Специфика взаимодействия ряда коротких пептидов с молекулой ДНК в растворе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Морозова Екатерина Алексеевна

• Морозова Екатерина Алексеевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Морозова Екатерина Алексеевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Взаимодействие ДНК с пептидами и белками

1.1.1 Структурные характеристики ДНК

1.1.2 Механизмы распознавания сайтов связывания на ДНК белками

1.1.3 Сайт-специфическое взаимодействие белков с ДНК по большой бороздке

1.1.4 Сайт-специфическое взаимодействие белков с ДНК по малой бороздке

1.2 Взаимодействие ДНК с короткими пептидами

1.2.1 Виды биологически активных пептидов

1.2.2 Способы пептидов проникать через клеточную и ядерные мембраны

1.2.3 Возможные механизмы взаимодействия коротких пептидов с молекулой ДНК

1.3 Связывание ДНК с различными аминокислотами

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.2 Методы исследования

2.2.1 Некоторые сведения из статистики биополимеров

2.2.2 УФ-спектрофотометрия

2.2.3 Метод кругового дихроизма

2.2.4 Плавление ДНК

2.2.5 Низкоградиентная вискозиметрия

2.2.6 Люминесценция

2.2.7 Изотермическое калориметрическое титрование

2.2.8 Ядерно-магнитный резонанс. WaterLOGSY

2.2.9 Динамическое двойное лучепреломление

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Исследование взаимодействия пептида AEDG с ДНК

3.2 Исследование взаимодействия пептида AEDL с ДНК

3.3 Исследование взаимодействия пептида ЕБЯ с ДНК

3.4 Исследование взаимодействия пептида KEDW с ДНК

3.5 Ядерный магнитный резонанс систем ДНК-пептиды. Метод WaterLOGSY

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ТЕРМИНОВ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 ВВЕДЕНИЕ

Изучение молекулярных механизмов взаимодействия коротких пептидов с молекулой ДНК, может дать ответы на целый ряд актуальных вопросов, связанных с различными процессами, протекающими с участием ДНК и белков in vivo. Такие исследования позволяют выяснить роль специфичности связывания различных полипептидных последовательностей с нуклеиновыми кислотами, выявить роль электростатических взаимодействий в ДНК-белковом узнавании, рассмотреть предпочтительные позиции для связывания с ДНК коротких аминокислотных композиций. Кроме того, короткие пептиды сами могут обладать биологической активностью [1].

Известно, что коротким пептидам отводится важная роль в функционировании различных органов и тканей. В частности, пептиды являются важным молекулярным звеном в реализации функциональной активности нервной, эндокринной, иммунной систем. Несмотря на большой прогресс, достигнутый к настоящему времени при изучении природы действия пептидов, белков и даже отдельных аминокислот в биологических системах, на сегодняшний день многие аспекты ДНК-пептидного взаимодействия остаются не до конца раскрытыми [2, 3].

В работе изучали взаимодействие с молекулой ДНК в растворе коротких синтетических пептидов разного состава, отличающихся зарядовыми свойствами: AEDG, AEDL, EDR и KEDW. Используется совокупность различных экспериментальных методик, позволяющих детектировать связывание пептидов с ДНК, а также следить за состоянием вторичной и третичной структуры макромолекулы при взаимодействии.

Изучение молекулярного механизма действия коротких пептидов представляет научный интерес не только для понимания физико-химической природы ДНК-пептидного взаимодействия, но и для развития биоинженерии, использующей уникальные свойства биологических молекул при создании новых устройств и систем медицинского назначения, лежащих в основе современной персонифицированной терапии сложных заболеваний. Сказанное выше свидетельствует об актуальности темы исследования.

Научная новизна работы. Впервые было изучено связывание коротких пептидов AEDG, AEDL, EDR и KEDW с молекулой ДНК в растворе. Были определены термодинамические параметры их взаимодействия, а также проведена оценка специфики связывания этих пептидов с молекулой ДНК.

