Стабилизация тирозиназы в водно-органических системах для создания ферментных электродов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Шиповсков, Степан Васильевич

• Шиповсков, Степан Васильевич
• кандидат химических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат химических наук Шиповсков, Степан Васильевич

1. Список сокращений

2. Введение

3. Обзор литературы

3.1. Стабильность ферментов в органических средах

3.1.1. Гомогенные растворы ферментов

3.1.2. Гетерогенные системы, содержащие фермент

3.2. Подходы к стабилизации ферментов в органических средах

3.3. Нековалентные комплексы полиэлектролитов

3.3.1. Интерполиэлектролитные комплексы

3.3.2. Белок - полиэлектролитные комплексы

3.3.3. Каталитические свойства и стабильность ферментов в 32 комплексе с полиэлектролитом

3.4. Тирозиназа - полифенолоксидаза

3.4.1. Физиологическая роль тирозиназы, методы очистки и 35 механизм катализа

3.4.2. Тирозиназа в органических средах

3.4.3. Некоторые аспекты применения тирозиназы в биосенсорах

4. Постановка задачи

5. Экспериментальная часть

5.1. Реагенты и приборы

5.2. Методы

5.2.1. Приготовление комплекса фермента с поликатионом

5.2.2. Определение каталитической активности тирозиназы в водных 48 растворах

5.2.3. Определение каталитической активности тирозиназы в системе 48 обращенных мицелл

5.2.4. Определение каталитической активности нативной тирозиназы 49 и в нековалентных комплексах с полиэлектролитами в водно-этанольной системе

5.2.5. Модификации элетродов и проведения электрохимических измерений

6. Результаты и обсуждение

6.1. Нековалентные комплексы тирозиназа с полибреном

6.1.1. Каталитическая активность комплексов в водных растворах: 52 рН - зависимость

6.1.2. Каталитическая активность комплексов тирозиназа с 57 полибреном в водно - этанольных смесях

6.2. Каталитическая активность тирозиназы в системе обращенных 65 мицелл

6.3. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в водной среде: 67 рН - зависимость

6.4. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе с 73 полиэлектролитом в водных и водно-этанольных системах

6.5. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в системе 79 обращенных мицелл в водной среде

6.6. Биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в ацетонитриле

6.7. Использование спрэй технологии для иммобилизации тирозиназы 91 на твердом носителе (электроде)

7. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Стабилизация тирозиназы в водно-органических системах для создания ферментных электродов»

Фенолы и их производные относятся к группе опасных органических соединений загрязняющих окружающую среду. Одним из основных источников фенолов и их производных являются продукты переработки древесины и отходы целюлозо-бумажной промышленности. Другим источником производных фенолов - алкилфенолов, являются продукты деградации неионных поверхностно-активных веществ - алкилфенолполиэтоксилатов (АФПЭ), применяемых в быту, текстильной, пищевой и лако-красочной промышленностях для обработки поверхностей металлов и в качестве диспергирующих агентов и эмульгаторов. В процессе ирригации сточных вод АФПЭ и продукты их деградации попадают в почву и водоемы и вследствие своей химической устойчивости накапливаются в речных и морских отложениях.В связи с этим, разработка высокоэффективных методов анализа/определения фенолов в окружающей среде представляет собой актуальную биотехнологическую задачу. Одним из ее решений является создание биосенсоров на основе электрохимических методов, т.е. разработка высокочувствительных ферментных электродов. Одним из ферментов, на основе которого создаются ферментные электроды для определения фенолов и их производных, является тирозиназа - медьсодержащая оксидоредуктаза, катализирующая окисление фенолов и их производных кислородом воздуха.Биосенсоры на основе тирозиназы уже применяются для мониторинга сточных вод в промышленности, однако данные сенсоры требуют продолжительной и сложной пробоподготовки, основным этапом которой является концентрирование определяемых веществ в органических растворителях, таких как ацетонитрил, этанол и их смеси, с последующим растворением в «дружественной» для ферментов водной системе. Данные биосенсоры также имеют ряд недостатков, связанных с ограниченной диффузией субстратов в пленках/системах иммобилизованных ферментов и протеканием неферментативной полимеризации продуктов реакции в водных средах, что затрудняет анализ и приводит к снижению чувствительности сенсора.Возможность работы сенсора в органических средах позволяет повысить эффективность определения фенолов. В частности, переход от водных сред неводным средам может дать следующие преимущества в анализе, а именно: упростить процедуру пробоподготовки за счет уменьшения количества/длительности ее этапов; - уменьшить, так называемые, «диффузионные ограничения», благодаря большей растворимости кислорода/фенолов во многих органических средах по сравнению с водой; - избежать отравления сенсора продуктами неферментативной реакции полимеризации, которая является рН - зависимой и можно предположить ее нивелирование в органических средах. Таким образом, одним из путей эволюции биосеносоров на основе тирозиназы для определения фенолов является разработка методов стабилизации каталитической активности и увеличение операционной стабильности тирозиназы как в полярных, так и неполярных органических системах, что позволит получить иммобилизованный препарат фермента успешно применяемый в биоэлектрокатализе.Целью настоящей работы является изучение закономерностей поведения тирозиназы как в гомогенных, так и в гетерогенных водноорганических средах и разработка путей стабилизации фермента для целей биоэлектрокатализа.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Шиповсков, Степан Васильевич

