Сравнительно-биохимическое исследование холинэстераз пресноводных костистых рыб бассейна Рыбинского водохранилища тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Чуйко, Григорий Михайлович

• Чуйко, Григорий Михайлович
• доктор биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации доктор биологических наук Чуйко, Григорий Михайлович

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ХОЛИНЭСТЕРАЗ (ХЭ).

1.1.1. История открытия и этапы изучения.

1.1.2. Типы, их свойства, функции, локализация и идентификация.

1.1.3. Молекулярное строение и структура.

1.2. ХОЛИНЭСТЕР АЗЫ РЫБ.

1.2.1. Типы, локализация и свойства.

1.2.2. Участие ХЭ в физиологических процессах.

1.2.3. Действие естественных экологических факторов и физиологических состояний.

1.2.4. Действие ФОС и КС на ХЭ рыб в условиях in vivo.

1.2.5. Влияние соединений, не обладающих прямым антихолинэстеразным действием.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Исследуемые рыбы.

2.2. Исследуемые химические соединения.

2.3. Методы исследования.

2.4. Культивирование экспериментальных рыб.

2.5. Постановка экспериментов.

2.6. Статистическая обработка.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование скорости гидролиза ацетил- и бутирилтиохолина в тканях

3.2. Электрофоретическое разделение и идентификация типов ХЭ в сыворотке крови рыб.

3.3. Чувствительность ХЭ рыб к ингибирующему действию ДЦВФ in vitro.

3.4. ДЦВФ как избирательный ингибитор для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ рыб.

3.5. Соотношение доли БуХЭ и АХЭ в общей активности ХЭ плазмы крови рыб из сем Cyprinidae.

3.6. Основные кинетические свойства АХЭ и БуХЭ рыб: сравнение с типичными ХЭ.

3.7. Активность АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме пресноводных костистых рыб: межвидовые и межсемейственные различия.

3.8. Изменение активности АХЭ в мозге окуня при остром стрессе, индуцированном введением адреналина.

3.9. Сезонная динамика активности АХЭ и БуХЭ в тканях окуня и плотвы.

3.10. Роль ингибирования АХЭ мозга в нарушении пищевого поведения леща при действии ДЦВФ in vitro.

3.11 Изменения АХЭ мозга окуня (Perca fluviatilis L.) при остром действии хлорофоса in vivo.

3.12. Изменение активности АХЭ в мозге карпа и динамика ее восстановления при действии in vivo различных концентраций карбофоса.

3.13. Динамика изменения активности ХЭ в тканях плотвы приодноразовом сублетальном действии ДДВФ in vivo.

3.13 Роль ХЭ и других причин в межвидовой избирательности летального действия ФОС на рыб.

3.13.1. Сравнительная устойчивость рыб к действию хлорофоса и ДДВФ в острых опытах.

3.13.2. Чувствительность АХЭ рыб к ингибированию ДДВФ in vitro.

3.13.3. Скорость поступления ДДВФ в организм карпа и окуня.

3.13.4. Интенсивность метаболического разрушения ДДВФ в печени окуня и карпа в условиях in vitro.

3.13.5. Роль БуХЭ плазмы в устойчивости леща к летальному действию хлорофоса и ДДВФ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительно-биохимическое исследование холинэстераз пресноводных костистых рыб бассейна Рыбинского водохранилища»

Актуальность проблемы. Изучение биоразнообразия и эволюции кинетических свойств ферментов и функций, выполняемых ими в организме - одна из основополагающих проблем современной биохимии и биологии в целом. Для решения этой проблемы необходимы сравнительные исследования ферментов у широкого круга живых организмов из разных филогенетических групп.