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты, полученные в настоящей работе, расширяют представление о молекулярных основах ДНК-белковых

взаимодействий in vivo, о свойствах ДНК-пептидных комплексов in vitro и о конформационных возможностях ДНК при формировании биологически значимых комплексов.

Методология. Для установления наличия взаимодействия ДНК с исследуемыми соединениями и для оценки термодинамических параметров комплексообразования были применены методы ультрафиолетовой спектрофотометрии, калориметрии и анализа кривых плавления ДНК. Для определения структуры комплексов и способов связывания пептидов с ДНК применяли методы вискозиметрии, динамического двойного лучепреломления в потоке, спектрофотометрии, люминесценции, кругового дихроизма, ядерного магнитного резонанса (ЯМР).

Личный вклад автора заключается в подготовке и проведении экспериментов (эксперименты по калориметрии и ЯМР были выполнены с участием сотрудников ресурсных центров СПбГУ), в обработке полученных данных, анализе и интерпретации результатов, участия в подготовке публикаций по теме исследований, в написании диссертации.

Достоверность полученных результатов подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, их согласованностью, использованием взаимодополняющих методов исследования.

Апробация работы. Основные результаты, полученные в работе, были представлены и обсуждены на следующих конференциях:

1. Международная молодежная конференция «ФизикА.СПб» (Санкт-Петербург, 2015).

2. ХХУ11 Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2015).

3. У съезд биофизиков России (Ростов-на-Дону, 2015).

4. ХХ11 международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2015).

5. 10 European Biophysics Congress (Dresden, 2015).

6. ХУШ Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул (Ярославль, 2016).

7. Инновационные российские технологии в геронтологии и гериатрии 2017, (Санкт-Петербург, 2017).

Основные результаты опубликованы в работах:

1. Кузнецова Е.П., Морозова Е.А., Касьяненко Н.А. Взаимодействие биологически активных пептидов KEDW, EDR с ДНК in vitro // Материалы научно-практической конференции «Инновационные российские технологии в геронтологии и гериатрии

2017», посвященной 25-летию Санкт-Петербургского института биорегуляции и геронтологии, 14-16 декабря 2017 г., Санкт-Петербург, С

2. Е.А. Морозова, Н.А. Касьяненко. Исследование взаимодействия пептида EDR c ДНК in vitro // ХУШ Симпозиум по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, 20-24 июня 2016 г., Сборник тезисов, С

3. Болдырев А. Ю., Морозова Е. А.', Кузнецова Е. П., Касьяненко Н. А. Взаимодействие коротких пептидов KE и KEDW с ДНК // Международная молодежная конференция ФизикА.СПб, 26-29 октября 2015 г., Сборник тезисов, С

4. Морозова Е. А. Сравнительный анализ взаимодействия коротких пептидов с ДНК in vitro // ХХУ11 Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 9-12 февраля, 2015 г., Сборник тезисов, С

5. Морозова Е.А., Болдырев А.Ю., Кузнецова Е.П., Линькова Н.С., Касьяненко Н.А. Взаимодействие коротких пептидов KE и KEDW с ДНК // У съезд биофизиков России, 4-10 октября 2015 г., г. Ростов-на-Дону, Сборник тезисов, Т. 1, С

6. Морозова Е. А. Исследование взаимодействия пептида KEDW с ДНК in vitro // Материалы ХХ11 международной молодежной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», секция «Биология», 13-17 апреля, 2015 г., Москва, Сборник тезисов, С

7. Е. Morozova, N. Kasyanenko, N. Linkova, У. Khavinson. DNA interaction with peptide KEDW // P. 185 EUROPEAN BIOPHYSICS JOURNAL WITH BIOPHYSICS LETTERS. -233 SPRING ST, NEW YORK, NY 10013 USA : SPRINGER, 2015. - Т. 44. - С. S185-S185.