1. Впервые получены и исследованы комплексы тирозиназы с полибреном, в молярных соотношениях тирозиназа/полибрен 1:10 - 1:500.Найдено, что в комплексах с полибреном тирозиназа сохраняет каталитическую активность в водных и водно-этанольных смесях в широком диапазоне содержания спирта — до 70% об. Показано, что тирозиназа в составе комплекса с полибреном 1:100 характеризуется повышенной каталитической активностью (в 2 - 1 0 раз) по сравнению со свободным ферментом.2. Тирозиназа сохраняет каталитическую активность при включении ее в систему обращенных мицелл в октане. Исследована зависимость каталитической активности тирозиназы в реакции окисления пирокахетина от степени гидратации мицелл в системе АОТ - вода - октан. Найдено, что зависимость максимальной скорости реакции от степени гидратации АОТ описывается кривой с двумя максимумами, что указывает на возможность функционирования фермента в виде различных олигомерных форм. Положение максимумов каталитической активности соответствует степеням гидратации 12 и 25. При степени гидратации 25 каталитическая активность тирозиназы соллюбилизированной в системе обращенных мицелл соизмерима с каталитической активностью тирозиназы в водной системе.3. Исследована каталитическая активность тирозиназы физически иммобилизованной на твердом носителе в водной и органической средах.Показана высокая каталитическая активность фермента в водных растворах и полная инактивация тирозиназы в «сухом» ацетонитриле и этаноле.4. Разработан тирозиназный электрод для определения фенолов в водно этанольных смесях и основанный на иммобилизованной на носителе тирозиназе в нековалентном комплексе с полибреном. Показано, что биоэлектрокаталитическая активность тирозиназы в комплексе выше, чем биоэлектрокаталитическая активность свободной тирозиназы. Разработанные электроды обладают значительно более высокой стабильностью при хранении (в десятки раз) и операционной стабильностью (в сотни раз) по сравнению со свободной тирозиназой как в водных, так и в водно-органических смесях.5. Разработан тирозиназный электрод для определения фенолов в органических средах и основанный на тирозиназе в системе обращенных мицелл иммобилизованных в каучуке. Показано, что каталитическая активность тирозиназы в системе иммобилизованных обращенных мицелл, дополнительно стабилизированных нафионовой мембраной, в «сухом» ацетонитриле выше, чем в водной среде.6. Впервые показана принципиальная возможность использования аэрозольной спрэй-технологии для получения биосенсоров методом трафаретной печати путем прямого распыления на носитель органических «чернил». Для этого разработана методика стабилизации тирозиназы обращенными мицеллами, включенными в графитизированные органические «чернила».Автор выражает глубокую благодарность: • д.х.н. проф. А.В. Левашову за постоянное внимание и оптимизм в ^ обсуждении результатов; • д.х.н. проф. Н.Л. Клячко за интерес и помощь в освоении экспериментальных методов биохимии и энзимологии; • проф. Т. Рузгасу (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет

