент кислотности в граммах молочной кислоты. Для этого количество градусов титрования умножали на 0,009 (количество граммов молочной кислоты, эквивалентное одному миллилитру 0,1н щелочи). Кроме этого устанавливали активную кислотность молока путем измерения рН, проводимого при помощи автоматического рН-метра рН410 (производство «НПКФ Аквилон», г. Москва).

Процессы адгезии изучали по методике Брилис с соавторами (Брилис В.И., Брилине Т.А\ и др. 1986), на дважды отмытых в фосфатном буфере эритроцитах телят. В пробирку вносили по 0,5 мл взвеси эритроцитов и суспензии микробов в концентрации 109 клеток/мл, инкубировали в течение 30 минут при 39°С и готовили из смеси мазок. Готовые мазки окрашивали по методу Романовского-Гимза, подсчет адгезированных микроорганизмов вели под микроскопом. Использовали показатели; средний показатель адгезии (среднее количество микробов прикрепившееся к 1 эритроциту при подсчете не менее 25 эритроцитов, учитывая не более 5 эритроцитов в одном поле зрения), коэффициент участия эритроцитов в адгезивном процессе (процент эритроцитов, имеющих на своей поверхности адгезированные микробы) и индекс адгезивности микроорганизмов (среднее количество микробных клеток на одном участвующем в адгезивном процессе эритроците, исчисляется по формуле ИАМ=СПАх100/к).

Чувствительность к антимикробным веществам у выделенных микроорганизмов определяли методом диффузии в агаре в соответствии с общепринятыми методиками (с помощью стандартных дисков производства НИЦФ, г. Санкт-Петербург). Концентрации антимикробных средств в дисках соответствовали: тетрациклина-ЗОмкг, рифампицина-5мкг, оксациллина-Юмкг, кларитромицина-15мкг, клиндамицина-2мкг, эритромицина-15мкг, левомицетина-ЗОмкг, ванкомицина-ЗОмкг, амикацина-ЗОмкг, стрептомицина-ЗОмкг, канамицина-ЗОмкг, неомицина-ЗОмкг, гентамицина-120мкг, фурадо-нина-ЗООмкг, бензилпенициллина-ЮЕД, ампициллина-Юмкг, меропенема-Юмкг, линезолида-ЗОмкг, ципрофлоксацина-5мкг, левофлоксацина-5мкг, доксициклина-ЗОмкг.

Для изучения толерантности выделенных лактобацилл к неблагоприятным факторам желудочно-кишечного тракта в опытные пробирки с 5мл среды MPC вносили: желчь для получения следующих концентраций - 20% и

40%,этанол для получения концентрации в 2%,4%,6% и 8%, 0,2% фенола, NaCl в концентрации 2%,4% и 6%. Суточную бульонную культуру добавляли по 0,5 мл' в каждую из опытных пробирок, культивировали при температуре 39°С. Через 24 часа фиксировали наличие или отсутствие роста.

Желчные кислоты оказывают мощное противомикробное действие, поэтому микрофлора ЖКТ выработала механизмы сопротивления действию желчи (Gunn J.S., 2000). По сравнению с грамотрицательными, грамположи-тельные бактерии, как правило, менее устойчивы к желчным кислотам, выделяющимся в двенадцатиперстную кишку, таким как N-ацильные соединения, конъюгированные с глицином или таурином (AlinY.T. et al., 2003). Во многих исследованиях получены данные о способности лактобацилл и бифидобакте-рий переносить кислотность желудка и действие желчных солей, присутствующих в ЖКТ, с вариабельностью между штаммами (Charteris W.P. et al., 1998; Prasad J. et al., 1998; Haller D. et al., 2001). Существуют методы, позволяющие моделировать имитацию транзита по ЖКТ, например методика Haller et al. (2001), предусматривающая инкубирование при рН 2,0-3,0 в физиологическом растворе в течение 1-2 ч, затем помещение в 1%-ный желчный бульон (CBS). Однако, желудочный сок, кроме низкого значения активной кислотности, содержит в себе ряд ферментов и солей. Данная методика не предусматривает изучение комплексного воздействия всех факторов желудочного сока на бактерийную клетку. Поэтому для проведения исследования на выживаемость в искусственном желудочном соке была выбрана методика, описанная Casey P.G. et al. (2004). Искусственный желудочный сок по прописи, предложенной Casey P.G. (Casey P.G., Casey G.D. et al., 2004), содержит на 1 литр сока: 35 г D-глюкозы, 20,5 г NaCl, 6 г КН2РО4, 1,1 г СаСЬ, 3,7 г КС1, 0,5 г бычей желчи (SERVA), 133 мг пепсина, 1 г лизоцима. Добавляли концентрированную соляную кислоту до получения значения рН* 1,85. В отличие от стандартной прописи, нами было решено не вводить в состав искусственного желудочного сока лизоцим, так как известно, что наибольшая активность лизоцима наблюдается при значениях рН от 3,5 до 7. Исследуемые штаммы выращивали- на лактобакагаре в течение суток при температуре 39°С, смывали 1 мл стерильного 0,9%-ного раствора NaCl и смешивали с 5 мл желудочного сока. Готовили серийные разведения сразу после смешивания и. через 30 минут. Посев из разведений производили на лактобакагар, а подсчет выросших колоний вели через 48 часов. Для оценки выживаемости лактобацилл в искусственном желудочном соке рассчитывали процент живых микробных клеток от количества первоначально внесенных.

Окончательную идентификацию изолятов проводили с помощью тест-системы для биохимической идентификации бактерий до вида API-50, производства БиоМерье (Франция), с использованием программного обеспечения apiweb - API 50 CHL V5.0.

