Сравнительное изучение Na+-транслоцирующих NADH:хинон оксидоредуктаз из Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae и Azotobacter vinelandii тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Фадеева, Мария Сергеевна

• Фадеева, Мария Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фадеева, Мария Сергеевна

Список сокращений

Введение

Обзор литературы

1. История открытия и изучения натрий-транслоцирующей 8 КАОН:хинон-оксидоредуктазы

2. Субъединичный состав фермента, гомология субъединиц с другими белками

3. Кофакторы

4. Каталитические активности Ыа+-ЫС)

5. Ингибиторы реакций, осуществляемых Ыа+-ЫС)

6. Роль кофакторов и возможные механизмы работы На+-ЫС)

7. Другие КАЭН :хинон-оксидоредуктазы, присутствующие в 31 дыхательной цепи прокариот

Материалы и методы

1. Штаммы микроорганизмов, использованные в работе

2. Выращивание бактериальных штаммов

3. Получение клеточного лизата и суббактериальных частиц

4. Выделение рекомбинантного препарата Ка+-КС)

5. Получение рекомбинантных фрагментов субъединиц ЫцгВ и ЫцгС

6. ЭПР-спектроскопия "

7. Измерение концентрации белка

8. Измерение концентрации натрия

9. Регистрация окисления ИАБН, ИАБРН и с^АБН

10. Генетические методы:

11 Измерение р-галактозидазной активности

12 Определение различных металлов в препаратах N<

13 Электрофоретическое разделение белков

14 Перенос белков методом Вестерн-блоттинга

15 Метод иммуноблоттинга

16 Экспериментальный протеолиз СБЧ.

Результаты

1. Регуляция экспрессии оперонов, кодирующих Ыа+-транслоцирующую ИАОНгхиноп-оксидоредуктазу у V. harveyi и К. pneumoniae

2. Каталитические свойства натрий-транслоцирующей NADH:xhhoh-оксидоредукгазы из V harveyi, К. pneumoniae и A. vinelandii

3. Анализ мембранной топологии субъединицы NqrC натрий-транслоцирующей ЫАОН:хинон-оксидоредуктазы из V. harvey

4. Сайт-напрайленный мутагенез консервативных остатков цистеина в субъединицах NqrD и NqrE

Обсуждение Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное изучение Na+-транслоцирующих NADH:хинон оксидоредуктаз из Vibrio harveyi, Klebsiella pneumoniae и Azotobacter vinelandii»

Многие морские и патогенные микроорганизмы содержат уникальный фермент -натрий-транслоцирующую КАОН:хипон-оксидоредуктазу (Na+-NQR) - который создает на цитоплазматической мембране бактерий первичиый электрохимический градиент ионов натрия. Фермент представляет значительный интерес для биоэнергетики, поскольку его сопрягающим ионом является Na+, а не протон. Это позволяет в широких пределах изменять концентрацию сопрягающего иона без существенного влияния на стабильность белка, что невозможно при исследовании протонных помп. Данный фермент устроен значительно проще NADH-дегидрогеназ I типа (Комплекса I), что также является преимуществом при исследовании механизма* преобразования энергии катализируемой редокс-реакции. Кроме того, Na+-NQR широко распространена среди патогенных микроорганизмов, таких как Vibrio cholerae, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitidis, Yersinia pestis, Pseudomonas aeruginosa, Porphyromonas ginginvalis и т.д., что делает исследование фермента актуальным и с медицинской точки зрения. При изучении V. cholerae была обнаружена взаимосвязь между уровнем мембранного натриевого потенциала, который является следствием работы фермента, и продукцией факторов вирулентности. Поэтому Na+-NQR можно рассматривать как вероятную мишень для создания новых лекарственных препаратов для лечения или предотвращения многих инфекционных заболеваний.