(Швеция)) за сотрудничество и за предоставленную возможность проведения части экспериментов; • к.х.н. н.с. Е.Э. Ферапонтовой (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет (Швеция)) за помощь в постановке и обсуждение ' ^ электрохимических экспериментов; • К.Х.Н., н.с. П.В. Самулееву (кафедра Неорганической Химии, Лундский Университет (Швеция)) за обсуждение тезисов; • проф. К.Т. Рейману (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет (Швеция)) за безупречное знание английского языка и «орлиный глаз».• А. Кристенсону (кафедра Аналитической Химии, Лундский Университет

(Швеция)) за помощь в разработке спрэй-метода и за отстаивание общих •*^ ^ интересов в неравной борьбе с «датским монстром».• проф. Е. Домингес (кафедра Аналитической и Инженерной Химии, Университет Алкалы (Испания)) за возможность проведения предварительных экспериментов; • сотрудникам и «выпускникам» кафедры Химической Энзимологии Химического Факультета МГУ за обучение, помощь и «поддержку» в работе; • родителям, родственникам и друзьям за проявленное терпение и понимание.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Шиповсков, Степан Васильевич, 2003 год

1. Левашов, А.В., Клячко, Н.Л. (2001) Мицеллярная энзимология: методология и технология. Язе. АН. Сер. Хим. 50,1718-1732.

2. Lee, M.Y., Dordick J.S., (2002) Enzyme activation in nonaqueous media. Current Opinion in Biotechn., 13, 376-384.

3. Klibanov, A.M. (2001) Improving enzymes by using them in organic solvent. Nature (London). 409, 241-246.

4. Khmelnitsky, Y.L., Rich, J.O. (1999) Biocatalysis in nonaqueous solutions. Current Opinion in Chem. Biol., 3, 47-53.

5. Mozhaev, V.V. (1998) Engineering stability of enzjmies in system with organic solvents. Progress in Biotechn., 15, 355-363.

6. Mozhaev, V.V., Berezin, LV., Martinek, K. (1988) Structure-stability relationship in proteins: fundamental tasks and strategy for the development of stabilized enzyme catalysts for biotechnology. CRC Critical Reviews in Biochemistry, lb, 235-281.

7. Гладилин, A.K., Левашов, A.B. (1996) Катализ надмолекулярными фермент- полимерными комплексами (ассоциатами) в органических средах. Успехи биол. химии, 36,141-161.

8. Шульц, Г., Ширмер, Г. (1982) Принципы структурной организации белков. Мир, Москва, 354 с.

9. Wangikar, P.P., Michels, Р.С, Clark, Р.С, Dordick, J.S. (1997) Structure and function of subtilisin BPN solubilized in organic solvents. / Am. Chem. Soc, 119,70-76. v^'

10. Vakurov, A.V., Gladilin, A.K., Partridge, J., Mozhaev, V.V., Levashov, A.V., Hailing, P. (1996) Non-covalent enzyme-polyelectrolyte complexes as self-buffered catalysts for use in low-water organic media. Biotechnol. Tech., 10, 621-624.

11. Bundy, H.F., Moore, R.L. (1966) Chymotrypsin-catalyzed hydrolysis of m-, p- and o-nitroanilides ofN-benzoyl-L-tyrosine. Biochemistry, 5, 808-811.

12. Sakurai, H, Shinohara, K., Hisabori, Т., Shinohara, K. (1981) Enhancement of adenosine triphosphatase activity of purified chloroplast coupling factor 1 in an aqueous organic solvent. J. Biochem., 90, 95-102.

