Сравнительная активность in vivo главных промоторов бактериофага XI74, G2 фага FD и laguv5 E. coli. тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Федченко, Валерий Иванович

• Федченко, Валерий Иванович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Федченко, Валерий Иванович

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. ОЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИИ ПРОМОТОРОВ

ПРОКАРИОТОВ

I.I. ОЩИЕ ЧЕРТЫ СТРУКТУРЫ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ

1. Структурная гомология рамки Прибнова-Шаллера у промоторов, узнаваемых РНК-полимеразой Е. coli

2. Область нуклеотида -35.

3. Другие функционально-значимые участки в нуклео-тидной последовательности промотора

I.II. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ

1. Особенности структур промоторов, узнаваемых РНК-полимеразами бактериофагов и РНК-полимеразой бактерий, модифицированных бактериофагом

2. Особенности структуры промоторов, узнаваемых РЩ-полимеразой е. coli.

II. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ППАЗМИДНЫХ ВЕКТОРОВ В ИЗУЧЕНИИ СТРУКТУРЫ И ФУНКЦИИ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ

III. БАКТЕРИОФАГ 0X174 И ЕГО ТРАНСКРИПЦИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

I. ВЫДЕЛЕНИЕ И КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК, СОДЕРЖАЩИХ

ПРОМОТОРЫ А, В И D БАКТЕРИОФАГА 0X174.

1. Выделение фрагментов ДНК, содержащих промоторы

2. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих промоторы, в плазмиде pBRH

3. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих промоторы, в плазмиде "phd68-17 . ??

II. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОМОТОРОВ БАКТЕРИОФАГА 0X

1. Определение активности промоторов по экспрессии tet-оперона (плазмида pBRH4).

2. Определение активности промоторов по экспрессии gal-оперона (плазмида pHD68-17 ).

3. Влияние числа копий промотора на экспрессию gal -оперона.

III. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОМОТОРА В БАКТЕРИОФАГА 0X174.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сравнительная активность in vivo главных промоторов бактериофага XI74, G2 фага FD и laguv5 E. coli.»

В В Е Д Е Н И Е Ключевой стадией транскрипционного цикла является взаимодействие молекулы РНК-полимеразы с промотором, расположеннъм в начале каждой единицы транскрипции (транскриптона). Это взаимодействие предшествует стадии инициации, и от него зависит, начнется или нет синтез РНК на транскриптоне. При этом, скорость инициации зависит от нуклеотидной последовательности промотора, и, следовательно, эффективность транскрипции, а в целом и экспрессия гена или группы генов промотора. Взаимодействие РНК-полимеразы с различными промоторами лежит в основе почти всех известных механизмов позитивного контроля транскрипции и во многих случаях обусловливает избирательность транскрипции, одним из проявлений которой является дифференциальная активность генов в онтогенезе. Более того, многие механизмы негативного контроля транскрипции реализуются путем нарушения или полного предотвращения контакта РНК-полимеразы с промотором. С момента возникновения проблемы избирательной транскрипции генов наиболее пристальное внимание ученых привлекают этапы взаимодействия РНК-полимеразы с промотором. После появления надежных методов расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК первостепенное значение приобрел аспект структуры промотора и её связи с функциями. Уже определена первичная структура большого числа разнообразных промоторов, выведены общие закономерности строения промотора, начинают складываться представления о связи между первичной структурой и эффективностью промотора. До недавнего времени об этой связи судили на основании экспериментов в очищенных бесклеточных системах. Однако, появление методов генной инженерии дало возможность достоверно оценивать сравнительную "силу" определяется главным образом структурой промоторов in vivo, Основной задачей данной работы является сравнительная оценка in vivo, с применением методов генной инженерии, эффективности трех главных промоторов: А, В и D бактериофага 0X174 и сопоставление её с эффективностью хорошо изученных промоторов-: G2 фага fd и lacUV5 Е. coli. С помощью этих же методов предстояло проверить локализацию на карте ДНК фага 0X174 функционально активного промотора В. Кроме того, на примере одного из промоторов (промотора В фага 0X174) было намечено изучить влияние различного числа его копий на эффективность экспрессии контролируемого им оперона. В результате проделанной работы в двух векторных системах (плазмиды pBRH4 и рШ)б8-.17 получен набор рекомбинантных молекул, содержащих перед -feet- и gal-оперонами промоторы А, В и D фага 0X174, G2 фага fd и iacUV5 Е. coli. Сопоставление относительной активности исследуемых промоторов in vivo позволило установить, что все промоторы обладают значительной биологической активностью. Наибольшую активность, из всех исследуемых промоторов, проявил промотор D бактериофага 0X174. Поэтому промотор D может быть рекомендован для экспрессии генов в генетической инженерии. Уточнена локализация на карте хромосомы фага 0X174 промотора В и показано, что из двух предполагаемых промоторов BI и ВП, локализованных в области фрагментаЕв in vivo функционально активным является только один из них промотор ВП. При изучении влияния на экспрессию gal-оперона (плазмида pHD 68-17) числа копий промотора В фага 0Xi74 было установлено, что экспрессия gal-оперона в клетках E.coli KS1366 возрастала прямо пропорционально числу встроенных промоторов. При этом, необходимым условием экспрессии gal-оперона является правильная ориентация всех копий промотора.7 Практическое значение имеет также созданный в ходе работы новый штамм Е. coli К12 KS1366 (P",gal, recA, Чс), предназначенный для клонирования рекомбинантных ДНК с последующим выявлением функционирующего gal-оперона. Кроме того, разработан новый метод вьщеления ДНК-полимеразы I Bacillus suЪtilis, препараты которой целесообразно использовать в работах по генной инженерии вместо фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli.12 Наиболее консервативен 6-ой (Т) нуклеотид рамки Прибнова, так как он встречается во всех рассмотренных промоторах. Вероятность встречаемости нуклеотидов в положении 3 (Т), 4 (А) и 5 (А) лежит в пределах от 50 до 60%. Положение 7 (6) гептамера Прибнова TATAATG слабо консервативно, и иногда этот нуклеотид не относят к рамке Прибнова 154J7. Наиболее убедительное доказательство функциональной значимости рамки Прибнова было получено при изучении влияния на биологическую активность промоторов мутационных замещений нуклеотидов в данной области (рис.За-к) [\Ъ1 J, На рис.За показана промоторная область 1ас-оперона Е. coli с точковыми мутациями. Природный 1ас-промотор, по-видимому, можно отнести к числу слабых промоторов с гептамером Прибнова TATGTTG, значительно отличающимся от среднестатистического /"57, 68_7. Мутация Р1а, находящаяся вне рамки Прибнова, увеличивает активность промотора всего в 5 раз /"57 J7, тогда как мутации, расположенные внутри рамки Прибнова, Р® и UV5 увеличивают промоторную активность соответственно в 10 и 25 раз /"50, 158_/. При этом мутация Р делает рамку Прибнова более похожей на среднестатистическую (TATAAOIG), а мутация UV5 идентичной с ней. Резкие изменения в активности промотора, вызываемые мутациями Р и UV5, прямо указывают на функциональную важность рамки Прибнова в обеспечении правильного взаимодействия РНК-полимеразы с промотором. Другим подтверждением функциональной значимости рамки Прибнова может служить образование промотора с17 в вирулентном мутанте бактериофага Л который является результатом дупликации небольшого участка ДНК /"107_7 (рис.36). В результате дупликации образовалась последовательность ТАТААТТ, почти полностью совпадающая со среднестатистической последовательностью Прибнова TATAATG. Две независимо отобранные по способности связывать РНК-полимеразу

