Сравнительная характеристика штаммов ВТМ (дальневосточные изоляты), идентифицированных на овощных культурах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Гнутова, Ирина Валерьевна

• Гнутова, Ирина Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гнутова, Ирина Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ. 4

ГЛАВА I. ВИРУС ТАБАЧНОЙ МОЗАИКИ И ЕГО ШТАММЫ обзор литературы) 1. ' Общая характеристика ВТМ .7

2, Распространение вирусов в растениях , , »

3. Симптомы пораженных растений

4. Круг растений-хозяев.

5. Цитопатология.

6. Штаммовое разнообразие вируса табачной мозаики.

6.1. Штаммы ВТМ, поражающие томаты

6.2. Штаммы ВТМ, поражающие перцы.

6.3. Штаммы ВТМ, поражающие баклажаны.

6.4 Классификация штаммов ВТМ.

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Вирусные изоляты, идентифицированные на овощных культурах

2. Биологическое тестирование

2.1. Механическая инокуляция

2.2. Определение физических свойств штаммов ВТМ

3. Получение очищенных вирусных препаратов штаммов ВТМ.

4. Получение штаммоспецифических антисывороток

5. Иммунохимические методы детекции штаммов ВТМ

5.1. Реакция двойной иммунодиффузии,,,,,,,,,

5.2. Ракетный иммуноэлектрофорез.

5.3. Иммуноферментный анализ.

5.3.1. Непрямой вариант

5.3.2. "Сэндвич" метод

6. Изучение вирусных включений методом световой микроскопии.

7, Электронная микроскопия

7.1. Негативное контрастирование .42

7.2. Ультратонкие срезы

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Биологическое тестирование вирусных изолятов ВТМ, выявленных на овощных культурах

1.1. Изолят из перца . 44

1.2. Изолят из томата.53

1.3. Изолят из баклажана.59

2. Физико-химическая и антигенная характеристики изучаемых штаммов ВТМ

2.1. Получение очищенных вирусных препаратов штаммов ВТМ.65

2.2. Получение моноштаммовых антисывороток . 67

2.3. Выявление антигенного родства между штаммами

ВТМ с помощью иммунохимических методов

2.3.1. Реакция двойной иммунодиффузии

2.3.2. Ракетный иммуноэлектрофорез .70

2.3.3. Иммуноферментный анализ .71

3. Ультраструктурная характеристика взаимодействия штаммов ВТМ с клетками листьев табака . 76

ГЛАВА IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ .84

ВЫВОДЫ . 102

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная характеристика штаммов ВТМ (дальневосточные изоляты), идентифицированных на овощных культурах»

Вирус табачной мозаики (ВТМ) является одним из самых контагиозных фитопатогенных вирусов, который поражает большое число видов растений из различных семейств и тем самым наносит огромный экономический ущерб растениеводству, главным образом, овощеводству, декоративному цветоводству и садоводству. Поэтому, изучение этого вируса и его штаммов до еих пор остается актуальной проблемой в прикладной фишовирусологии.

Вирус распространен в природе в виде различных штаммов, которые возникают в результате мутаций в процессе его репродукции. При этом образуемые штаммы значительно различаются по вирулентности (Молдован, 1979; Matthews, 1981; Van Loon, 198?), Наиболее вредоносными и опасными для овощных культур являются многие штаммы фитопатогенных вирусов, в том числе и штаммы ВТМ (Власов и др5, 1978; Толкач, Гнутова, 1996).

Известно, что особенности взаимодействия штаммов с растением-хозяином обусловлены свойствами их структурных белков и РНК (Мэтьюз, 1973). Исследование влияния различных штаммов на состояние растения-хозяина - перспективный путь для изучения механизмов вирусного патогенеза и защитных реакций растений.

Идентификацию вирусов растений обычно начинают с описания биологических свойств изолятов, в результате чего 5 предварительно относят их к определенному виду и роду по принятой Международным комитетом таксономии вирусов (Murphy et al., 1995).