По теме диссертации опубликовано 4 статьи, 2 из них в журналах, индексируемых в международных библиографических базах данных Web of Science и Scopus:

1. Морозова Е. А., Линькова Н. С., Хавинсон В. Х., Соловьёв А. Ю., Касьяненко Н. А. Взаимодействие пептида AEDL с ДНК in vitro // Журнал структурной химии. - 2017. - Т. 58. - №. 2. - С. 438-442. Перевод: E. A. Morozova, N. S. Lin'kova, У. Kh. Khavinson, A. Yu. Soloviev, N. A. Kasyanenko. In vitro interaction of the AEDL peptide with DNA // Journal of Structural Chemistry. - 2017. - Т. 58. - №. 2. - С

2. Silanteva I. A., Komolkin A. У., Morozova E. A., Vorontsov-Velyaminov P. N., Kasyanenko N. A. Role of Mono and Divalent Ions in Peptide Glu Asp Arg-DNA Interaction // The Journal of Physical Chemistry B. - 2019. - T123. - У. 9. - C

3. Морозова Е. А., Линькова Н. С., Касьяненко Н. А. Спектрофотометрическое исследование взаимодействия пептида H-Ala-Glu-Asp-Gly-OH c ДНК в растворе NaCl // Труды Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого. - 2012. -№. 514. - С

4. Khavinson V., Lin'kova N., Kukanova E., Bolshakova A., Gainullina A., Tendler S., Morozova E., Tarnovskaya S., Vinski DSP, Bakulev V. Neuroprotective Effect of EDR Peptide in Mouse Model of Huntington Disease // J Neurology and Neuroscience. - 2017. - Т. 1. - №. 8. - С

Положения, выносимые на защиту:

• Короткие пептиды AEDG, AEDL, EDR и KEDW взаимодействуют с ДНК in vitro. Реализуется слабое связывание со значением константы диссоциации порядка 10-3 M.

• Пептиды при связывании локализуются преимущественно в большой бороздке ДНК.

• Связывание пептидов с ДНК осуществляется с помощью электростатических взаимодействий и формирования и водородных связей.

• Формирование комплексов пептидов с ДНК влияет на состояние вторичной и третичной структуры макромолекулы.

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Взаимодействие ДНК с пептидами и белками

Специфическое взаимодействие различных белков с ДНК лежит в основе большинства биологических процессов. ДНК-белковые взаимодействия можно условно разделить на 2 категории: специфическое связывание белков или их частей с определенными последовательностями ДНК (так называемое прямое считывание) и неспецифическое связывание (непрямое считывание). Связывание аминокислот, входящих в состав белков, с определенными азотистыми основаниями может осуществляться как по малой, так и по большой бороздкам ДНК. Неспецифическое связывание может быть обусловлено, например, изгибом двойной спирали ДНК или оно может осуществляться в результате локальных изменений формы ДНК (например, когда большая бороздка сужается) [4].

Перед обсуждением основных способов взаимодействия ДНК и белков стоит также отметить базовые представления о термодинамике ДНК-белкового комплексообразования. Так же как и для большинства процессов, связывание белков с молекулой ДНК определяется изменением значений свободной энергии Гиббса AG!ind, - это разница энергии свободных молекул ДНК и белка и энергии комплекса. Значение и знак AG!ind характеризует наличие связывания и степень аффинности комплекса, которая выражается константой связывания Ка:

= ^Т1пКа (1),

где Ка - константа связывания, М-1, AG!ind - изменение свободной энергии Гиббса, Дж, Т -температура, в градусах К, Я- универсальная газовая постоянная.

Для специфического ДНК-белкового связывания характерно формирование кинетически и термодинамически стабильного молекулярного комплекса с четко определенной стехиометрией (это следствие определенного количества доступных сайтов связывания), тогда как неспецифическое связывание рассматривается как случайное взаимодействие белка или его части с любым участком ДНК.