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Федченко, Валерий Иванович

выводы

1. На основе плазмид pBRH4 и pHD68-17 сконструированы рекомби-нантные ДНК, содержащие, соответственно, в tet- и gal-onepo-нах промоторы А, В и D фага 0X174, G2 фага fd и lacUV5 Е. cdli.

2. Качественная оценка активности промоторов не зависела от выбо-. ра тест—системы в составе плазмиды - pBRH4 или pHD68-17, но более подходящей тест-системой для более строгого определения активности промоторов in vivo является gal-оперон-содержащая плазмида рЫ0б8-17«

3. Эффективность главных промоторов фага 0X174 располагается в следующем порядке: Промотор D значительно превосходит по эффективности все исследованные промоторы, в том числе и такой сильный промотор, как G2 фага fd.

4. Экспрессия генов gal-оперона увеличивается пропорционально числу копий встроенного перед ним промотора, причем тандемный промотор активен только тогда, когда все составляющие его монопромоторы имеют правильную ориентацию относительно оперона.

5. В промоторной зоне В фага 0X174 содержится только один промотор, а именно ВП (из двух промоторов - BI и ВП, ранее предполагавшихся Сенгером).

6. Сконструирован новый штамм е. coli К12 KS1366 (F~, д gal, recA, Тсг), который удобен для клонирования плазмид с функционально активным gal-опероном.

7. Разработан новый метод выделения ДНК-полимеразы I Bacillus subtilis, которую можно использовать в работах по генной инженерии, вместо более трудно доступного фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I Е. coli.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Федченко, Валерий Иванович, 1984 год

1. Добрынин В.Г., Коробко В.Г., Северцева И.В., Колосов М.Н. Химико-ферментативный синтез модельного промотора транскрипции и участка узнавания РНК-полимеразы Escherichia coli . Биоорг. химия, 1980, т.6, №5, с. 783-785.

2. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Северцова Н.В., Быстров Н.С., Колосов М.Н. Синтез промоторных линкеров для экспрессии генов Е. coli. Биоорг. химия, 1980, т.б, Ml, с. 1740-1742.

3. Коробко В.Г., Добрынин В.Г., Северцова Н.В., Чувпило С.А., Шпиганова Л.Н., Колосов М.Н. Модификации промотора гена tet в плазмиде pBR322 . Биоорг. химия, 1980, т.б, Ml, с. 1743-1745.

4. Коробко В.Г., Добрынин В.Н., Чувпило С.А. Северцов П.В., Шин-гарова Л.Н., Колосов М.Н. Плазмидный вектор для клонирования промоторов. Биоорг. химия, 1981, т.7, №2, с. 309-311.

5. Никифоров В.Г., Зограф Ю.Н. Регуляция активности генов у бактерий. Сб.: Итоги науки и техники. Мол. биол., т. 13, 1977, ВИНИТИ, М.

6. Овчинников Ю.А., Ефимов В.А., Чахмахчева О.Г., Долганов Г.М., Ровердатто С.В. Взаимодействие РНК-полимеразы Е. coli с синтетическим промотором ДНК бактериофага fd in vitro и in vivo. Биоорг. химия, 1980, т.6, Ml, с.1682-1692.