Для характеристики штаммов необходимо всестороннее исследование их с помощью различных методов физиков химических, иммунохимических, цитологических. Физико-химические и электрофоретические исследования позволяют изучать структурные белки. С помощью иммунохимических методов выявляется антигенная специфичность капсидных белков не только вирусов, но и их штаммов. Благодаря специфичности антитела реагируют только с теми эпитопами, в ответ на которые, они образовались, или с вирусами, сходными я© антигенной структуре (Гнутова, 1993а). Цитологические исследования дают представление об особенностях внутриклеточного развития вирусов и их штаммов.

Только на юге Дальнего Востока России выявлено уже около 10 штаммов ВТМ, поражающих перец, декоративные культуры, картофель и травянистые растения. Благодаря новым исследованиям число их ежегодно увеличивается. В последние годы штаммы ВТМ стали причиной снижения урожайности овощных культур - томатов, возделываемых как в открытом, так и закрытом грунте (Толкач, Гнутова, 1998), перцев, баклажанов и др. Поэтому актуальность изучения штаммов ВТМ не вызывает сомнений. Представляется необходимым изучать не только свойства этих штаммов, но и определять их групповую принадлежность в рамках одного вида. б

Цель настоящей работы состояла в изучении биологических, физико-химических, антигенных и цитопатогенных свойств штаммов ВТМ, идентифицированных на юге Приморья на овощных культурах - перце, томате и баклажане и отнесении их к определенной группе штаммов в пределах вида. Кроме того, планировалось провести сравнительный анализ изучаемых штаммов и некротического штамма ВТМ, описанного ранее на перце (Толкач, 1995), который отличается тем, что не заражает системно табак настоящий (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun), томат съедобный (Lycopersicon esculentum Mill.) и вызывает на большинстве тест-растениях реакцию локально-некротическую.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи: 1) выявить экспериментальный круг растений-хозяев и провести сравнительный анализ симптомов, вызываемых исследуемыми штаммами на них; 2) изучить внутриклеточные вирусные включения, индуцируемые каждым штаммом; 3) получить данные о физических и физико-химических свойствах вирусных частиц; 4) исследовать антигенные свойства капсидных белков и выявить вирус- и штаммоспецифические эпитопы для определения степени антигенного родства штаммов; 5) изучить ультраструктуру клеток листьев N. tabacum cv. Samsun, инфицированных исследуемыми штаммами; 6) провести классификацию штаммов по группам в пределах одного вида Tobacco mosaic virus рода Tobamovirus. 7

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Гнутова, Ирина Валерьевна

ВЫВОДЫ

Идентифицированы три новых дальневосточных штамма ВТМ на овощных культурах - перце (ВТМп), томате (ВТМт) и баклажане (ВТМб). Штамм ВТМ на баклажане обнаружен в России впервые.

Показано, что все исследуемые штаммы различаются по кристаллическим и аморфным включениям (Х-телам), образуемым в зараженных клетках табака. Выявленные включения могут служить диагностическим признаком этих штаммов.

Определен круг растений-хозяев (45 видов и сортов из 9 семейств) и выявлены различия штаммов по симптоматологии.

Установлено, что дальневосточный штамм ВТМб имеет наиболее низкую точку термической инактивации (85°С) в сравнении с двумя другими изученными штаммами ВТМ. Иммунохимическими методами (РДД, РИЭФ, непрямым вариантом и "сэндвич" методом ИФА) показана степень антигенного родства штаммов ВТМп, ВТМт, ВТМб и ВТМпн. Выявлены вирусспецифические и штаммоспецифические эпитопы капсидных белков штаммов. Показано, что штамм ВТМб является активным иммуногеном. К этому штамму получена моноштаммовая антисыворотка, которую можно использовать для детекции других штаммов ВТМ.