За последние годы достигнут значительный прогресс в изучении Na+-NQR: полностью определена нуклеотидная последовательность ядг-оперона, установлен субъединичный состав фермента, определена роль некоторых кофакторов в передаче электронов от NADH к хинону и т.д. Тем не менее, в настоящее время исследователи еще очень далеки от полного понимания механизма функционирования Na+-NQR. В том числе, все имеющиеся па настоящий момент данные были получены при изучении Na+-NQR из V. alginolyticus, V. harveyi и V. cholerae. Эти организмы очень близки друг к другу, и гомология нуклеотидных последовательностей соответствующих генов крайне высока. При этом абсолютно ничего не известно о свойствах Na+-NQR из других микроорганизмов. Подобная информация была бы исключительно полезна как для понимания физиологической роли фермента в бактериальной клетке, так и для выявления общих закономерностей функционирования и структурных характеристик Na+-NQR, которые являются принципиальными в осуществлении редокс-реакции и транслокации ионов натрия. различных экологических нишах. Особое внимание было уделено определению физиологической роли и сравнительному изучению кинетических параметров данных ферментов из эволюционно и экологически отдаленных микроорганизмов, а также анализу роли их консервативных аминокислотных остатков в функционировании белка.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Фадеева, Мария Сергеевна

выводы

Такие параметры как концентрация NaCl, значение рН и присутствие разобщителя в ростовой среде практически не оказывают влияния на экспрессию nqr генов V. harveyi и К. pneumoniae, кодирующих Ыа+-транслоцирующую NADH:xhhoh-оксидоредуктазу.

Экспрессия nqr V. harveyi и К. pneumoniae в значительной степени зависит от того, какие субстраты используются этими бактериями в качестве основного источника энергии. Особенно сильное влияние на экспрессию nqr V. harveyi оказывает доступность акцепторов электронов для дыхательной цепи и значения их окислительно-восстановительных потенциалов. Установлено, что система АгсАВ не участвует в регуляции экспрессии генов nqr V. harveyi.

Определены кинетические характеристики Na ^-транслоцирующих NADH:xhhoh оксидоредуктаз из V. harveyi. К. pneumoniae и A. vinelandir. константы Михаэлиса по нонам натрия, а также параметры ингибирования этих ферментов дыхательным ингибитором 2-гептил-4 гидроксихинолин-1\[-оксидом. Показано различие действия SH-реагентов (ионов серебра и N-этилмалеимида) на ферменты из этих бактерий.

Дифенилиодониум модифицирует только нековалентно присоединенный FAD. расположенный на субъединнце NqrF, при этом не происходит модификации остатков FMN. принадлежащих субъединицам NqrB и NqrC.

При анализе первичных последовательностей субъединиц Na+-NQR из разных организмов определены 4 консервативные остатка цистеина, расположенные внутри трансмембранных ex-спиралей. С помощью сайт-направлениого мутагенеза показана необходимость этих остатков для правильной сборки и функционирования №+-транслоцирующей ЫАОН:хинон-оксидоредуктазы.

Ж.'

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фадеева, Мария Сергеевна, 2008 год

1. Берцова Ю.В., Попов В.Н. и Богачсв А.В. (2004) Окисление NADH митохондриями 1срмогенного растении Arum orientals. Биохимия, 69. 712-718.

2. Богачсв А.В. и Верховский М.И. (2005) Ыа'-транслоцпрующая NADH:xhhoh оксидоредуктаза достигнутый прогресс и перспективы исследований. Биохимия. 70, 177- 185.

3. Кондратьева И. А, Самуилов В. Д. (ред) (2001). Практикум по иммунологии; М., МГУ, с.114-118.

4. Скулачев, В. П. (1989) Энергетика биологических мембран, М. Паука.

5. Alexeyev, M.F. (1999) The pKNOCK series of broad-host-range mobilizable suicide vectors lor gene knockout and targeted DNA insertion into the chromosome of gram-negative bacteria. Biotechniques. 26, 824-828.

6. Asano M., Hayashi M. Unemoto Tokuda H. (1985) Ag+-sensitive NADH dehydrogenase in the Na+-motive respiratory chain of the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Agric. Biol Chem., 49,2813-2817.