7. Патрушев Л.И., Капица Е.Л., Стукачева Е.Д., Шемякин М.Ф. Влияние фактора терминации транскрипции р на экспрессию геновбактериофага jz(X174 in vitro. Два класса генов бактериофага jzfX174. Биоорг. химия, I960, т.6, №2, с.303-305.

8. Стукачева Е.А., Капица E.JI., Шемякин М.Ф. Изучение условий образования jzfXI74 специфических РНК in vitro. Биоорг. химия, 1982, т.8, МО, с. 1365-1374.

9. Федченко В.И., Долганов Г.М., Акопьянц Н.С., Честухин А.В., Шемякин М.Ф. Определение сравнительной активности трех главных промоторов бактериофага jzfXI74 при экспрессии tet- и gal-оперонов Е. coli in vivo. Биоорг. химия, 1982, т.8, №10,с.1365-1374.

10. Честухин А.В., Федченко В.И., Шемякин М.Ф. Выделение и свойства ДНК-связывающих белков Bacillus subtilis, ингибирующих АТР-зависимую дезоксирибонуклеазу. Мол. биол., т.13, №3, с. 656-665.

11. Шемякин М.Ф., Шумилов В.Ю. Защита РНК-полимеразой Е. coli участков репликативной формы I ДНК фага jzfX174, узнаваемых рес-триктазами Hindu, BspRI и Alul. Мол. биол., 1981, т.15, №5, с.1144-1147.

12. Allet, В., Roberts, R.J.Gesteland, R.P., Solem, R. Class of promoter sites for E. coli DNA-dependent RNA polymerase. Nature, 1974, v.249, N5454, p.217-221.

13. Arndt-Jovin,D.J., Jovin,T.M., Bahr, W., Frischanf, A.M., Marquardt, M. Covalent attachment of DNA to agarose. Europ. J. Biochem., t975, v.54, p.411-419.

14. Arnott, S., Puller, W., Hodgson, A., Prutton, I. Molecular conformations and structure transitions of КИА complemehtary helices and their possible biological significance. Nature, 1968, v.220, p.561-564.

15. Arnott, S., Bond, P.J., Seising, E., Smith, P.J. Models of tripl-strendend polynycleotides with optimised stereochemistry. Nucl. Acids Res., 1976, v.3, N10, p.2459-2470.

16. Axelrod, N. Transcription of bacteriophage f£X174 in vitro: Selective initiation with oligonucleotides. J. Mol. Biol., 1976, v.108, N4, p.753-770.

17. Axelrod, N. Transcription of bacteriophage $4X174 in vitro: Analysis with restriction enzymes. J. Mol. Biol., 1976, N4, p.771-779.

18. Bautz, E. K. P., Bautz, P.A. Initiation of RNA synthesis: The function of d? in the binding of RNA polymerase to promoter sites. Nature, 1970, v.226, N5252, p.1219-1222.

19. Benham, C.J. Torsional stress and local denaturation in super-coiled DNA. Proc. Hat. Acad. Sci. U.S.A., 1979, v.76, N8,p.3870-3874.

20. Berk, A.J., Sharp, P.A. Sizing and mapping of early adenovirus mRNAs by gel electrophoresis of S1 ehdonuclease-digested hibrids. Cell, 1977, v.12, N3, p.721-732.

21. Berman, M.N., Landy, A. Promoter mutations in thi transfer

22. RNA gene tyrT of Escherichia coli. Proc. Wat. Acad. Sci. U.S. A., 1979, v.76, И9, P.4303-4307.

23. Birnboim, H.C., Doli, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucl. Acids Res,, 1979» v.7, N6, p.1513-1523.

24. Blatner, P.R., Dahlberg, J.E. RNA synthesis startpoints in bacteriophage X : are the promoter and operator transcribed? Nature New Biol., 1972, v.237, p.227-232.

25. J. Biol. Chem., 1979, v.254, N13, p.5609-5612.

26. Bolivar, P., Rodriguez, R.L., Betlach, M.C., Boyer, H.W. Construction and characterization of new cloning vehicles. I. Ampicillin-resistant derivatives of the plasmid pMB9. Gene, 1977, v.2, N2, p.75-93.

27. Bolivar, P., Rodriguez, R.L., Greene, R.J., Betlach, M.C., Heyneker, H.L., Boyer, H.W. Construction and characterization of new cloning vehicles. II. A multipurpose cloning system» Gene, 1977, v.2, N2, p.95-113.

28. Bradford, M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding. Anal. Biochem., 1976, v.72, p.248-254.

29. Bram, S., Tougard, P. Polymorphism of natural DNA. Nature New Biol,, 1972, v.239, N92, p.128-131.

30. Brown, N.L., Smith, M. The mapping ahd sequence determination of the single site in f£X174 am3 replicative form DNA cleaved by restriction endonuclease Pstl. FEBS Letters, 1976, v.65, N3, p.284-287.

31. Brown, W.M., Shine, J., Goodman, H.M. Human mitochondrial DNA: Analysis of 7S DNA from the origin of replication. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1978, v.75, N2, p.735-739.

32. Burgess, A.B. Studies on the proteins of J&X174. II. The protein composition of the 0L coat. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. A., 1969, ve64, p.613-619.

33. Calos, M.P. DNA sequence for a low-level promoter of the lac repressor gene and an "up" promoter mutation. Nature, 1978, v.274, N5673, p.762-765.

