Сравнительное изучение действия канцерогенов на функции клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих рецепторы ксенобиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат биологических наук Волков, Максим Сергеевич

• Волков, Максим Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Волков, Максим Сергеевич

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Механизмы химического канцерогенеза

2. Общая характеристика химических канцерогенов окружающей среды

3. Химические канцерогены

3.1 Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ)

4. Механизм активации непрямых канцерогенов

4.1 Роль цитохрома Р450

4.2 Роль АЬ-рецептора в регуляции метаболизма ксенобиотиков

5. Промоция канцерогенеза

5.1 Лиганды АЬ-рецептора

5.2 Пролиферация

5.3 Структура и функция АР-1

5.4 Структура и функция ОТ-кВ

5.5 Межклеточные щелевые коммуникации (МЩК) и

их ингибирование в ходе опухолевой промоции

5.6 Апоптоз

6. Эффекты канцерогенов не связанные с АЬ-рецептором

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культуры клеток

2. Используемые в работе вещества

3. Методика исследования клеточного цикла

4. Выделение РНК из культивируемых клеток

5. Обратная транскрипция и ПЦР

6. Определение пролиферации

7. Трансфекция репликативной конструкции ]\Е-кВ

и определение активности репортерного гена

8. Трансфекция гена АР-1 и определение активности репортерного гена

9. Трансфекция siRNA

10. Электрофорез и иммуноблотинг

11. Проницаемость щелевых контактов

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Гепатома 27

1.1 Определение пролиферации и исследование

клеточного цикла

1.2 Определение активности АР-1

1.3 Определение активности NF-кВ и экспрессия IkB

2. Гепатома HepG2

2.1 Определение пролиферации и исследование

клеточного цикла

2.2 Определение активности АР-1

2.3 Определение активности NF-кВ и экспрессия IkB

2.4 Определение пролиферации клеток HepG2 в условиях ингибирования экспрессии Ah рецептора и ARNT

3. Клетки HelA и трансформированные фибробласты (CL-1)

3.1 Определение пролиферации

3.2 Определение активности NF-kB

3.3 Эффект ПАУ на межклеточные щелевые контакты (МЩК)

V. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

VI. ВЫВОДЫ

VII. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений:

ПАУ - полицикличечкие ароматические углеводороды

БП - бензо/а/пирен

Б(е)П - бензо/е/пирен

MX - 3-метилхолантрен

а-НФ - а нафтофлавон

Р-НФ - (3 нафтофлавон

ДМБА - 7,12 - диметилбензантрацен

1KB - ингибиторная субъединица NF-kB, экспрессируемая при активации NF-kB

IKK - киназа, фосфорилирующая IkB МЩК - межклеточные щелевые контакты

АР-1 - activated protein ¡.Транскрипционный фактор, являющийся димером, содержащим по одному онкобелку от представителей семейства Jun и Fos. NF-кВ- ядерный транскрипционный фактор кВ ТРА - 12-о-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат

Ah-рецептор - Aryl hydrocarbon receptor. Рецептор, являющийся сенсором попадания в клетку молекул ксенобиотиков.

ARNT - Aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator. Белок, образующий комплекс с Ah-рецептором и обеспечивающий его прохождение в ядро клетки.

ТХДД - 2,3,7,8 - тетрахлордиоксидибенздиоксин GPDH - глицерол-3-фосфат дегидрогеназа

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительное изучение действия канцерогенов на функции клеток, экспрессирующих и не экспрессирующих рецепторы ксенобиотиков»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

В настоящее время для решения целого ряда проблем цитологии и клеточной биологи используются самые разные модели. Это обусловлено разнообразием и сходством морфофункциональных, молекулярно-генетических и биохимических изменений, лежащих в основе жизнедеятельности клеток в различных условиях функционирования в норме и при развитии патологических процессов. С этих позиций довольно часто в экспериментальных исследованиях используется модель канцерогенеза. Очевидно, что работы в этой области важны и для биологии, и для практической медицины. Причины возникновения злокачественных опухолей многообразны. К ним следует отнести ультрафиолетовое излучение, ионизирующую радиацию, инфекционные агенты, генетические факторы и др. (107). Лидирующие позиции в этом списке занимают химические канцерогены (71, 143, 126). Химические канцерогены подразделяются на вещества прямого и непрямого действия. Непрямые канцерогены (проканцерогены) исходно биологически инертные вещества и для их превращения в активную форму канцерогена требуется метаболическая трансформация в клетке. Прямые канцерогены в исходной форме реализуют свой канцерогенный потенциал. Кроме того, среди химических веществ выделяют «полные» и «неполные» канцерогены. Полные канцерогены способны вызывать развитие опухоли без дополнительных воздействий. Неполные канцерогены - индуцируют или стадию инициации (инициаторы), или стадию промоции (промоторы). ПАУ, используемые в нашей работе, являются полными непрямыми канцерогенами.

ПАУ - наиболее распространенные загрязнители окружающей среды. Эти соединения находятся в выхлопных газах двигателей внутреннего сгорания, в табачном дыме, их выявляют в продуктах питания, подвергшихся термической обработке и пр.

В процессе химического канцерогенеза принято выделять три стадии: инициацию, промоцию и прогрессию (132). На стадии инициации под действием активных форм канцерогена происходят генетические изменения в наследственном аппарате клетки, приводящие к тому, что клетка становиться потенциальным родоначальником будущего опухолевого узла. Однако она не может реализовать свой опухолевый потенциал, поскольку окружающие клетки препятствуют ее росту. Для образования опухоли необходимы дополнительные воздействия, называемые промоцией, функция которых, «отключить» опухолевую клетку от регуляторного воздействия окружающих клеток. В отличие от стадии инициации промоция не связана с воздействием на генетический аппарат клетки и реализуется по эпигенетическому механизму. Считается, что промоторное воздействие включает в себя: способность стимулировать пролиферацию, ингибировать апоптоз и блокировать межклеточные щелевые контакты. Стадия инициации достаточно хорошо изучена и для многих соединений доказана структура «конечного» канцерогена. Механизм промоторного действия изучен намного менее подробно. Неизвестно на какую клеточную структуру направлено действие промоторов, являются ли все эффекты промоторов результатом взаимодействия с одним клеточным компонентом или в реализацию стадии промоции вовлечены различные клеточные структуры. Для соединений типа ПАУ в клетке выявлен один объект взаимодействия - АЬ-рецептор. Предполагается, что все негенотоксические эффекты, в том числе опухолевая промоция реализуются благодаря активации АЬ-рецептора.

Однако существуют литературные данные согласно которым эффекты, связанные с промоцией, могут реализовываться в системах, в которых отсутствует АЬ-рецептор или он не активен. В связи с этим, мы попытались выяснить какова роль АЬ-рецептора в реализации некоторых клеточных функций, связанных с промоцией, используя для этого клеточные культуры экспрессирующие и не экспрессирующие АИ-рецептор.

Целью исследования - является определение роли АЬ рецептора при действии его лигандов на функции клеток, нарушение которых обуславливают опухолевую промоцию. Выяснить существует ли помимо АЬ рецептора в клетке другие акцепторы лигандов АЬ рецептора, взаимодействие с которыми вызывает эффекты ассоциированные с опухолевой промоцией Задачи исследования

В рамках поставленной цели задачей диссертационной работы является изучение механизма действия ряда канцерогенных ксенобиотиков -лигандов АЬ рецептора и индукторов цитохрома Р450, - относящихся к группе полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), хлорированных углеводородов и флавонов на функции клеток, нарушение которых, согласно современным представлениям, определяют опухоль-промоторное действие.

Согласно задачам исследования в работе запланировано: 1. Провести сравнительное изучение действия лигандов АЬ рецептора таких как канцерогенные ПАУ и их неканцерогенного аналога, хлорированного бифенила - ароклор 1254 и соединения из класса флавонов - бета нафтофлавона на пролиферативную активность и на изменения функционирования клеточных систем, связанных с пролиферацией, в культуре клеток, экспрессирующих и неэкспрессирующих ферменты метаболизма ксенобиотиков и АЬ-рецептор.

2. Исследовать влияние этих же веществ на функционирование одного из факторов противоапоптической защиты - транскрипционного фактора М^-кВ (ядерный транскрипционный комплекс кВ).

3. Выяснить, реализуется ли эффект ингибирования межклеточных щелевых контактов канцерогенными ПАУ в клетках трансформированных фибробластов крысы СЬ-1.

Научная новизна

Одним из важнейших результатов исследования является обнаружение ранее неизвестных науке фактов, связанных с эпигенетическим действием чужеродных веществ на функции клеток. Частным случаем такого действия является опухолевая промоция. До нашего исследования считалось, что канцерогены окружающей среды, в первую очередь наиболее распространенные из них - ПАУ - реализуют свой канцерогенный, токсический и другие эффекты или путем образования активных электрофильных метаболитов или благодаря активации АЪ рецептора (70). Используя уникальную клеточную модель - клетки гепатомы 27, в которой отсутствует экспрессия как АЪ. рецептора, так и система метаболизма ксенобиотиков, мы показали, что стимуляция пролиферации и активация транскрипционного фактора МБ-кВ может происходить независимо от экспрессии в клетке АЬ рецептора и системы метаболизма. Полученные в данном исследовании результаты впервые демонстрируют тот факт, что в клетках помимо известного акцептора канцерогенных ПАУ и флавонов - АЬ-рецептора - присутствует некий неизвестный ранее фактор, взаимодействие с которым приводит к эффектам, описанным в данном исследовании, и ассоциированные с промоторным действием. Сопоставляя эффекты лигандов АЬ рецептора в клетках, экспрессирующих и неэкспрессирующих АЬ рецептор, мы показали, что неизвестный фактор отличается по своим свойствам от АЬ рецептора, поскольку «классический» лиганд АЬ рецептора -хлорированный бифенил ароклор 1254 , в отличие от ПАУ, не влияял на

изучаемые фцункии клеток. Эти данные меняют общепринятое представление о том, что АЬ-рецептор является единственным компонентном клетки, взаимодействие с которым вызывает эпигенетические изменения, приводящие в конечном итоге к опухолевой промоции.

Таким образом, мы показали, что эффекты канцерогенных ПАУ, ассоциированные с промоторной стадией канцерогенеза, в культуре клеток реализуются по нескольким механизмам в зависимости от экспрессии АЬ-рецептора и изоформ цитохрома Р450 в клетках-мишенях

Теоретическая и практическая значимость

Принято считать, что химический канцерогенез включает в себя 3 стадии: инициация, промоция и прогрессия. Стадия инициации химического канцерогенеза для ПАУ достаточно хорошо изучена, в то же время однако в представлениях о стадии промоции, необходимой для дальнейшего выживания инициированной клетки, остается много невыясненных вопросов. Полученные нами данные позволяют ответить на некоторые из них. В частности, на основании полученных данных можно заключить, что в клетках помимо АЬ-рецептора существует некий фактор, по некоторым свойствам близкий к АЬ-рецептору, взаимодействие с которым некоторых лигандов АЬ-рецептора вызывает эффекты, связанные с промоцией. Полученные данные углубляют существующие представления о механизмах действия ПАУ, реализующихся на стадии опухолевой промоции. Выявление новых закономерностей в действии ПАУ является важным элементом в поисках надежных профилактических мер в предотвращении опухолевых заболеваний.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Механизмы химического канцерогенеза.

В ходе многочисленных экспериментальных исследований было выявлено, что химический канцерогенез включает несколько стадий. Так, в 50-60-х годах опыты по индукции опухолей с применением химических канцерогенов привели к созданию концепции инициации и промоции. На стадии инициации происходят наследуемые изменения в геноме клетки, предопределяющие опухолевый генотип образующегося клона. Стадия промоции по современным представлениям обусловлена негенотоксическим действием, создающим условия для избирательного роста инициированных клеток. Феномен промоции изучается, как правило, на модели двухстадийного канцерогенеза, при котором стадии инициации и промоции вызываются различными соединениями. Для «полных» канцерогенов (веществ, вызывающих опухоль без дополнительного воздействия) наличие стадии промоции подразумевается. Неизвестно, реализуется ли стадия промоции по такой же схеме, как и в двухстадийном канцерогенезе (т.е. по негенотоксическому механизму), в какой форме (исходной или метаболизированной) действует соединение, изменяется ли функционирование тех же регуляторных систем, которые изменяются на модели двух стадийного канцерогенеза. Далее следует стадия прогрессии, которая заключает в себе процесс возникновения и отбора новых клонов опухолевых клеток. Наблюдается автономизация роста опухоли и возникновение ее метастатической активности (139). Таким образом, первые две стадии канцерогенеза требуют воздействия химических канцерогенов для возникновения опухоли, а стадия прогрессии является результатом нестабильности генома (144,140,142).

2.0бщая характеристика химических канцерогенов окружающей среды

Канцерогенные вещества принято делить на генотоксичные и негенотоксичные. Генотоксичные соединения представлены канцерогенами прямого действия и соединениями, чей канцерогенный потенциал проявляется только после их активации в клетке в результате взаимодействия с определенными ферментами. Действие данных типов канцерогенов обусловлено образованием высоко активных электрофильных производных, взаимодействующих с отрицательно заряженными группами молекул, в том числе и с ДНК, образуя стабильную ковалентную связь. При репликации нуклеотид, связанный с остатком канцерогена, может быть неправильно считан ДНК-полимеразой, что приводит к мутации. Канцерогены прямого действия при растворении в воде образуют электрофильные производные. Таким образом, генотоксичные канцерогены по механизму действия на клетку можно отнести к инициаторам. Инициаторы вызывают необратимые изменения в геноме клетки для чего достаточно их краткосрочного применения.

Негенотоксичные канцерогены или промоторы представляют собой большую группу химических соединений неспособных ковалентно связываться с ДНК. В некоторых случаях промоторы способны вызывать опухоли и без предварительного действия инициатора, что можно объяснить образованием спонтанно инициированных клеток.

Считается, что необходимым свойством промоторов является способность стимулировать пролиферацию, нарушать межклеточные щелевые контакты, ингибировать апоптоз (144). Таким образом, эпигенетические механизмы, действующие на стадии промоции, после предшествующей мутации приводят к развитию опухоли.

3. Химические канцерогены

Химические канцерогены являются широко распространенными соединениями. Они входят в состав табачного дыма, присутствуют в продуктах питания и атмосферном воздухе.

Основными канцерогенными загрязнителями окружающей среды являются ПАУ (144,140,142), образующиеся при работе двигателей внутреннего сгорания, при курении, их обнаруживают в продуктах питания, подвергнутых различного типа термической обработки. Ввиду своей химической инертности они накапливаются, и сохраняться в среде обитания. Для выведения из организма ПАУ подвергаются ферментативному окислению монооксигеназной ферментной системой. В результате окисления образуются промежуточные высокоактивные метаболиты. Показано, что подобные метаболиты, в частности диолэпоксиды, являются агентами, инициирующими опухоль. В то же время механизм реализации стадии промоции остается неизвестным.

Нитрозосоединения широко распространены в окружающей среде. Их находят в пище, напитках, косметических средствах, табачном дыме, и на некоторых производствах. Доказана способность "табачных нитрозосоединений" вызывать опухоли у человека. Так, канцерогенные химические соединения КЫК NNN5 являющиеся потенциальными канцерогенами легких, образуются в процессе превращения никотина и обладают генотоксическим эффектом (97,43).