2.4. Изучение острой токсичности лактобацилл

В связи с тем, что мы должны были изучить влияние выделенных антагонистических штаммов лактобацилл, наиболее полно отвечающих требованиям применяемым к пробиотикам, на рост и некоторые физиологические показатели телят, было решено исследовать острую токсичность этих штаммов. В качестве основы для исследований были взяты «методические инструктивные документы по изучению препаратов для животноводства и ветеринарии» (Ветеринарные препараты, 1988), раздел по изучению острой токсичности препаратов. Изучение проводили на линейных мышах. Исследуемые штаммы засевались на лактобакагар и после выращивания в течение 72 часов при 39°С выросшие колонии смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия и проводили титрование с целью установления концентрации живых клеток в. смыве. Было взято по пять животных на каждый штамм, трем стерильно вводили взвесь живых микроорганизмов в концентрации 1x10 9-11 КОЕ/мл внутрибрюшинно, двум животным задавали штаммы перорально, по 1 мл с концентрацией 1хЮ10 клеток. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно по 1 мл физиологического раствора, а также использовали животных без каких-либо добавок. Наблюдение вели в течение 72 часов, при стандартных условиях содержания. Затем животных умертвляли в парах хлороформа и производили посев из внутренних органов (селезенки, печени, почек и сердца с кровью), для изучения возможного обсеменения органов введенными микроорганизмами.

2.5 Постановка научно - хозяйственных опытов

Первый научно - хозяйственный опыт проводился с февраля по апрель 2009 года на центральной ферме ОПХ «Ермолино» (Калужская область), в период массовых отелов на телятах холмогорской породы. На ферме имеется родильное отделение и профилакторий для новорожденных. В 3-х дневном возрасте телят переводили в индивидуальные домики, расположенные на открытом воздухе. Уход за телятами и их кормление осуществляось в соответствии со схемами и требованиями, принятыми в хозяйстве. Ежедневно теля га получали не менее 5 литров цельного молока, на седьмой день начинали вводить заменитель цельного молока «Кормилак», в состав которого входят: молоко сухое обезжиренное; сыворотка молочная подсырная; концентрат соевого белка; смесь жиров; моноглицериды; инол пищевой; премикс кормовой ПКК61-1. С десятого дня в рацион вводили сено, овес и стартерный комбикорм ПК-1.

Контрольную и две опытные группы формировали по методу пар - аналогов (Овсянников А.И., 1976) по мере рождения телят. В каждую группу набирали по семь голов, по три бычка и четыре телочки. Различия по средней массе животных между группами не превышали пяти процентов.

Для профилактики диареи новорожденным телятам опытных групп выпаивали ежедневно по 50 мл культуры, содержащей в среднем по 3x108 колониеобразующих единиц (КОЕ) в одном миллилитре, то есть по 1,5x1010 живых микробных клеток на голову. Животные 2-й группы получали штамм Ь. /егтепШт В238/06, а третьей группы - штамм Ь./егтепШт В395/06.

Клинические наблюдения за телятами вели ветеринарные специалисты хозяйства. Они учитывали день возникновения расстройств пищеварения и их продолжительность, сохранность телят и прирост массы тела в течение первого месяца жизни.

Контроль за состоянием микрофлоры пищеварительного тракта осуществляли путем микробиологических исследований фекалий, которые получали при-акте вынужденной дефекации. Отбор1 проб проводили на 10-й, 20-й и 30-й день опыта. Изучалось количественное содержание в, химусе сальмонелл, эшерихий, протеев, грибов рода кандида, бифидо- и лактобактерий. Для этого разведения фекалий высевали на соответствующие элективные среды с последующим подсчетом количества выросших колоний.

Для изучения неспецифической резистентности на 30-й день опыта у животных контрольной и опытных групп брали пробы крови. Взятие крови у телят проводили с соблюдением правил асептики и антисептики из яремной вены в две стерильные пробирки. В одной из пробирок кровь стабилизировали гепарином (2,0-2,5 Ед/мл), а другую использовали для получения сыворотки. Сыворотку крови получали после ее свертывания при температуре +18-20°С, с последующим центрифугированием при 800g в течение 10 минут. Определяли: фагоцитарную активность клеток крови по Кост и Стенко (Кондрахин И.П., 2004), бактерицидную активность сыворотки крови по модифицированному методу Бухарина и Созыкина (Саруханов В.Я. с соавт., 2007), содержание лизоцима по методу Емельяненко (1980).

Определение фагоцитарной активности клеток крови основано на том, что при контакте с иммунологически чужеродными частицами специализированные клетки крови (моноциты, гранулоциты) поглощают (фагоцитируют) и разрушают их внутриклеточными ферментами. Ход определения: в ви-далевскую пробирку вносят 1 капилляр Панченкова со стерильным 4% -ным раствором цитрата натрия, два капилляра крови и 1 капилляр живой однодневной культуры с концентрацией 1-2 млрд/мл микробных клеток (Е. coli 113-3). Полученный раствор тщательно перемешивают и помещают в термостат на 1 час при 37°С. Содержимое пробирки после инкубации перемешивают и на предметных-стеклах готовят мазки; их подсушивают, фиксируют и окрашивают обычными методами. В приготовленных и окрашенных гематологическими красителями препаратах подсчитывают 100 нейтрофилов под иммерсионной системой микроскопа. Высчитывают процент фагоцитирующих клеток - показатель фагоцитарной активности.

Ход определения бактерицидной активности сыворотки крови: в пробирку помещали 20 мкл сыворотки крови, 2000 мкл питательного бульона и 300 мкл тест - культуры Е. coli 113-3 с концентрацией 1 млрд микробных1 тел в 1 миллилитре. Инкубировали в течение 90 минут при температуре 39°С, периодически перемешивая. Исследования вели на фотоэлектроколориметре марки КФК-2-УХЛ4.2, в кюветах длинной 5 мм, при длине волны 590 нм. Расчет вели по формуле: BA(%)=100-(D2-Di/Dk2-Dki)x100, где БА - бактерицидная активность, в процентах; Dr оптическая плотность опытных образцов сыворотки крови до инкубирования с тест - культурой, D2- оптическая плотность тех же образцов после инкубирования; DKt и DK2- оптическая плотность контрольных образцов, без добавления сыворотки крови, соответственно до и после инкубирования.

Количество эритроцитов и лейкоцитов определяли на гематологическом анализаторе Stat fax 1904 Plus Biochemistry Photometer (USA). Лейко-грамму выводили путем микроскопии мазков крови, приготовленных общепринятыми методами и окрашенными по Романовскому-Гимза.