34. Chacko, C.M., McCrone, L., Nadler, H.L. A study of galacto-kinase and glucose 4-epimerase from normal and galactosemic skin fibroblast. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v.282, N2, p.552-555.

35. Chamberline, M.J. The selectivity of transcription. Ann. Rev. Biochem., 1974, v.43, p.721-775.

36. Chamberline, M.J. Interaction of RNA polymerase with the DNA template. In: RNA polymerase (Losick, R., Chamberline, M.J., eds.), 1976, p.159-191, Cold Spring Harbor Lab., N.Y.

37. Chamberline, M.J. RNA polymerase are overview. In: RNA polymerase (Losick, R., Chamberline, M.J., eds.), 1976, p.17-63, Cold Spring Harbor Lab., N.Y.

38. Chen, C.Y., Huthison, Ш, C.A., Edgell, M.H. Isolation and genetic localization of the three 0X174 promoter regions. Nature New Biology, 1973, v.243, 11129, p.233-236.

39. Crothers, D.M., Zimm, B.H. Theory of the melting transitionof synthetic polynucleotides: Evaluation of the stacking free energy. J. Mol. Biol., 1964, v.9, p.1-9.

40. Csordas-T6th, E., Boros, I,, Venetianer, P. Structure of The promoter region for the rrnB gene in Escherichia coli. Uucl. Acids Res., 1979, v.7, N8, p.2189-2197.

41. Davis, B,J. Disc electrophoresis II. Method and application to human serum proteins. Arm. N. Y. Acad. Sci., 1964, v.121, p.404-427.

42. Denhardt, D.T. The single-stranded DNA phages. CRC Crit. Rev. Microbiol., 1975, v.4, p.161-222.

43. Dennis, P.P., Bremer, H. Regulation of ribonucleic acid synthesis in E. coli B/r: An analysis of a shift-up. 1. Ribosomal RNA chain growth rates. J. Mol. Biol,, 1973, v.75, N1, p.145-159.

44. Dickson, R.C., Abelson, J., Bernes, W.M., Reznikoff, W.S. Genetic regulation: The lac control region. The nucleotide sequence of the lac control region containing the promoter and operator is presented. Science, 1975, v.187, N4171, p.27-30.

45. Dressier, D., Hourcadl, D., Koths, K., Sims, J. The DNA replication cycle of the isometric phages. In: The Single-Stranded DNA Phages (Denhardt, D.T., Dressier, D., Ray, D.S., eds.), 1978, p.187-214, Cold Spring Harbor Lab., N.Y.

46. Duffy, J.J., Geiduschek, E.P. RNA polymerase from phage SP01-infected and uninfected Bacillus subtilis. J. Biol. Chem.,1975, v.250, N12, p.4530-4541.

47. Dunn, J.J,, Bautz, P.A., Bautz, E.K.P. Different template specificities of phage T3 and T7 RNA polymerases. Nature New Biol., 1971, v.230, N1, p.94-96.

48. Dykes, G., ВатЪага, R., Marians, K., Wu, R. On the statistical significance of primary structural features found in DNA-pro-tein interaction sites. Nucl. Acids Res., 1975, v.2, N3, p.327-346.

49. Echols, H. Developmental pathways for the temperate phage: Lysis vs lysogeny. Ann. Rev. Genet., 1972, v.6, p.157-190.

50. Pijjisawa, H., Hayashi, M. Viral DNA-synthesizing intermediate complex isolated during assembly of bacteriophage <6X174. J. Virol., 1976, v. 19, p.469-416.

51. Fijjisawa, H., Hayashi, M. Functions of gene С and gene D products of bacteriophage <6X174. J. Virol., 1977, v.24, p.506-511.

52. Fujjita, D.J., Ohlsson-Wilhelm, B.M., Geidusehek, E.P. Transcription during bacteriophage SP01 development: Mutations affecting the program of viral transcription. J. Mol. Biol., 1971, v.57, N2, p.301-317.

53. Gentz, R., Largner, A., Chang, A.C.Y., Conen, S.N., Bujard, H. Cloning and analysis of strong promoters is made possible by the dow^nstream placement of a RNA termination signal. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1981, v.78, N8, p.4936-4940.

54. Gilbert, W. Starting and stopping sequences for the RNA polymerase. In: RNA Polymerase (Losick, R., Chamberlin, M., eds.),1976, p.193-205, Cold Spring Harbor Lab., N.Y.

55. Gilbert, W., Maxam, A., Mirzabekov, A. Contacts between the lac repressor and DNA revealed by methylation. In: Control of

56. Rib о some Synthesis (Kjjeldgaard, N.O., Maaloe, 0., eds), 1976, p.139-148, Benzon Symposium IX, Acad. Press, N.Y.

57. Gilbert, S.P., de Boer, H.A., Nomura, M. Identification of initiation sites for the in vitro transcription of rRNA ope-rons rrnE and rrnA in E. coli. Cell, 1979, v.17, N1, p.211-224.

58. Goeddel, D.V., Shepard, H.M., Yelverton, E., Leung, D., Crea, R., Sloma, A., Pestka, S. Synthesis of human fibroblast interferon by E. coli. Nucl. Acids Res., 1980, v.8, N18, p.4057-4074.

59. Golomb, M., Chamberline, M. Characterization of T7-specific ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem., 1974, v.249, N9, p.2858-2863.