Холинэстеразы (ХЭ) - ферменты, широко распространенные в живой природе от микроорганизмов и простейших одноклеточных организмов до позвоночных, включая человека. Выделяют два основных типа ХЭ: ацетилхолинэстераза (ацетилхолин ацетилгидролаза, АХЭ; К.Ф. 3.1.1.7) и холинэстераза (ацилхолин ацилгидролаза; К.Ф. 3.1.1.8), представленная рядом ферментов. К последнему типу относится наиболее известная и часто встречаемая среди животных бутирилхолинэстераза (БуХЭ). ХЭ участвуют в различных физиологических процессах, но функциональное значение установлено только для АХЭ: она играет ведущую роль в механизме трансдукции нервного импульса в холинергических синапсах животных, гидролизуя медиатор ацетилхолин (АХ). Роль БуХЭ до сих пор остается неясной (Silver, 1954; Taylor, 1991; Бресткин и др., 1997). Особенностью ХЭ является их способность взаимодействовать с фосфорорганическими (ФОС) и карбаматными (КС) соединениями, что приводит к необратимому ингибированию их активности. Ингибирование АХЭ нервной системы животных блокирует проведение нервного импульса и вызывает нарушение нормального функционирования организма, приводя в конечном итоге к его гибели (О'Брайн, 1960; Голиков, Розенгарт, 1964). Этот феномен нашел широкое применение в практическом использовании ФОС и КС в качестве пестицидов, боевых отравляющих веществ и лекарственных препаратов (Розенгарт, Шерстобитов, 1978; Chambers, Levi, 1992), а также в использовании ХЭ как биомаркеров действия этих соединений на разные виды животных (Minneau, 1991; Huggett et al., 1992). Наиболее полно к настоящему времени изучены АХЭ эритроцитов и мозга человека и крупного рогатого скота, а также БуХЭ сыворотки (плазмы) крови человека и лошади. Эти ферменты принято считать «типичными». ХЭ других организмов изучены недостаточно, хотя они могут заметно отличаться по свойствам от «типичных» АХЭ и БуХЭ (Бресткин и др., 1997).

Данные о ХЭ пресноводных костистых рыб носят ограниченный характер и получены в основном зарубежными исследователями на незначительном числе нехарактерных для ихтиофауны Европейской части России видов. Детальные исследования по идентификации типов ХЭ среди широкого ряда видов пресноводных костистых рыб, изучению их кинетических свойств, межвидовых различий в активности и распределению в органах до сих пор не проводились. В связи с этим до последнего времени преобладает мнение, что в организме рыб доминирует АХЭ, а БуХЭ, если и присутствует, то в очень небольших количествах (Augustinsson, 1958, 1959, 1961; Hogan, 1971а,b; Брик, 1969; Brestkin et al., 1973; Hobden, Klaverkamp, 1977; Бресткин и др., 1997). Практически отсутствуют данные о сезонной динамике ХЭ, об их участии в таких биологически важных процессах, как питание, нерест, стресс. С момента обнаружения АХЭ в мозге рыб (Mendel, Rudney, 1943) исследования связаны, главным образом, с возможностью ее использования как биомаркера действия ФОС и КС (Weiss 1958, 1961, 1965; Coppage, Matthews, 1974; Гантверг, Перевозников, 1983; Zinkl et al., 1991). Тем не менее, до сих пор имеется мало данных о динамике восстановления активности ХЭ in vivo, особенно после хронического действия низких концентраций антихолинэстеразных соединений. Единичны исследования роли ХЭ в механизмах межвидовых различий в устойчивости рыб к ФОС.

Цель и задачи исследования: идентификация типов ХЭ у пресноводных костистых рыб, изучение их каталитических свойств, видоспецифичности органо-тканевого распределения и некоторых прикладных аспектов (роль в физиологических процессах и варьирование активности при действии биологических и антропогенных факторов окружающей среды).

Соответственно цели были определены задачи работы:

1. Охарактеризовать типы ХЭ у разных представителей пресноводных костистых рыб и сравнить их по каталитическим свойствам с типичными ХЭ млекопитающих.

2. Исследовать межвидовые и межсемейственные особенности в органо-тканевом распределении разных типов ХЭ и в уровнях их активности у пресноводных костистых рыб.

3. Изучить изменения активности АХЭ мозга при стрессе, индуцированном адреналином.

4. Установить пределы биологической вариабельности и определить уровни нормальной активности ХЭ в разные сезоны года.

5. Оценить участие холинергической нервной системы и роль АХЭ мозга в формировании пищевого поведения рыб в норме и при хроническом отравлении ФОС.

6. Выявить роль ХЭ и других физиолого-биохимических факторов в межвидовых различиях устойчивости рыб к острому токсическому действию ФОС.