ДНК-белковые взаимодействия с характерными значениями констант связывания в интервале Ка от 108 до 1011 М-1 считаются специфическими, в то время как для слабых неспецифических взаимодействий характерен интервал значений от 103 до 105 М-1[4].

Для оценки вклада различных процессов в изменение энергии при связывании необходимо учитывать энтальпийный и энтропийный вклад в изменение свободной энергии Гиббса:

Д^Ь£п$ = Д^Ьтй + ( — Т^ыпа.) (2Х

где AH!ind - изменение энтальпии при связывании, AS!ind - изменение энтропии при связывании. В большинстве случаев энтальпийная и энтропийная части вносят противоположный вклад в изменение свободной энергии Гиббса при комплексообразовании. Действительно, для большинства белков благоприятное изменение энтальпийного вклада (АНЦыа < 0) влечет за собой неблагоприятное изменение энтропийного вклада (-TAS!ind > 0). Может наблюдаться и противоположная ситуация, когда благоприятное изменение энтропийного вклада ( —TAS!ind < 0 ) сопровождается неблагоприятным изменением энтальпийного вклада (AH^ind > 0) [4]. Водородные связи, Ван-дер-Вальсовы или электростатические взаимодействия между белком и ДНК обычно положительно влияют на энтальпию, тогда как десольватация полярных групп и изменение структурных характеристик комплекса являются источником нежелательных изменений энтальпийного вклада. Изменения энтропии отражают вклад различных процессов, связанных с комплексообразованием, поэтому высвобождение молекул воды и перераспределение ионов благоприятно для комплексообразования, тогда как потеря поступательной, вращательной и колебательной степеней свободы, а также сворачивание пептидных цепей во время образования ДНК-белкового комплекса относятся к энтропийно неблагоприятным процессам [5].

Согласно существующим представлениям, механизм специфического распознавания последовательностей ДНК белками, в частности, факторами транскрипции включает два основных этапа. На первом этапе неспецифические дальнодействующие электростатические взаимодействия сближают белок и ДНК. Первый этап формирования комплекса сопровождается скольжением белка вдоль ДНК в одномерном процессе диффузии, что приводит к ускорению поиска белком нужной нуклеотидной последовательности. Как только белок обнаружил целевую последовательность ДНК, устанавливаются специфические взаимодействия. Образование комплекса часто сопровождается конформационными перестройками ДНК и белка [5].

Основываясь более чем на 1500 структурах ДНК-белковых комплексов, доступных в банке данных о белках PDB (Protein data bank), можно утверждать, что отдельные ДНК-связывающие белки используют множественные типы взаимодействий для достижения специфичности связывания с ДНК.

Несмотря на то, что структура ДНК была впервые предложена Уотсоном и Криком еще в 1953 году [7], до настоящего времени еще нет полного понимания механизма ДНК-белкового взаимодействия. Особый интерес вызывает механизм распознавания специфических сайтов связывания, учитывая большое разнообразие ДНК-связывающих белков. Большинство ДНК-связывающих белков является частью больших семейств, обладающих ДНК-связывающими

доменами с очень похожими биохимическими свойствами. Как эти белки выполняют свои уникальные функции in vivo? Поиск ответов на эти вопросы особенно актуален с учетом необходимости точного описания функций многих последовательностей генома, информация о которых теперь доступна. Сложность и актуальность этой проблемы были отмечены в ряде публикаций, в которых используются высокотехнологичные подходы, например, белок-связывающие микрочипы или бактериальная одногибридная система для создания базы данных о последовательностях ДНК, предпочтительных для ДНК-связывающих белков [8-11].