60. Greene, J.G., Heyneker, H.L., Bolivar, P., Rodriguez, R.L., Betlach, M.C., Covarrubias, A.A., Backman, K., Russel, D.J., Tait, R., Boyer, H.W. A general method for the purification of restriction enzymes. Nucl. Acids Res., 1979, v.5, p.2373-2380,

61. Grigg, G.W. Selective breakage of DNA along side 5-bromodeoxy-uridine nucleotide residues by high temperature hydrolysis. Nucl. Acids Res., 1977, v.4, N4, p.969-987.

62. Hamming, J., Cruber, M., A.B.G. Interaction between RNA polymerase and a ribosomal RNA promoter of E. coli. Nucl. Acids Res., 1979, v.7, N5, Р.Ю19-ЮЗЗ.

63. Hansen, U.M., McClure, W.R. Role of the sigma subunit of E.coli RNA polymerase in initiation. J. Biol. Chem., 1980, v. 255, N20, p.9556-9563.

64. Hayashi, M.N., Haylhi, M. Isolation of /Х174 specific mRNAin vivo and indentification of their 5' terminai nucleotides.

65. Heyden, В., Nusslein, C., Schaller, H. Single RNA polymerase binding site isolated. Nature New Biol., 1972, v.240, N96, p. 9-12.

66. Hillel, Z., Wu, C-W. Photochemical cross-linking studies on the interaction of E. coli RNA polymerase with T7 DNA. Biochemistry, 1978, v.17, N15, p.2954-2961.

67. Hinkle, D.C., Chamberlin, M.J. Studies of the binding of E. coli RNA polymerase to DNA. I. The role of sigma subunit in site selection. J. Mol. Biol., 1972, v.70, N2, p.157-185.

68. Humayum, Z., Kleid, D., Ptashne, M. Sites of contact between Л operators and X. repressor. Nucl. Acids Res., 1977, v.4, N5, p.1595-1607.

69. Johnson, A., Meyer, B.J., Ptashne, M. Mechanism of action of the cro protein of bacteriophage Л. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S.A., 1978, v.75, N4, p.1783-1787.

70. Johnsrud, L. Contacts between Escherichia coli RNA polymerase and lac operon promoter. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1978, v.75, N11, p.5314-5318.

71. Kapiza, E.L., Stukacheva,E.A., Shemyakin, M.F. The effect of the termination rho factor and ribonuclease III on the transcription of bacteriophage /6X174 DNA in vitro. FEBS Letters, 1976, v.64, N1, p.81-84.

72. Kapiza, E.L., Stukacheva, E.A., Shemyakin, M.F. Effect of E. coli p factor and RNase III on the formation of jz$X174 RNA in vitro. FEBS Letters, 1979, v.98, N1, p.123-127.

73. Kiss, A., Sain, В., Venetianer, P. The number of rRNA genes in E. coli. FEBS Letters, 1977, v.79, N1, p.77-79.

74. Kleckner, N., Roth, J., Botstein, D. Genetic engineering in vivo using translocatable drag-resistant elements. J. Mol. Biol., 1977, v.116, N1, p.125-159.

75. Kleid, D., Humayun, Z., Jeffrey, A., Ptashne, M. Novel properties of a restriction endonuclease isolated from Haemophilus parahemolyticus. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1976, v. 73, N2, p.293-297.

76. Kosaganov, Yu.N., Zarudnaja, M.I., Lazurkin, Yu.S., Frank-Kamenetskii, M.D., Beabealashvilly, R.S., Savochkina, L.P. Local unwinding of DNA during RNA synthesis in vitro. Nature New Biol., 1971, v.231, p.212-214.

77. Lund, E., Dahlberg, J.E. Initiation of E.coli ribosomal RNA synthesis in vivo. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1979, v.76, N11, p.5480-5484.

78. Maniatis, Т., Ptashne, M., Beckman, K., Kleid, D., Flashman, S., Jeffrey, A., Maurer, R. Recognition sequences of repressor and polymerase in the operators of bacteriophage lambda. Cell, 1975, v.5, p.109-113.

79. Maurer, R., Maniatis, Т., Ptashne, M. Promoters are in the operators in phage lambda. Nature, 1974, v.249, N5454, p.221-223.

80. Maxam. A.M., Gilbert, W. A new method for sequencing DNA. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1977, v.74, N2. p.560-565.

81. Mc Corquodale, D.J. The T-odd bacteriophages. CR Microbiol., 1975, v.4, p.101-159.

82. Mc Donell, M.W., Siman, M.N., Studier, P.W. Analysis of restriction fragments of T7 DNA and determination of molecular weights by electrophoresis in neutral and alkaline gels. J. Mol. Biol., 1977, v.110, N1, p.119-146.

83. Merril, C.R., Geier, M.R., Petricciani, J.C. Bacterial virus gene expression in human cells. Nature, 1971» v.233» N5319, p.398-400.

84. Meyer, B.J., Maurer, R., Ptashne, M. Gene regulation at the right operator (0R) of bacteriophage Я . ц. 0R1, 0R2, and 0R3: Their roles in mediating the effects of repressor and cro. J. Mol. Biol., 1980, v.139, N2, p.163-194.

85. Meyer, B.J., Kleid, D.J., Ptashne, M. Repressor turns off transcription of its own gene. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1975, v.72, N12, p.4785-4789.