Уровень гемоглобина определяли гемиглобинцианидным колориметрическим методом. Метод основан на том, что гемоглобин крови при взаимодействии с железосинеродистым калием (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин (гемиглобин), образующий с ацетонциангидрином ге-миглобинцианид (цианметгемоглобин), интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации гемоглобина в крови и измеряется фотометрически, при длине волны 540 (500-560) нм.

Содержание лизоцима определяли чашечным методом, основанным на способности лизоцима растворять взвешенный в агаре ацетоновый порошок из клеточных оболочек Micrococcus lysodeictikus. Степень литической активности определяется путем измерения диаметра зоны лизиса вокруг лунки в агаре, в которую был внесен исследуемый материал. Лизоцимную активность опытных проб определяют накладывая полученный результат на калибровочную кривую, построенную на основании показателей, отражающих диаметр зон лизиса, полученных при использовании серийных разведений* определенной концентрации стандартного кристаллического- лизоцима, лиофили-зированного из яичного белка марки «В», с определенной активностью.

Для оценки достоверности различий межгрупповых средних использовали t-критерий (Плохинский Н.А., 1980).

Второй научно — хозяйственный опыт был проведен в 2010 году, с 1 марта по 24 мая, в том же хозяйстве. Изучалась возможность производственного внедрения смеси антагонистических лактобацилл штаммов Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06 в технологическую схему выращивания телят, с целью оптимизации микробиоценоза кишечника и повышения их живой массы. Для проведения опыта было сформировано три группы животных по методу сбалансированных групп - аналогов (Овсянников А.И. 1976) по мере рождения телят. Аналогичность групп определялась фенотипическими качествами, соблюдалась через исходные средние показатели по группам в целом (пол, живой вес, возраст, физиологическое состояние). В каждую группу набирали по 20 животных, по 10 бычков и телочек. Учитывали привесы живой массы, фиксировали данные по расстройствам функций пищеварения у животных (сопровождающихся диарейным синдромом). Первая опытная группа в дополнение к основному рациону, получала ежедневно по 50 мл смеси антагонистических культур лактобацилл Lactobacillus fermentum В238/06 и В395/06, в равной пропорции, с титром живых микробных тел в среднем 4,5x109, выращенных в среде, содержащей 10% сухого обезжиренного молока. Вторая опытная группа получала в дополнение к основному рациону по 50 мл пробиотика «Лактоамиловорин». Третья группа являлась контрольной и получала основной рацион, принятый в хозяйстве и аналогичный по составу с первым опытом.

3. Результаты собственных исследований.

3.1 Биология гетероферментативных лактобацилл пищеварительного тракта телят.

3.1.1 Выделение лактобацилл из кишечника телят, и их скрининг на антагонизм Для изучения было выделено 150 микробных культур, дополнительно было получено 50 культур ранее изолированных профессором Б.В. Таракановым. Все выделенные на элективных средах штаммы представляли собой грамположительные палочки и были первично идентифицированы как лак-тобациллы, с присвоением названия Lactobacillus spp. В№, где .уУ?-номер данный при выделении (сокращенное обозначение LBB№).

Первичный скрининг на антагонизм проводили в отношении штамма Е. coli 113-3, который используется как стандартная индикаторная культура в нашей лаборатории. Антагонистической активностью различной степени обладали только 24 штамма. При этом, штаммов продуцирующих низкомолекулярные антибиотикоподобные субстанции - микроцины не было выявлено. При дальнейшем изучении ингибирующих способностей в отношении эше-рихий, сальмонелл, стафилококков и энтерококков дикого типа, из этих 24 штаммов было отобрано 9, обладающих наиболее широким спектром подавления роста возможных патогенов, которые и были изучены более детально.

Все 9 штаммов подавляли рост сальмонелл дикого типа в 100% случаев, ингибировали не менее 90% от использованных в качестве индикаторных штаммов кишечной палочки и не менее 80% стафилококков и энтерококков дикого типа. Результаты скрининга на антагонизм в отношении коллекционных культур представлены в таблице 1. В качестве индикаторных культур для изучения ингибирующих способностей лактобацилл нами использовались как грамположительные (Micrococcus spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp.), так и грамотрицательные микроорганизмы {Escherichia spp., Salmonella spp., Klebsiella spp.). Это связано с различным механизмом подавления роста микроорганизмов лактобациллами. Так, ингибирующее воздействие на грамотрицательную микрофлору обусловлено, в основном, продукцией молочной кислоты. В то время как антагонизм по отношению к грампо-ложительным микроорганизмам проявляется за счет продукции антибиоти-коподобных субстанций - бактериоцинов, микроцинов и др.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Петраков, Евгений Сергеевич, 2010 год

1. Алехина Г.Г., Суворов А.Н. Пробиотики новый подход к старым проблемам//Успехи современного естествознания, 2007, 6, 36-39.

2. Алиев А.А. Липидный обмен и продуктивность жвачных животных. -М.: Колос, 1980. -381с.

3. Алиев А.А. Обмен веществ жвачных животных. М.: НИЦ «Инженер», 1997, - 564 с.

4. Андреева И.В. Потенциальные возможности применения пробио-тиков в клинической практике// Клин, микробиол. и антимикроб, химиотер., 2006, т.8,2, 151-172.

5. Анохин Б.М. Профилактика болезней телят в условиях интенсификации сельскохозяйственного производства. Воронеж, 1987. - 87 с.

6. Антипов В.А., Субботин В.М. Эффективность и перспективы применения пробиотиков//Ветеринария, 1980, 12, 55-57.

7. Ануфриева Т.А., Борисова О.А., Жбанова Т.В., Борисова И.А. Смешанные инфекции животных: обзор литературы. Владимир: ФГУ «ВНИИЗЖ», 2010. - 123 с.

8. Апатенко В. М. Смешанные инфекции сельскохозяйственных животных. 2-е Изд. Перераб. и дополн. Киев: Урожай. -1990, - 62 с.

9. Бекер М.Е., Лиенинын Г.К., Райнулис Е.П. Биотехнология. М., 1990.-334 С.

10. Белоусова Е.А., Никитина Н.В., Мишуровская Т.С., Златкина А.Р. Восстановления кишечной микробиоты: возможности препаратов на основе микробных метаболитов// Консилиум, 2005, 1,9-13.