В статье Badis et al. [12] были описаны предпочтительные сайты связывания для 104 факторов транскрипции мыши, включающих несколько членов из одного семейства таких белков. Были сопоставлены наиболее предпочтительные ДНК-связывающие сайты для 21 члена семейства Sox (SRY-связанные группы высокой мобильности) / TCF (Т-клеточного фактора) транскрипционных регуляторов. Примечательно, что, хотя каждый фактор выполняет уникальные функции, 14 из 21 предпочитают связываться с последовательностью ACAAT. Вместе с тем, были выявлены небольшие различия в описании последовательности. Например, фактор Sox1 связывается с последовательностью ATTTAAAT, тогда как его два наиболее близких родственника (Sox14 и Sox21), а также гораздо более отдаленный член семейства SRY предпочли последовательность ACAAT. В этом исследовании также было показано, что многие факторы транскрипции обладают способностью распознавать два разных сайта связывания (так называемые первичные и вторичные сайты связывания) и что существует раннее недооцененная взаимозависимость между соседними парами оснований внутри сайта связывания [12].

Исследования, подобные вышеуказанным, указывают на ряд фундаментальных вопросов, касающихся механизма распознавания белковыми молекулами определенных последовательностей ДНК. Ответы на эти вопросы требуют лучшего понимания правил, определяющих механизм связывания белков, точнее, их пептидных фрагментов с определенными последовательностями нуклеотидов на ДНК.

Известно, что последовательность пар оснований ДНК в месте связывания белка не играет единственной решающей роли, поэтому необходимо учитывать трехмерные структуры обеих макромолекул, чтобы полностью понять распознавание белком ДНК. В частности, локальные вариации структуры ДНК могут быть столь же важны, как и структурные особенности белковой молекулы. В исследовании Parker SC et. al. [13], посвященном изучению эволюционных ограничений на топологию ДНК, решительно поддерживается вышеуказанная точка зрения.

В ранних работах по исследованию структуры ДНК методом рентгеноструктурного анализа впервые были изложены основные идеи механизма ДНК-белкового взаимодействия. Так, за основу связывания белковых молекул с ДНК была принята концепция взаимодействия белков с группами ДНК в большой бороздке, содержащей набор доноров, акцепторов, гидрофобных групп, которые могут быть комплементарно распознаны соответствующими группами аминокислотных остатков (а. о.) сайта связывания белка. Вскоре появились предположения, что короткие последовательности ДНК могут служить комплементарными сайтами связывания для аминокислот [14]. Согласно банку данных о белках PDB, практически все из 1500 ДНК-белковых комплексов образуются по вышеописанному механизму комплементарного взаимодействия или посредством способа прямого считывания. Тем не менее, нет простого кода распознавания или взаимно однозначного соответствия между ДНК и белковыми последовательностями при взаимодействии ДНК и белков. Из анализа ДНК-белковых комплексов часто можно заметить отличие формы связанной ДНК от традиционной В-конформации, что существенно влияет на специфичность взаимодействия (например, это относится к белку папиломовируса Е2) [15-16]. В этих случаях требуется изгиб или какая-либо другая деформация спирали ДНК для формирования водородных связей или неполярных взаимодействий между белком и ДНК. Основываясь на таких наблюдениях, был введен термин «непрямое считывание» [17]. Непрямым считыванием называют взаимодействие белка с ДНК, зависящее от пар оснований ДНК, которые непосредственно не контактируют с белком [18]. Этот термин включает случаи, когда последовательность ДНК принимает конформацию, которая впоследствии распознается белком, а также когда контакт белка с ДНК происходит с участием молекул воды. Кроме того, этот термин включает в себя любое взаимодействие между белками и ДНК, в котором ДНК не является спиралью в В-форме.

1.1.Структурные особенности ДНК-связывающих белков

Первые ДНК-белковые комплексы, структуры которых были изучены методом рентгено-структурного анализа, были представлены Cro-репрессором, -репрессором и катаболитовым активаторным белком. Эти белки связываются с соответствующими сайтами ДНК. В дальнейшем были изучены комплексы 1500 белков с ДНК (PDB, protein data bank, база данных белков) [19].