86. Morita,M., Oka, A. The structure of a transcriptional unit on colicin E1 plasmid. Eur. J. Biochem., 1979, v.97, H2, p.435.443.

87. Morris, D.W., Kjeldgaard, И.О. Evidence for the non-co-ordinate regulation of RNA synthesis in stringent strains'of E. coli. J. Mol. Biol., 1968, v.31, p.145-148.

88. Mozola, M.A., Friedman, D.I., Crawford, C.L., Wulff, D.L., Shimatake, H., Rosenberg, M. Mutations reducing the activity of c17» a promoter of phage X formed by a tandem duplication. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1976, v.76, N3, p.1122-1125.

89. Musso, R.E., DiLauro, R., Adhya, S., de Crombrugghe, B. Dual control for transcription of the galactose operon Ъу cyclic AMP and its receptor protein at two interspersed promoters. Cell, 1977, v.12, N3, p.847-854.

90. Musso, R., DiLauro, R., Rosenberg, M., de Crombrugghe, B. Nucleotide sequence of the operator promoter region of the galactose operon of Escherichia coli. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1977, v.74, N1, p.106-110.

91. Nakanishi, S., Adhya, S,, Gottesraan, M., Pastan, I, Activation of transcription at specific promoters by glycerol.

92. J. Biol. Chem., 1974, v.249, N13, p.4050-4056.

93. Neve, R.L., West, R.W., Rodriguez, R.L. Eukaryotic DNA fragments which ac-^as promoters for a plasmid gene. Nature, 1979, v.277, N5694, p.324-325.

94. Niles, E.G., Conlon, S.W., Summers, W.C. Purification and physical characterization of 17 RNA polymerase from T7-in-fected E. coli B. Biochemistry, 1974, v.13, N19, p.3904-3912.

95. Oakley, J.L., Pascale, J.A., Coleman, J.E. T7 RNA polymerase: Conformation, fanctional groups, and promoter binding. Biochemistry, 1975, v.14, N21, p.4684-4691.

96. Oakley, J.L., Strothkamp, R.E., Sarris, A.H., Coleman, J.E.

97. Т7 RNA polymerase: Promoter structure and polymerase binding. Biochemistry, 1979, v.18, N3, p.529-537.

98. Oakley, J.L., Coleman, J.E, Structure of promoter for T7 RNA polymerase, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1977, v.74, N 10, p.4266-4270.

99. Okamoto, Т., Sugimito, K,, Sugisaki, H,, Takanami, M. DNA regions essential for the function of a bacteriophage fd promoter. Nucl. Acids Res., 1977, v.4, N7, p.2213-2222.

100. Oostra, B.A., van Ooyen, A.J.J,, Gruber, M. In vitro transcription of three different ribosomal RNA cistrons of E. coli, heterogeneity of control regions. Mol. Gen. Genet., 1 1977, v.151, p.1-6.

101. Ooyen, A.J.J., Gruber, M. The mechanism of action of ppGpp on RNA sinthesis in vitro. Cell, 1976, v.8, N1, p.123-128.

102. Otsuka, A., Abelson, J. The regulatory region of the biotin operon in E. coli. Nature, 1978, v.276, N5689, p.689-694.

103. Oullette, A.J., Preederick, D., Malt, R.A. Methylated messenger RNA in mause kindey. Biochemistry, 1975, v.14, N20, p.4361-4367.

104. Panayotatos, N., Wells, R.D. Recognition and initiation site for four late promoters of phage T7 is a 22-base pair DNA sequence. Nature, 1979, v.280. N5712, p.35-38.

105. Park, C.S., Hillel, Z., Wu, C-W. DNA strand specificity in promoter recognition by RNA polymerase. Nucl. Acids Res., v.8, N23, p.5895-5912.

106. Patrushev, L.I., Kapitza, E.L., Stukacheva, E.A., Shemyakin, M.F. Control of bacteriophage f£X174 gene expression by the transcription termination factor p in vitro. Mol. Gen. Genet., 1981, v.183, p.471-476.

107. Pogo, A.O., Allfrey, V.G., Mirsky, A.E. Evidence for increased ША template activity in regenerating liver nuclei, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1966, v.56, p.471-476.

108. Pollock, T,J., Tessman, I., Tessman, E.S. Radiologicol mapping of functional transcription units of bacteriophage j6X174 and S13. The function of proximal and distal promoters. J. Mol. Biol., 1978, v.124, N1, p.147-160.

109. Post, L.E., Arpston, A.E,, Nomura, M,, Jaskunas, S.R. Isolation and characterization of a promoter mutant in the str ribosomal protein operon in Escherichia coli. Cell, 1978, v. 15, N1, p.231-236.

110. Pribnow, D. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site at an early T7 promoter. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1975, v.72, N3, p. 784-788.

111. Pribnow, D. Bacteriophage T7 early promoters: Nucleotide sequences of two RNA polymerase binding sites. J. Mol. Biol., 1975, v.99, N3. p.419-443.

112. Primakoff, P., Artz, S.W. Positive control of lac operon expression in vitro by gusnosine 5'-diphosphate 3'-diphosphate. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1979, v. 76, p,1726-1730.

113. Ptashne, M., Beckman, K., Humayun, M.Z., Jeffrey, A., Maurer, R., Meyer, В., Sauer, R.T. Autoregulation and function of a repressor in bacteriophage lambda. Science, 1976, v.194, N4261, p.156-161.