11. Бондаренко В.М. «Острова» патогенности бактерий// Микробиология, 2001, 4, 67-74.

12. Бондаренко В.М. Классификация бактерий рода Lactobacillus. Материалы VIII съезда Всерос. общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. М., 2002, Т.1. -С.140.

13. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Аладышева Ж.И., Мацулевич Т.В. Пробиотики и механизмы их терапевтического эффекта// Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология, 2004, 3, 83-87.

14. Бондаренко В.М., Чупринина Р.П., Воробьева М.А. Механизм действия пробиотических препаратов// БиоПрепараты, 2003, 3, 2-5.

15. Брилис В.И., Брилине Т.А., Ленцнер Х.П., Ленцнер A.A. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов// Лабораторное дело, 1986, 4,210-212.

16. Бухарин О.В. Антилизоцимный признак бактерий и перспективы его практического использования //В сб.: Персистенция микроорганизмов. -Куйбышев, 1987, 4-10.

17. Бухтилов Ф.Н. , Кошевая Г.И., Ливанов К.С., Смолин А.И., Бочарова А.Г., Бухтилова Н.С., Щеткина A.A. Развитие кишечной микрофлоры у новорожденных телят// Ветеринария, 1981, 4, 37-38.

18. Ветеринарные препараты. Справочник / Под ред. А.Д. Третьякова. -М.: ВО «Агропромиздат», 1988. -319 с.

19. Вильсенс А.Т.Е., Ваще Кастеле Ж.С., Деметер Р.Л. Содержание стафилококков и микрококков в сыром молоке. XII Меж-дунар. конгр. по мол. делу. М.: Пищепром., 1971, 259-260.

20. Глотов А., Шкиль Н., Глотова Т. Особенности проявления вирусных и ассоциативных вирусно-бактериальных болезней крупного рогатого скота// Ветеринария с.-х. животных, 2009, 2, 17-27.

21. Глушанова H.A. Биологические свойства лактобацилл// Бюллетень сибирской медицины, 2003, 4, 50-58.

22. Глушанова H.A., Блинов А.И. О биологической и антагонистической активности «сухого» и «жидкого» пробиотика «NARINE»// Бюллетень ВСНЦ СО РАМН, 2005, 1(39),148-153.

23. Глушанова H.A., Шендеров Б.А. Взаимоотношения пробиотиче-ских и индигенных лактобацилл в условиях совместного культивирования in vitro//Микробиология, 2005, 2, 56-61.

24. Голиков А.Н., Базанова Н.У. Физиология сельскохозяйственных животных. М.: Агропромиздат, 1991. - С. 242-245.

25. Головко В.А., Апатенко В.М., Копиецкий В.Ф. Пространственно временные отношения при факторной инфекционной патологии, ассоциированной с острым кишечным заболеванием телят// Вет. консультант, 2007, 13, 11-14.

26. Григорьева Г.И., Арбузова A.A., Кульчицкая М.А., Панитков М.А. Роль микроорганизмов (бактерий и вирусов) в возникновении желудоч-но кишечных заболеваний новорожденных телят// Вет. патология, 2005, 4, 108-113.

27. Давидов Р.Б. Молоко. М.: Колос, 1969. - 327 с.

28. Данилевская Н.В. Фармакологические аспекты применения про-биотиков в ветеринарии электронный ресурс.// Биотехнологическая фирма «Компонент»: библиотека. URL: http://www.bf-component.nj/library.html

29. Денисенко В.Н., Печников Г.Н., Грызлова О.Н., Емельяненко П.А. Роль иммуноглобулинов в формировании механизмов естественной резистентности новорожденных телят// Сельскохоз. биология, 1994, 2, 98-103.

30. Диланян З.Х Молочное дело. 2-е изд. М.: Колос, 1967. - 296 с.

31. Долгов B.C. Использование пробиотиков в животноводстве// Доклады РАСХН, 2007, 5, 48-50.

32. Долинов К.Е. Основы технологии сухих биопрепаратов. М.: Медицина, 1969.-С.152-219.

33. Донченко А.С., Магер С.Н. Ассоциативное проявление вирусно -бактериальных инфекций на примере лейкоза и туберкулеза крупного рогатого скота// Вестн. РАСХН, 2005, 5, 66-67.

34. Доронин А.Ф., Шендеров Б.А. Функциональное питание. М.: Грантъ, 2002. -296 с.

35. Егоров Н.С., Баранова И.П. Бактериоцины. Образование, свойства, применение// Антибиотики и химиотерапия, 1999, 6, 33-40.

36. Емельяненко П.А Методические указания по тестированию естественной резистентности телят. — М., 1980, 29 с.

37. Зинченко Е.В., Панин А.Н. Иммунобиотики в ветеринарной практике. Пущино, ОНТИ ПНЦ РАН, 2000. -164 с.

38. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Наровлянский А.Н. Влияние бактерий рода Lactobacillus на продукцию цитокинов клетками пейеровых бляшек экспериментальных животных// Иммунология, 2004, 25(5), 288-290

39. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Шаповалова О.В. Влияние бактерий рода Lactobacillus на миграционную активность макрофагов// Микробиология, 2006, 6, 40-44.

40. Ивановский А.А. Иммуностимуляторы и их роль в повышении резистентности животных к болезням. Киров: Зональный НИИСХ Северо-Востока, 2005. - 68 с.

41. Иммунобиологические препараты и перспективы их использования в инфектологии/ Под редакцией Онищенко Г.Г., Алешкина В.А., Афанасьева С.С., Поспеловой В.В. М., ГОУ ВУНМЦ Минздрава РФ, 2002. -608 с.

42. Иноземцев В.П., Самсонов О.В., Талер Б.Г. Профилактика незаразных болезней основа сохранности животных// Ветеринария, 2000, 11,913.

43. Кавардаков В.Я., Кайдалов А.Ф., Баранников А.И., Косее Г.И. Корма и кормовые добавки: учебно-методическое и справочное пособие. — Ростов-на-Дону, 2007. 512 с.