Электронномикроскопические исследования клеток

103 системно инфицированных листьев N. tabacum cv. Samsun показали, что по степени стимуляции лизосомального компартмента, а также развития внутриклеточных литических процессов исследованные штаммы могут быть расположены в следующем порядке: ВТМп, ВТМб, ВТМт. 8. На основании изучения биологических, физических, физико-химических, антигенных, цитопатогенных свойств штаммы ВТМт и ВТМб отнесены к томатной, а ВТМп - к табачной группам вида Tobacco mosaic virus рода Tobamovirus.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гнутова, Ирина Валерьевна, 2000 год

1. Аксельсен Н., Крелль И., Вееке В. Руководство по количественному иммунозлектрофорезу. М.: Наука, 1977. С. 200-205.

2. Белицер Н.В. Лизосомная система и микротельца в клетках растений и животных: Автореф. дис. .д-ра биол. наук. Л., 1978. 48с.

3. Бойко А.Л. Вирусы и вирусные заболевания хмеля и розыэфиромасленичной. Киев: Наук, думка, 1976. 70с.

4. Васильев А.Е. Функциональная морфология секреторных клеток растений. Л.: Наука, 1977. 208с. Васильева Т. Изучение свойств штамма вируса табачной мозаики, выделенного из растений рода Allium // Биол, науки. 1976. N1. С. 31-34.

5. Гамалей Ю.В. Цитологические основы дифференциации ксилеммы. Л»: Наука, 1972. 144с.

6. Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений. М.: Мир, 1978. 429с.

7. Гнутова Р.В., Чуян А.Х., Крылова Н.В., Рублева Н.В., Крылов A.B. Характеристика некоторых дальневосточных штаммов вируса табачной мозаики // Биол. науки. 1980. N1. С. 31-37.

8. Гнутова Р.В. Иммунологические исследования в фитовирусологии. М.: Наука, 1985. 183с. Гнутова Р.В. Серология и имунохимия вирусов растений. М.: Наука, 1993а. 301с.

9. Гольдин М. Вирусные включения в растительной клетке и природа вирусов. М.: Изд-во АН СССР, 1963. 204с. Дамрозе И., Копоревич В., Игнаш Я. Вирус табачной мозаики на паприке // Тр. JICXA. Вып. 69. Елгава: ЛСХА, 1972. С. 134-135.

10. Дорохов Ю.Л. Транспорт инфекции в растении: функция, контролируемая геномом вируса и хозяина // Успехи совр. генетики. 1994. N19. С. 3-24.

11. Журавлев Ю.Н. Фитовирусы в целом растении и в модельных системах. М,: Наука, 1979, 247с,

12. Иванова Е.С., Сухов К.С. Штаммы вируса табачной мозаики выделенные из мозаичных растений сладкого перца в теплицах Болгарии // Штаммы вирусов растений и их практическое использование. Елгава. Вып. 191. 1981. С. 53-55.

13. Ивановский Д. О двух болезнях табака // Сел. хоз-во лесоводство. 1892. N2. С. 1-3.

14. Игнаш Я.Р. Сравнительные результаты реакции тест-растений Nicotiana sylvestris Speg et Comes, и Petunia hybrida Vilm, при заражении различными изолятами вируса табачной мозаики // Тр. ЛСХА. Вып. 164. Елгава: ЛСХА, 1978. С. 21-25.

15. Курсанов А.JI. Транспорт ассимилятов в растении. М. : Наука, 1976. 646с.

16. Леднева Р.К. Вирус табачной мазаики, нуклеиново-белковые взаимодействия // Итоги науки и техники. Сер. Молекул, биол. Т.17 М.: ВИНИТИ, 1982. С. 66-138. Лурия С., Дарнелл Дж. Общая вирусология. М: Мир, 1970. 423с.

17. Малиновский В.И. Механизмы устойчивости сверхчувствительных растений табака к вирусу табачной мозаики: Автореф. дис. .д-ра биол. наук. Владивосток, 1998. 45с.

18. Машанский В.Ф., Винниченко Л.Н., Мосевич Т.Н., Дунаев С.Е., Синицкая И.А. Два различных типа изменений ультраструктуры митохондрий в животных и растительных клетках // Ультраструктура растительных клеток. Л.: Наука, 1972. С. 98-102.