Ароматические амины способны вызывать опухоли печени (70,71), мочевого пузыря. Способность ароматических аминов вызывать рак мочевого пузыря у людей была выявлена у рабочих занятых в производстве красителей. Рак мочевого пузыря у людей способны вызывать следующие ароматические амины: 2-нафтиламин, бензидин, 4-аминобифенил. Возможно, последнее соединение обуславливает повышенный риск возникновения рака мочевого пузыря у курильщиков, так как обнаруживается в табачном дыме.

Афлатоксины являются продуктами жизнедеятельности гриба Aspergillus flavus, растущего на земляных орехах и злаках. Наиболее канцерогенным и мутагенным из природных афлотоксинов является афлотоксин Вь который в сочетании с вирусом гепатита В ответственен за возникновением рака печени (43,41).

3.1. Полициклические ароматические углеводороды (ПАУ)

Степень канцерогенного действия ПАУ зависит от числа ароматических колец в молекуле и их взаимного расположения. Наибольшим канцерогенным потенциалом обладают вещества, имеющие 4-7 бензольных конденсированных колец, а так же метальную группу в структуре.

Исследования по изучению канцерогенного действия ПАУ начались в 1920-е годы. Опухоли (саркомы) вызывали подкожным или внутримышечным введением веществ (12,107). К числу экспериментальных опухолей, вызываемых ПАУ относятся гепатоцеллюлярные карциномы, рак легких (11) и молочной железы (13,116), рак желудка.

Механизм действия ПАУ на стадии инициации изучен достаточно хорошо. Считается, что исходно биологически инертная молекула ПАУ в результате метаболизма на цитохроме Р450 в монооксигеназной ферментной системе, образует эпоксиды, способные взаимодействовать с молекулой ДНК(144,140,142,65). Большое значение имеет положение в молекуле канцерогенного ПАУ, где происходит присоединение кислорода с образованием эпоксида. Так например для бензо\а\пирена «конечным» канцерогном является 7,8,дигидродиокси-9,10-эпоксибензо\а\пирен (144), хотя образуются эпоксиды и по другим положениям молекулы, но они не вызывают инициацию.

Помимо образования химически активных метаболитов ПАУ, у этого класса канцерогенов выявлен еще один эффект, обусловленный

взаимодействием неметаболизированной молекулы вещества с цитоплазматическим АЬ-рецептором. Активированный взаимодействием с ПАУ АЬ-рецептор транспортируется в ядро, где функционирует как транскрипционный фактор, вызывая активацию генов, кодирующие ферменты метаболизма ксенобиотиков.

4. Механизм активации непрямых канцерогенов.

4.1. Роль цитохрома Р450

В ходе эволюции в организме человека сформировались ферментные системы, препятствующие накоплению химически инертных липофильных чужеродных веществ (ксенобиотиков) в клетках. Одной из таких систем является монооксигеназная ферментная система, расположенная в эндоплазматическом ретикулуме (микросомальная фракция) и в небольшом количестве присутствующая в митохондриях. Функция монооксигеназной ферментной системы заключается в окислении липофильных соединений с образованием водорастворимого метаболита с последующим его выведением из организма (132,143). Основным каталитическим звеном монооксигеназной ферментной системы является цитохром Р450, который катализирует включение атома кислорода в структуру липофильного соединения с образованием соответствующего оксипроизводного. При окислении канцерогенов результатом такой реакции является образование более токсичного соединения, нежели чем исходное (144,140). В организме животных имеется большое разнообразие изоформ цитохрома Р450 с различными механизмами регуляции экспрессии, являющиеся продуктами различных генов и обладающие различной субстратной специфичностью. Изоформы цитохрома Р450 разделяют на две категории. Изоформы, требующиеся для синтеза стероидных гормонов, и изоформы, необходимые для выведения чужеродных липофильных веществ из организма. Последние экспрессируются органами наиболее подверженных воздействию

ксенобиотиков. В первую очередь к таким органам относится печень, почки, легкие и кожа. Увеличение уровня мРНК и белка цитохрома Р450 в ответ на введение соответствующего ксенобиотика называется индукцией. В зависимости от механизма индукции изоформы цитохрома Р450, участвующие в метаболизме ксенобиотиков, можно разделить на 3 семейства. Семейство 1 включает изоформы 1А1, 1А2 и 1В1, индукцию которых вызывают ПАУ, хлорированные бифенилы и диоксины и флавоны. Наиболее эффективным индуктором семейства 1 является 2,3,7,8-тетрахлородибензодиоксин (ТХДД). ТХДД обладает сильным промоторным действием и является гепатоканцерогеном у животных (126). Изоформы 2В1, 2В2, 2С6 и ЗА индуцируются фенобарбитал-подобными соединениями, ДДТ; изоформы семейсва 4А - пролифераторами пероксисом, которые также относятся к группе опухолевых промоторов (140)

4.2. Роль Ah-рецептора в регуляции метаболизма ксенобиотиков.

При попадании ксенобиотика в клетку он взаимодействует с цитоплазматическим белком - Ah-рецептором, образуя стабильный комплекс. Ah-рецептор в цитоплазме находится в комплексе с рядом белков-шаперонов, удерживающих его в неактивном состоянии: белком теплового шока 90, определяющим его цитоплазматическую локализацию и доступность лиганда к взаимодействию с рецептором, белком семейства иммунофилинов - ХАР2, защищающим белковый комплекс от убиквинтирования и белком р23. (рис. 1) Образование комплекса Ah-рецептор-лиганд вызывает отщепление белков-шаперонов, с последующим фосфорилированием Ah-рецептора протеинкиназой С и транспортировкой в ядро, где происходит взаимодействие двойного комплекса с белком ARNT (94). Образовавшийся комплекс Ah-R-ARNT-лиганд является транскрипционным фактором, взаимодействующим с нукклеотидной последовательностью CACGTG, называемой XRE.(Xenobiotic Responsible

Element) Далее, гены, имеющиеся в промоторной части XRE, экспрессируются (2, 125).

цитоплазма

<ч Лиганд(ТХДД))

< Ah-рецептор .

р23) ( Hsp90 ;

( Hsp90 )

Лиганд(ТХДД)) Ah-рецептор )

ядро

Фосфорилирование

Ah-рецептора Протеинкиназой С

( +ARNT

(Лиганд(ТХДЦ)) ( Ah-рецептор; ( ARNT .)

XRE.(Xenobiotic Responsible Element) Экспрессия цитохрома Р4501 и др. белков, таких как ферменты 2 фазы метаболизма ксенобиотиков (глутатион-э-трансфераза и др.)

Рис.1 Механизм индукции Ah-рецептор-зависимых белков. (Подробности в

тексте)

5. Промоция канцерогенеза.

5.1 Лиганды АИ-рецептора

Общим свойством индукторов различных изоформ цитохрома Р450 является их способность выступать в роли промоторов канцерогенеза (144).

В культуре клеток маркерами промоции являются стимуляция пролиферации, ингибирование МЩК и предотвращение апоптоза.

Предполагается, что индукторы цитохрома Р450 могут реализовывать промоторную стадию двумя способами. Первый - это события в клетке, происходящие до синтеза изоформ цитохрома Р450. Они обусловлены изменениями в клеточном гомеостазе, вызванными взаимодействием индуктора с рецептором. Второй - это функционирование цитохрома Р450 (140).

Исследования последнего десятилетия показали, что роль АЬ рецептора в организме не ограничивается только транскрипционными функциями, связанными с экспрессией генов метаболизма ксенобиотиков. Нокаут мышей по АЬ-рецептору приводит к нарушению функционирования иммунной системы, уменьшению размеров печени, за счет уменьшения размеров гепатоцитов и нарушению других функций организма (120). Гиперэкспрессия АЪ-рецептора вызывает развитие опухоли желудка и укорачиванию срока жизни животных (68). Эти данные свидетельствуют о важной роли АЬ рецептора в жизнедеятельности организма. Мыши, нокаутированные по АЬ рецептору, устойчивы к канцерогенному действию индукторов цитохрома Р450 типа ТХДД (120,68). 5.2 Пролиферация

Важным фактором промоции является стимуляция пролиферации под действием промоторного агента. Данные по пролиферативному действию лигандов АЬ рецептора неоднозначны. На клетках гепатомы 5Ь показано, что ТХДД ингибирует пролиферацию (25,26). На модели эпителиальных

клеток печени показано, что |3-нафтофлавон стимулирует клеточную пролиферацию по Ah рецептор - зависимому пути (130).

На примере лигандов Ah-рецептора, митогенный эффект этих веществ может быть реализован в результате их взаимодействия с рецептором. Такое взаимодействие ведет к активации фосфокиназ, участвующих в передаче митотического сигнала (140).

Эксперименты на мышах, содержащих нормальный и дефектный Ah-рецептор показали, что токсическое воздействие и промоторный эффект (ингибирование апоптоза, стимуляция пролиферации) ТХДД, индуктора изоформ цитохрома Р450 семейства 1 происходит через Ah-рецептор (127,15,10). В то же время на другой клеточной модели (гепатома 5L) показано, что ТХДД ингибирует рост клеток благодаря взаимодействию Ah-рецептора с белком ретинобластомы (31). БП вызывал остановку клеточного роста фибробластов ЗТЗ. Антагонист Ah-рецептора а-НФ предотвращал эффект БП на клеточную пролиферацию (119). Бенз/а/антрацен и бензофлуорантен вызывали увеличение числа клеток в культуре гепатомы WB-F344 и процент клеток в S-фазе клеточного цикла, что сопровождалось увеличением экспрессии циклина А и усилением активности комплекса циклинА/сс1к2. Данные эффекты отсутствовали в клетках с мутантным Ah-рецептором. БП индуцировал апоптоз и снижал общее число клеток и значительно увеличивал число клеток в S-фазе клеточного цикла, усиливал активность комплекса циклинА/сс1к2 и снижал уровень белка р27. В клетках с инактивированным Ah-рецептором не наблюдалось индукции циклина А (4). В клетках MCF-7 ТХДД ингибирует пролиферацию клеток, а БП и бенз/а/антрацен стимулируют пролиферацию, ускоряя переход из фазы G1 в фазу S (84). In vivo после гепатоэкстомии ТХДД ингибирует пролиферацию клеток печени (67). В клетках мышцы аорты БП стимулирует переход клеток из G0 в G1, не влияя на другие фазы клеточного цикла (122). Таким образом можно заключить, что стимулирующий или ингибирующий эффект лигандов Ah

рецептора на пролиферацию зависит как от типа клеток, на которое направлено действие веществ, так и от конкретного действующего соединения.

5.3 Структура и функция АР-1

Транскрипционный фактор АР-1 представляют собой группу струкурно и функционально связанных членов семейства белка 1ип и белка Роб. Активация АР-1 осуществляется рядом физиологических и патологических воздействий, включая инфекционные и онкогенные стимулы. АР-1 контролирует клеточный цикл, благодаря способности влиять на экспрессию и функцию таких регуляторов клеточного цикла как циклины Б, А, Е, белки р53, р21, р16, р19. Ы I и соавт. установили, что в эпидермальных клетках мыши С141 после введения различных ПАУ, включая БП, БП-диолэпоксид, хризен-1,2-диол-3,4-эпоксид и 5-МЦДЭ происходила активация АР-1(58). Введение агониста АЬ-рецептора ТХДД гвинейским свинкам вызывало активацию АР-1 в гепатоцитах (6). РатвИ и

■ч

соавт. показали активацию АР-1 в срезах печени в результате действия БП (80). ТХДД вызывал индукцию генов «быстрого ответа» с-Аэб, ^п-В, с-]ип, апс1 ]ип-0 и увеличивал активность АР-1 транскрипционного фактора в клетках гепатомы мыши (86). Таким образом можно заключить, что лиганды АЬ рецепторы на исследованных моделях активируют АР-1.

5.4 Структура и функция ОТ-кВ.

Транскрипционный фактор М^-кВ представляет собой небольшое сообщество тесно связанных белковых димеров. Последовательности ДНК с которыми они связываются известны как кВ-сайт. Семейство белков (КЕЬу №-кВделится на два класса, в зависимости от типа синтеза и трансактивационной способности. Первый класс состоит из Б1ЕЬА (р65), ЯЕЬВ, с-ЯЕЬ, которые синтезируются уже в готовом виде. Эти белки

содержат аминотерминальный гомологичный домен (RHD), отвечающий за димеризацию и связывание с ДНК, и домен модулирующий транскрипцию, находящейся на С-конце. Второй класс включает NF-kBl и NF-kB2 белки, которые синтезируются в виде больших предшественников (р105 и рЮО) с аминотерминальным RHD доменом и ANK (ankyrin repeats) последовательностью на С-конце. Убиквитин-зависимый потеолиз удаляет этот С-терминальный домен, в результате чего образуется белок (р50 или р52) готовый к связыванию с ДНК. В итоге, конечный продукт содержит RHD домен. RHD домен содержит сигнал ядерной локализации (NLS), узнаваемый белками группы IkB, связывание которых с RHD нарушает функционирование NLS. Таким образом IkB является белком, поддерживающим NF-кВ в неактивном состоянии. IkB белки включают три изоформы IkBa, IkBf3, IkBs, которые связывают белки NF-кВ в цтолазме, и BCL3, который действует как транскрипционный коактиватор для гомодимеров р50 и р52. Все IkB содержат 6-7 последовательностей, которые опосредуют их связывание с RHD. IkBa IkB{3 IkBs содержат аминотерминальный регуляторный домен, внутри которого имеются два консервативных участка (SS). Фосфорилирование по этим сайтам вызывает убиквинтин зависимую деградацию IkB. Для активации NF-кВ необходимой стадией является удаление IkB.

Существует два главных пути активации NF-kB. Первый путь активации NF-kB, в котором участвуют димеры формирующие RELA, с-REL и р50. Канонический путь активации в норме запускается в ответ на микробную или вирусную инфекции и воздействие провоспалительных цитокинов, которые приводят к активации IkB киназного комплекса(1КК). IKK фосфорилирует комплекс NF-kB-IkB по двум остаткам, находящихся в пределах N-терминального регуляторного домена IkB, что приводит к убиквитин-зависимой деградации IkB, в результате чего образовавшиеся димеры NF-кВ транслоцируются в ядро. За фосфорилирование IkB ответственна каталитическая субъединица IKK комплекса 1КК(3. Во

втором пути активации принимает участие NF-kB2, который димеризуется предпочтительно с RELB. Этот путь запускается некоторыми членами семейства цитокинов TNFa, которые вызывают активацию протеинкиназы NIK, а та, в свою очередь, активирует каталитическую субъеденицу IKKa. Вместе IKK и NIK идуцируют зависимое от фосфорилирования протеолитическое удаление IkB. Это позволяет димерам транслоцироваться в ядро (28). IkB транскрибируется NF-kB, образуя регуляторную петлю.

Гены-мишени NF-кВ делятся на четыре функционыльные категории: иммунорегуляторные и воспалительные гены, антиапоптотические гены, гены, стимулирующие клеточную пролиферфцию, и гены, негативно регулирующие активность NF-кВ к которым относятся белки семейства IkB.