13. Fink, A.L. (1974) The effect of dimethyl sulfoxide on the interaction of proflavine with a-chymotrypsin. Biochemistry, 13, 277-280. -лг" X

14. Levitsky, V., Lozano, P., Gladilin, A., Iborra, J.L. (1998) Stability о immobilized enzyme-polyelectrolyte complex against irreversible inactivation by organic solvents. Prog. Biotech., 15,417-422.

15. Zaks, A., KJibanov, A.M. (1988) The effect of water on enzyme action in organic media. J. Biol Chem., 263, 8017-8021.

16. Kuhl, P., Hailing, P.J. (1991) Salt hydrates buffer water activity during chymotrypsin-catalysed peptide synthesis. Biochim. Biophys. Acta, 1078, 326-334.

17. Eisenbach, M., Caplan, S. R., Tanny, G. (1979) Interaction of purple membrane with solvents. 1. Applicability of solubility parameter mapping. Biochim. Biophys. Acta, 554, 269-280.

18. Jackson, M., Mantsch, H.H. (1991) Beware of proteins in DMSO. Biochim. Biophys. Acta, 1078, 231-235.

19. Veluicelebi, G., Sturtevant, J.M. (1979) Thermodynamics of the denaturation of lysosyme in alcohol-water mixtures. Biochemistry, 18, 1180-1186.

20. Gething, M.-J., Sambrook, J. (1992) Protein folding in the cell. Nature, 355, 33-44.

21. Murphy, A., Fagain, CO. (1996) Stability characteristics of chemically-modified soluble trypsin./. Biotechnol. 49, 163-171.

22. LeJeune, K.E., Mesiano, A.J., Bower, S.B., Grimsley, J.K., Wild, J.R., Rassel, A.J. (1997) Dramatically stabilized phosphotriesterase-polymers for nerve agent degradation, ^/ог'ес/гио/. Bioeng., 54, 105-114.

23. Clark, D.S., Shubhada, S., Sundaram, P.V. (1995) The role of pH change caused by the addition of water-miscible organic solvents in the destabilization of an enzyme. Enzyme. Microb. Technol, 17, 330-335.

24. Fitzpatrick, P.A., Klibanov, A.M. (1991) How can the solvent affect enzyme action in organic solvents? J. Am. Chem. Soc, 113, 3166-3171.

25. Parida, S., Dordick, J.S. (1991) Substrate structure and solvent hydrophobicity control lipase catalysis and enantioselectivity in organic media. J. Am. Chem. Soc, 113,2253-2259. ч/ -s^

26. Valivety, R.H., Hailing, P.J., Macrae, A.R. (1992) Reaction rate with lypase catalyst shows similar dependence on water activity in different organic solvents. Biochim. Biophys. Acta. 1118,218-222.

27. Affleck, R., Xu, Z.-F., Suzava, V., Focht, K., Clark, D.S., Dordick, J.S. (1992) Enzymatic catalysis and dynamics in low-water environments. Proc. Natl. Acad. Sol t/.5.A, 89,1100-1104.

28. Ghatorae, A.S., Bell, G., Hailing, P.J. (1994) Inactivation of enzyme by organic solvents: new technique with well-defined interfacial area. Biotechnol. Bioeng., 43,331-336.

29. Blanco, R., Rakels, J.L.L., Guisan, J.M., Hailing, P.J. (1992) Effect of thermodynamic water activity on aminoacid ester synthesis catalyzed by agarose-chymotrypsin in 3-pentanone. Biochim. Biophys. Acta, 1156, 67-70.

30. Hailing, P.J. (1992) Salt hydrates for water activity control with biocatalysts in organic media. Biotechnol Tech., 6, 271-276.

31. Hailing, P.J. (1990) High affinity binding of water by proteins is similar in air and in organic solvents. Biochim. Biophys. Acta, 1040, 225-228.