114. Reznikoff, W.S., Abelson, J.N. The lac promoter. In: The Operon (Miller, J.H., Reznikoff, W.S., eds.), 1978, p.221-243, Cold Spring Harbor Lab., N.Y.

115. Rodriguez, R.L., V/est, R.W., Heyneker, H.L., Bolivar, P., Boyer, H.W. Characterizing wild-type and mutant promoters of the tetracycline resistance gene in pBR 313. Nucl. Acids Res., 1979, v.6, N10, p.3267-3287.

116. Rosa, M.D. Pour T7 RNA polymerase promoters contain an identical 23 b.p. sequence. Cell, 1979, v.16, N4, p.815-825.

117. Rosenberg, M., Court, D. Regulatory sequences involved in the promotion and termination of RNA transcription. Ann. Rev. Genet., 1979, v.13, p.319-353.

118. Russel, M., Gold, L., Morrissett, H., O'Farrell, P.Z. Tran-slational, untogenous regulation of gene 32 expression during bacteriophage T4 infection. J. Biol. Chem., 1976, v. 251, p. 7263-7270.

119. Rossi, J.J., Soberon, X., Morumoto, Y., McManon, J., Itakura, K. Biological expression of an Escherichia coli consensus sequence promoter and sam mutant derivatives. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1983, v.80, N11, p. 3203-3207.

120. Russell, D.R., Bennett, G.N. Construction and analysis of in vivo activity of E. coli promoter hybrids and promoter mutants that alter the -35 to -10 spacing. Gene, 1982, v.20, N2, p.231-243.

121. Sanger, P., Air, G.M., Barrell, B.G., Brown, N.L., Coulson,

122. A.Re, Fiddes, J.С,, Hutchison, III C.A., Slocombe, P.M., Smith, M. Nucleotide sequence of bacteriophage $X174 DNA. Nature, 1977, v.265, p.687-695.

123. Sanger, F., Coulson, A.R., Priedmann, Т., Air, G.M., Bar-rell, B.G., Brown, N.L., Piddes, J.C., Hutchison, III C.A., SXLocombe, P,M., Smith, M, The nucleotide sequence of bacteriophage (6X174. J. Mol. Biol., 1978, v.125, p.225-246.

124. Saucier, J-M., Wang, J.C. Angular alteration of the DNA helix by E. coli RNA polimerase. Nature New Biol., 1972, v.239, N93, p.167-170.

125. Schaller, H., Gray, C., Herrmann, K. Nucleotide sequence of an RNA polymerase binding site from the DNA of bacteriophage fd. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1975, v.72, N2, p.737-741.

126. Scherer, G.E.F., Walkinskaw, M.D., Armott, S. A computer aided oligonucleotide analysis provides a model sequence for RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1978, v.5, N10, p. 3759-3773.

127. Schmitz, A., Galas, D.J. The interaction of RNA polymerase an lac repressor with lac control region. Nucl. Acids Res., f979, v.6, N1, p.111-137.

128. Seeburg, P.H., Nusslein, C., Schaller, H. Interaction of RNA polymerase with promoters from bacteriophage fd. Eur. J. Biochem., 1977, v.74, N1, p.107-113.

129. Sekiya, Т., Khorana, G. Nucleotide sequence in the promoter region of the E. coli tyrosin tRNA gene. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1974, v.71, N8, p.2978-2982.

130. Sibenlist, U., Simpson, R.B., Gilbert, W. E. coli RNA polymerase interacts homologously with two different promoters. Cell, 1980, v.20, N2, p.269-281.

131. Sibenlist, U., Gilbert, V/. Contacts between E. coli RNA polymerase and an early promoter of phage T7. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1980, v.77, N1, p.122-126.

132. Sibenlist, U. RNA polymerase unwinds an 11-base pair segment of a phage T7 promoter. Nature, 1979, v.279, N5714, p.651-652.

133. Sibenlist, U. Nucleotide sequence of the three major early promoters of bacteriophage T7. Nucl. Acids Res., 1979, v.6, N5, p.1895-1907.

134. Silverstone, A.E., Arditti, R.R., Magasanik, B. Catabolite-insensitive revertants of lac promoter mutants. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1970, v.66, N3, p.773-779.

135. Simpson, R.B. The molecular topography of RNA polymerase-promoter interaction. Cell, 1979, v.18, N2, p.277-285.

136. Simpson, R.B. Contacts between E. coli RNA polymerase and thymines in lacUV5 promoter. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1979, v.76, p.3233-3237.

137. Sinsheimer, R.L. Bacteriophage *$X174 and related viruses. Progr. NugI. Acids Res. Mol. Biol., 1968, v.8, p.115-169.

138. Skare, J., Niles, E.G., Summers, W.C. Localization of the leftmost initiation site for T7 late transcription, in vivo and in vitro. Biochemistry, 1974, v.13, N19, p.3912-3916.

139. Smith, И.О., Wilcox, K.W. A restriction enzyme from H. influenzae. I. Purification and general properties. J. Mol. Biol., 1970, v.51, N2, p.379-391.

140. Smith, L.H., Sinsheimer, R.L. The in vitro transcription units of bacteriophage *5X174. I. Characterization of Synthetic parameters and measument of transcript molecular weights. J. Mol. Biol., 1976, v.103, N4, p.681-697.

141. Smith, L.H., Sinsheimer, R.L. The in vitro transcription units of bacteriophage $И74. II. In vitro initiation sftes of *$X174 transcription. J. Mol. Biol., 1976, v.103, N4, p. 699-710.