NF-кВ является ингибитором программированной клеточной смерти, благодаря собственной активации при действии TNFa и других членов этого семейства (8, 23). Антиапоптотические факторы, которые индуцируются NF-kB, включают ингибиторы апоптоза (cIAP), блокирующие активность каспазы 8, и членов антиапоптического семейства BCL2 (такие как А1/ВЕ11 BCL-X). NF-кВ способен ослаблять апоптический ответ на генотоксические противоопухолевые препараты и ионизирующую радиацию. Опухолевые клетки, в которых обнаруживается конститутивная активация NF-кВ высоко резистентны к противоопухолевым препаратам и ионизирующей радиации, а при подавлении в них активности NF-кВ чувствительность их к лечению этими воздействиями возрастает (87). NF-кВ также помогает избежать апоптоз клеткам, в которых возникли различные типы повреждений ДНК. Это влечет за собой риск увеличения потомства трансформированных клеток, тогда как в норме такие клетки элеминируются из организма путем чекпойнт контроля, например активацией р53.

ЫБ-кВ контролирует клеточную пролиферацию, стимулируя активацию генов, кодирующих циклины семейства О, также ЫБ-кВ активирует гены интерлейкина-1, гранул оцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и лиганда СБ40, которые кодируют ростовые факторы стимулирующие пролиферацию миелоидной и лимфоидной ткани. Конститутивная продукция таких цитокинов может стимулировать хроническую клеточную пролиферацию в аутокринной или паракринной манере (38, 39).

Активация ЫБ-кВ, как ранее упоминалось, может происходить в результате действия активных форм кислорода. Не совсем понятно как это происходит. Однако, известно, что это непрямой процесс, так как непосредственное действие активных форм кислорода на очищенный М7-кВ не эффективно (22). Добавление к культуре миелоидных клеток человека КВМ-5 перекиси водорода приводит к активации Ж-кВ сильнее, чем это делает ЮТ-а. Было так же обнаружено, что Н202 вызывает фосфорилирование по тирозину 1кВ, которое требуется для убиквитирования 1кВ и активации №-кВ. Имеется ряд доказательств того, что тирозин киназа 8ус вовлечена в индуцированную Н202 активацию кВ. А именно: Н202 активирует 8ус в КВМ-5 клетках. Н202 не вызывает активации ЫБ-кВ в клетках с отсутствием экспрессии 8ус, гиперэкспрессия 8ус усиливает вызванную перекисью активацию ОТ-кВ, прекращение транскрипции 8ус подавляет индуцированную перекисью активацию кВ. Таким образом, данные результаты демонстрируют, что перекись водорода вызывает активацию №-кВ через деградацию 1кВ опосредованное активацией белка 8ус с последующим фосфорилированием по тирозину 1кВ. (113)

В культуре клеток со стабильной экспрессией каталазы, вызывающей деградацию перекиси водорода, активация ОТ-кВ в ответ на воздействие ТЫБ-а понижена. Ингибитор каталазы восстанавливал активацию КБ-кВ. Стабильная гиперэкспрессия цитоплазматической Си/7п-зависимой

супероксид дисмутазы, увеличивающей образование Н202, потенцирует активацию NF-kB (95).

Опухолевые промоторы также способны вызывать активацию NF-kB, что позволяет объяснить их стимулирующий эффект на пролиферацию опухолевых клеток и антиапоптотический эффект. Полихлорированные бифенилы, являющиеся загрязнителями окружающей среды и опухолевыми промоторами индуцируют экспрессию NF-kB и АР-1, и стимулируют пролиферацию гепатоцитов. Было обнаружено значительное возрастание связывающей активности NF-kB и АР-1 в ядерных экстрактах печени крыс, которым вводились высокие дозы таких полихлорированных бифенилов, как РСВ-77 и PCB-153. После применения РСВ-77 также отмечалось усиление пролиферации (109). ТХДД - агонист Ah-рецептора и опухолевый промотор вызывает гиперэкспрессию NF-kB и АР-1 в течение 72 часов в клетках гепатомы Нера-1. В клетках с37 с отсутствием цитохрома Р-450-1А1 и в клетках с37 с дефицитом Ah-рецептора такого эффекта не наблюдалось. Таким образом, ТХДД значительно увеличивает способность NF-kB связываться с ДНК, опосредованную взаимодействием с Ah-рецептором и функционированием цитохрома Р450 (85). Введение крысам промотора опухолей печени фенобарбитала повышало активность NF-kB вдвое уже после 3 дней и вчетверо после 10 дней примененения (59). БП и его «конечный» канцероген (+/-)-анти-бензо(а)пирен-7,8-диол-9,10-эпоксид (БПДЭ), а также «конечный» канцероген другого ПАУ - 5-метилхризен-1,2-диол-3,4-эпоксид (МХДЭ), исследовались на способность влиять на экспрессию NF-kB в клетках эпидермиса мыши С141, в которых экспрессируются цитохром Р450 и Ah-рецептор. Результаты исследования показали, что МХДЭ и БПДЭ были способны активировать NF-kB и АР-1, тогда как БП вызвал только незначительную активацию АР-1 и не влиял на активацию NF-kB. 5-МТДЭ и БПДЭ активировали фосфорилирование IkB, а БП не имел эффекта (79). Другие исследователи обнаружили, что воздействие на культуру эпидермальных клеток мыши JB6P частицами,

образующимися при сгорании дизельного топлива, вызывает активацию NF-kB. Авторы считают, что действующим фактором является смесь ПАУ - основной органический компонент, образующийся при сгорании топлива (60). Pei и соавт. показали, что БП индуцирует транскрипцию гена р53 через активацию NF-kB в клетках А549 и NIH ЗТЗ (82).

Ah-рецептор взаимодействует с субъединицей р65 транскрипционного фактора NF-kB. Данное взаимодействие не требует присутствия лиганда. Экспрессия Ah-рецептора в клетках Нера 1с1с7 подавляет связывание NF-кВ с ингибирующим протеином IkB, а добавление ТХДД усиливает данный эффект(110).

В другом исследовании была установлена способность активированного Ah-рецептора взаимодействовать с NF-kB и блокировать его функции (111). БП вызывал увеличение связывания NF-kB с ДНК в гладкомышечных клетках аорты крысы (128) и в клетках опухоли легких человека А549 (82).

Имеются результаты исследований по влиянию опухолевых промоторов другого класса - пролифераторов пероксисом на активацию NF-kB у крыс и сирийских хомячков. Так, Wy-14,643 увеличивал ДНК связывающую активность NF-kB во всех исследованных трех временных точках (6, 34, 90 дней) у крыс. Гемфиброзил и дибутил фталат увеличивали активацию NF-kB в меньшей степени и не во всех временных точках. Не было выявлено различий в уровне NF-kB у контрольных сирийских хомячков и тех, кому вводились прлифераторы пероксисом. (108)

Анализируя вышеизложенное, можно сделать вывод, что способность опухолевых промоторов к активации NF-kB объясняет их стимулирующее влияние на пролиферацию опухолевых и инициированных клеток, а также ингибирование апоптоза. Одним из механизмов действия опухолевых промоторов, являющиеся агонистами Ah-рецептора, связано с образованием активных форм кислорода, которые в свою очередь запускают экспрессию NF-kB. Помимо этого показано непосредственное

взаимодействие АЬ-рецептора с субъединицей р65 ИР-кВ, что может являться фактором тормозящим активацию ЫР-кВ.

5.5 Межклеточные щелевые коммуникации (МЩК) и их ингибирование в ходе опухолевой промоции.

Как ранее упоминалось, ингибирование межклеточных щелевых коммуникаций является одним из эффектов промоторов канцерогенеза (134), обеспечивающим клональную экспансию инициированных клеток.

Обмен информацией между нормальными клетками происходит за счет функционирования межклеточных щелевых контактов (136-138,144). Межклеточные щелевые контакты представляют собой кластеры мембранных каналов, называемые коннексонами, которые соединяют содержимое соседних клеток в тканях,. Коннексон состоит из шести трансмембранных белковых молекул, называемых коннексинами (3, 47). К настоящему времени известно до 14 различных коннексинов, которые имеют специфические последовательности, молекулярный вес и биохимические свойства (3). Каждый коннексин кодируется отдельным геном (3). Все коннексины состоят из четырех доменов, погруженных в цитоплазматическую мембрану, которые соединены двумя внеклеточными и одной внутриклеточной петлями и двух внутрицитоплазматических «хвостов». Таким образом, коннексин может быть представлен в форме буквы «\У» (45).

Опухолевый промотор фенобарбитал вызывал ингибирование МЩК гепатоцитов. Добавление к клеткам ингибитора цитохрома Р450 отменяло данный эффект. Двойное иммуноокрашивание печени крыс, которым вводился фенобарбитал, показало,. что уменьшается окрашивание коннексина 32 и усиливается окрашивание цитохрома Р450 (73).

Клетки, как правило, экспрессируют более чем один тип коннексинов. Разные изоформы коннексинов могут быть ассоциированы

друг с другом в большом числе комбинаций. От этого существенно зависит такое свойство щелевых контактов, как проницаемость. Теоретически, канал щелевого контакта между двумя клетками может состоять из двух идентичных коннексонов, содержащих один тип коннексина (гомотипичный щелевой контакт), или из различных коннексонов, сформированных разными типами коннексинов или с разной стоихиометрией каждой половины пары клеток (гетеротипичный щелевой контакт). Потенциальная несовместимость между некоторыми парами коннексонов обеспечивает формирование коммуникационного барьера между группами клеток (47). Селективная ассоциация коннексинов может объяснить разнообразие генов щелевых контактов и причину распределения некоторых коннексинов между специфичными клеточными типами (47).

Некоторые исследуемые модели показывают, что не все коннексоны образуют пары друг с другом, а только те, где коннексины высоко гомологичны друг другу, особенно в области экстрацеллюлярного домена (53, 4). Эти данные свидетельствуют о том, что второй внеклеточный домен важен для совместимости между коннексинами (1).

Существование гетеромерных коннексонов было подтверждено в ходе биохимического эксперимента, который показал, что коннексины 32 и 26 способны олигомеризоваться с образованием гетеромерного коннексона (14,44,103,104).

Щелевой контакт может заключать в себе кластер от нескольких до тысяч коннексонов. Область щелевых контактов, содержащая множество коннексонов, может быть организованна в трех различных формах. Так, площадка щелевых контактов может иметь следующий состав: смесь гомомерных и/или гетеромерных коннексонов (113,75); изолированные гомомерные коннексоны, находящиеся в отдельных областях внутри площадки щелевых контактов (102); гомомерные коннексоны которые представлены в виде отдельной площадки и, возможно, в различных

мембранных компартментах (27,50,102). Каждая из этих форм описана in vivo.

Межклеточные щелевые контакты являются динамическими структурами, которые могут подвергаться обратимым конформационным изменениям. Так, проницаемость коннексонов быстро, в течение секунд, обратимо снижается при падении цитоплазматического рН.(20)Высокий уровень ионов Са2+ внутри поврежденной клетки также вызывает закрытие коннексонов, эффективно изолируя клетку и предупреждая повреждения здорового окружения (115).

Как было установлено, имеется три уровня модуляции межклеточных щелевых контактов. Первый - это быстрый контроль, т.е. когда пора межклеточного щелевого канала мгновенно, в миллисекунды, закрывается в результате изменения аллостерической конфигурации каждого коннексина или поворота коннексинов вокруг оси поры наподобие отверстия линз камеры (42). Далее следует промежуточный контроль, требующий минут или часов, когда пул коннексинов перераспределен между плазматической мембраной, где идет формирование коннексонов, и цитплазматическим депо поддерживающим запас коннексинов (42).Для некоторых коннексинов (Сх43) клеточная локализация обусловлена степенью их фосфорилирования. Опухолевые промоторы в клетках-мишенях разрушают межклеточные щелевые контакты, вызывая удаление некоторой части от общего количества коннексинов из плазматической мембраны в различные внутриклеточные компартменты (42). Так, внутрицитоплазматическая локализация коннексинов является частой иммуногистохимической находкой в различных опухолях. И, наконец, третий тип - длительный, который происходит на уровне синтеза мРНК коннексина. Вероятно, этот тип регуляции межклеточных щелевых контактов поврежден в некоторых опухолях (42).

Фосфорилирование коннексинов оказывает регулирующее влияние на межклеточные щелевые контакты на нескольких уровнях от экспрессии гена до деградации белка, включая трансляционную и посттрансляционную модификацию белка (т.е. фосфорилирование готовых каналов действует как запирающий механизм), сборку в плазматическую мембрану и удаление из нее (115,90). Соответственно некоторые коннексины имеют сайты для фосфорилирования протеин киназами. Эти сайты различаются между коннексинами и располагается чаще всего на С-конце. Таким образом, изменения межклеточных коммуникаций опосредованы фосфорилированием белка и как предполагается, контролируют различные физиологические тканевые и клеточные функции (50,54,90,100).

•у.

Через МЩК способны проходить ионы, например, такие как Са , вода, сАМР, инозитол фосфат, олигонуклеотиды, различные метаболиты. Исходя из этого, межклеточные щелевые контакты обеспечивают необходимую концентрацию важных мессенджеров внутри группы клеток (115). Другими словами, главной функцией межклеточных щелевых контактов является поддержание тканевого гомеостаза. Также существуют и другие функции, выполняемые щелевыми контактами то, как передача электрической волны в нервных клетках (57,77), или в некоторых тканях без кровяных сосудов через щелевые контакты осуществляется питание клеток. Щелевые контакты принимают участие в тканевом ответе на гормоны (55,69) , регулируют развитие эмбриона (36).

Считается, что межклеточные щелевые контакты способны влиять на клеточный рост и неопластический фенотип при помощи воздействия на клеточный цикл и факторы его регулирующие. Изменение внутриклеточной концентрации вторичных мессенджеров и других небольших сигнальных молекул, проходящих через щелевые контакты, являются критическими для прогрессии клеточного цикла. (81,124) ц-АМФ

- одна из потенциальных сигнальных молекул, регулирующих в 1-фазу клеточного цикла и способна проходить через щелевые контакты (115).

В большинстве клеток уровень ц-АМФ падает в поздней 01-фазе до начала 8-фазы. Если уровень ц-АМФ поддерживается добавлением к клеткам со стимулированным ростом ц-АМФ, то они останавливаются в вЬфазе клеточного цикла (81). Блок 01-фазы не до конца понятен, однако, это может происходить в результате возрастания р27к,р"1 и снижения циклина Б1, как результат влияния ц-АМФ. В подтверждении сказанного, было показано возрастание межклеточных коммуникаций в клетках карциномы легкого мыши Е9 после трансфекции коннексина 43 и в эпителиальных клетках печени крысы, обедненных коммуникациями и с высокой туморогенностью после трансдукции коннексина 32. В обоих случаях снижалась скорость роста клеток, и увеличивался процент клеток в в 1-фазе клеточного цикла и снижался процент клеток в Б-фазе. Этому сопутствовало приблизительно пятидесяти процентное снижение уровня циклина Б1 и двойное увеличение уровня р27Кф"1 в клетках (53, 40).

В ходе многочисленных экспериментов, замечена обратная связь между коммуникационной и ростовой способностью в опухолевых/трансформированных клеточных линиях, восстановление межклеточных щелевых контактов в опухолевых клетках после трансфекции гена коннексина подавляет их рост. Стимуляция пролиферации различными видами митогенов снижает уровень коннексонов. Механизмы, с помощью которых межклеточные щелевые контакты регулируют клеточную пролиферацию, до конца не ясны. Однако, трансфекция Сх43 в трансформированные эпителиальные клетки почки собаки не только восстановила межклеточные щелевые контакты, но и нормализовала их рост, уменьшила онкогенность и снизила уровень пролиферации связанный с удвоением продолжительности и 8 фаз клеточного цикла. Этот эффект, индуцированный Сх-43, сопровождался снижением экспрессии специфических генов, стимулирующих

продвижение клетки по клеточному циклу, таких как циклины А, Б1, Б2, и циклин-зависимых киназ СБК 5 и 6 (40) .