Научная новизна. Обобщены исследования ХЭ пресноводных костистых рыб. Впервые в плазме пресноводных костистых рыб сем. Сурпшёае обнаружена БуХЭ, описаны ее каталитические свойства и распределение в различных органах, показаны сходство и отличия от АХЭ рыб и АХЭ и БуХЭ млекопитающих. Выявлены различия между видами и семействами рыб по уровню активности БуХЭ в плазме и печени. Показано, что у леща Abramis brama в отличии от других представителей сем. Cyprinidae БуХЭ в плазме присутствует лишь у 30% особей. Впервые установлены устойчивые различия в активности АХЭ мозга не только между отдельными видами, но и среди представителей разных семейств пресноводных костистых рыб, а также выявлена корреляция между активностью АХЭ в мозге и БуХЭ в плазме. Впервые определен нормальный диапазон варьирования активности АХЭ и БуХЭ в органах широкого ряда пресноводных костистых рыб, принадлежащих к нескольким семействам. Продемонстрировано, что сезонные изменения активности АХЭ мозга рыб связаны не только с температурой окружающей среды, как у других пойкилотермных животных, но и с их биологическим репродуктивным циклом. Впервые показано участие холинергической системы и АХЭ в мозге при формировании пищевого поведения у рыб и установлен один из механизмов действия антихолинэстеразных соединений на пищевое поведение рыб при хронической интоксикации ФОС. Впервые для рыб выявлено увеличение активности АХЭ в мозге при остром стрессе. Показано, что динамика активности АХЭ в мозге рыб in vivo при хроническом действии и после его прекращения веществ различной природы неантихолинэстеразного действия имеет стрессорный характер. Проанализирована взаимосвязь уровня активности АХЭ мозга и симптомокомплекса отравления и реабилитации при остром и хроническом действии ФОС на рыб. Впервые установлено, что чувствительность АХЭ и БуХЭ рыб к действию ФОС in vitro не является фактором, определяющим межвидовые различия в токсикорезистентности рыб; разная скорость проникновения ФОС в организм и интенсивность их детоксикации играют основную роль в этом процессе.

Научно-практическая значимость работы. На основании анализа и обобщения литературных данных и результатов собственных исследований даны практические рекомендации по использованию ХЭ пресноводных костистых рыб для оценки антропогенного загрязнения водных объектов ФОС и КС. При выполнении работы разработаны методы: энзиматического определения ФОС в воде (получено авторское свидетельство SU №1359741 от 15.08.87, ГК ИО СССР); определения эффективных концентраций в токсикологических опытах; определения ДДВФ в крови и печени рыб с использованием ГЖХ с электронно-захватным детектором (ЭЗД); метод раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб с использованием селективного фосфорорганического ингибитора ДЦВФ. Материалы диссертации нашли практическое применение при обучении студентов в ряде Университетов в России и за рубежом в курсах «Экологическая физиология и биохимия», «Водная токсикология» и «Water Pollution and Fish Physiology».

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. В плазме (сьюоротке) крови и печени пресноводных костистых рыб из сем. Cyprinidae наряду с АХЭ (КФ 3.1.1.7) присутствует БуХЭ (КФ 3.1.1.8), удельная активность которой преобладает в общей активности ХЭ и ее уровень коррелирует с уровнем активности АХЭ в мозге.

2. АХЭ и БуХЭ рыб по ряду каталитических свойств отличаются от «типичных» АХЭ и БуХЭ млекопитающих.

3. Существуют закономерные сезонные, межвидовые и межсемейственные различия в активности АХЭ и БуХЭ в тканях пресноводных костистых рыб