7. Barquera, В., Hase, C.C., and Gennis, R.B. (2001) Expression and mutagenesis of the NqrC subunit of the NQR respiratory Na+ pump from Vibrio cholerae with covalently attached FMN. FEBS Lett., 492, 45-49.

8. Barquera В., Zhou W., Morgan J. E., and Gennis, R. B. (2002). Riboflavin is a component of the Na'-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio cholerae. PNAS, 99, 10322-10324.

9. Barquera B., Zhou W., Morgan J. E., Gennis R. B. (2002) Riboflavin is a component of Na+-pumpmg NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae. PNAS, 99, 10322-10324.

10. Belevich G., Euro L., Wikström M., Verkhovskaya M. (2007) Role of the conserved arginine 274 and histidine 224 and 228 residues in the NuoCD subunit of complex I from Escherichia coli. Biochemistry, 46, 526-533.

11. Bertsova Y. V. & Bogachev A. V. (2004) The origin of the sodium-dependent NADH oxidation by the respiratory chain of Klebsiella pneumoniae. FEBS Lett., 563, 207-212.

12. Bertsova, Y.V. and Bogachev A.V. (2002) Operation of the cbb^-type terminal oxidase in Azotobacter vinelanclii. Biochemistry (Moscow), 67, 622-626.

13. Bertsova Y.V., Bogachev A.V., and Skulachev V.P. (1998) Two NADH:ubiquinone oxidoreductases of Azotobacter vinelandii and their role in the respiratory protection. Biochim. Biophys. Acta, 1363, 125-133.

14. Bertsova Y.V., Bogachev A.V., and Skulachev V.P. (2001) Noncoupled NADH:ubiquinone oxidoreductase of Azotobacter vinelandii is required for diazotrophic growth at high oxygen concentrations. J. Bacteriol., 183(23), 6869-6874.

15. Bogachev A. V., Bertsova Y. V., Barquera B., Verkhovsky M. I. (2001) Sodium-dependent steps in the redox reactions of the Na+-motive NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochemistry, 40, 7318-7323.

16. Bogachev A. V., Bertsova Y. V., Rooge E. K., Wikström M„ Verkhovsky M. I. (2000) Kinetics of the spectral changes during reduction of the Na+-motive NADH-quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochim Biophys Acta, 1556, 113-120.

17. Bogachev, A.V., Bertsova, Y.V., Bloch, D.A., and Verkhovsky, M.I. (2006) Thermodynamic properties of the redox centers of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase. Biochemistry, 45, 3421-3428.

18. Bogachev A.V., Bertsova Y.V., Aitio O., Permi P., and Verkhovsky M.I. (2007) Redox-dependent sodium binding by the Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase from Vibrio harveyi. Biochemistry, 46, 10186-10191.

19. Bogachev A. V., Murtasina R. A., Skulachev V. P. (1997) The Na+/e" stoichiometry of the Na+-motive NADH-quinone oxidoreductase in Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 409, 475477.

20. Bongaerts J, Zoske S, Weidner U, Unden G (1995) Transcriptional regulation of the proton translocating NADH dehydrogenase genes («woA-N) of Escherichia coli by electron acceptors, electron donors and gene regulators. Mol. Microbiol., 16, 521-534.

21. Bourne R. M., Rich P. R. (1992) Characterization of a sodiummotive NADH:ubiquinone oxidoreductase. Biochem. Soc. Trans., 20, 577-582.

22. Chakraborty S. and Massey V. (2002) Reaction of reduced flavins and flavoproteins with diphenyliodonium chloride. J. Biol. Chem., 277, 41507-41516.

23. Curatti L, Brown CS, Ludden PW, Rubio LM. (2005) Genes required for rapid expression of nitrogenase activity in Azotobacter vinelandii. PNAS, 102, 6291-6296.