32. Gorman, L.S., Dordick, J.S. (1992) Organic solvents strip water off enzymes. Biotechnol. Bioeng., 39, 392-397.

33. Dong, A., Meyer, J.D., Kendrick, B.S., Manning, M.C., Сафетег, J.F. (1996) Effect of secondary structure on the activity of enzymes suspended in organic solvents. Arch. Biochem. Biophys., 334,406-414.

34. Zaks, A., Klibanov, A.M. (1988) Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents. J. Biol. Chem., 263,3194-3201.

35. Affleck, R., Haynes, C.A., Clark, D.S. (1992) Solvent dielectric effects on protein dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89, 5167-5170.

36. Griebenow, K., Klibanov, A.M. (1997) Can conformational changes be responsible for solvent and excipient effects on the catalytic behavior of subtilisin Carsberg in organic solvents? Biotechnol. Bioeng., 53, 351-362.

37. Partridge, J., Hutcheeon, G.A., Moore, B.D., Hailing, P.J. (1996) Exploiting hydration hysteresis for high activity of cross-linked subtilisin crystals in acetonitrile. J. Am. Chem. Sac, 118,12873-12877. Ч/^ V -

38. Жоли, М. (1968) Физическая химия денатурации белков М.: Мир, 364 с.

39. Khmelnitsky, Yu.L., Kabanov, A.V., Klyachko, N.L., Levashov, A.V., Martinek, K. (1989) Enzymatic catalysis in reverse micelles. In: Structure and Reactivity in Reverse Micelles (Pileni, M.P., ed.), Elsevier, Amsterdam, 230-261.

40. Levashov, A.V., Klyachko, N.L. (1995) Micellar enzymology for enzyme engineering. Ideas and realization. Annals N. Y. Acad. Sci., 750, 80-84.

41. Mittal, KL., Lindman, B. (1984) Surfactants in solution. New York: Plenum Press.

42. Day, R.A., Robinson, B.H., Clarke, J.H.R., Doherty, J.V. (1979) Characterization of water-containing reversed micelles by viscosity and dynamic light scaterring methods. J. Chem. Soc, Faraday Trans. I, IS, 132-139.

43. MuUer, N. (1975) A multiple-equilibrium model for the micellization of ionic surfactants in nonaqueous solvents. J. Phys. Chem., 79,287-291.

44. Yamashita, Т., Yano, H., Harada, S., Yasunaga, R. (1982) Kinetic studies of the micelle system of octilammonium alkanoates in hexane solution by the ultrasonic absorbtion method. Bull. Chem. Soc. Japan, 55, 3403-3406.

45. Lindman В., Stilbs P., Moseley M. E. (1981) Fourier transform NMR self-diffusion and microemulsion structure. J. Colloid Interface Sci., 83, 569-582.

46. David, G.G., Morris, D.F., Short, E.L. (1981) Aggregation of a hquid cation exchanger. J. Colloid Interface Sci., 92, 226-232.

47. Cebula, D.J., Myers, D.Y., Ottewill, R.H. (1982) Studies of microemulsions. Part

48. Scattering studies of water-in-oil microemulsions. Colloid Polym. Sci., 260, 96-107.

49. Wong, M., Thomas, J.K., Gratzel, M. (1976) Fluorescence probing of inverted micelles. The state of solubilized water clusters in alkane/diisooctylsulphosuccinate (Aerosol ОТ) solution. J. Am. Chem. Soc, 98, 2391-2397.

50. Мартинек, К., Левашов, А.В., Клячко, Н.Л., Березин, И.В. (1977) Катализ водорастворимыми ферментами в органических растворителях. Стабилизация фермента путем включения в обращенные мицеллы. Докл. - ^ Акад. Наук СССР, 236, 920-923.

51. Levashov, A.V., Khmelnitsky, Yu.L., Klyachko, N.L., Chemyak, V.Ya., Martinek, K. (1982) Enzymes entrapped into organic solvents. Sedimentation analysis of ; the protein - AOT - water - octane system. J. Colloid Interface Sci., 88, 444-457.