4. Ингибирование и восстановление активности АХЭ и БуХЭ является важным симптомом токсического действия ФОС на рыб, однако устойчивость рыб к этим токсикантам связана не только с угнетением ХЭ, но обусловлена и другими биохимическими и физиологическими факторами (поступление ФОС в организм и мощностью детоксикационных ферментных систем печени).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Основные результаты и положения работы доложены на: Всесоюзной конференции по водной токсикологии (Юрмала, 1982); Научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Проблемы рыбохозяйственных исследований внутренних водоемов Северо-Запада Европейской части СССР» (Петрозаводск, 1984); Советско-американском симпозиуме «Проблемы водной токсикологии, биотестирования и управления качеством воды» (Борок, 1984); I Всесоюзном симпозиуме по чувствительности и устойчивости гидробионтов к токсикантам (Батуми, 1985); VI Всесоюзной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Вильнюс, 1985); 9-ом совещании по эволюционной физиологии (Ленинград, 1986); USA-USSR Symposium «Fate and effects of pollutants on aquatic organisms and ecosystems» (Athens, USA, 1987); 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Методы ихтио-токсикологических исследований» (Ленинград, 1987); Всесоюзном совещании «Поведение рыб» (Москва, 1989); VII Всесоюзной конференции «Экологическая физиология и биохимия рыб» (Ярославль, 1989); Международной конференции «Методы исследования и использования гидроэкосистем» (Рига, 1991); II Всесоюзной конференции по рыбохозяйственной токсикологии (С.-Петербург, 1991); VIII Научной конференции по экологической физиологии и биохимии рыб (Петрозаводск, 1992); VIII Congress of European Ichthyology Society «Fishes and their environment» (Ovideo, Spain,1994); Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Петрозаводск, 1995); 17 SETAC Annual Meeting (Washington, USA, 1996); 18 SETAC

Annual Meeting. (San Francisco, USA, 1997); Симпозиуме по возрастной и экологической физиологии рыб (Борок, 1998); Международной молодежной школе «Биоиндикация-98» (Петрозаводск, 1998); Конференции «Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре» (Москва, 2000); Конференции «Озера холодных регионов» (Якутск, 2000); Научно-практической конференции «Проблемы биологии, химии, экологии и экологического образования» (Ярославль, 2001); Всероссийской конференции «Современные проблемы водной токсикологии» (Борок, 2002); III (XXVI) Международной конференции «Биологические ресурсы Белого моря и внутренних водоемов Европейского Севера» (Сыктывкар, 2003).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 58 печатных работ (28 статей и 30 тезисов докладов)

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ Диссертация изложена на 305 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов и материалов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 218 отечественных и 338 иностранных источников. Работа иллюстрирована 37 таблицами и 36 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Чуйко, Григорий Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе проведенной работы обобщены результаты различных исследователей, накопленные за 60 летний период изучения ХЭ рыб в целом, и получены новые оригинальные данные о различных аспектах функционирования этих ферментах у пресноводных костистых рыб (Teleostei), представляющих 19 видов из 5 наиболее распространенных семейств, обитающих и Рыбинском водохранилище и имеющих широкое распространение в водоемах Северо-запада европейской части России.

Основное внимание было направлено на идентификацию типов ХЭ у пресноводных костистых рыб, изучение их каталитических свойств, видоспецифичности органо-тканевого распределения и некоторые прикладные аспекты. В результате были установлены типы ХЭ у разных представителей пресноводных костистых рыб и проведено сравнение их по каталитическим свойствам с типичными ХЭ млекопитающих; исследованы межвидовые и межсемейственные особенности в органо-тканевом распределении разных типов ХЭ и в уровнях их активности; изучены изменения активности АХЭ мозга при стрессе, индуцированном адреналином; установлены пределы биологической вариабельности и определены уровни нормальной активности ХЭ в разные сезоны годового цикла; оценено участие холинергической нервной системы и роль АХЭ мозга в формировании пищевого поведения рыб в норме и при хроническом отравлении ФОС; показана роль ХЭ и других физиолого-биохимических факторов в различной видовой устойчивости рыб к острому токсическому действию ФОС.

В результате работы установлено, что гомогенаты мозга всех исследованных рыб не зависимо от семейства и вида способны гидролизовать АТХ и практически не разрушают БуТХ, что подтверждает полученные ранее данные о существенном преобладании в мозгу рыб АХЭ. В печени, селезенке и плазме активность в отношении этих субстратов зависит как от вида, так и от семейства. У представителей большинства исследованных видов с различной интенсивностью гидролизуются оба субстрата. У карпа и 70% особей леща (ceM.Cyprinidae) в печени, у щуки (ceM.Esocidae) в печени и селезенке, у карася и линя (ceM.Cyprinidae) и всех видов ceM.Percidae в селезенке БуТХ практически не разрушается или разрушается с очень низкой скоростью. В плазме оба субстрата гидролизуются лишь у части представителей ceM.Cyprinidae, а у другой части видов этого семейства и представителей остальных исследованных семейств - только АТХ. Гидролиз обоих субстратов предполагает наличие в исследованных тканях у этих видов рыб либо АХЭ и БуХЭ, либо одной нетипичной ХЭ.