19. Мэтьюз Р. Вирусы растений. М.: Мир. 1973. 600с. Молдован М.Я. Вирусные болезни табака и меры борьбы с ними. Кишинев: Штиинца, 1979. 228с. Навалинскене М. Вирусы цветочных культур (идентификация, биология и профилактика заболеваний):

20. Поликсенова В.Д. Повышение устойчивости томатов к вирусным болезням // Матер. Межд. конф. "Актуальные вопросы фитовирусологии и защиты растений". Минск. 1997. С. 38-39.

21. Проценко А.Е. Штаммы или виды вирусов рода Virothrix Ryzk // Штаммы вирусов. Владивосток: ДВНЦ АН СССР. 1977 С. 5-11.

22. Романова С.А,, Леднева В,А. Вирус табачной мозаики на картофеле в Приморском крае // Фитовирусологические исследования на Дальнем Востоке, Владивосток: ДВО РАН. 1989. С. 191-193.

23. Сердеченко В.Д. Штамм вируса табачной мозаики, вызывающий кольцевые пятнистости листьев табака в Молдавии: Автореф. дис. .канд. биол. наук. Киев, 1974. 23с.

24. Силаева A.M. Структура хлоропластов и факторы среды. Киев, 1978. 233с.

25. Сибирякова И.И. Повышение активности антисывороток к вирусам растений, применяемых в иммунохимических реакциях: Дис. .канд. биол. наук. Владивосток. 1987, 141с.

26. Смит К. Некроз табака // Вирусные болезни растений. М. :1. Мир. I960. 72c.

27. Тальянский М.Э. Молекулярно-биологическиеосновы взаимодействия между вирусами растений: Автореф.дис. .д-ра. биол. наук. М., 1984. 35с.

28. Толкач В.Ф., Чуян А.Х., Шафрановская И.В., Крылов A.B. Биологическая характеристика ВТМ, изолированного из ириса в Приморском крае // Бюл. Гл. ботан. сада. 1988. Вып. 157. С. 72-76.

29. Толкач В.Ф., Гнутова Р.В. Вирусы овощных культур // Приморский центр НТИ N 66-96. 1996. 4с.

30. Allam Е.К., Ali M.D.H., Abo Tl-Nasr M.A. Host range as a mean of differentiation between tomato mosaic virus strains // Egypt. J. Phytopathol. 1978(1979), 10. N1. P. 1-7.

31. Amparo V.J. Microbiol. Esp. 1972. 25, N4. P.211-224. Anderer F.A., Uhlig H., Weber E., Schramm G. Primary structure of the protein of tobacco mosaic virus // Nature. 1960. 186. P. 922-925.

32. Atabekov J.G., Morozov S.Y. Translation of plant messenger RNAs // Adv. Virus Res. 1979. V.25. P. 1-91. Atabekov J.G., Dorokhov Y.L. Plant virus-specific transport function and resistance of plant to virus // Ibid. 1984. V. 29. P. 313-364.

33. Blanco S., Herrera C., Abreu S. Comportamien to de doce variedades de pimieto (Capsicum annuum) frente a tres cepas del virus mosaico del tobacco (TMV) // Sienc. agr. 1987. N31. P. 3-7.

34. Cherian S., Joseph J., Muniyappa V., Savithri H.S. Characterization of tobacco mosaic virus isolated from tomato in India // Current Science. 1999. N76(10). P. 1384-1388.

35. Corbett M.K. Some distinguishing characteristics of the orhid strain of tobacco mosaic virus // Phytopathology, 1967. Vol.57. N2. P. 164-171.

36. Строименова E. Нов щам тютюнево мозаичния вирус (ТМВ) по пипера // Градин, и лозар. Наука. 1984. Вып. 21. N 6. С. 72-78.

37. Culver J.N., Dawson W.O. Point mutations in the coat protein gene of tobacco mosaic virus induce hypersensitivity in Nicotiana sylvestris // J. Mol. Biol. 1989. V.2. N4. P. 209-213.