24. Dibrov P. A., Kostyrko V. A., Lazarova R. L., Skulachev V. P.,Smirnova I. A. (1986) The sodium cycle. I. Na+-dependent motility and modes of membrane energization in the marine alkalotolerant Vibrio Alginolyticus. Biochim Biophys Acta, 850, 449-457.

25. Duffy, E.B., and Barquera, B. (2006) Membrane topology mapping of the Na+-pumping NADH: quinone oxidoreductase from Vibrio cholerae by PhoA-green fluorescent protein fusion analysis. J. Bacteriol., 188, 8343-8351.

26. Duran-Pinedo, A. E., Nishikawa K. and Duncan M. J. (2007). The RprY response regulator of Porphyromonas gingivalis. Mol. Microbiol., 64, 1061-1074.

27. Fadeeva M.S., Yakovtseva E.A., Belevich G.A., Bertsova Y.V., and Bogachev AV. (2007) Regulation of expression of Na+-translocating NADH:quinone oxidoreductase genes in Vibrio harveyi and Klebsiella pneumoniae. Arch. Microbiol., 188, 341-348.

28. Fu H A, Iuchi S, Lin E C (1991) The requirement of ArcA and Fnr for peak expression of the cyd operon in Escherichia coli under microaerobic conditions. Mol. Gen. Genet., 226, 209213.

29. Georgellis D, Kwon O, Lin E C, Wong S M, Akerley B J (2001) Redox signal transduction by the ArcB sensor kinase of Haemophilus influenzae lacking the PAS domain. J. Bacteriol., 183, 7206-7212.

30. Hiise C. C. (2003). Ion motive force dependence of protease secretion and phag transduction in Vibrio cholerae and Pseudomonas aeruginosa. FEMSMicrobiol. Lett., 227, 6571.

31. Hase C. C., Barquera B. (2001) Roles of sodium bioenergetics in Vibrio cholerae. Biochim Biophys Acta, 1505, 169-178.

32. Häse C. C., Fedorova N. D., Galperin M. Y., Dibrov P. A. (2001) Sodium-ion cycle in bacterial pathogens: evidence from cross-genome comparison. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 65, 353-370.

33. Hayashi M., Hirai K., Unemoto T. (1995) Sequencing and the alignment of structural genes in the nqr operon encoding the Na+-translocating NADH:quinone reductase from Vibrio alginolytiens. FEBS Lett, 363, 75-77.

34. Hayashi, M., Miyoshi, T., Sato, M., Unemoto, T. (1992) Properties of respiratory chain-linked Na+-independent NADH-quinone reductase in a marine Vibrio alginoly tiens. Biochim. Biophys. Acta, 1099, 145-151.

35. Hayashi M., Nakayama Y., and Unemoto T. (1996) Existence of Na+-translocating NADH-quinone reductase in Haemophilus influenzae. FEBS Lett., 381, 174-176.

36. Hayashi M., Nakayama Y., Unemoto T. (2001) Recent progress in the Na+-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. Biochim. Biophys. Acta, 1505, 37-44.

37. Hayashi M., Nakayama Y., Yasui M., Maeda M., Furuishi K., Unemoto T. (2001). FMN is covalently attached to a threonine residue in NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginoly ticus. FEBS Lett., 488, 5-8.

38. Hayashi M., Unemoto T. (1984) Characterization of the Na+-dependent respiratory chain NADH:quinone oxidoreductase of the marine bacterium, in Vibrio alginolyticus, in relation to the primary Na+ pump. Biochim Biophys Acta, 767, 470-478.

39. Hayashi M., Unemoto T. (1987) Subunit component and their roles in the sodium-transport NADIi:quinone reductase of a marine bacterium Vibrio alginolyticus. Biochim. Biophys. Acta, 890, 47-54.

40. Nakayama, Y., Yasui, M., Sugahara, K., Hayashi, M., and Unemoto, T. (2000) Covalently bound flavin in the NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 474, 165-168.

41. Jeong H-S., and Jouanneau Y. (2000) Enhanced nitrogenase activity in strains of Rhodobacter capsulatus that overexpresses the rnf genes. J. Bacteriol., 182, 1206-1214.