Более детальное исследование ферментов плазмы крови пресноводных костистых рыб с использование методов электрофореза в ПААГ и субстратно-ингибиторного анализа позволило выявить присутствие в ней трех типов эстераз: неспецифическая КЭ и более специализированные АХЭ и БуХЭ. Наличие БуХЭ в сыворотке пресноводных костистых рыб описано впервые. Ранее считалось, что в эволюционном ряду позвоночных он появляется у представителей пресмыкающихся. Вместе с тем показано, что эстеразный спектр у исследованных видов рыб имеет различия. Все из них обнаруживают КЭ и АХЭ, а БуХЭ выявлена лишь у трех представителей сем. Cyprinidae: плотвы, синца и леща, хотя у последнего только 30-40% обладают этим типом ХЭ. На основании гетерогенности ХЭ выделено два фенотипа леща: фенотип Б, в сыворотке которого присутствует АХЭ и БуХЭ, и фенотип А, для которого характерно наличие только АХЭ. У карпа (сем. Cyprinidae), окуня (ceM.Percidae), щуки (сем. Esocidae) и налима (сем. Lotidae) БуХЭ не обнаружена.

Изучение ингибирования ХЭ мозга и плазмы (сыворотки) крови рыб при действии ДДВФ in vitro показало, что чувствительность аналогичных типов ферментов в этих тканях одинакова. Обнаружено, что АХЭ по чувствительности к этому ингибитору практически мало отличается от чувствительности АХЭ млекопитающих. В то же время, чувствительность БуХЭ рыб выше более чем в 1000 раз по сравнению с АХЭ и более чем в 100 раз - по сравнению с БуХЭ млекопитающих.

На основании выявленных различий проведено сравнение селективности ДЦВФ и другого ФОС изо-ОМФА, широко известного своей избирательностью к типичной БуХЭ из сыворотки лошади. Установлено, что оба ингибитора избирательно действуют как на БуХЭ плотвы, так и лошади по сравнению с АХЭ плотвы и эритроцитов быка. Степень избирательности для них соответственно составляет 2000 и 80 раз. При этом диапазоны эффективных концентраций ДЦВФ для АХЭ быка и БуХЭ лошади перекрываются, а для ферментов плотвы нет. Аналогичная закономерность выявлена при действии изо-ОМФА. Однако ДЦВФ обладает большей ингибирующей способностью и избирательностью в отношении БуХЭ плотвы, чем изо-ОМФА. Это дает возможность использовать ДЦВФ как новый селективный ингибитор для раздельного определения активности АХЭ и БуХЭ в тканях рыб.

Использование ДЦВФ позволило обнаружить, что в плазме (сыворотке) крови рыб из сем. Сурпшс1ае, у которых методом электрофореза установлено наличие двух типов ХЭ, активность БуХЭ преобладает над активностью АХЭ и ее доля в общей активности ХЭ составляет в зависимости от вида 83-96%.

В результате кинетического анализа показано, что АХЭ и БуХЭ исследованных рыб наряду с общими свойствами, характерным для типичных ХЭ, имеют и отличительные особенности. Для АХЭ рыб это - более высокая относительная скорость гидролиза и повышенное сродство к ПрТХ, для БуХЭ - к МеТХ по сравнению с типичными ХЭ. Последнее указывает на необходимость более осторожной трактовки результатов, получаемых при использовании МеТХ, как специфического субстрата для идентификации АХЭ рыб и выявления ее локализации при гистохимическом определении.