В то же время, стимуляция пролиферации клетки приводит к снижению межклеточных щелевых коммуникаций эпителиальных клеток печени крыс в поздней в 1-фазе (46). Существуют также и предположения о том, что коннексоны вовлечены и в другой компонент системы контроля над ростом клеток, а именно апоптоз (114).

Данные, полученные в экспериментах т укго,свидетельствуют о том, что опухолевые клетки имеют обычно низкую способность к коммуникациям друг с другом и окружающими нормальными клетками (139). Такая селективная коммуникационная изоляция опухолевых клеток от нормальной окружающей ткани помогает им избегать сигналов, сдерживающих пролиферацию (57,64,66). Стимуляция деления нормальных клеток, вызванная различными факторами, такими как гепатоэктомия или добавление митогенов (например, некоторые ростовые факторы) к клеточной культуре приводит к снижению межклеточных коммуникаций. Таким образом, можно сделать предположение о сходстве между механизмами, действующими на стадии самоподдерживающегося нерегулируемого роста опухолевых клеток и теми которые определяют низкий уровень межклеточных контактов в ходе пролиферации нормальных клеток, обусловленных, к примеру, гепатоэктомией. На ранних стадиях канцерогенеза, когда спонтанный нерегулируемый рост еще не наблюдается, одной из главных функций опухолевых промоторов является защита трансформированных клеток от регуляторного воздействия организма путем нарушения межклеточных коммуникаций. Это дает потенциал для пролиферации до достижения стадии самоподдерживающего роста.

Добавление нормальных клеток в культуру опухолевых клеток подавляет их рост (63). Ингибиторы межклеточных коммуникаций ослабляют этот эффект, тогда как соединения увеличивающие

межклеточные контакты потенцируют подавляющий эффект нормальных клеток на рост опухолевых клеток (63).

Путем микроинъекций красителя in vivo было обнаружено, что межклеточные щелевые контакты нарушаются уже на ранних стадиях экспериментального канцерогенеза у крыс, как, например в пренеопластических фокусах печени. Считается, что пренепластические фокусы являются наиболее ранним морфологически определяемым предраком печени, в которых, как показали некоторые исследования, не обнаруживается экспрессии мРНК и белка коннексина 32. При помощи метода внутриклеточной инъекции флуоресцентного красителя люцифера желтого было показано, что некоторые пренеопластические фокусы не имели коммуникаций с окружающим их нормальными гепатоцитами (72, 49).

Отсутствие коммуникаций, определяемое на ранних стадиях формирования опухоли печени у крыс, сохраняется и на последующих этапах прогрессии опухоли. Так, иммуноокрашивание крысиной гепатоцеллюлярной карциномы антителами к коннксину 32 в большинстве случаев демонстрирует сильное его снижение (34,74,92). В тех опухолях, в которых коннексин 32 экспрессируется на достаточно высоком уровне, этот белок щелевых контактов локализуется не в мембране, а внутрицитоплазматически, что свидетельствует о его функциональной несостоятельности, как компонент коннексона (49, 77, 78).

Нарушения межклеточных щелевых контактов могут происходить в результате генетических изменений на стадии инициации канцерогенеза, так как генотоксические канцерогены вызывают мутации в генах коннексинов или на поздней стадии опухолевой прогрессии, в результате накопления вторичных генетических повреждений Мутационная дисактивация генов коннексинов, может происходить как в регуляторном, так и в кодирующем регионе. Некоторые проведенные исследования подтверждают это (47). В гепатокарциноме крыс, вызванной

генотокическим канцерогеном 1Ч-этил-1Ч-гидроксиэтилнитрозамином, была обнаружена мнсенс мутация гена коннексина 32 в кодоне 220 с заменой аргинина на гистидин (77, 78). Некоторые опухоли печени у крыс, в которых коннексин 32 по данным иммуногистохимии локализован в цитоплазме, также демонстрируют нарушение электрофоретической подвижности белков коннексинов 32, что подтверждает возможность изменения их первичной структуры или посттрансляционной модификации (52). Обнаружение стабильного снижения экспрессии коннексина 32 в опухолях печени крыс, подтверждают высокую вероятность генетических повреждений в регуляторном регионе этих генов (34,21).

Мутации генов коннексинов в опухолях встречаются достаточно редко, эпигенетические механизмы повреждения межклеточных щелевых контактов в ходе канцерогенеза играют, несомненно, важную роль в развитии и прогрессии опухоли. Это подтверждает выявленное в ходе исследований in vitro обратимое ингибиование межклеточных щелевых контактов опухолевыми промоторами. Таким образом, негенотоксичные канцерогенные соединения при повторяющемся воздействии способны вызывать продолжительное ингибирование межклеточных щелевых контактов, в результате чего прекращается циркуляция в ткани сигналов контролирующих клеточную пролиферацию и стимулируется рост инициированных клеток и развитие опухоли. Как это было показано, посредством прямого измерения функции межклеточных щелевых контактов в печени крыс, хроническое введение различных гепатопромоторов ингибировало конексоны в этом органе (107,47). Иммуноокрашивание с антителами к коннексину 32 показало, что опухолевые промоторы вызывали нарушение межклеточных щелевых контактов в печени крыс, с сопутствующим удалением белков коннексинов 32 из латеральной мембраны гепатоцитов и накоплением их внутри цитоплазмы (47) . Так, Ren Р, Ruch RJ продемонстрировали, что

опухолевый гепатопромотор, относящийся к группе барбитуратов, фенобарбитал в течение одного часа ингибирует щелевые контакты на 3090%, восстановление которых наблюдается после отмены промотора в течение 24 часов (89) . Длительное инкубирование гепатоцитов крысы (314 дней) с фенобарбиталом, амобарбиталом, барбиталом приводило к нарушению межклеточных щелевых контактов на 30-50%. Данное воздействии на щелевые контакты гепатоцитов сопровождалось отсутствием каких либо нарушений в экспрессии коннексина 32, что говорит о характерном для опухолевых промоторов эпигенетическом механизме действия (89). Длительные эксперименты показывают, что низкий уровень межклеточных коммуникаций, обусловленный действием фенобарбитала, спонтанно восстанавливается в течение суток до начального после отмены промотора (89). Возможно, что промоторный эффект барбитуратов обусловлен активацией цитохрома Р450.

Такие опухолевые промоторы, как Aroclor 1260, бензол пероксид, ДДТ, ТРА и фенобарбитал исследовались на способность влиять на МЩК. Для эксперимента была использованы трансформированные клетки эпидермиса мыши ЗРС, которые были получены из кераноцитов, подвергшихся воздействию ДМБА in vitro и в которых отсутствовала экспрессия цитохрома Р450. Aroclor 1260, бензол пероксид, ДДТ, ТРА продемонстрировали способность ингибировать МЩК в клетках ЗРС, а фенобарбитал не вызвал ингибирования МЩК в клетках ЗРС. В то же время, в клетках HepG2, в которых экспрессируется цитохром Р450 фенобарбитал ингибировал МЩК (33).

Полихлорированные бифенилы структурно различная группа загрязнителей окружающей среды являются эффективными промоторами на модели двухстадийного канцерогенеза. Как показал Machala М, полихлорированный бифенил 153 ингибировал щелевые контакты в линии эпителиальных клеток печени крысы с характеристиками плюрипотентных

овальных клеток в течение 48 часов, и при этом активировались митоген-активируемые протеин киназы ЕШС1/2 (61).

ТХДД достоверно не нарушал межклеточные щелевые контакты в культуре гепатоцитов крысы. Незначительное ингибирование МЩК

о лу

наблюдалось в течение 4 часов в дозе 1 1(Г 10'" и продолжалось в течение 48 часов. Ингибирование сочетается со снижением мРНК коннексина 32, однако не влияет на уровень мРНК коннексина 26. Инкубирование клеток с ТХДД и а-нафтофлавоном (ингибитор АЪ-рецептора) отменяло эффект ТХДД на МЩК. Таким образом, ингибирующий эффект ТХДД на МЩК связан с А11-рецептором, а так же с типом коннексина экспрессируемого в клетке (7).

Яеп и соавт. установили, что опухолевые промоторы группы форболовых эфиров эффективнее ингибируют МЩК, образуемые коннексином 43, по сравнениюс МЩК образуемыми коннексином 32 (88).

ПАУ также оказывают ингибирующее влияние на МЩК. ирЬаш и соавт. показали структурную взаимосвязь между различными монометильными изоформами антрацена и ингибированием МЩК. Антрацен и 2-метилантрацен не влияли на МЩК, тогда как антрацен метилированный по 1 и 9 позициям обратимо ингибировал МЩК. Таким образом, монометильный изомер антрацена, обладающий "бэй" регионом, способен нарушать МЩК, в то время как, антрацен и его монометильный изомер без "бэй" региона не оказывают подобного эффекта (118). \Vase и соавт. также показали, что ПАУ с "бэй" регионом и с "бэй" регионом, образованным включением метальной группы, являются более эффективными ингибиторами МЩК, чем без "бэй" региона ПАУ (123).

Трехчленные ПАУ, содержащие "бэй" регион, образованный метальной группой или хлором и ПАУ оказывают более сильный ингибирующий эффект на МЩК в клетках WB-F344 по сравнению с ПАУ из 2-х 4-х, 5-ти колец или трехчленных без "бэй" региона(9).

Таким образом, ингибирование МЩК зависит от структуры используемого ПАУ и от типа клеток.

Повреждения межклеточных щелевых контактов являются важным этиологическим фактором в формировании опухоли. Следует подчеркнуть, что очевидно существование нескольких механизмов, в основном эпигенетических, ответственны за нарушения межклеточных щелевых контактов при развитии опухоли.

5.6 Апоптоз

Ингибирование апоптоза является третьим необходимым фактором в реализации опухолевой промоции. Наиболее широко используемой моделью по изучению этого феномена является так называемый байстандер (bystander англ.) эффект. Суть его заключается в передаче апоптотического сигнала от клеток с запущенным апоптозом соседним нормальным клеткам связь которых осуществляется через МЩК, сформированных из различных типов коннексинов. Sanson показал, что трансфекция в клетки С6 (показывают слабый байстандер эффект и имеют низкий уровень коннексинов) гена коннексина 43 вызывала индукцию стойкого байстандер эффекта. Игибирование щелевых контактов отменяло метаболическое взаимодействие между клетками (93). Tanaka проводили опыты по трансфекции гена коннексина 32 в клетки HeLa с отсутствием МЩК. Оказалось, что байстандер эффект возрастает в результате экспрессии коннексина 32 (106).

Некоторые исследователи предполагают, что молекулой передающей апоптотический сигнал через МЩК являются ионы кальция.

Имеются данные, свидетельствующие, что некоторые опухолевые промоторы способны ингибировать байстандер эффект. В клетках Сертоли мыши ди-(2этилгексил) фталат вызывал значительную дисактивацию МЩК наряду с ингибированием таких апоптотических изменений, вызваннх отсутствием сыворотки как, конденсация хроматина,

фрагментация ядра и инактивация поли(АДФ-рибозы)полимеразы. Также наблюдалось снижение фосфорилирования коннексина 43, что может частично объяснить механизм ингибирования МЩК повлекшее за собой блокаду апоптотического сигнала (37).

Davis и соавт. сообщили о том, что ТХДД ингибирует апоптоз, вызванный ЭФР (эпидермальный фактор роста), в эпителиальных клетках молочной железы MCF-10A благодаря своей способности аутокринным образом стимулировать продукцию ТФР (трансформирующий фактор роста) (19).

Группа других ученых установила, что ТХДД вызывает подавление апоптоза в гепатоцитах печени, который был вызван УФ-излучением, но не влиял на спонтанный апоптоз в культуре клеток, не подвергшихся действию УФ-излучения. Наряду с этим, имелось ослабление активации опухолевого супрессора белка р53, происходящее в результате УФ-излучения и его гиперфосфорилирование после воздействия ТХДД, которое опосредованно активацией Ah рецептора(96). Аналогичным действием на апоптоз, вызванный УФ-излучением или канцерогенным ароматическим амина 2-ацетиламинофлюореном, обладал и фенобарбитал(12,129). Полихлорированные бифенилы 28, 101 и 187 полностью ингибируют апоптоз вызванный УФ-излучением (12).

Пролифератор пероксисом нафенопин подавляет спонтанный апоптоз и апоптоз вызванный трансформирующим фактором роста ßlB гепатоцитах. Был показан ингибирующий эффект нафенопина на апоптоз вызванный веществами, повреждающими ДНК (этопозид и гидроксимочевина) (24).

Christensen J.G. и соавт. исследовали влияние фенобарбитала, нафенопина и ТХДД на апоптоз, вызванный блеомицином и трансформирующим фактором роста ß. Апоптоз вызванный блеомицином сопровождался снижением уровня антиапоптотических белков bcl-2, BCL-xl и увеличением уровня проапоптотических белков р53, bak, bax, а при

апоптозе вызванном трансформирующим фактором роста |3 наблюдалось снижение уровня белка BCL-xl и увеличение bak. Фенобарбитал и нафенопин ингибировали апоптоз, вызванный данными веществами. Также фенобарбитал нормализовал уровень белков bcl-2 Ьах и р53. ТХДД на апоптоз не влиял (18).

Промотор гепатоканцерогенеза пентохлорофенол нарушает МЩК в клетках печени крыс и ингибирует апоптоз, вызванный отсутствием сыворотки в эпителиальных клетках печени крыс с трансфекцией гена v-myc (91).

Solhaug и соавторы показали, что БаП и циклопентаны способны вызывать как про, так и анти апоптотические сигналы в клетках гепатомы мыши Hepalclc7. Так, исследуемые соединения вызывали образование активных форм каспазы-3 и фрагментацию ДНК в клетках. Воздействие данных веществ привело к снижению уровня анти-апоптотического Bcl-xl, тогда как на анти-апоптотический Вс1-2 не оказывал влияния. Удивительно, но уровень про-апоптотического Bad снижался, а уровень анти-апоптотических фосфо- Bad (Serl55) и фосфо- Bad (Serl 12) возрастал после воздействия БаП и ЦП-ПАУ. Добавление альфа-нафтофлавона, значительно снижающего образование активных метаболитов БаП не ингибировал стимуляцию образования фосфо- Bad (109) .Исходя из этого, правомочно предположить, что исходная молекула ПАУ действует в качестве промотора канцерогенеза, негативно регулирующая апоптоз.

6. Эффекты лигандов Ah-рецептора не связанные с Ah-рецептором

Принято считать, что негенотоксические эффекты канцерогенных ПАУ, такие как индукция ферментов и другие, обусловлены активацией Ah-рецептора. Для многих опухолевых промоторов (хлорированных диоксинов, нафтофлавонов, ПАУ) выявлен только один объект воздействия - Ah-рецептор. Однако анализ литературных данных

свидетельствует о том, что существуе феномен биологического эффекта лигандов Ah-рецептра в клетках, не зависимый от экспрессии Ah-рецептора. Показано, что ТХДД стимулировал МАР-киназный каскад в клетках независимо от АЬ-рецептора.(76) Анализ активации генов быстрого ответа, таких как fas и jun, при действии ТХДД показал, что активация происходит по нескольким механизмам и по крайне мере один из них не зависит от АЬ-рецептора(29). Активация MAP - киназ при действии ТХДД наблюдается в культуре клеток, в которых отсутствует Ah-рецептор(111).