142. Stead, N.W., Jones, O.W. Stability of RNA polymerase-DNA complexes. J.Mol. Biol., 1967, v.26, N1, p.131-135.

143. Stender, W. Sequence-specific interaction of & subunit of

144. E. coli RNA polymerase with DNA. Nucl. Acids Res., 1980, v.8, N15, p.3453-3666.

145. Stuber, D., Bujard, H. Organization of transcriptional signals in plasmids pBR322 and pACYC184. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1981, v.78, N1, p.167-171.

146. Studier, P.W. Biology Department Brookhaven National laboratory Upton, N.Y. 11973.

147. Studier, P.W. Analysis of bacteriophage T7 early RNAs and proteins on slab gels. J. Mol. Biol., 1973, v.79, N2, p.237-248.

148. Stockel, P., May, P., Strall, I., Ceyka, Z., Hoppe, W., Heumann, H., Zillig, W., Crespi, H. The core subunit structure in RNA polymerase holoenzyme determined by neutron small-angle scattering. Eev. J. Biochem., 1980, v.112, p.411-417.

149. Sutcliffe, J.G. Complete nucleotide sequence of the E. c51i plasmid pBR322. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 1979, v. 43, p.77-90.

150. Tabak, M.P., Plavell, R.A. A method for the recovery of DNA from agarose gels. Nucl. Acids Res., 1978, v.5, p.2321-2332.

151. Takanami, M., Sugimoto, K., Sugisaki, H., Okamoto, T. Sequence of promoter for coat protein gene of bacteriophage fd. Nature, 1976, v.260, p.297-302.

152. Takeda, Y., Folkmanis, A., Echols, H. Cro regulatory protein specified by bacteriophage ?l.J. Biol. Chem., 1977, v.251,1. N10, p.6177-6183.

153. Talkington, С., Pero, J. Promoter recognition by phage SP01-modified RNA polymerase. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1978, v.75, N3, p.1185-1189.

154. Talkington, C., Pero, J. Distinctive nucleotide sequences of promoters recognized by RNA polymerase containing a phage-coded "b -like" protein. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 1979, v.76, N11, p.5465-5469.

155. Travers, A.A., Buckland, R. A mutation affecting the h sub-unit of RNA polymerase changes transcriptional specificity. Nature, 1978, v.273, N5661, p.354-358.

156. Travers, A.A., Buckland, R., Debenham, P.G. Regulation of promoter selection by RNA polymerase. In: Prom Gene to Protein: Information Transfer in Normal and Abnormal Cells, 1979, p.271-292, Acad. Press., N.Y.

157. Vologodskii, A.V., Lukashin, A.V., Anshelevich, V.V., Frank-Kamenetskii, M.D. Fluctuations in superhelical DNA. Nucl. Acids Res», 1979, v.6, N3, p.967-982.

158. Walz, A., Pirrotta, V., Ineichen, К.Л repressor regulates the switch between P^ and P promoters. Nature, 1976, v. 262, N5570, p.665-669.

159. Wang, J.C., Jacobsen, J.H., Sancier, J-M. Physicochemical studies on interactions between DNA and RNA polymerase. Unwinding of the DNA heltx by E. coli RNA polymerase. Nucl. Acids Res., 1977, v.4, N5, p.1225-1241.

160. Weber, K., Geisler, N. Lac repressor fragments produced in vivo and in vitro: An approach to the understanding of the interaction of repressor and DNA. In: The Operon (Meller, J.H., Reznikoff, W.S., eds), 1978, p.155-175, Cold Spring Harbor Lab., N.Y.

161. Weisblum, В., Graham, М.У., Gryczan, Т., Dubnau, D.J. Plasmid copy number control: Isolation and characterization of high-copy-number mutants of plasmid pE184. J. Bacterid., 1979, v.137, H1, p.635-643.

162. West, R.W., Neve, R.L., Rodriguez, R.L. Construction and characterization of E. coli promoter-probe plasmid vectors.

163. Cloning of promoter-containing DNA. fragments. Gene, 1979, v.7, N3-4, p.271-288.

164. Wu, C.W., Goldthwait, D.A. Studies of nucleotide binding to the ribonucleic acid polymerase by a fluorescence technique. Biochemistry, 1969, v.8, N11, p.4450-4458.

165. Young, R.A., Steiz, J.A. Tandem promoters direct E. coli ribosomal RNA synthesis. Cell, 1979, v.17, N1, p.225-234.

166. Zarudnaya, M.T., Kasaganov, Y.N., Lazurkin, Y.S., Frank-Kamenetskii, M.D., Beabealashvilli, R.S., Savochkina, L.P. The study of DNA-RNA polymerase complexes by kinetic formaldehyde method. Eur. J. Biochem., 1976, v.63, N2, p.607-615.

167. Выражаю свою глубокую благодарность моему научному руководителю МИХАИЛУ ФЕДОРОВИЧУ ШЕМЯКИНУ за постоянную поддержку при выполнении работы.

168. Считаю своим приятным долгом выразить глубокую признательность АРСЕНИЮ ВАСИЛЬЕВИЧУ ЧЕСТУХИНУ, чья постоянная помощь и поддержка сопутствовала при проведении этой работы.

169. Приношу глубокую благодарность всем сотрудникам Лаборатории генетической энзимологии за теплое и дружеское отношение и интерес к работе.