Сравнительное исследование 16 видов пресноводных костистых рыб, принадлежащих к четырем семействам (Сурпшс1ае, Регс1(1ае, Езос1ёае, Ьойёае), выявило между ними межвидовые и межсемейственные различия в активности АХЭ и БуХЭ в мозге и плазме. Активность АХЭ в мозге варьирует между видами 15-кратно от 138 до 2011 мкмоль/г/ч. Все исследованные представители сем. Сурпшёае имеют более высокую активность АХЭ в мозге, чем представители трех других семейств: Евоаёае, Реплёае и Ьойёае . В плазме рыб активность АХЭ в среднем в 100 раз ниже, чем в мозге и варьирует среди видов от 1.2 1о 18.6 мкмоль/мл/ч. Активность БуХЭ в плазме присутствует только у видов, представляющих сем. Сурпшёае, за исключением карпа, карася, линя и чехони. У остальных представителей этого семейства ее значения лежат в пределах от 26 1:о 1083 мкмол/мл/ч. В целом уровень активности БуХЭ в плазме прямо коррелирует с активностью АХЭ в мозге и плазме рыб, что вероятнее всего связано с общим холинергическим статусом организма.

Показано, что повышение уровня адреналина в организме рыб, известного стресс-гормона, оказывает влияние на активность АХЭ в мозге рыб. Изменения активности АХЭ происходит на фоне гипергликемии, свидетельствующей о стрессорной природе этих изменений. Выявленные изменения активности АХЭ наблюдаются в среднем и промежуточном отделах мозга и носят двухфазный характер: первоначальное краткосрочное снижение и последующее стойкое увеличении относительно контрольного уровня, сохраняющееся не менее 3 суток. Из этого следует, что любой стрессирующий фактор, повышающий уровень адреналина, способен приводить к изменениям активности АХЭ в мозге рыб. Следует считать, что изменения активности АХЭ в мозге рыб являются одним из элементов вторичного стресс-ответа у рыб.

Исследование активности АХЭ в среднем и промежуточном отделах мозга окуня в течение нескольких лет выявило закономерную сезонную цикличность ее изменений в течение года, связанную в целом с цикличностью изменений температуры окружающей воды: летом активность фермента выше, чем зимой. Связь активности фермента с температурой подтверждается в лабораторных условиях при длительной адаптации рыб к разным температурам. Однако в природных условиях максимальный уровень активности АХЭ не связан с наивысшими значениями температуры воды в водоеме, а наблюдается в конце весны в период нереста рыб и отличается от минимального, наблюдаемого зимой, в 2 раза. Выявленный подъем активности АХЭ в этот период обусловлен, скорее всего, изменением гормонального статуса рыб и носит стрессорный характер. Величина активности фермента не зависит от пола, но имеет слабую обратно пропорциональную зависимость от длины тела и веса мозга. В основе сезонных изменений активности АХЭ мозга окуня лежат как эндогенные причины, так и температурный фактор окружающей среды.

Сходный сезонный характер цикличности изменений активности обнаружен для АХЭ в целом мозге, плазме, селезенке и печени плотвы, а также для БуХЭ в этих органах. Низкие значения показателей наблюдаются зимой, высокие - летом. Полученные данные позволяют косвенно заключить, что в плазме и печени в летне-осенний и зимне-весенний периоды происходит перераспределение доли активности БуХЭ и АХЭ в общей активности ХЭ, в селезенке - нет. В период созревания половых продуктов и подготовки рыб к нересту во всех рассмотренных органах наблюдается увеличение активности ХЭ.

Сезонные колебания удельной активности ХЭ в плазме плотвы связаны с динамикой содержания в ней белка и, вероятно, обусловлены изменениями объема самой плазмы. Между удельной активностью ХЭ печени в течение годового цикла и массой органа существует достоверная обратная корреляция. Однако достоверной связи между удельной активностью ХЭ и массой селезенки не обнаружено. Активность АХЭ в мозге плотвы в течение года прямо пропорциональна содержанию в нем водорастворимого белка. Пол, и размер рыб не оказывают заметного влияния на сезонную динамику активности ХЭ в рассмотренных тканях плотвы.