52. Левашов, A.B., Клячко, Н.Л., Пантин, В.И., Хмельницкий, Ю.Л., Мартинек, К. (1980) Катализ водорастворимыми ферментами, включенными в обращенные мицеллы ПАВ в неводных растворителях. Биоорг. Хим., 6, 929-943.

53. Хмельницкий, Ю.Л., Левашов, А.В., Клячко, Н.Л., Мартинек, К. (1984) Коллоидный раствор воды в органическом растворителе -микрогетерогенная среда для химических (ферментативных) реакций. Усп. Хим., 53,545-565.

54. Левашов, А.В., Пантин, В.И., Мартинек, К., Березин, И.В. (1980) Кинетическая теория реакций, катализируемых ферментами, солюбилизованными в органических растворителях с помощью ПАВ. Докл. Акад. Наук СССР, 252, 133-136.

55. Мартинек, К., Хмельницкий, Ю.Л., Левашов, А.В., Березин, И.В. (1982) Субстратная специфичность алкогольдегидрогеназы в коллоидном растворе воды в органическом растворителе. Докл. Акад. Наук СССР. 263, 737-741.

56. Kurganov, V.I., Tsetlin, L.G., Malakhova, E.A., Lankin, V.Z., Levashov, A.V., Martinek, K. (1985) A novel approach to study the action of water-insoluble inhibitors on enzymic reactions. J. Biochem. Biophys. Methods, 11, 177-184.

57. Khmelnitsky, Yu.L., Welch, S.H., Clark, D.S., Dordick, J.S. (1994) Salts dramatically enhance activity of enzymes suspended in organic solvents. J. Am. Chem. Soc, 116,2647-2648.

58. Rich, J.O., Dordick, J.S. (1997) Controlling subtilisin activity in organic media by imprinting with nucleophiUc substrate. J. Am. Chem. Soc, 119, 3245-3252.

59. Березин, И.В., Антонов, B.K., Мартинек, К. (1976) Иммобилизованные ферменты. М.: МГУ, т. 1-2.

60. Martinek, К., Mozhaev, V.V. (1985) Immobihzation of enzymes: an approach to fundamental studies in biochemistry. Adv. Enz. Rel. Ar. Mol. Biol, 57,179-249.

61. Березин, И.В., Клячко, Н.Л., Левашов, A.B., Мартинек, К., Можаев, В.В., Хмельницкий, Ю.Л. (1997) Биотехнология, т. 7, Иммобилизованные ферменты. М.: ВШ.

62. Matsushima, А., Kodera, Y., Hiroto, М., Nishimura, Н., Inada. Y. (1996) Bioconjugates of proteins and polyethylene glycol: potent tools in biotechnological processes. J. Mol. Cat. B: Enzym. 2, 1-17.

63. Ke, Т., Wescott, C.R., Klibanov, A.M. (1996) Prediction of the solvent dependence of enzymatic prochiral selectivity by means of structure-based thermodynamic calculations. J. Am. Chem. Soc., 118, 3366-3374.

64. Wescott, C.R., Noritomi, H., Klibanov, A.M. (1996) Rational control of enzymatic enantioselectivity through solvation thermodynamics. / Am. Chem. Soc, 118, 10365-10370.

65. You, L., Arnold, F.A. (1994) Directed evolution of subtilisin E in Bacillus subtilis to enhance total activity in aqueous dimethylformamide. Protein Eng., 9, 77-83.

66. Moore, J.C, Arnold, F.H. (1996) Directed evolution of a para-nitrobenzyl esterase for aqueous-organic solvents. Nature Biotechn., 14,458-467.

67. Изумрудов, В.А., Зезин, А.Б., Кабанов, В.А. (1983) Реакции образования нестехиометричных полиэлектролитных комплексов. Вые. Мол. Соед. А, 25,1972-1978.

68. Бакеев, К.Н., Изумрудов, В.А., Касаикин, В.А., Зезин, А.Б. (1987) Влияние низкомолекулярного электролита на тушение люминесценции в растворах ч ^ НПЭК. Вые. Мол. Соед. Б. 29, 424-428.