Установлено, что в клетках гепатомы мышей Hepa 1с1с7 антиапоптическое действие БП не ингибируется а-нафтафлавоном -веществом, которое одновременно является и ингибитором метаболизма ПАУ, и антагонистом АЬ-рецептора( 101). Показано, что БП одинаково эффективно активировал МАР-киназный каскад в клетках нормальных мышей и в клетках, полученных из мышей нокаутированных по гену Ah-рецептора (105).

В макрофагах человека БП стимулировал экспрессию TNFa, которая не уменьшалась при действии антагонистов Ah-рецептора, из чего авторы делают вывод о том, что эффект не связан с активацией АЬ-рецептора(5 6) .В другой работе (32) показано, что канцерогенная активность ДМБА одинакова в мышах, имеющих Ah-рецептор и в мышах, нокаутированных по его гену. Все приведенные данные свидетельствуют о том, что некоторые эпегенетические эффекты ПАУ и других лигандов Ah-рецептора могут реализовываться независимо от Ah-рецептора. Из этого следует, что в клетках помимо известных путей, реализующих биологический эффект лигандов Ah-рецептора, существует по крайне мере еще один путь, обусловленный взаимодействием исходной неметаболизированной молекулы вещества с неизвестным компонентом клетки.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

БЕНЗО/а/ПИРЕН

БЕНЗО/е/ПИРЕН

СНЗ

СНЗ

СНЗ

СН2 _СН2

7,12-ДИМЕТИЛБЕНЗ/а/АНТРАЦЕН

3 -МЕТИЛХО JIАНТРЕН

Рис.2 Формулы ПАУ, используемые в работе

1. Культуры клеток

В работе использовали клетки гепатомы человека HepG2 и гепатомы Г27 крысы. Клетки HepG2 были получены из АТСС («American Type Culture Collection», США). Гепатома Г27 представляет собой низкодифференцированную перевиваемую опухоль, полученную

действием химического канцерогена на беспородных крыс. Для культивирования клетки Г27 получали из подкожной опухоли крысы с помощью следующей прроцедуры: гепатому стерильно удаляли, отделяли участок, свободный от некрозов, помещали его в охлажденный раствор смеси трипсина с версеном (1 : 1), выдерживали 24 ч при 4 °С, промывали раствором Хенкса и добавляли среду, представляющую смесь сред ДМЕМ и RPMI (1 : 1), содержавшую 10 % эмбриональной телячьей сыворотки (Flow, Австрия) и 100 мкг/мл гентамицина. Клеточную суспензию в количестве 70 ООО клеток высевали во флаконы Корреля. Через 24 ч проводили смену среды для удаления неприкрепившихся клеток. Далее клетки обоих типов культивировали в смеси сред ДМЕМ и RPMI (1 : 1), содержащей 10 % эмбриональной телячьей сыворотки («HyClone», UT, США). Для перевода клеток в состояние покоя их в течение 3 сут культивировали в среде с содержанием сыворотки 0.5 %.

Выбор данных клеточных культур объясняется отсутствием ферментов цитохрома Р450 и Ah-рецептора в клетках культуры гепатомы 27 в отличие от клеток культуры HepG2 (133). Это позволяет при сравнении действия ПАУ на клетки экспрессирующие и не экспрессирующие Ah-рецептор выявить его роль в реализации изучаемых эффектов и определить существование других возможных объектиов воздействия лигандов Ah-рецептора в клетках.

Для расширения исследования по изучения действия лигандов Ah-рецептора на пролиферацию и активацию транскрипционного фактора NF-кВ использовались трансформированные фибробласты (CL-1) и клетки рака шейки матки человека HeLa. Клетки CL-1 были любезно предоставлены Н.П. Щербаком.

2 Используемые в работе вещества

В качестве канцерогеных ПАУ использовали: БП, MX, ДМБА и неканцерогенный аналог БП - бензо/е/пирен (БеП) (рис.2). Все ПАУ

; РОССИЙСКАЯ I ГОСУДАРСТВЕННАЯ [ БИБЛИОТЕКА___

произведены фирмой Fluka (Австрия). Смесь хлорированных бифенилов -ароклор 1254 произведена фирмой "ОхЬого"(США). (3-нафтафлавон и а-нафтафлавон произведены фирмой Sigma (США). Для введения в клетки, соединения растворяли в ацетоне, далее ацетоновый раствор добавляли к раствору альбумина человека в культуральной среде (25 мг/мл) до конечной концентрации в альбуминовом растворе 500 мкг/мл; этот раствор добавляли непосредственно к испытуемым клеткам до конечной концентрации веществ 5 мкг/мл., а ароклор 1254 до конечной концентрации 1микромоль/литр. К контрольным клеткам добавлялся альбумин с ацетоном. Ингибиторы белка IKK - PS1145 и BMS335541, а также ТРА (1 ммоль) были любезно предоставлены А.В Гаспаряном.

3 Методика исследования клеточного цикла

Клетки гепатомы Г-27 рассеивались в количестве 100 тысяч на чашку в среде с 5% сыворотки, на следующие сутки после прикрепления и распластывания клеток на чашках клеткам менялась среда на бессывороточную. В бессывороточной среде клетки культивировались в течение 72 часов. Затем добавлялся БП в концентрации 5 мкг/мл на 48 часов, а к контрольным клеткам добавлялся альбумин. Клетки гепатомы HepG2 рассеивались на чашки в количестве 100 тысяч на чашку в среде с 5% сыворотки, на следующие сутки после прикрепления и распластывания клеток на чашках к клеткам добавлялся БП в концентрации 5 мкг/мл на 48 часов, а к контрольным клеткам добавлялся альбумин. Клетки гепатомы Г-27 и гепатомы HepG2 после инкубирования с БП снимались путем добавления раствора Версена в количестве 2 мл на чашку и инкубировались в течение 10 минут, далее Версен удалялся. Затем добавлялся раствор трипсина в количестве 1 мл на чашку, с которым клетки инкубировались в течение 1 минуты. После удалении раствора трипсина клетки инкубировались в С02 инкубаторе в течение 10 мин до полного открепления от подложки. Клетки переносились в центрифужные

пробирки. Полученная суспензия клеток осаждалась центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин. Осадок клеток фиксировали 70% этанолом в течение часа. Далее этанола отмывался раствором Хенкса и суспензия центрифугировалась при 1000 об/мин в течение 10 минут. К полученному осадку добавлялся 400 мкл буфера с пропидием иодидом в конечной концентрации 50 мкг/мл, и смесь тщательно пипетировалась.

Состав буфера:

-Цитрат натрия в конечной концентрации 0,1%

-NP40 в конечной концентрации 0,3%

-РНКазаА в конечной концентрации 100 мкг/мл с целью исключения окрашивания РНК.

-Пропидий иодид в конечной концентрации 50 мкг/мл (пропидий иодид связывается с ДНК пропорционально ее количеству и таким образом позволяет измерить количество ДНК в ядре)

-Вода в количестве необходимом для доведения веществ до конечной концентрации.

Далее после 20 минут инкубирования клеток в буфере, пробы исследовались на проточном цитофлуориметре по FL2. Обработка полученных результатов производилась на программе WinMDI 2.9.

4. Выделение РНК из культивируемых клеток.

Выделение РНК из культивируемых клеток человека проводилось по стандартной методике, с использованием реактива «TRI Reagent» фирмы «SIGMA»(Molecular research).

К клеткам добавляли 1 мл TRI Reagent'а, пипетировали и переносили в чистую пробирку Eppendorf фирмы Costar, объёмом 1,7 мл. TRI Reagent брали из расчёта 1 мл на 2-ИО х Ю6 клеток, но не менее 0,6 мл на пробу. Для культур клеток, растущих монослоем: клетки промывали раствором 1 х PBS. Далее монослой заливали 0,8-^1 мл TRI Reagent'a и пипетировали, смывая клетки данным реактивом в течении 3-5 минут под тягой. Далее

лизаты клеток переносили в микроцентрифужные пробирки. Для полной диссоциации комплексов нуклеиновых кислот и белков, лизаты клеток в TRI Reagent'e находятся 5 минут при комнатной температуре. К образцам добавляется по 200 мкл хлороформа на 1 мл TRI Reagent'а. Смесь интенсивно перемешивается около 15-25 секунд на вортексе. Далее образцы стоят в пробирках 2-15 минут при комнатной температуре. Центрифугируем получившуюся смесь при 12000 х g в течение 15 минут при 4°С. Центрифугирование разделит смесь TRI Reagent'а на 3 фазы: нижнюю красную органическую фазу (содержащую белок), интерфазу (содержащую ДНК) и верхнюю бесцветную водную фазу (содержащую RNA). Далее мы переносим водную фазу в чистую пробирку и добавляем равный объём изопропилового спирта и аккуратно перемешиваем, переворачивая пробирки в руках. Образцы стоят при +20°С, 5-10 минут. Центрифугируем при 12000 х g в течение 10 минут при 4°С. Выделенная РНК должна дать осадок на дне пробирки. Убедившись в наличии осадка, сливаем спирт. Осадок РНК промывается добавлением более 1 мл 70-75% этанола. Осадок в спирте встряхивается, центрифугируется при 7500 х g в течение 5 минут при 4°С. Осадок после хранения в спирте центрифугировался, спирт сливался и осадок подсушивался до полупрозрачного состояния. В этот момент добавляли воду в объёме 10-60 мл (в зависимости от размера осадка), за 2-5 минут осадок хорошо растворялся. Пипетировали для лучшего растворения тотальной РНК и хранили при -20°С. Как правило, сразу после растворения РНК, отбирали 2-5 мкл раствора РНК и измеряли оптическую плотность раствора РНК на спектрофотометре фирмы Nanodrop (Германия). Сразу после измерения оптической плотности, рассчитывали концентрацию исходного раствора РНК. Для определения качества РНК (отсутствия примесей ДНК или возможности деградации РНК) проводили гель-электрофорез РНК. Для электрофореза готовили стандартный К 1,2% гель на 0,5хТВЕ буфере, приготовленном по стандартному протоколу. В гель перед его заливкой

добавляли раствор этидиум бромида до конечной концентрации 0,4 микрограмма/мл геля. Так как РНК плохо связывает этидиум бромид, его также добавляли в пробы для нанесения на гель. По необходимости в пробы добавляли воду до равного объёма. Электрофорез проводили, используя по 2 мкг тотальной РНК, что более чем достаточно для визуализации РНК. Когда убеждались в качестве РНК и подтверждали примерно равные количества РНК в пробах, приступали к обратной транскрипции.

5. Обратная транскрипция и ПЦР

Для проведения реакции использовали 1 мкг тотальной РНК. Реакцию проводили при 37 °С в течение 1 ч, далее выдерживали 5 с при 94 °С для инактивации фермента. Полученную кДНК использовали для по-лимеразной цепной реакции (ПЦР). Во всех экспериментах проводили контрольную реакцию с использованием дистиллированной воды вместо РНК. ПЦР для всех изучаемых генов проводили по следующей схеме: денатурация при 94 °С в течение 40 с; отжиг праймеров (62 °С, Юс); синтез продукта (72 °С, 10 с); выдержка 2 мин после прохождения циклов при 72 °С. Число циклов варьировало от 22 до 32 в зависимости от изучаемого гена. В качестве контроля использовали РНК вместо кДНК. В RT-PCR использовали следующие ферменты: обратную транскриптазу, MuLV и Taq-SE (Fermentas, Латвия). Праймеры и гексануклеотиды были синтезированы фирмой Литех (Россия).

Праймеры для 1-кВ:

прямой 5'-ССА TGA AGA AAA GGC ACT GAC CAT GG-3' обратный 5'-GCC ATT АСА GGG CTC CTG AGC ATT G-3'. Для сравнения использовали гены домашнего хозяйства - ген ß-актина для клеток Г 27 крысы и ген глицеро-3-фосфо дегидрогеназы (GPDH) для клеток Hep G2 человека.

Для крысы: Праймеры к ß-актину:

прямой: 5'-TGC AGA AGG AGA TTA CTG CC -3' обратный 5'-GCA GCT CAG TAACAG TCC G-3' Праймеры к IkB:

прямой: 5'- CCA TGA AGA AAA GGC ACT GAC CAT GG -3' обратный 5'- GCC ATT АСА GGG CTC CTG AGC ATT G -3' Праймеры к Ah-рецептору: прямой: 5'-TCCATGTACCAGTGCCAGG-3'

обратный 5'-ATATCAGGAAGAGGGTGGGC-3'

Для человека: Праймеры к GPDH:

прямой 5'-ССС CTG GCC AAG GTC АТС CAT GAC AAC TTT-3' обратный 5'-GGC CAT GAG GTC CACCAC CCT GTT GCT GTA-3'. Праймеры к Ah-рецептору:

прямой 5'-ACTTAACGGATGAAATCCTGACG -3' обратный 5'-ТССATTCTCAAACTTGTTTAAAA -3' Праймеры к ARNT:

прямой 5'- CGGAACAAGATGACAGCCTAC-3' обратный 5' - AC AGAAAGCC ATCTGCTGCC -3'

Количество кДНК для амплификации специфических генов уравнивали по количеству мРНК ß-актина для гепатомы Г27 и по GAPDHjxm клеток Hep G2. Реакцию ОТ и реакции амплификации проводили на приборе «Терцик» (Россия). Продукты ОТ-ПЦР разделяли стандартным электрофоретическим методом при напряжении 150 В в 2%-ном агарозном геле, приготовленном на ТВЕ-буфере в течение 30 мин. Электрофореграммы денсиметрировали. При анализе гелей использовали программу Scion Image, версия 4.0.2.

6. Определение пролиферации

Пролиферацию клеток оценивали при помощи анализа с использованием флуоресцентного красителя CyQUANT NF Cell Proliferation Assay (Invitrogen, США), позволяющим определять содержание клеточной ДНК при связывании ее со специфическим флуоресцентным красителем. Анализ проводили в соответствии с инструкциями производителя.

Исследуемые клетки добавляли по 10000 в лунки 96-луночного планшета, содержащего клеточную среду (150мкл). Ввиду особенности эксперимента использовалась культуральная среда с содержанием сыворотки 10% или 0,5%. Для остановки пролиферации клетки со средой, содержащей 0,5% сыворотки, инкубировали при 37°С в С02 инкубаторе в течении 3-х суток. Для определения влияния исследуемых веществ на пролиферацию к клеткам добавляли: БП, Б(е)П, ДМБА, MX в концентрации 5 мкг/мл, БНФ, Арохлор 1254 в концентрации 1 микромоль,. Вещества добавлялись на 24 часа и 48 часов.

По прошествии инкубационного времени среду удаляли, и в каждую лунку добавляли 100 мкл CyQUANT® NF dye reagent в буфере для клеточного лизиса (IX HBSS buffer), содержащий зеленый флуоресцентный краситель CyQuant GR. Флуоресценция этого красителя резко увеличивается при связывании с клеточными нуклеиновыми кислотами, и уровень флуоресценции пропорционально количеству нуклеиновой кислоты, присутствующей в данном образце. Образцы инкубировали в течение 30-45 минут в отсутствии света при 37°С в С02 инкубаторе. Флуоресценцию Су QUANT-GR измеряли на флуоресцентном считывателе для микропланшетов Molecular Devices Fmax(Ä, возбуждения 485 нм, эмиссия 530 нм).