44. Калачнюк Гл. Интенсивна впчщвля телят при зниженних витратах молока i зерна / Гл. Калачнюк, L. И. Грабовенськш / Львив.: Каменяр, 1983. -86 с.

45. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1 и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета// Иммунология, 2002, 2, 77-80.

46. Кондратьева В., Наумова Н., Ветшева А. Влияние метицилина на биохимические показатели крови. Профилактика и ликвидация болезней домашних животных и птиц. Ульяновск, 1980. - С. 45-48.

47. Коршунов В.М., Смеянов В.В., Ефимов Б.А. Рациональные подходы к коррекции микрофлоры кишечника// Вест. РАМН, 1996, 2, 60-65.

48. Кугенев П.В., Барабанщиков Н.В. Практикум по молочному делу. Изд. 5-е, перераб. и доп. М., «Колос», 1978. -240 с.

49. Курилов Н.В. , Кроткова А.П. Физиология и биохимия пищеварения жвачных. М.: Колос, 1971. -432 с.

50. Ленцнер A.A., Лактофлора животного организма и ее защитные функции// Теоретические и практические проблемы гнотобиологии. — М.: Агропромиздат, 1986. С. 195-200.

51. Логинов С.И., Табакаев В.В., Семенова О.Н. Гематологические и иммунологические показатели у крупного рогатого скота при лейкозе на эн-зоотичных по анаплазмозу территориях// Сиб. вестн. с.-х. науки, 2005, 2, 2430.

52. Лопатина Т.К., Бляхер М.С., Николаенко В.Н. Иммуномодули-рующее действие препаратов эубиотиков// Вестн. РАМН, 1997, 3, 30-34.

53. Малик К.И., Панин А.Н. Ветеринарные пробиотические препараты// Ветеринария, 2001, 1, 46-50.

54. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник/ под ред. проф. И.П. Кондрахина. М.: КолосС, 2004. - 520 с.

55. Методы микробиологического контроля продуктов детского, лечебного питания и их компонентов: Методические указания МУК 4.2.577.96. -М.: Информационно-издательский центр Минздрава России, 1998. -95 с.

56. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Григорьева Е.А. Влияние бактерий рода Lactobacillus на цитотоксическую активность спленоцитов экспериментальных животных// Микробиология, 2007, 3, 53-57.

57. Овсянников А.И. Основы опытного дела в животноводстве. М., «Колос», 1976, - 304 с.

58. Оксанич Н. Выход из кризиса по государственной программе// Животноводство России, 2009, 6, 2-6.

59. Панин А.Н. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био, 2002, 2(17), 4-7.

60. Панин А.Н., Малик Н.И. Пробиотики неотъемлемый компонент рационального кормления животных// Ветеринария, 2006, 3, 3-6.

61. Панин А.Н., Малик Н.И., Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био, 2002, 3(18), 9-12.

62. Панин А.Н., Малик Н.И., Малик Е.В. Иммунобиология и кишечная микрофлора. — М.: Аграрная наука, ИК «Родник», 1998. 48 с.

63. Панин А.Н., Серых Н.И., Малик Е.В. Второе рождение пробиоти-ков//Ветеринарная газета, 1995, 17(79), 3.

64. Пивняк И.Г., Тараканов Б.В. Микробиология пищеварения жвач ных. М.: Колос, 1982 . - 247 с.

65. Пикина А.П., Смеянов В.В., Ефимов Б.А., Байнов H.A., Brook I., Reeves G.,Коршунов В.М. Первичный скрининг штаммов бифидобактерий и лактобактерий с целью разработки на их основе эффективных препаратов -пробиотиков//Микробиология, 1999, 6, 34-38.

66. Пинегин Б.В., Мальцев В.Н., Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника. -М.: Медицина, 1984. 144 с.

67. Плохинский H.A. Алгоритмы биометрии. М: Изд-во Моск. унта, 1980,- 150 с.

68. Плященко С.И., Сидоров В.Т., Трофимов А.Ф. Получение и выращивание здоровых телят. Минск: Урожай, 1990. - 222 с.

69. Рой Дж.Х.Б. Выращивание телят/ перевод с английского Г.Н. Жид-коблиновой и Д.В. Карликова// -М.: Колос, 1982. 470 с.

70. Садуахасова С.А., Кушугулова А.Р., Рахимова С.Е., Оралбаева С.С., Бисенова Н.М., Алмагамбетов К.Х. Характеристика антагонистических и кислотообразующих свойств Lactobacillus casei// Микробиология, 2007, 1, 84-87.

71. Саруханов В .Я., Исамов H.H., Мирзоев Э.Б., Кобялко В.О. Модификация метода определения бактерицидной активности крови сельскохозяйственных животных// Сельскохозяйственная биология, 2007, 2, 119-122.

72. Сидорович М. Влияние технологии на адаптацию телят в профи-лакторный период// Молочное и мясное скотоводство, 2003, 5, 12-13.

73. Субботин В.В., Сидоров М.А. Основные элементы профилактики желудочно-кишечной патологии новорожденных животных// Ветеринария, 2004,1,3-6.

74. Тараканов Б.В. Использование пробиотиков в животноводстве. -Калуга: Опер, типогр. Облкомстата, 1998. 53 с.

75. Тараканов Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы. — М.: Научный мир, 2006.- 188 с.

76. Тимошко М.А. Микрофлора пищеварительного тракта молодняка сельскохозяйственных животных. Кишинев: «Штиница», 1990. - 189 с.

77. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Рахимова Н.Г. К механизму антагонистической активности лактобацилл//Микробиология, 1989, 2, 3-8.

78. Федорова О.О. Спорообразующие анаэробные бактерии — антагонисты патогенных видов энтеробактерий // В сб.: Персистенция микроорганизмов. Куйбышев, 1987, 125-130.

79. Федотов В., Останина Е.Чувствительность микрофлоры цыплят к антибиотикам при пуллорозе тифе птиц. Профилактика и терапия болезней животных Алтая с учётом изменения морфологии. - Барнаул, 1981, 110-111.

80. Хаитов P.M., Пинегин Б.В. Иммунная система желудочно-кишечного тракта: особенности строения и функционирования в норме и при патологии// Иммунология, 1997, 5, 4-7.