При сублетальном хроническом действии ДДВФ на молодь леща снижается количество потребляемого ею корма и подавляется активность АХЭ мозга. Внутрибрюшинное введение холинергических препаратов с антидотным действием, атропина и ТНБ-4, приводит к восстановлению количества потребляемого корма, что свидетельствует об участии холинергической системы в процессе, контролирующем питание рыб. В основе нарушения пищевого поведения леща лежит ингибирование активности АХЭ в мозге, что подтверждается реактивацией активности АХЭ при введении ТНБ-4. В отличие от млекопитающих у леща ТНБ-4 хорошо проникает через гематоэнцефалический барьер и оказывает центральное действие.

При интоксикации хлорофосом независимо от силы токсического воздействия (острая интоксикация, периодическое воздействие МПК) массовая гибель окуня наступает при снижении активности АХЭ на 60-80% от уровня контроля. Единичные особи погибают при уровне активности фермента 50%. Хлорофос обладает суммирующимся эффектом действия. При периодическом воздействии МПК гибель рыб наступает при суммарном количестве, меньшем, чем в остром опыте. При определении активности АХЭ в токсикологических исследованиях, необходимо стандартизировать условия отбора, хранения и анализа проб, так как у рыб, остающихся после гибели в токсической среде, активность фермента продолжает снижаться. Кроме того, во время хранения гомогенатов возможна частичная реактивация или дополнительное угнетение активности АХЭ.

Симптомокомплекс острого отравления рыб ФОС независимо от силы токсического воздействия включает в себя следующие стадии: состояние повышенной возбудимости, нарушение координации движения, потеря рефлекса равновесия, потеря чувствительности, гибель рыб. Начальные этапы интоксикации вплоть до стадии потери рефлекса равновесия высоко обратимы. На стадии потери чувствительности обратимость составляет 50%. Интоксикация рыб ФОС сопровождается угнетением активности АХЭ мозга, степень которого зависит от силы и продолжительности токсического воздействия. Снижение активности АХЭ в мозге при контакте рыб с ФОС происходит значительно быстрее, чем ее восстановления после перемещения рыб в чистую воду. Продолжительность восстановления активности АХЭ прямо пропорциональна степени ее снижения. В процессе восстановления активности АХЭ мозга рыб выделяется два этапа. Первый этап, сразу после прекращения контакта с токсикантом, характеризуется высокой скоростью восстановления активности фермента и продолжается несколько часов. На втором этапе, который наступает через сутки и может длиться 10-20 дней, скорость восстановления активности АХЭ в десятки раз ниже. В процессе реабилитации рыб в чистой воде после прекращения действия ФОС внешние симптомы отравления исчезают значительно раньше, чем восстанавливается активность АХЭ. К моменту исчезновения внешних симптомов отравления активность АХЭ мозга составляет в среднем 45% от контрольного уровня не зависимо от концентрации токсиканта и продолжительности токсического действия.

При сублетальном одноразовом воздействии сверхмалых концентраций ДЦВФ (1/100 ЛК50 за 48ч) на плотву происходит снижение активности ХЭ в ее органах. Наиболее существенно снижение БуХЭ в плазме, менее - АХЭ в мозге. В плазме активность БуХ остается пониженной не менее 45 суток, тогда как ее уровень в печени, а также активность АХЭ в остальных исследованных органах достаточно быстро восстанавливается до контрольных значений и даже превышает его, демонстрируя компенсаторную реакцию. Активность БуХЭ в плазме рыб является более чувствительным показателем присутствия в воде ДЦВФ, чем активность АХЭ в мозге.

Установлено, что окунь и карп различаются по устойчивости к острому летальному действию ДДВФ в несколько десятков раз. При этом чувствительность АХЭ в мозге рыб к действию ингибитора in vitro не играет заметной роли в механизмах формирования видовой избирательности токсиканта. Некоторое значение, видимо, имеет более высокая активность АХЭ в мозге карпа по сравнению с окунем. Однако основные причины этого феномена - межвидовые различия в скорости поступления ФОС в организм рыб и эффективности их детоксикации в печени. Последняя определяется как более высокой скоростью разрушения ДДВФ в печени карпа, так и большей относительной массой самого органа. Наличие БуХЭ или ее отсутствие в крови леща не приводит к изменению его устойчивости к острому летальному действию ДДВФ, что указывает на низкую значимость этого фермента в повышенной устотйчивости рыб при данных условиях экспозиции.