42. Jouanneau Y., Jeong H-S., Hugo N., Meyer C., and Willson J. (1998). Overexpression in E. coli of rnf genes from Rhodobacter capsulatus. Characterization of two membrane-bound iron-sulfur proteins. Eur. J. Biochem., 251, 54-56.

43. Kerscher S, Drose S, Zickermann V, Brandt U. (2007) Three Families of Respiratory NADH Dehydrogenases. Results Probl. Cell Differ., Springer, in press.

44. Kogure K. (1998). Bioenergetics of marine bacteria. Curr. Opin. Biotechnol., 9, 278-282.

45. Kogure K., and Tokuda H. (1989) Respiration-dependent primary Na+ pump in halophilic marine bacterium, Alcaligenes strain 201. FEBS Lett., 256, 147-149.

46. Koo M.S., Lee J.H., Rah S.Y., Yeo W.S., Lee J.W., Lee K.L., Koh Y.S., Kang S.O., and Roe J.H. (2003) A reducing system of the superoxide sensor SoxR in Escherichia coli. EMBO Jour., 22,2614-2622.

47. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head bacteriophage T-4. (1970) Nature, 227, 680-685.'

48. Li, Q., Li, L., Rejtar, T., Karger, B.L., and. Ferry J.G. (2005) Proteome of Methanosarcina acetivorans part i: an expanded view of the biology of the cell. J. Proteome Res., 4, 112-128.

49. Majander A., Finel M., Wikstrom M. (1994) Diphenyleneiodonium inhibits reduction of iron-sulfur clusters in the mitochondrial NADH-ubiquinone oxidoreductase (Complex I). J. Biol. Chem., 269, 21037-21042.

50. Malpica R, Sandoval G R, Rodriguez C, Franco B, Georgellis D (2006) Signaling by the arc two-component system provides a link between the redox state of the quinone pool and gene expression. Antioxid. Redox Signal., 8, 781-795.

51. Manukhov I V, Bertsova Y V, Trofimov D Y, Bogachev A V, Skulachev V P (2000) Analysis of HI0220 protein from Haemophilus influenzae, a novel structural and functional analog of ArcB protein from Escherichia coli. Biochemistry (Moscow), 65, 1321-1326.

52. Miller S., and Mekalanos J. (1988) A novel suicide vector and its use in construction of insertion mutations: osmoregulation of outer membrane proteins and virulence determinants in Vibrio cholerae requires toxR. J. Bacteriol., 170, 2575-2583.

53. Nakayama Y., Ilayashi M.3 Unemoto T. (1998) Identification of six subunits Na+-translocating NADH-quinone reductase from the marine Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 422, 240-242.

54. Nakayama Y., Yasui M., Suhugara K., Hayashi M., Unemoto T. (2000) Covalenly bound flavin in the NqrB and NqrC subunits of Na+-translocating NADH-quinone reductase from Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 474, 165-168.

55. Park S.J., Tseng C.P., and Gunsalus R.P. (1995) Regulation of succinate dehydrogenase (sdhCDAW) operon expression in Escherichia coli in response to carbon supply and anaerobiosis: role of ArcA and Fnr. Mol. Microbiol., 15, 473-482.

56. Pfenninger-Li X D, Dimroth P (1992) NADH formation by Na+-coupled reversed electron transfer in Klebsiella pneumoniae. Mol. Microbiol., 6, 1943-1948.

57. Pfenninger-Li X. D., Albracht S. P., van Belzen R„ Dimroth P. (1996) NADH:ubiquinone oxidoreductase from Vibrio alginolyticus: purification, properties and reconstitution of the Na+ pump. Biochemistry, 35, 6233-6242. ;,

58. Pfenninger-Li X. D., Dimroth P. (1995) Na+-translocating NADH:Quinone oxidireductase from a marine bacterium Vibrio alginolyticus contains FAD but not FMN. FEBS Lett., 369, 173-176.