В дальнейшем все результаты обрабатывались в программе Microsoft Excel.

7. Трансфекция гена NF-кВ и определение активности репортерного гена.

Для определения транскрипционной активности гена NF-кВ клетки трансфецировали плазмидой, содержащей люциферазный репортерный ген под контролем респонсивного элемента NF-kB. Используемая в данной работе плазмида была любезно предоставлена A.B. Гаспаряном. Трансфекцию проводили в течении 24 ч при 37 °С в среде без сыворотки. В качестве трансфецирующего агента для клеток Г27 использовали Polifect (Qiagen, США), а для клеток HepG2 - Fugene 6 (Roche, Швейцария). Для контроля эффективности трансфекции клети так же трансфицировали плазмидой, содержащей ß-галактозидазу. Эксперименты проводили в течении 48 ч после трансфекции. Люциферазную активность измеряли согласно страндартному протоколу (Promega, USA) на

приборе Turner BioSystems 20/20 n luminometer (USA). Люциферазную активность рассчитывали из соотношения активностей люциферазы и ß-галактизидазы и выражали в отн. ед..

8.Трансфекция гена АР-1 и определение активности репортерного гена.

Для определения транскрипционной активности АР-1 клетки трансфецировали плазмидой, содержащей люциферазный репортерный ген под контролем респонсивного элемента АР-1. Используемая в данной работе плазмида была любезно предоставлена A.B. Гаспаряном. Трансфекцию проводили в течении 24 ч при 37 °С в среде без сыворотки. В опытах, в которых определялась транскрипционная активность АР-1 в присутствии сыворотки через 12 ч. после трансфекции среда заменялась на среду с сывороткой. В качестве трансфецирующего агента для клеток 27 использовали Polifect (Qiagen, США). Для контроля эффективности трансфекции клетки так же трансфицировали плазмидой, содержащей ß-

галактозидазу. Эксперименты проводили в течении 48 ч после трансфекции. Люциферазную активность измеряли согласно страндартному протоколу (Promega, USA) на приборе Turner BioSystems 20/20 n luminometer (USA). Люциферазную рассчитывали из соотношения активностей люциферазы и (3-галактизидазы и выражали в относительных единицах.

9.Трансфекция siRNA

Трансфекция клеток гепатомы Hep G2 проводилась с помощью

Lipofectamine 2000 (Invitrogen, США) согласно стандартному протоколу

Последовательности используемые в работе:

Scramble 5-GCGCGCUUUGUAGGAUUCGTT TTCGCGCGAAACAUCCUAAGC-5 5- CGAAUCCUACAAAGCGCGCTT

AhR 5-UACUUCCACCUCAGUUGGCTT TTAUGAAGGUGGAGUCAACCG-5 5- GCCAACUGAGGUGGAAGUATT

ARNT 5 -CCAUCUUACGCAUGGCAGUTT TTGGUAGAAUGCGUACCGUCA-5 5- ACUGCCAUGCGUAAGAUGG

10. Электрофорез и иммуноблоттинг

Клетки выращивали на 60 мм чашках с 10% сыворотки. ПАУ добавлялись на определенное количество часов, после чего клетки на стадии формирования 80-90% монослоя несколько раз промывались раствором Хенкса и переносились в пробирку. Затем клетки осаждались в течение 5 минут на 10000 об/мин при +4С. Супернатант тщательно отбирался. Клеточные лизаты готовили следующим способом. К клеткам добавлялся лизирующий буфер ProteoJET™ Mammalian Cell Lysis Reagent (Fermentas) и тщательно пипетировали, a затем оставляли на 30 минут во льду при +4С. Затем лизаты откручивали при 12000 об/мин при +4С. Белки супернатанта разделяли электрофоретически в 12,5% SDS-ПААГ геле и переносились на мембрану Immobilon-P (Millipore Corporation, Bedford,

США). Для иммуноблотинга использовались антитела к ERK1/2, которые были получены из Santa Cruz Biotechnology Inc., США, к фосфо-ЕЮСШ -из Cell Signaling Technology Inc, США, также в работе использовались антитела к Циклину Е (Cell Signaling Technology Inc, США). Инкубация с AT к ERK1/2 длилась 1,5 часа при комнатной температуре, а к фосфо -ERK1/2 -12 ч при 25 °С. Инкубация с AT к циклину Е длилась в течение 12 часов при комнатной температуре. В качестве вторичных для AT к ERK1/2 и фосфо-ЕЮСШ использовались кроличьи AT, коньюгированные с пероксидазой (GE Healthcare, Швеция) в буфере с молоком). Проявка специфического сигнала осуществлялась на пленке, с помощью системы ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Швеция).

Для оценки интенсивности иммуноблотинга использовали программу Scion Image (версия 4. 02) Scion corporation США.

П.Проницаемость щелевых контактов.

Проницаемость МЩК определяли методом внутриклеточных инъекций флуоресцентного красителя люцифера желтого СН (Sigma США) в одну из клеток монослоя с последующей регистрацией распространения его в соседние клетки. Флуоресценция регистрировалась при помощи флуоресцентного микроскопа Axiolab (Zeiss, Германия) с фазово-контрастным освещением и 40 водно- иммерсионным объективом и видео камерой CCTV (Panasonic, Япония), связанной с компьютером. Окрашивание клеток регистрировалось через 2 минуты после инъекции.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для того, чтобы исключить действие пролиферативных факторов, находящихся в сыворотке мы сравнивали эффект изучаемых соединений на функции клеток на двух системах: клеток, находящихся в состоянии пролиферации в присутствии 10% сыворотки в среде культивирования и клетки в состоянии покоя, которое достигалось культивированием клеток в среде с содержанием сыворотки 0,5% в течении 3-х суток

1.Гепатома 27

Клетки гепатомы 27, в отличие от других клеточных моделей, используемых в данной работе, не экспрессируют АЪ рецептор (рис. 3).

Нер02 Г-27

1 2

1 трек -$-актин

2 трек - АН-рецептор

Рис. 3 Экспрессия мРНК^-актина и АН- рецептора в клетках гепатомы 27 и Нер02

1.1 Определение пролиферации и исследование клеточного цикла

На рис. 4А приведены данные по пролиферативной активности клеток под действием ряда лигандов АЬ-рецептора в клетках гепатомы 27 при культивировании в стандартной 10% среде с сывороткой. Из рисунка видно, что все канцерогенные ПАУ и |3-НФ стимулируют пролиферацию примерно в одинаковой степени (на 2-ые сутки культивирования увеличение количества клеток составляет 1.2 - 1.5 раза). Неканцерогенный ПАУ - бензо/е/пирен (5мкг/мл) никак не влияет на скорость пролиферации, а хлорированный бифенил - ароклор 1254 ингибирует пролиферацию.

При культивировании клеток в течение 3-х суток в среде с низким содержанием сыворотки скорость роста контрольных клеток незначительно замедляется по сравнению с ростом клеток, культивируемых в присутствии сыворотки (рис.4Б). Стимуляция пролиферации, вызванная канцерогенными ПАУ и (3-НФ, более эффективна, чем в среде с 10% сывороткой, что видно из рис.4В Так на 2-ые сутки культивирования (3-НФ и ДМБА увеличивают количество клеток в 4.8 раза, а БП и МХ в 2.4 и 2.1 соответственно по сравнению с контролем. Бензо/е/пирен также как и при инкубации клеток в среде с сывороткой не влиял на пролиферативную активность, а ароклор 1254 угнетал пролиферацию (рис.4Б, 4В).

Исходя из того, что в отсутствии сыворотки стимуляция пролиферации значительно выше, чем в среде с сывороткой, можно предположить, что ростовые факторы, находящиеся в сыворотке, и изучаемые нами соединения, активируют один и тот же сигнальный путь. Известно, что ростовые факторы активируют ЕЮСШ-зависимый МАР-киназный путь, фосфорилируя Е11К1/2. Мы определяли изменение уровня активной фосфорилированной формы ЕШС1/2. В качестве маркерного соединения мы использовали основной загрязнитель окружающей среды -БП (рис.5)

А

160000

140000

§ 120000 ь

Заключение диссертации по теме «Онкология», Волков, Максим Сергеевич

выводы

1. Лиганды АЬ-рецептора - канцерогенные ПАУ и (3-НФ - стимулируют пролиферацию клеток по ЕШС1/2 зависимому пути в клетках гепатом, экспрессирующих и не экспрессирующих АЬ-рецептор.

2. Канцерогенные ПАУ и (3-НФ активируют ЫБ-кВ и стимулируют пролиферацию более эффективно в клетках, находящихся в состоянии покоя, независимо от экспрессии АЬ-рецептора.

3. Наличие в клетках экспрессии АЬ-рецептора ослабляет активацию ЫР-кВ при действии канцерогенных ПАУ.

4. Нахождение клеток в состоянии покоя (содержание сыворотки 0,5% в среде культивирования) уменьшает экспрессию мРНК АЬ-рецептора и не влияет на экспрессию мРНК АЕШТ в клетках гепатомы НерС2

5. Уменьшение экспрессии АЬ-рецептора увеличивает пролиферацию при действии ПАУ в клетках гепатомы НерС2

6. В исследованных клетках помимо АЬ-рецептора существует некий фактор взаимодействие с которым некоторых лигандов АЬ-рецептора вызывает эффекты, связанные с промоцией.

7. Нарушение МЩК и влияние на пролиферацию и на активность кВ при действии лигандов АЬ- рецептора происходят по независимым механизмам.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Волков, Максим Сергеевич, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Abe J., Takahashi M., Ishida M., Lee J.D., Berc B.C. C-src is require for oxidative stress-mediated activation of big mitogen-activated protein kinase 1./ Abe J. // J. Biol. Chem., 1997-№15: 272-c. 20389-20394.

2. Akintobi A.M., Villano C.M., White L.A. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) exposure of normal human dermal fibroblasts results in AhR-dependent and -independent changes in gene expression. /Akintobi A.M.// Toxicol. Appl. Pharmacol. 2007-№220-c. 9-17.

3. Alberts B., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., and Walter P., Study gap junctional intercellular communication disorders in hepatorarcinogenesis / Alberts B.//Molecular Biology of the Cell. 2002-№27-c.88-112.

4. Andrysik Z., Vondracek J., Machala M., Krcmar P., Svihalkova-Sindlerova L., Kranz A., Weiss C., Faust D., Kozubik A., Dietrich C. The aryl hydrocarbon receptor-dependent deregulation of cell cycle control induced by polycyclic aromatic hydrocarbons in rat liver epithelial cells./ Andrysik Z // Mutat. Res., 2007-№615-c.87-97.

5. Andrysik Z., Vondracek J., Machala M., Krcmar P., Svihalkova-Sindlerova L., Kranz A., Weiss C., Faust D., Kozubik A., Dietrich C. The aryl hydrocarbon receptor-dependent deregulation of cell cycle control induced by polycyclic aromatic hydrocarbons in rat liver epithelial cells. /Andrysik Z.// Mutat. Res., 2007-№615-c.87-97.

6. Ashida H., Nagy S., Matsumura F. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD)-induced changes in activities of nuclear protein kinases and phosphatases affecting DNA binding activity of c-Myc and AP-1 in the livers of guinea pigs. / Ashida H // Biochem. Pharmacol., 2000-№l:59-c. 741-751.

7. Baker T.K., Kwiatkowski A.P., Madhukar B.V., Klaunig J.E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by 2,3,7,885

tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in rat hepatocytes. /Baker T.K// Carcinogenesis, 1995-№ 16-C.2321 -2326.

8. Beg A.A., Baltimore D. An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death./ Beg A.A. // Science, 1996-№1: 274-c. 782-784.

9. Blaha L., Kapplova P., Yondracek J., Upham B., Machala M. Inhibition of gap-junctional intercellular communication by environmentally occurring polycyclic aromatic hydrocarbons. / Blaha L.// Toxicol. Sci.

2002-№65-c.43-51.

10. Bock K.W., Kohle C. Ah receptor- and TCDD-mediated liver tumor promotion: clonal selection and expansion of cells evading growth arrest and apoptosis. / Bock K.W.// Biochem. Pharmacol. 2005-№69-c.l403-1408.

11. Boffetta P., Jourenkova N., Gustavsson P. Cancer risk from occupational and environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons. / Boffetta P // Cancer Causes. Control., 1997-№8-c.444-472.

12. Bohnenberger S., Wagner B., Schmitz H.J., Schrenk D. Inhibition of apoptosis in rat hepatocytes treated with 'non-dioxin-like' polychlorinated biphenyls./ Bohnenberger S // Carcinogenesis. 2001- №22-c.l601-1606.

13. Burdick A.D., Davis J.W. 2nd, Liu K.J., Hudson L.G., Shi H., Monske M.L., Burchiel S.W. Benzo(a)pyrene quinones increase cell proliferation, generate reactive oxygen species, and transactivate the epidermal growth factor receptor in breast epithelial cells. / Burdick A.D.// Cancer Res.,

2003-№63-c.7825-7833.

14. Cascio M., Kumar N.M., Safarik R., Gilula N.B. Physical characterization of gap junction membrane connexons (hemi-channels) isolated from rat liver./ Cascio M.// J. Biol. Chem., 1995-№270-c.l8643-18648.

15. Chapham D., and Schiller C. Dose-related effects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in C57BL/6J and DBA/2J mice./ Chapham D.//Toxicol. Appl. Pharmacol., 1985-№78-c.l47-157.

16. Chen S.C., Pelletier D.B., Ao P., Boynton A.L. Boynton Connexin43 reverses the phenotype of transformed cells and alter their expression of cyclin/cyclin-depended kinases./ Chen S.C. // Cell Growth Differ., 1995-№6-c.681-690.

17. Chen W, Li Z, Bai L, Lin Y., NF-kappaB in lung cancer, a carcinogenesis mediator and a prevention and therapy target/ Chen W //Front Biosci. 201 l-№16-c.l 172-85

18. Christensen J.G., Gonzales A.J., Cattley R.C., Goldsworthy T.L. Regulation of apoptosis in mouse hepatocytes and alteration of apoptosis by nongenotoxic carcinogens. / Christensen J.G.// Cell Growth Differ.,

1998-№9-c.815-825.

19. Davis J., Lauer F., Burdick A., Hudson L., Burchiel S. Prevention of apoptosis by 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) in the MCF-10A cell line./ Davis J. // Cancer Res. 2001-№61-c.3314-3320.

20. Ek-Vitorin, J. F., Calero G., Morley G. E., Coombs W., Taffet S.M., and Delmar M. PH regulation of connexin43: molecular analysis of the gating particle. // Biophys J. 1996-№71-c. 1273-1284.

21. Fitzegarld D.J., Mesnil M., Oyamada M., Tsuda H., Ito N. and Yamasaki H. Changes in gap junction protein (connexin 32) gene expression during rat liver carcinogenesis. / Fitzegarld D.J. // J. Cell Biochem. 1989-№41-c.97-102.

22. Flohe L., Brigelius-Flohe R., Saliou C., Traber M.G., Packer L. Redox regulation of NF-kappa B activation. / Flohe L.// Free Radic. Biol. Med., 1997-№22-c.l 15-1126.