81. Хмель И.А., Манохина И.М., Басюк Е.И. Характеристика энтеробактерий, продуцирующих антибиотики широкого спектра действия мик-роцины//Генетика, 1993, 29(5), 768-776.

82. Хоменко A.C., Погорелый А.О. Лечебно профилактические свойства комплексных препаратов содержащих нитрофураны// Ветеринария, 1984, 7, 64-65.

83. Цой И.Г., Сапаров A.C., Тимофеева И.К. Иммуностимулирующее действие лактобактерий на цитотоксичность естественных клеток киллеров и продукцию интерферона// Микробиология, 1994, 6, 112-113.

84. Чахава O.B. Гнотобиология — учение о микрофлоре организма хозяина// В кн.: Теоретические и практические проблемы гнотобиологии. М.: Агропромиздат., 1986.-С.14-19.

85. Чахава О.В. Гнотобиология. М.:Медицина, 1972. - 284 с.

86. Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Шабанова* H.A., Самоукина A.M., Червинец В.М. Бактериоциногенные высокоантагонистические штаммы лактобацилл// Микробиология, 2006, 7, 78-82.92. ■ Чернышев А.И. Диспепсия и сохранность телят. Казань, 1989. 35 с.

87. Чернышев А.И. Как сохранить телят. Казань, 1986. - 112 с.

88. Чурикова В.В., Викторов Д.И. Основы микробиологии и вирусологии. Воронеж: Издательство ВГУД989. - 272 с.

89. Шахов А.Г. Этиология и профилактика желудочно кишечных и респираторных болезней телят и поросят// Вет. патология, 2003, 2, 25-28.

90. Шендеров Б.А. Лекция на XIV школе-семинаре «Современные проблемы физиологии пищеварения», Пущино-на-Оке, 1997// Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 1998, 1, 61-66

91. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Том III. Пробиотики и функциональное питание. М.: Грантъ, 2001.-288 с.

92. Шлегель Г. Общая микробиология: Пер. с нем. — Москва: «Мир», 1987.-567 с.

93. Эклз К.Г. Молочное скотоводство США. М.: Сельхоз-гиз, 1960. -638 с.

94. Яшин А.В, Современные представления о патогенезе токсической диспепсии у телят// Материалы научно-практич. конф. СПбГАВМ. — С.Петербург, 2000, 86-87.

95. Annuk H., Shchepetova J., Kullisaar T., Songisepp E., Zilmer M., Mikelsaar M. Characterization of intestinal lactobacilli as putative probiotic candidates//J. Appl. Microbiol., 2003, 94, 403-412.

96. Atkinson R.L., Klatzer F. H., Stewart G.F. Laktose in animal and humen feeding// A review J. Dairy Science, 1957, 40, 1114.

97. BaiTow P. A., Brooker B.E., Fuller R. The attachment of bacteria to the gastric epithelium of the pig and its importance in the microecology of the intestine//J. Appl. Bacteriol., 1980, 96, 161-169.

98. Bjorck L. The lactoperoxidase system // In: Natural Antimicrobial Systems, 1985.-P. 18-30.

99. Blom H., Mortvedt C. Anti-microbial substances produced by food associated micro-organisms//Biochem. Soc., 1991, T.19, 694-698.

100. Bozza M., Satoskar A., Lin G. Targeted disruption of migration inhibitory factor gene reveals its critical role in sepsis// JEM, 1999, 189(2), 341-346.

101. Brashears M.M., Gilliland S.E., Buck L.M. Bilesalt deconjugation and cholesterol removal from media by Lactobacillus casei// J. Dairy Science, 1998, 36(3), 281-301.

102. Braunt M.P. The characteristics of strains of Selenomonas isolated from bovine rumen contents// Bacteriol, 1956, 72, 2, 162-167

103. Calandra T. Macrophage migration inhibitory factor and host innate immune responses to microbes// Scand. J. Infect. Dis., 2003, 35(9),-573-576.

104. Chen T., Toivanen P., Vainio O. Suppression of antigen-specific lymphocyte proliferation by Gram-positive bacterial cell walls// APMIS, 2002, 110(6), 490-498.

105. Clark D.S., Takacs J. Cases as preservatives// In: Microbial Ecology of Food./Ed. J.H. Silliker. -London, Academic Press, 1980. -P. 170-180.

106. Collins E.B., Aramaki K. Production of hydrogen peroxide by Lactobacillus acidophilus//J. Dairy Sci., 1980, 63, 353-357.

107. Collins M.D., Gibson G.R. Probiotics, prebiotics, and synbiotics: approaches for modulating the microbial ecology of the gut// Am. J. Clin. Nutr., 1999, vol.69, 5, 1052-1057.

108. Condon S. Responses of lactic acid bacteria to oxygen // FEMS Microbial. Revs., 1987, 46. -P.264.

109. Corzo G., Gilliland S.E. Bile salt hydrolase activity of three strains of lactobacillus acidophilus// J. Dairy Science, 1999, 82, 472-480.

110. Cross M.L. Microbes versus microbes: immune signal generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens// FEMS, 2002, 34(9), 245-253.

111. Cummings J.H. Short chain fatty acids in the human colon// Gut, 1981, 22, 530-532.

112. De Mann J.C., Rogosa M., Sharpe M.E. A medium for the cultivation of Lactobacilli// J. Appl. Bact., 1960, 23, 130-135.

113. Drago L., Gismondo M.R., Lombardi A., de Haen C., Gozzini L. Inhibition of in vitro growth of enteropathogens by new Lactobacillus isolates of human intestinal origin// FEMS Microbiol. Lett., 1997, 153, 455-463.

114. Duval-Iflah Y., Chappuis J.C. Current Perspective on Microbiology-Ecology // In: Ed. H.J. Kug and C.A. Reddy, 1984. -P.264.

115. Fennel C. An investigation into effect of additing a specific strain of a lactic asid produsing organism to diet young calves in conventional calf rearing unit. Vitalink studies Ltd. Ireland, 1982.

116. Franz C.M., Holzapfel W.H., Slites M.E. Enterococci at the crossroads of food'safety// Int. J. Food. Microbiol., 1999, 47, 1-24.