69. Бакеев, К.Н., Изумрудов, В.А., Зезин, А.Б., Кабанов, В.А. (1987) Кинетика и механизм реакции образования полиэлектролитных комплексов. Докл. Акад. Наук СССР, 299, 1405-1408.

70. Dubin, P.L., Ross, T.D., Sharma, I., Yegerlehner B.E. (1987) Coacervation of 1 polyelectrolyte-protein complexes. ^ СУ iSywp. Ser. 342, 162-169.

71. Изумрудов, B.A., Зезин, А.Б., Кабанов, В.А. (1984) Кинетика макромолекулярного обмена в растворах комплексов глобулярных белков с полиэлектролитами. ДоА г^. Акад. Наук СССР, 291, 1150-1154.

72. Lopez, R.A., Arce, А., Barra, H.S. (1990) Effect of polyanions and polycations on detyrosination of tubulin and microtubules at steady state. Biochim. Biophys. Acta. 1039,209-217.

73. Mekras, С I. (1989) Inhibition of pepsin by polyions and c.d. studies. Int. J. Biol. Macromol. 11,207-212.

74. Gibson T.D., Woodward J.R. (1990) Stabilization against protein denaturation during drying using cationic polyelectrolytes and cyclic polyols. PCT Int. Appl, 23.

75. Lawton J.B., Mekras C.I. (1985) The effect of polycations on the activity of pepsin. J. Pharmacy Pharmacol, 37 396-400. ч^

76. Eicken, С, Gerdemann, С , Krebs, В. (2001) Catechol oxidase. In: Handbook of Metalloproteins. (Editors: A. Messerschmidt, R. Huber, T. Poulos, K. Weghardt.) 2,1319-1329.

77. Witkop, C.J. (1985) Inherited disorders of pigmentation. Clin. Dermatol, 3, 70-134

78. Rodakiewicz-Nowak, J. (2000) Phenol oxidizing enzymes in water-restricted media. Topics in Catalysis 11,419-434.

79. Whitaker, J.R. (1994) Polyphenol oxidase. FoodSci. Technol 61, 543-556.

80. Mason, H.J., Fowlks, W.B., Peterson, E.W. (1955) Oxygen transfer and electron transport by the phenolase complex. J. Am. Chem. Soc, 11,2914-2915.

81. Mayer, A.M., Harel, E. (1979) Polyphenol oxidases in plants. Phytochemistry, 18, 193-275.

82. Sommer, A., Neeman, E., Steffens, J.C, Mayer, A.M., Harel, E. (1994) Import, targeting, and processing of a plant polyphenol oxidase. Plant. Physiol, 105, 1301-1311.

83. Walker, JR, Ferrar, PH. (1998) Diphenol oxidases, enzyme-catalyzed browning and plant disease resistance. Biotechnol Genet. Eng. Rev., 15, 457-498.

84. Thipyapong, P., Hunt, MD, Steffens, JC. (1995) Systematic wound induction of potato Solanum Tuberosum polyphenol oxidase. Phytochemistry, 40, в1Ъ-Ы6.

85. Kertesz, D., Zito, R. (1965) Mushroom polyphenol oxidase. I. Purification and general properties. Biochim. Biophys. Acta, 96, 447-462.

86. Uiterkamp, A.J.M.S., Evans, L.H., Jolley, R.L., Mason, H.S. (1976) Adsorption and circular dichroism spectra of different forms of mushroom tyrosinase. Biochim. Biophys. Acta., 453, 200.

87. Solomon, E.I., Lowery, M.D. (1993) Electronic structure contribution to function in bioorganic chemistry. Science, 259, 1575-1581.

88. Solomon, EL, Sundaram, UM., Machonkin, ТЕ. (1996) Multicopper oxidases and oxygenases. Chem. Rev. 96, 2563-2605.

89. Brown, R.S., Male, K.B., Luong, H.T. (1994) A substrate recycling assay for phenolic compounds using tyrosinase and NADH. Anal. Biochem., 222, 131-139. u

90. Espin, JC, Garcia-Ruiz, PA., Tudela, J., Garcia-Canovas, F. (1998) Study of stereospecificity in mushroom tyrosinase. Biochem. J., 331, 547-551.