59. Proctor L M, Gunsalus R P (2000) Anaerobic respiratory growth of Vibrio harveyi, Vibrio fischeri and Photobacterium leiognathi with trimethylamine N-oxide, • nitrate and fumarate: ecological implications. Environ. Microbiol., 2, 399-406.

60. Rich P. R., Meunier B., Ward F. B. (1995) Predicted structure and possible ionmotive mechanism of the sodium-linked NADH-ubiqinone oxidoreductase of Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 375, 5-10.

61. Singer T. and Mclntire. (1984) Covalent attachment of flavin to flavoproteins: occurrence, assay and synthesis. Methods Enzymol., 106, 369-378.

62. Skulachev V. P. (1989) The sodium cycle: a novel type of bacterial energetics. J. Bioenerg. Biomembr., 21, 635-647

63. Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D., Fujimoto, E.K., Goeke, N.M., Olson, B.J., and Klenk, D.C. (1985) Anal. Biochem., 150, 76-85.

64. Tokuda H. (1984) Solubilization and reconstitution of the Na+-motive NADH oxidase activity from the marine bacterium Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 176, 125-128.

65. Tokuda H., Asano M., Shimamura Y., Unemoto T., Sugiyama S., Unemoto T (1987) Roles of the respiratory Na+ pump in the bioenergetics of Vibrio alginolyticus. J. Biochem., 103, 650-655.

66. Tokuda H, Udagawa T, Unemoto T. (1985) Generation of the electrochemical potential of Na+ by the Na+-motive NADH oxidase in inverted membrane vesicles of Vibrio alginolyticus. FEBS Lett., 183, 95-98.

67. Tokuda H, Unemoto T. (1981). A respiration-dependent primary sodium extrusion system functioning at alkaline pH in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. Biochem. Biophys. Res. Commun., 102,265-71.

68. Tokuda H., Unemoto T. (1982) Characterization of the respiration-dependent Na+ pump in the marine bacterium Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 257, 10007-10014.

69. Tokuda H., Unemoto T. (1983). Growth of a marine Vibrio alginolyticus and moderate halophilic Vibrio costicola becomes uncoupler resistant when the respiration-dependent Na+ pump functions. J. Bacteriol., 156, 636-643.

70. Tokuda H., Unemoto T. (1984) Na+ is translocated at NADH:quinone oxidoreductase segment in the respiratory chain of Vibrio alginolyticus. J. Biol. Chem., 259, 7785-7790.

71. Tsuchiva T., Shinoda S. (1985). Respiration-driven sodium pump and Na+ circulation in Vibrio parahaemolyticus. J. Bacteriol., 162, 794-798.

72. Turk K., Puhar A., Neese F., Bill E., Fritz G., Steuber J. (2004). NADH oxidation by Na+-transIocating NADH:quinone oxidireductase from Vibrio cholerae. J. Biol. Chem., 279, 21349-21355.

73. Udagawa T., Unemoto T., Tokuda H. (1985). Generation of Na+ electrochemical potential by the Na+-motive NADH-oxidase and Na+/H+-antiport system of a moderate halophilic Vibrio costicola. J. Biol. Chem., 261, 2616-2622.

74. Unemoto T, Hayashi M, Hayashi M. (1977). Na+-dependent activation of NADH oxidase in membrane fractions from halophilic Vibrio alginolyticus and Vibrio costicolus. J. Biochem., 82, 1389-1395.

75. Unemoto. T., Hayashi M. (1979) NADHrquinone oxidoreductase as a site of Na+-dependent activation in the respiratory chain of marine Vibrio alginolyticus. J. Biochem., 85, 1461-1467.

76. Yommitsu T., Homma M. (2001) Na+-driven flagellar motor of Vibrio. Biochim. Biophys. Acta, 1505, 82-93.

77. Yoshikawa K., Takadera T., Adachi K., Nishijima M., Hiroshi S. (1997). Korormicin, a novel antibiotic Specifically active against marine gram-negative bacteria, produced by a marine bacterium. J. Antibiot., 50, 945-953.