117. Fuller R. Probiotics in man and animals// J. Appl. Bacteriol., 1989, 66, 365-378.

118. Fuller R., Newman H.N., Snoeyenbos G.H., Gould G.W., RhodesRoberts M.E., Charnley A.K. Microbial competition in the mouth and gastrointestinal tract. Natur. Antimicrobial System. Bath : Bath University Press, 1986. -P. 11-28.

119. Galdeano C.M., Perdigon G. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation// J. Appl. Microbiol., 2004, 97, 673-681.

120. Gevers D., Huys G., Swings J. In vitro conjugal transfer of tetracycline resistance from Lactobacillus isolates to other Gram-positive bacteria// FEMS Microbiol. Lett, 2003, 225(1), 125-130.

121. Gill H.S., Rutherfurd K.J., Cross M.L. Dietary probiotic supplementation enhances natural killer cell activity in the elderly: an investigation of age-related immunological changes// J. Clin. Immunol., 2001, 21, 264-271.

122. Gilles Chanviere, Marie-Helene Coconnier Adhesion of human Lactobacillus acidophilus strain LB to human enterocyte like Caco-2 cells // J. General. Microbiol., 1992, V.138,8. P.1689-1696.

123. Gilliland S.E. Health and nutritional benefits from lactic acid bacteria//FEMS Microbiol. Rev., 1990, v.87, №1-2, 175-188.

124. Gilliland S.E., Nelson C.R., Maxwell C. Assimilation of cholesterol by Lactobacillus acidophilus// Appl. Environ. Microbial., 1985, v.49, 2, 377-381.

125. Goldin B.R., Gorbach S.L. The effect of milk and lactobacillus feeding on human intestinal bacterial enzyme activity// Amer. J. Clin. Nutr., 1984, 39, 756-761.

126. Guidelines for the Evaluation of Probiotics in Food. Joint FAO/WHO Working Group. London, Ontario, Canada, 2002. -11 P.

127. Gunn J.S. Mechanism of bacterial resistance and response to bile// Microbe Infect., 2000 Jul; 2 (8), 907-913.

128. Haller D., Bode C., Hammes W.P., Pfeifer A.M.', Schiffrin E.J., Blum S. Non-pathogenic bacteria elicit a differential cytokine response by intestinal epithelial cell/leucocyte co-cultures// Gut, 2000, 47, 79-87.

129. Hamid A., Selman J.E. Investigations into the use of Streptococcus faecium (strain 68) as prevention against neonatal calf diarrheae// Ph. D. Tesis, Vet. Scool, Universiti of Glasgow, UK, 1980. 34 P.

130. Hoa N.T., Baccigalupi L., Huxham A. Characterization of Bacillus species used for oral bacteriotherapy and bacterioprophylaxis of gastrointestinal disorders// Appl. Environ. Microbiol., 2000, 66: 5241-5247.

131. Hoesl C.E., Altwein J.E. The probiotic approach treatment option in urology// Eur. Urol., 2005, 47, 288-296.

132. Hungate R.E. Studies on cellulose decompositing bacterial from rumen of cattle//J. Bacterial, 1967, -vol.53, 631 639.

133. Hiitt P., Shchepetova J., Loivukene K., Kullisaar T., Mikelsaar M. Antagonistic activity of probiotic lactobacilli and bifidobacteria against entero- and uropathogens//J. Appl. Microbiol., 2006, 100(6), 1324-1332.

134. Jones G.W. Adhesion to animal surfaces in Microbial adhesion and aggregation. Marshall K.C. (ed) Dahlem IConferencen, 1984, P. 71-84.

135. Kaila M., Isolauri E., Saxelin M., Arvilommi H., Vesikari T. Viable versus inactivated Lactobacillus strain GG in acute rotavirus diarrhea// Arch. Dis. Child., 1995,72,51-53.

136. Kaizu M., Sasaki M., Nakajama H., Suzuki Y. Effect of antioxidative lactic acid bacteria on rats fed a diet deficient in vitamin E// J. Dairy Sci., 1993, 76, 2493-2499.

137. Kato I., Yokokyra T., Mutai M. Macrophage activation by Lactobacillus casei in mice// Microbiol. Immun., 1983, 27: 611-618.

138. Kleerebezem M. Quorum sensing control of lantibiotic production; nisin and subtilisin autoregulate their own biosynthesis// Peptides, 2004, 25, 14051414.

139. Kullisaar T., Zilmer M., Mikelsaar M., Vihalemm T., Annuk H., Kai-rane C., Kilk A. Two antioxidative lactobacilli strains as promising probiotics// Int. J. Food Microbiol., 2002, 72, 215-224.

140. Larlcin M. Probiotics strain for credibility// Lancet, vol. 354,1. 9193, -P. 1884.

141. Lee J.W., Shin J.G., Kim E.H. Immunomodulatory and antitumor effects in vivo by the cytoplasmatic fraction by Lactobacillus casei and Bifidobacterium longum// J. Vet. Sci., 2004, 5(1), 41-48.

142. Lilly D.M., Stilwell R.H. Probiotics: growth promoting factors produced by microorganisms// Science, 1965, 147, 747-748.

143. Lindgren S.E., Dobrogosz W.J. Antagonistic activities of lactic acid bacteria in food and feed fermentation// FEMS Microbiol. Rev., 1990, 7(1-2), 149164.

144. Link-Amster H., Rochat F., Saudan K.Y., Mignot O., Aeschlimann J.M. Modulation of a specific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through fermented milk intake// FEMS Immunol. Med. Microbiol., 1994, 10, 55-63.

145. London J. The ecology and taxonomic status of lactobacilli// Ann. Rev. Microbiol., 1976, vol. 30. P. 279-301.

146. Lund Bi, Edlund C. Probiotic Eriterococcus faecium strain is a possible recipient of the vanA gene cluster// Clin. Infect. Dis., 2001, 32, 1384-1385.

147. Marteau P., Rambaud J. Potencial of.using lactic acid bacteria for, therapy and immunomodulation in man// FEMS Microbiol. Rev., 1993, 12, 207220.

148. Metchnikoff E. Lactic acid inhibiting intestinal putrefaction. In: Chalmers Mitchell P, ed. The prolongation of life: optimistic studies. London: Heinemann, 1907, 161-183.