91. Kermasha, S., Вас, H., Bisakowski, B. (2001) Biocatalysis of tyrosinase using catechin as substrate in selected organic solvent media. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 11, 929-938.

92. Burton, SO. (1994) Biocatalysis with polyphenol oxidase: a review. Catalysis Today, 22,459-487.

93. Khbanov, A.M. (1989) Enzymatic catalysis in anhydrous organic solvents. Trends Biochem. Sci., 14,141-144.

94. Gupta, N.M. (1992) Enzyme function in organic solvent. Eur. J. Biochem., 203, 25-32.

95. Chang, S.C, Rawson, K., McNeil, C.J. (2002) Disposable tyrosinase-peroxidase bi-enzyme sensor for amperometric detection of phenols. Biosens. Bioelectr., 17,1015-1023.

96. Campanella, L., Favero, G., Persi, L., Sammartino, M.P., Tomassetti, M., Visco, G. (2001) Organic phase enzyme electrodes: applications and theoretical studies. Anal.Chem.Acta., 426, 235-247.

97. Campanella, L., De Santis, G., Favero, G., Sammartino, M.P., Tomassetti, M. (2001) Two OPEEs (organic phase enzyme electrodes) used to check the percentage water content in hydrophobic foods and drugs. Analyst, 126, 1923-1928.

98. Chen, Т., Embree, H.D., Brown, E.M., Taylor, M.M., Payne, G.F. (2003) Enzyme-catalyzed gel formation of gelatin and chitosan: potential for in situ applications. Biomaterials, 24, 2831-2841.

99. Hoare, J.P. (1984) A cyclic voltammetry study of the gold-oxygen system. J. Electrochem. Soc. 131, 1808-1815.

100. Khmelnitskiy, Y.L., Levashov, A.V., Klyachko, N.L., Martinek, K. (1988) Engineering of biocatalytic systems in organic media with low water content. Enzyme Microb. TechnoL, 10,710-724. \L^I - О

101. Matsushima, A., Okada, M., Inada, Y. (1984) Chymotrypsin modified with polyethylene glycol catalyzes peptide synthesis reaction in benzene. FEBS Lett., 178, 275-277.

102. Kudryashova, E.V., Artemova, T.M., Vinogradov, A.A., Gladilin, A.K., Mozhaev, V.V., Levashov, A.V. (2003) Stabilization and activation of chymotrypsin in water-organic solvent systems by complex formation with oligoamines. Protein Eng., 16, 303-309.

103. Thiele, В., Gunter, K., Schwunger, M.S. (1997) Alkylphenol ethoxylates: Trace analysis and envirormiental behaviuor. Chem. Rev., 97, 3247-3272.

104. Willner, I., Katz, E. (2000) Integration of layered redox proteins and conductive supports for bioelectronic applications. Ang. Chem. Int. Ed, 39, 1181-1218.

105. Kulys, J., Schmid, R.D. (1990) A sensitive enzyme electrode for phenol monitoring, ^wa/. Lett., 23, 589-597.

106. Schultze, J.W., Bressel, A. (2001) Principles of electrochemical micro- and nano- system technologies. Electrochim. Acta, 47, 3-21.

107. Dock, E., Ruzgas, T. (2003) Screen-printed carbon electrodes modified with cellobiose dehydrogenase; amplification factor for catechol vs. reversibility of ferricyanide, Electroanalysis, 15,492-498.

108. Wang, J., Fang, L., Lopez, D. (1994) Amperometric biosensor for phenols based on a tyrosinase-graphite-epoxy biocomposite. Analyst, 119, 455-458.

109. Albareda-Sirvent, M., Merko9i, A., Alegret, S. (2000) Configuration used in the design of screen-printed enzymatic biosensors. A review. Sens. Act. В., 69, 153-163.