23. Gasparian A.V., Yao Y., Kowalezyk D., Lyakh L.A., Karseladze A., Slaga T And Budunova I.V. The role of IKK in constitutive activation of NF-kappaB transcription factor in prostate carcinoma cells./ Gasparian A.V. // J. Cell. Sci., 2002-№ l:115-c. 141-151.

24. Gill J.H., James N.H., Roberts R.A., Dive C. The non-genotoxic hepatocarcinogen nafenopin suppresses rodent hepatocyte apoptosis

induced by TGFbetal, DNA damage and Fas. / Gill J.H.// Carcinogenesis. 1998-№ 19-C.299-304.

25. Göttlicher M., Cikryt P., Wiebel F.J. Inhibition of growth by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin in 5L rat hepatoma cells is associated with the presence of Ah receptor. / Göttlicher M.// Carcinogenesis, 1990- №11-c.2205-2210.

26. Göttlicher M., Wiebel F.J. 2,3,7,8-Tetrachlorodibenzo-p-dioxin causes unbalanced growth in 5L rat hepatoma cells. / Göttlicher M.II Toxicol. Appl. Pharmacol., 1991 -№11 l-c.496-503.

27. Guerrier D., Rousset B.,and Munari- Silem Y. Gap junction and cell polarity: connexin32 and connrxin 43 expressed in polarized thyroid epithelial cells assemble into separate gap junctions, which are located in distinct regions of the lateral plasma membrane domane. / Guerrier D.// J Cell Sei., 1995-№ 108-C.2609-2617.

28. Hayden M.S., Ghosh S. Signaling to NF-kappaB./ Hayden M.S. // Genes Dev., 2004-№15:18-c. 2195-2224.

29. Hoffer A., Chang C., Puga A., Dioxin induces transcription of fos and jun geneses by Ah-receptor-dependent and -independent pathways. / Hoffer A.//Toxicol. Appl. Pharm.2006-№ 141 -c.238-247

30. Hossain A., Tsuchiva S.,Minegishi M., Osada M., Ikava S., Tezuka F., Kaji M., Konno T., Watanabe M., Kikuchi H., The Ah-receptor is not involved in 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin-mediated apoptosis in human leucemic T cell lines. / Hossain A., //J.Biol. Chem. 1998-№273-c.1953-1958

31. Huang G., Elferink C.J., Multiple mechanisms are involved in Ah receptor-mediated cell cycle arrest. /Huang G.// Mol. Pharmacol., 2005-№67-c.88-96.

32. Ide F., Suka N., Kitada M., Sakashita H., Kusama K., Ishikawa T., Skin and salivary gland carcinogenicity of 7,12dimethylbenz(a)anthracene is

equivalent in the presence or absence of aryl hydrocarbon receptor./ Ide F.// Cancer lett. 2004-№214-c.35-44

33. Jansen L.A., Jongen W.M. , The use of initiated cells as a test system for the detection of inhibitors of gap junctional intercellular communication. /Jansen L.A.// Carcinogenesis, 1996-№17-c.333-339.

34. Janssen-Timmen U., Traub O., Dermitzel R., Rades H.M. and Willecke K. , Reduced number gap junction in hepatocarcinomas detected by monoclonal antibody./ Janssen-Timmen U. // Carcinogenesis, 1986- №7-c.1475-1482

35. Janssen-Timmen U., Traub O., Dermitzel R., Rades H.M. and Willecke K., Reduced number gap junction in hepatocarcinomas detected by monoclonal antibody./ Janssen-Timmen U. // Carcinogenesis, 1986-№7-c.1475-1482

36. Kalimi G.H., Lo C.W. Communication compartments in the gastrulating mouse embryo./ Kalimi G.H. // J. Cell Biol, 1988-№107-c.241-255.

37. Kang, K, Lee, Y, Kim, S, DI-(ethylhexyl)phthalate-induced cell proliferation is involved in the inhibition of gap junctional intercellular communication and blockage of apoptosis in mouse Sertoli cells. / Kang, K, // J. Toxicol. Environ. Health, 2002-№65-c.447-459.

38. Karin M. /Nuclear factor-kappaB in cancer development and progression. / Karin M. // Nature, 2006- №25-c .431-436

39. Karin M, Cao Y., Greten F.R, Li Z.W. /NF-kappaB in cancer: from innocent bystander to major culprit. / Karin M.// Nat. Rev. Cancer, 2002-№2-c.301-310.

40. Kato J.Y, Matsuoka M, Polyak K, Massague J, Sherr C.J. Cyclic AMP-induced G1 phase arrest mrdiated by an inhibitor(pp7Kipl) of cyclin-depenent kinase 4 activation./ Kato J.Y. // Cell, 1994-№79-c.486-496.

41. Kew M.C.,Synergistic interaction between aflatoxin B1 and hepatitis B virus in hepatocarcinogenesis./ Kew M.C // Liver Int., 2003-№23-c.405-409.

42. Kirk G.D., Bah E., Montesano R. Molecular epidemiology of human liver cancer: insights into etiology, pathogenesis and prevention from The Gambia, West Africa./ Kirk G.D // Carcinogenesis, 2006-№27-c.2070-2082.

43. Kirk G.D., Bah E., Montesano R. Molecular epidemiology of human liver cancer: insights into etiology, pathogenesis and prevention from The Gambia, West Africa./ Kirk G.D. // Carcinogenesis, 2006-№27-c.2070-2082.

44. Kistler J., Bond J., Donaldson P., Engel A. Two distinct levels of gap junction assembly in vitro. /Kistler J.// J. Struct. Biol., 1993-№1 lO-c.28-38.

45. Kolluri S.K., Weiss C., Koff A., Göttlicher M. p27Kipl induction and inhibition of proliferation by the intracellular Ah receptor in developing thymus and hepatoma cells. / Kolluri S.K.// Genes Dev., 1999-№1:13-c.1742-153.

46. Koo S.K, Kim D.Y, Park S.D., Kang K.W, Joe C.O, PKC phosphorilation disrupts gap junctional communication at GO/s phase in clone 9 cells. / Koo S.K.// Mol. Cell Biochem, 1997-№167-c.41-49.

47. Krutovskikh V.A. and Yamasaki H. , Ex vivo dye transfer assay as an approach to study gap junctional intercellular communication disorders in hepatorarcinogenesis./ Krutovskikh V.A. // Elsever Science, 1995-№88-c.93-97.

48. Krutovskikh V.A. and Yamasaki H. /Ex vivo dye transfer assay as an approach to study gap junctional intercellular communication disorders in hepatorarcinogenesis. / Krutovskikh V.A. // Elsever Science, 1999-№3-c. 93-97.

49. Krutovskikh V.A, Oyamada M, Yamasaki H. Sequentional changes of gap junctions intercellular communications during multistage rat liver carcinogenesis: direct measurement of communication in vivo./ Krutovskikh V.A. //Carcinogenesis, 1991-№12-c. 1701-1706

50. Laird D.W., Connexin phosphorylation as a regulatory event linked to gap junction internalization and degradation./ Laird D.W// Biochim. Biophys Acta., 2005-№10:-c.l72-182.

51. Laird D.W., Yancey S.B., Bugga L.., Revel J.P. Connexin expression and gap junction communication compartments in the developing of mouse limb./ Laird D.W. // Dev. Dyn., 1992-№195-c.3725- 3734.

52. Lake B.G. Mechanisms of hepatocarcinogenicity of peroxisome-proliferating drugs and chemicals. / Lake B.G.// Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol, 1995-№35-c.483-507.

53. L'AUemain G, Lavoie J.N, Rivard N, Baldin Y, Pouyssegur J. Cyclin D1 expression is a major target of the cAMP-induced inhibition of cell cycle entry in fibroblasts./ L'AUemain G. // Oncogene. 1997-№24:14-c.1981-1990

54. Lampe P.D., Lau A.F. Regulation of gap junctions by phosphorylation of connexins. / Lampe P.D.// Arch. Biochem. Biophys, 2000-JV2l5:384-c. 205-215.

55. Lawrence T.S, Beers W.H, Gilula N.B. Transmission of hormonal stimulation by cell-cell communication./ Lawrence T.S. // Nature, 1978-№272-c.501-506.

56. Lecureur V, Ferrec E.L, Ndiaye M,Vee M.L, Gardyn C, Gilot D, Fardel O, ERK-dependent induction of TNFalpha expression by the environmental contamiant benzo(a)pyrene in primary human macrophages./ Lecureur V.// FEBS lett. 2005-№579 -c. 1904-1910

57. Lee S.W, Tomasetto C, Paul D, Keyomarsi K. and Sager R. Transcriptional downregulation of gap junction proteins blocks junctional communications in human mammary tumor cell lines./ Lee S.W. // J.Cell Biol, 1992-C.188-C. 1213-1221.

58. Li J, Chen H, Ke Q, Feng Z, Tang MS, Liu B, Amin S, Costa M, Huang C. Differential effects of poly cyclic aromatic hydrocarbons on

transactivation of AP-1 and NF-kappaB in mouse epidermal cl41 cells./ Li J. // Mol. Carcinog, 2004-№40-c. 104-115.

59. Loewenstein W.R. Junctional intercellular communication: the cell-cell membrane channel. / Loewenstein W.R. // Physiol. Rev., 1981-61-C.829-913.

60. Ma C., Wang J., Luo J. Activation of nuclear factor kappa B by diesel exhaust particles in mouse epidermal cells through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt signaling pathway./ Ma C. // Biochem, Pharmacol., 2004-№15:67-c. 1975-1983.

61. Machala M., Blaha L., Vondracek J., Trosko J.E., Scott J., Upham B.L. Inhibition of gap junctional intercellular communications by noncoplanar polychlorinated biphenyls: inhibitory potencies and screening for potential mode(s) of action. / Machala M.// Toxicol. Sci., 2003-№76-c.102-111

62. McGarry M.A, Charles GD, Medrano T, Bubb MR, Grant MB, CampbellThompson M, Shiverick KT., Benzo(a)pyrene, but not 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, alters cell adhesion proteins in human uterine RL95-2 cells./ McGarry MA// Biochem Biophys Res Commun. 2002-№31-c.l01-7

63. Mehta P.P., Bertram J.S., Loewenstein W.R. Growth inhibition of transformed cells correlates with their junctional communication with normal cells. / Mehta P.P.// Cell, 1986-№44:l-c.87-96.

64. Mehta P.P., Hotz-Wagenblatt A., Rose B., Shalloway D., Loewenstein W.R. Incorporation of the gene for cell-cell channel protein into transformed cells leads to normalization of the growth. /Mehta P.P.// J. Membr. Biol., 1991-№ 124-C.207-225.

65. Melendez-Colon V.J., Luch A., Seidel A., Baird W.M. Cancer initiation by polycyclic aromatic hydrocarbons results from formation of stable DNA adducts rather than apurinic sites./ Melendez-Colon V.J // Carcinogenesis, 1999 - №20-c. 1885-1891.

66. Mesnil M, Krutovskikh V, Piccoli C, Elfgang C, Traub O, Willecke K, Yamasaki H. Negative growth control of HeLa cells by connexin genes: connexin species specifity. /Mesnil M.// Cancer Res, 1995-№1: 55-C.629-639.

67. Mitchell K.A, Wilson SR, Elferink CJ, The activated aryl hydrocarbon receptor synergizes mitogen-induced murine liver hyperplasia./ Mitchell KA// Toxicology. 2010-№276(2)-c. 103-9.

68. Murray S.A, Fletcher W.H. Hormone-induced intercellular signal transfer dissociates cyclic amp-dependent protein kinase. / Murray S.A.// J. Cell. Biol, 1984-№98-c. 1710-1719.

69. Nebert D.W, Puga A, Vasiliou V. Role of the Ah receptor and the dioxin-inducible [Ah] gene battery in toxicity, cancer, and signal transduction. / Nebert D.W.//Ann. N. Y. Acad. Sci, 1993-№23:685- 624640.

70. Neumann H.G. Aromatic amines in experimental cancer research: tissue-specific effects, an old problem and new solutions./ Neumann H.G // Crit. Rev. Toxicol, 2007- №37-c.211-236.

71. Neumann H.G, Hammerl R, Hillesheim W, Wildschutte M. Role of genotoxic and nongenotoxic effects in multistage carcinogenicity of aromatic amines. / Neumann H.G // Environ. Health Perspect, 1990-№88-c.207-211

72. Neveu M, Hully J, Paul D. and Pitot H. Reversible alterations in the expression of the gap junctional protein connexine32 during tumor promotion in rat liver and its role during cell proliferanion./ Neveu M. // Cancer Communic, 1990-№2-c.21-31.

73. Neveu M.J, Babcock K.L, Hertzberg E.L, Paul D.L, Nicholson B.J, Pitot H.C. Colocalized alterations in connexin32 and cytochrome P450IIB1/2 by phenobarbital and related liver tumor promoters./ Neveu M.J. // Cancer Res, 1994-№54-c. 3145-3152.

74. Neveu M.J, Hully J.R, Babcock K.L, Hertzberg E.L, Nicholson B.J, Paul D.L, Pitot H.C. Multiple mechanisms are responsible for altered expression of gap junction genes during oncogenesis in rat liver. /Neveu M.J.//J. Cell Sci, 1994-№ 107-C.83-95.

75. Nicholson B, Dermietzel R, Teplow D, Traub O, Willecke K, Revel J.P. Two homologous protein components of hepatic gap junction. /Nicholson B.// Nature, 1987-№329-c.732-734.

76. Oikawa K,Ohbayashi T, Mimura J, Iwata R, Kameta A, Evine K, Iwaya K, Fujii-Kuriyama Y, Kuroda M, Mukai K, Dioxin suppresses the checkpoint protein, MAD2, by an aryl hydrocarbon receptor-independent pathway. / Oikawa K //Cancer Res.2001-№61-c.5707-5709

77. Omori Y, Krutovskikh V, Mironov N, Tsuda H, Yamasaki H. Cx32 gene mutation in chemically-induced rat liver tumor. /Omori Y.// Carcinogenesis, 1996-№ 17-C.2077-2080.

78. Omori Y, Mesnil M, Yamasaki H., Connexin 32 mutations from X-linked Charot- Marie-Tooth disease patients; functional defects and dominant-negative effects. /Omori Y.//Mol. Biol. Cell, 1996-№7-c.907-916.

79. Park J.Y, Shigenaga M.K, Ames B.N. Induction of cytochrome P4501A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin or indolo(3,2-b)carbazole is associated with oxidative DNA damage./ Park J.Y. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996-№ 19:93-c. 2322-2327.

80. Parrish A.R, Fisher R, Bral C.M, Burghardt R.C, Gandolfi A.J, Brendel K, Ramos K.S. Benzo(a)pyrene-induced alterations in growth-related gene expression and signaling in precision-cut adult rat liver and kidney slices./ Parrish A.R. // Toxicol. Appl. Pharmacol, 1998- №152-c.302-308.

81.Pastan I.H, Johnson G.S, Anderson W.B. Role of cyclic nucleotides in growth control. / Pastan I.H // Annu Rev Biochem, 1977-№44-c.491-522.

82. Pei X.H., Nakanishi Y., Takayama K., Bai F., Hara N. Benzo[a]pyrene activates the human p53 gene through induction of nuclear factor kappaB activity./ Pei X.H. // J. Biol. Chem., 1999- №3:274-c. 35240-35246.