38. Elliot M.S., Zettler F.W., Zimmerman M.T., Barnett O.W., Legrande M.D. Problems with interpretation of serological assays in a virus survey of orchid speciesfrom Puerto-Rico, Ecuador, and Florida // Plant disease. 1996. N80(10). P. 1160-1164.

39. Esau K. Viruses in plant hosts. Form, distribution and pathologic effects. Madison, Milwaukee: and London: Univ. Wisconsin Press, 1968. 225p.

40. Everitt E., Persson M.J., Wohlfart C. PH-dependent exposure of endoproteolytic cleavage sites of the adenovirus 2 hexon protein // FEMS microbiol. Left. 1988. V.49. N2. P. 229-233.

41. Feldman J., Oremianer S. An unusual strain of tobacco mosaic virus from pepper // Phytopathol. Z. 1972. N75. S. 250-267.

42. Feng L., Tian R., Yang C., Yang C.Y. Обследование иидентификация на томатах вирусов и штаммов TMV, CMV в

43. Северном Китае // Zhiwu baohu xuebao = Actaphytophylacica sin. 1996. Vol.23. N1. P. 51-55.

44. Fenner F. Classification and nomenclature of viruses //1.tervirology. 1976. Vol.7. N1/2. P. 65-90.

45. Gebre S., Dumas V., Marchoux G., Pochard E. La virusde la mosaique du tabac chez le piment. 1. Apparation en

46. France du pathotype P 1-2 // Aggronomie. 1981. N10. P.853.858.

47. Gibbs A. Viruses and plasmodesmata // Intercellular communication in plants: studies on plasmodesmata. Berlin; Hiedelberg; New York: Springer, 1976. P. 149164.

48. Gibbs A. Tobamovirus group // С.M.I./A.A.B. Description

49. Plant of Viruses. 1977. N 184. 5p.

50. Giri L., Chessin M. A severe strain of Tobacco mosaic virus from cactus // Phytopathology. 1975. Vol.65. N6. P. 824-825.

51. Gnutova R.V. Comparison of tobacco mosaic virus (TMV) strains by rocket immunoelectrohoresis // Zeszyty problemowe postepow Nauk Roiniczvch, Warszawa. 1983. Z. 291. P. 111-118.

52. Gnutova R.V., Tolkach V.F. Taxonomy of the family Potyviridae // Arch. Phytopath. Pflanz., 1998. Vol.31 P. 543-548.

53. Golinowski W., Kupidlowska E., Skrzeczkowski L. Degradation of potato virus X (PVX) in the intercellular spaces of potato mesophyll // Phytopathol. Z. 1981. Bd.101. H.2. P. 136-142.

54. Greenleaf W.f Cook A., Heyn A. Resistance to tobacco mosaic in Capsicum with reference to the Samsun latent strain // Phytopathology. 1964. Vol.54. N11. P. 1367-1371.

55. Hart R.G. Morphological changes accompanying thermal de naturation of tobacco mosaic virus // Biochim. Biophys. Acta, 20. 1956. P. 388-389.

56. Henry E.W. Tobacco mosaic virus in tissues of Nicotiana tabacum cv. "Little Turkish"// Cytology. 1980. Vol.45. N 3. P.467-476.

57. Kiss E., Lovai Z., Suranyi R., Gombos J. The effect of ecological factors on the virus infection of pepper // Proc. Int. Conf. Integr, Plant Prot. 1983. Vol.3. P. 58-64.

58. Macleill B.H. A specializes tomato from of the tobacco mosaic virus in Canada // Can. J. Bot., 40. 1. 1962. P. 1603-1604.

59. Markham R., Hitchborn J.H., Hills G.J., Frey S. The anatomy of tobacco mosaic virus // Virology, 1964. N22. P. 342-359.

60. Matile P. Plant lysosomes// Lysosomes in biology and pathology. Amsterdam: North-Holland Publ. Co., 1969. P. 406-430.