149. Mitsuoka T. Intestinal flora and host// Asian med. J. Japan, 1988, 7: 400-409.

150. Neutra M.R. Current concept in mucosal immunity. Role of M cells in transepithelial transport of antigens and pathogens to the mucosal immune system// AJP, 1998,274(5), 785-791.

151. Ogawa T., Asai Y., Tamai R., Makimura Y., Sakamoto H., Hashi-kawa S., Yasuda K. Natural killer cell activités of symbiotic Lactobacillus casei ssp. casei in conjugation with dextran// Clin. Exp. Immunol., 2006, 143, 103-109.

152. Orla M., Conneely Ph. Lactoferrin, Lactoperoxidase and Lizozyme: Nature's Protective Proteins // Presented ot Alltech's 8th Annual Symposium on Biotechnology in the Feed Industry, April, 1992, P. 123-133.

153. Ouwehand A.C., Vesterlund S. Antimicrobial components from lactic acid bacteria. In: Lactic Acid Bacteria: Microbial and Functional Aspects. Ed. Salminen S.A., von Wright A. and Ouwehand A.C. New York: Marcel Dekker, 2004, P.375-379.

154. Perdigon G., De Macias M.E.N., Alvares S. Systemic augmentation of the immuneresponse in mice by feeding fermentation milks with Lactobacillus casei and Lactobacillus acidophilus// Immunology, 1988, vol.63, №1, 37-44.

155. Perdigon G., Fuller R., Raya R. Lactic acid bacteria and their effect on the immune system// Curr. Issus. Intest. Microbiol, 2001, 2(1), 27-42.

156. Peuhkuri K., Lahteenmaki T., Sievi E., Saxelin M., Vapaatalo H., Korpela R. Antioxidative properties of Lactobacillus GG measured as prostacyclin and nitric oxide production in endothelial cell culture// Nutr. Today (Suppl.), 1996, 31, 53-54.

157. Plant L., Conway P. Association of Lactobacillus spp. with Peyer's patches in mice// CDLI, 2001, 8(2), 320-324.

158. Prasad J., Gill H., Smart J., Gopal P.K. Selection and characterization of Lactobacillus and Bifidobacterium strains for use as probiotics// Int Dairy Journal 1998,8,993-1002.

159. Rafler J. Lactic acid bacteria and cancer: mechanistic perspective// Br. J. Nutr., 2002, 88(1), 89-94.

160. Reddy G.V., Shahani K.M., Banerjee M.R. Inhibitory effect of the yogurt on Ehrlich ascites tumor cell proliferation// J. National Cancer Institute, 1973, 50,815-817.

161. Reid G. Regulatory and clinical aspects of dairy probiotics// FAO/WHO Expert Consultation on Evaluation of Health and Nutritional Properties of Powder Milk with Live Lactic Acid Bacteria. Cordoba, Argentina, 2001, 1-34.

162. Reid G. Safety of Lactobacillus strains as probiotic agents// Clin. Infect. Dis., 2002, 35:349-50.

163. Reiter B., Marshall V.M., Philips S.M. The antibiotic activity of the lactoperoxidase-thiocyanate-hydrogen peroxide system in the calf abomasum // Res. Vet. Sci., 1980, vol. 28. -P.l 16-122.

164. Rowland I.R., Grasso P. Degradation of N-nitrosamine by intestinal bacteria//J. Appl. Microbiol., 1975, 29, 7-12.

165. Sablon E., Contreras B., Vandamme E. Antimicrobial peptides of lactic acid bacteria: mode of action, genetics and biosynthesis// Adv. Biochem. Eng. Biotechnol., 2000, 68, 21-60.

166. Saito Hajime, Watanabe Takashi, Horikawa Yoshiya. Effects of Lactobacillus casei on Pseudomonas aeruginosa infection in normal and dexa-methasone treated mice// Microbiol, and Immunol., 1986, v.30, №3, 249-259.

167. Sanders J.W., Leenhouts K., Burghoom J., Brands J.R., Venema G., Kok J. A chloride-inducible acid resistance mechanism in Lactococcus lactis and its regulation// Molecular Microbiology, 1998, 27, 299-310.

168. Schiffrin E.J., Rochat F., Linc-Amster H. Immunomodulation of human blood cells following the ingestion of lactic acid bacteria// J. Dairy Sci., 1995, 78,491-497.

169. Sheih Y.H., Chiang B.L., Wang L.H., Liao C.K., Gill H.S. Systemic immunity-enhancing effects in healthy subjects following dietary consumption of the lactic acid bacterium Lactobacillus rhamnosus HN001// J. Am. Coll. Nutr., 2001,20, 149-156.

170. Stein T. Bacillus subtilis antibiotics: structures, syntheses and specific functions//Mol. Microbiol., 2005, 56, 845-857.

171. Takeda K., Suzuki T., Shimada S.I., Shida K., Nanno M., Okumura K. Interleukin-12 is involved in the enhancement of human natural killer cell activity by Lactobacillus casei Shirota// Clin. Exp. Immunol., 2006, 146, 109-115.

172. Tannok G.W. Effect of dietary and environmental stress on the gastrointestinal microflora. Human Intestinal Microflora and Disease. London: Acad. Press, 1983. P.517-539.

173. Temmreman R. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products// Int. J. Food Microbiol., 2003, 81(1), 1-10.

174. Van der Waaji D., Vries-Hospers H.G. Colonization resistance of the digestive tract; mechanism and clinical consequences// Ann. 1st. Super. Sanita, 1986, -vol.22, № 3, 875 882.

175. Vonk A.D., Schaafsma G., Dekker P.R. Relationship between intestinal transit time and iron absorption from milk and yogurt in rats // Neth. Milk Dairy., 1988, vol. 42, -P. 147-154.

176. Weizman Z., Asli G., Aisheikh A. Effect of a probiotic infant formula on infections in child care centers: comparison of two probiotic agents// Pediatrics, 2005, 115(1), 5-9.

177. Yang R., Ray B. Factors influencing production of bacteriocins by lactic acid bacteria// Food Microbiol., 1994, 11, 281-291.