83. Pei X.H., Nakanishi Y., Takayama K., Bai F., Hara N. Benzo[a]pyrene activates the human p53 gene through induction of nuclear factor kappaB activity./ Pei X.H. // J. Biol. Chem., 1999-№ 3:274-c. 35240-35246.

84.Pliskova M, Vondracek J, Vojtesek B, Kozubik A, Machala M. Deregulation of cell proliferation by polycyclic aromatic hydrocarbons in human breast carcinoma MCF-7 cells reflects both genotoxic and nongenotoxic events. /Pliskova M//Toxicol Sci. 2005 -№83(2)-c.246-56

85. Puga A., Barnes S.J., Chang C., Zhu H., Nephew K.P., Khan S.A., Shertzer H.G. Activation of transcription factors activator protein-1 and nuclear factor-kappaB by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. / Puga A.// Biochem. Pharmacol., 2000-№58-c.997-1005.

86. Puga A, Nebert DW, Carrier F., Dioxin induces expression of c-fos and c-jun proto-oncogenes and a large increase in transcription factor AP-1./ Puga A// DNA Cell Biol. 1992-№1 l(4)-c.269-81

87. Rahman K.W., Ali S., Aboukameel A., Sarkar S.H., Wang Z., Philip P.A., Sakr W.A., Raz A. Inactivation of NF-{kappa}B by 3,3'-diindolylmethane contributes to increased apoptosis induced by chemotherapeutic agent in breast cancer cells./ Rahman K.W // Mol. Cancer Ther., 2007 - №62-c.757-765.

88. Ren P., Mehta P.P., Ruch R.J. Inhibition of gap junctional intercellular communication by tumor promoters in connexin43 and connexin32-expressing liver cells: cell specificity and role of protein kinase C./ Ren P. // Carcinogenesis. 1998-№19-c.l69-175.

89. Ren P., Ruch R.J. Inhibition of gap junction intercellular communication by barbiturates in long- term primary cultured rat hepatocytes is correlated with liver tumor promoting activity. / Ren P.// Carcinogenesis, 1996-№17-c.2119-2124.

90. Saez J.C., Martinex A.D., Branez M.C., Conzalez H.E. Regulation of gap junction by protein phosphorilation./ Saez J.C.// Braz. J. Med. Biol. Res., 1998-№31-c.593-600.

91. Sai K., Kang K., Hirose A., Hasegawa R., Trosko J., Inoue T. Inhibition of apoptosis by pentachlorophenol in v-myc-transfected rat liver epithelial cells: Relation to downe-regulatione of gap junctional intercellular communication./ Sai K. // Cancer Lett., 2001-№173-c.l63-174.

92. Sakamoto H., Oyamada M., Enomoto K. and Mori M. Differential changes in expression of gap junctions protein connexin 26 and 32 during hepatocarcinojenesis in rats. / Sakamoto H.// Jpn. J. Cancer Res., 1992-№83-c.l210-1215.

93. Sanson M., Marcaud V., Robin E., Valery C., Sturtz F., Zalc B. Connexin 43-mediated bystander effect in two rat glioma cell. / Sanson M.// Cancer Gene Ther., 2002-№9-c. 149-155.

94. Savas U., Griffin K.J., Johnson E.F. Molecular mechanisms of cytochrome P-450 induction by xenobiotics: An expanded role for nuclear hormone receptors./ Savas U. // Mol. Pharmacol., 1999-№56-c.851-857.

95. Schmidt K.N., Amstad P., Cerutti P., Baeurle P.A. The roles of hydrogen peroxide and superoxide as messengers in the activation of transcription factor NF-kappa B./ Schmidt K.N. // Chem. Biol., 1995-№2-c. 13-22.

96. Schrenc D., Schmitz H.J., Bohnenberger S., Wagner B., Worner W., Tumor promoters as inhibitors of apoptosis in rat hepatocytes. / Schrenc D.// Toxicol. Lett., 2004-№149-c.43-50.

97. Schuller H.M.,Nitrosamines as nicotinic receptor ligands./ Schuller H.M // Life Sci., 2007- 30:80- c. 2274-2280.

98. Sharovskaya J, Kobliakova I, Solomatina N, Kobliakov V., Effect of some carcinogenic and non-carcinogenic polycyclic aromatic hydrocarbons on gap junction intercellular communication in hepatoma cell cultures./ Sharovskaya J // Eur J Cell Biol. 2006-№85(5)-c.387-97.

99. Shipley J.M, Waxman DJ. Aryl hydrocarbon receptor-independent activation of estrogen receptor-dependent transcription by 3-methylcholanthrene./ Shipley JM// Toxicol Appl Pharmacol. 2006-№213(2)-c.87-97

100. Solan J.L, Lampe P.D. Connexin phosphorylation as a regulatory event linked to gap junction channel assembly. / Solan J.L.// Biochim. Biophys. Acta, 2005-№10:1711-c.l54-163.

101. Solhaug A, Refsnes M, LaEg M, Schwarze P.E, Husoy T, Holme J, Poly cyclic aromatic hydrocarbons induce both apoptotic and anti-apoptotic signals in Hepalclc7 cells./ Solhaug A/I Cancerogenesis.2002-№25-c.809-819

102. Spray D.C, Moreno A.P, Kessler J.A. and Dermietzel R. Characterization of gap junction between cultured leptominengeal cells. / Spray D.C.// Brain Res, 1991-№568-c.l-14.

103. Stauffer K.A. The gap junction proteins Bl-connecsin(connecsin-32) and B2-connecsin(connecsin-26) can form heteromeric hemichannels. / Stauffer K.A // J. Biol. Chem, 1995-№270-c.6768-6772.

104. Stauffer K.A, Kumar N.M, Gilula N.B, Unwin N. /Isolation and purification of gap junction channels. / Stauffer K.A.// J. Cell Biol, 1991-№115-c.l41-150.

105. Tan Z, Chang X, Puga A, Xia Y,Activation of mitogen-activated protein kinases (MAPKs) by aromatic hydrocarbons: role in regulation of aryl hydrocarbon receptor(AHR) function/ Tan Z.I I. Biochem. Pharmacol. 2002-№64-c.771-780

106. Tanaka T, Yamasaki H, Mesnil M, Induction of bystander effect in HeLa cells by using a bigenic vector carrying vira\l thymidine kynase and connexin32 genes. / Tanaka T.// Mol. Carcinogen, 2001-№30-c.l76-180.

107. Tateno C., Ito S., Tanaka M., Oyamada M. and Yoshitake A. Effect of TCDD on hepatic gap junction intercellular communication in rats. / Tateno C., // Carcinogenesis, 1994-№15-c.517-521.

108. Tharappel J.C., Cunningham M.L., Spear B.T., Glauert H.P. Differential activation of hepatic NF-kappaB in rats and hamsters by the peroxisome proliferators Wy-14,643, gemfibrozil, and dibutyl phthalate. / Tharappel J.C.// Toxicol. Sci., 2001-№62:20-c.27.

109. Tharappel J.C., Lee E.Y., Robertson L.W., Spear B.T., Glauret H.P. Regulation of cell proliferation, apoptosis, and transcription factor activities during the promotion of liver carcinogenesis by polychlorinated biphenyls./ Tharappel J.C. // Toxicol. Appl. Pharmacol., 2002-№179-c.172-184.

110. Tian Y., Ke S., Denison M.S. Rabson A. B. and Gallo M. A. Ah Receptor and NF-B Interactions, a Potential Mechanism for Dioxin Toxicity./ Tian Y. // J. Biol. Chem., 1999 - №274: 1-c. 510-515.

111. Tian Y., Rabson A., Gallo M., Ah receptor and NF-kappaB interactions:mechanisms and physiological implications. / Tian Y //Chem. Biol. Interact. 2001-№141 -c. 97-115

112. Tian Y., Rabson A.B., Gallo M.A. Ah receptor and NF-kappaB interactions: mechanisms and physiological implications. / Tian Y.// Chem. Biol. Interact., 2002-№20:141-c. 97-115.

113. Traub O., Look J., Dermietzel R, Brummer F., Hulser D. and Willecke K. Comparative characterization of the 21 kD and 26 kD gap junction proteins in murine liver and cultured hepatosytes. / Traub O.// J. Cell Biol., 1989-№108-c. 1039-1051.

114. Trosko J.E. and Goodman J.I. Intercellular communication may facilitate apoptosis: implications of tumor promotion. / Trosko J.E. // Mol. Cancinogen., 1994-№ll-c.8-12.

115. Trosko J.E., Ruch R.J. Cell-cell communication in carcinogenesis. / Trosko J.E.// Front Biosci., 1998-№15-c.208-236.

116. Turpaev K.T, Role of transcription factor AP-1 in integration of cellular signalling systems/Turpaev K.T. // Mol. Biol. (Mosk). 2006-№40-c.945-961.

117. Upham B, KoskiT, Rummel A, Wilson M, Horvath A, Trosko J.E. Differential roles of 2, 6, and 8 carbon ceramides on the modulation of gap junctional communication and apoptosis during carcinogenesis. / Upham B.// Cancer Lett, 2003-№191-c.27-34.

118. Upham B.L, Weis L.M, Rummel A.M., Masten S.J, Trosko J.E. The effects of anthracene and methylated anthracenes on gap junctional intercellular communication in rat liver epithelial cells. / Upham B.L.// Fundam. Appl. Toxicol, 1996-№34-c.260-264.

119. Vaziri C, Faller D.V. A benzo[a]pyrene-induced cell cycle checkpoint resulting in p53-independent G1 arrest in 3T3 fibroblasts./ Vaziri CM J. Biol. Chem, 1997-№272-c.2762-2791.

120. Vrzal R, Ulrichova J, Dvorak Z. Aromatic hydrocarbon receptor status in the metabolism of xenobiotics under normal and pathophysiological conditions. // Biomed. Pap. Med. Fac. Univ. Palacky, 2004-№148-c.3-10.

121. Wang H, Cho C, NF-kappaB signaling pathway, inflammation and colorectal cancer./ Wang H // Cancer Drug Targets. 2010-№10(6)-c.593-9

122. Weber T.J, Fan YY, Chapkin RS, Ramos KS, Growth-related signaling in vascular smooth muscle cells is deregulated by TCDD during the G0/G1 transition./ Weber TJ // J Toxicol Environ Health 1997-№51(4)-c.369-86

123. Weis L.M, Rummel A.M., Masten S.J, Trosko J.E, Upham B.L. Bay or bay like regions of poly cyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of Gap junctional intercellular communication. / Weis L.M.// Environ. Health Perspect, 1998-№106-c. 17-22.

124. Whitfield J.F, Boynton A.L, MacManus J.P, Sikorska M, Tsang

B.K. The regulation of cell proliferation by calcium and cyclic AMP. / Whitfield J.F.// Mol. Cell Biochem, 1979-№27-c.l55-179.

125. Whitlock J.P. Jr., Okino S.T, Dong L, Ko H.P, Clarke-Katzenberg R, Ma Q, Li H. Cytochromes P450 5: induction of cytochrome P4501A1: a model for analyzing mammalian gene transcription./ Whitlock J.P. Jr.// FASEB J, 1996-№10-c.809-818.

126. Wilson C.L, Safe S. Mechanisms of ligand-induced aryl hydrocarbon receptor-mediated biochemical and toxic responses./ Wilson

C.L.// Toxicol. Pathol, 1998-№26-c.657-671.

127. Witlock J. Genetic and molecular aspects of 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin action. Ann. Rev. / Witlock J // Pharm. Toxicol, 1990-№30-c.251-277.

128. Wolfle D, Becker E, Schmutte C. Growth stimulation of primary rat hepatocytes by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. /Wolfle D.// Cell Biol. Toxicol, 1993-№9-c. 15-31.

129. Worner W, Schrenc D, Influence of liver tumor promoters on apoptosis in rat hepatocytes induced by 2-acetylaminofluorene, ultraviolet light, or transforming growth factor beta 1. / Worner W // Cancer Res, 1996-№56-c. 1272-1278.

130. Zatloukalova J, Svihalkova-Sindlerova L, Kozubik A, Krcmar P, Machala M, Vondracek J. beta-Naphthoflavone and 3'-methoxy-4'-nitroflavone exert ambiguous effects on Ah receptor-dependent cell proliferation and gene expression in rat liver 'stem-like' cells. /Zatloukalova J// Biochem. Pharmacol, 2007-№73-c. 1622-1634.

131. Zhang L, Shiverick KT Benzo(a)pyrene, but not 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, alters cell proliferation and c-myc and growth factor expression in human placental choriocarcinoma JEG-3 cells./ Zhang L// Biochem Biophys Res Commun. 1997-№231(l)-c.ll7-20

132. Белицкий Г.А. Будунова И.В. Культуры клеток печени мыши и человека как возможные объекты для ускоренного тестирования канцерогенных соединений / Белицкий Г.А. // Экспериментальная онкология. - 1980. - №3. - С. 39-46.

133. Болотина H.A., Шаровская Ю.Ю., Кобляков В.А., Ah рецептор независимое ингибирование межклеточных щелевых контактов в клетках гепатомы 27 полициклическими ароматическими углеводородами/ Болотина H.A.// Цитология 2009-№51(5)-с.428-34

134. Будунова И.В., Миттельман Л.А., Белицкий Г.А., Возможность выявления опухолевых промоторов по их ингибирующему действию на межклеточный обмен люциферовым желтым / Будунова И.В.// Бюллетень экспериментальной онкологии и медицины. - 1987. -№11.-С. 717-719.

135. В.С.Турусов, Г.А.Белицкий/Механизмы действия химических канцерогенов/ В.С.Турусов //Канцерогенез / под ред. Заридзе Д.Г. -М.: Медицина-2000-c. 106-121

136. Васильев Ю.М. ,Клетка как орхитектурное чудо. - Ч. 2: Цитоскилет способный чувствовать и помнить / Васильев Ю.М. // Соросовский образовательный журнал. - 1996. - № 4. - С. 4-10.

137. Васильев Ю.М., Опухолевые клетки и их микроокружение.// Вопросы онкологии / Васильев Ю.М // 1984. - № 30920. - С. 96-103.

138. Васильев Ю.М., Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. 2 Клетки строят ткань / Васильев Ю.М.// Соросовский образовательный журнал. -1997.-№ 5.-С. 20-25.

139. Гелыптейн, В.И.Регуляция пролиферации нормальных и опухолевых клеток в культуре. Явления индукции и дифференцировки при опухолевом росте/В.И. Гелыптейн// Биохимия- 1981-№ бб-с.23-38

140. Кобляков В.А. Индукторы суперсемейства цитохрома Р-450, как промоторы канцерогенеза / Кобляков В.А // Биохимия. - 1998. -№63.-С. 885-898.

141. Кобляков В.А, Механизмы опухоль-промоторного действия активных форм кислорода/ Кобляков В.А //. Биохимия 2010-№75-с. 757-769

142. Кобляков В.А., Цитохром Р-450 в опухолях и в процессе канцерогенеза / Кобляков В.А // Биохимия. - 1995. - № 60. - С. 17471764.

143. Кулинский В.И. Обезвреживание ксенобиотиков / Кулинский В.И.// Соросовский образовательный журнал. - 1999. - № 1. - С. 812.

144. Пальцев М.А., Иванов A.A. Межклеточные взаимодействия/ Пальцев М.А.// - М.: Медицина, 1998.- №66-с.27-35