61. Matthews R.E.F. Classification and nomenclature of viruses Third report of the international committee on taxonomy of viruses // Intervirology, 1979, Vol,12, N3-5. P. 129.

62. Matthews r.e,F, Plant virology. Second edition. New York; London; Toronto; Sydney; San Francisco: Acad. Press, 1981. 897p.

63. Murphy F., Fauquet C., Bishop D. et al. The classiffication and nomenclature of virus // Virus Taxonomy 6-th report of the international Committee on Taxonomy of Virus. 1995. P. 1-586.

64. Nagai J., Takauchi T.f Tochihara H. A new mosaic of sweet pepper caused by pepper strain of tobacco mosaic virus // Ann. Phytopathol. Soc. Jap. 1981. Vol.47. N4. P. 541-546.

65. Pares R.D. A tobamovirus infecting capsicum in Australia // Ann. App. Biol. 1985. 106. N3. P. 469-474. Pop I., Jilaveanu A. O boala necrotica a vinetelor pro dusl de virusul mozaicului tutunului // Stud, si cerc. biol. 1975. Vol.27. N3. P. 239-243.

66. Prochazkova Z. Presumed role of mucilage of plantainseeds in spread of tobacco mosaic virus // Biologia

67. Plantarum. 1977. Vol.19. N4. P. 259-263.

68. Rast A. Maat D. Yellow mosaic strains of Capsicum mosaicvirus // Meded. Fac. Landbouwwetensch Rijksuniv. Gent.1986. Vol.51. N2B. DEEL 2. P. 791-797.

69. Reinero A., Beachy R.N. Association of tobacco mosaicvirus coat protein with chloroplast membranes in virusinfected leaves // Plant Mol. Biol. 1986. V.6. N5. P.291.301.

70. Reinero A., Beachy R.N. Reduced photosystem II activity and accumulation of viral coat protein in chloroplasts of leaves infected with tobacco mosaic virus // Plant Physiol. 1989. V.89, N1. P. 111-116.

71. Rochon D., Siegel A. Chloroplast DNA transcripts are encapsidated by tobacco mosaic virus coat protein // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V.81, N6. P. 17191723.

72. Russo M., Martelli G.P. Ultrastructure of turnip crinkle- and saguaro cactus virus-infected tissues // Virology. 1982. V.118. N1. P. 109-116.

73. Shaw J.G., Plaskitt K.A., Wilson T.M.A. Evidence that tobacco mosaic virus particles disassemble cotranslationally in vivo // Virology. 1986. V.148, N2. P. 326-336.

74. Sulzinski M.A., Zaitlin M. Tobacco mosaic virus replication in resistant and susceptible plants: in some resistance species virus is confined to a small number of initially infected ceils // Virology. 1982. V.121. N 1. P. 12-19.

75. Tosic M., Videnov E. Prilog proucavanju nekih izolata virus mozaika duvana in paprike // Zast. Bilja. 1981. Vol32. N157. P. 285-292.

76. Wetter C., Dore I., Bernard M. Bell pepper mottle virus, a distinct tobamovirus infecting pepper // Phytopathol. Z. 1987. 119, N4. P. 333-344.126

77. Wilson T.M.A. Cotranslational disassembly of tobacco mosaic virus in vitro 11 Virology. 1984. V.137, N2. P. 255-265.

78. Wittmann H.G., Wittmann-Liebold B. Protein chemical studies of two RNA viruses and their mutants, Cold Spring Hrbor Symp. Quant, Biol., 31. 1966. P. 163-172.

79. Христова Д., Кайтазова П. Вирусни болести по доматите в България през периода 1986-1994 гг. // Растениевьд. Науки. 1996. 33. N3. С. 57-59.

80. Zaitlin М., Israel H.W. Tobacco mosaic virus (type strains) // CMI/AAB. Descriptions of plant viruses. 1975. N 151. 5p.

81. Zaitlin M., Hull R. Plant virus-host interactions // Ann. Rev. Plant Physiol. 1987. V.38. P. 291-315.