При классификации ДНК-связывающих белков, как правило, рассматривают конформацию белкового домена, участвующего в распознавании ДНК, и структуру ДНК-связывающего мотива. Под мотивом понимают общие структурные элементы, характерные для

регуляторных белков, участвующие в специфическом распознавании определенной последовательности ДНК. Согласно базе данных Scopus, все известные ДНК-связывающие белки разделены на 70 суперсемейств [20].

Известно, что некоторые локальные мотивы, такие как «спираль-поворот-спираль», используются неоднократно. Более того, в зависимости от белка и сайта связывания ДНК мотив может быть использован несколькими способами для взаимодействия с ДНК [21].

Рассмотрим способы связывания ДНК с белками, имеющими конформацию связывающего домена в виде а-спирали. Согласно базе Scopus, 17 суперсемейств ДНК-связывающих белков содержат а-спираль в структуре домена для распознавания сайтов связывания на ДНК. Известно, что а-спираль считается наиболее распространенной конформацией домена при связывании белков с ДНК по большой бороздке. Положение спирали в большой бороздке может варьироваться как для различных семейств белков, так и для белков внутри одного и того же семейства [22-23]. Такие белки, как Lac-репрессор [24-25] и интронные эндонуклеазы [26] взаимодействуют с ДНК по малой бороздке, используя а-спиральный домен. Для а-спиральной конформации домена характерны такие мотивы, как спираль-поворот-спираль (НТН - helix-turn-helix), спираль-петля-спираль (HLH - helix-loop-helix), лейциновая застежкаи и др. Мотив HTH присутствует во многих белках разных суперсемейств SCOP и является одним из наиболее часто представленных структурных мотивов. Структура мотива включает в себя 60 остатков аминокислот, образующих конформацию HTH, в которой а-спирали связаны с помощью коротких петлевых участков. Домен включает две антипараллельные N-концевые спирали и перпендикулярную им С-концевую спираль. В большинстве случаев, как например в Cro репрессоре, в распознавании сайта связывания на ДНК непосредственное участие принимает С-концевая спираль, или «спираль распознавания», тогда как N-концевые спирали играют важную роль в стабилизации ДНК-белкового комплекса [27-28]. Хотя большинство белков использует а-спираль при связывании с ДНК по большой бороздке, некоторые белки взаимодействуют с ДНК по малой бороздке также при участии а-спирали [29-30].

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Специфика взаимодействия ряда коротких пептидов с молекулой ДНК в растворе»

последовательность

аминокислот

о-спираль

образует поворот

Рисунок 1 - Упрощенная схема мотива НТН [30]

С помощью «спирали распознавания» белки через серию водородных связей и гидрофобных взаимодействий связываются с доступными основаниями ДНК. Остальные структурные элементы домена играют важную роль в стабилизации ДНК-белкового комплекса. Для НТН-мотива свойственна высокая консервативность, однако его структурный контекст и предварительная ориентация по отношению к распознаваемым им сайтам связывания ДНК, могут варьироваться для различных белков. Также аминокислотные последовательности вне центральной области НТН могут сильно различаться у белков [31].

Два других вида мотивов, реализуемых для а-спиральных белковых доменов, называются НЬН и лейциновая застежка. Мотив НЬН состоит из короткой а-спирали, связанной петлей с более длинной а-спиралью. Основной функцией мотива является димеризация белка с другими белками, содержащими такой же мотив, для образования гомо-или гетеродимеров. Партнер по димеризации часто определяет аффинность и специфичность ДНК-связывания, поскольку две а-спирали, по одному от каждого мономера, связываются с большой бороздкой ДНК [31-33].

Лейциновая застежка (Ь2ГР) представляет собой а-спираль с чередующимися приблизительно через каждые 8 а.о. лейцинов. Со структурной точки зрения это, вероятно, один из самых простых ДНК-связывающих мотивов, так как он состоит из димеров а-спиралей, содержащих около 60 а.о. В каждой спирали имеется два разных субдомена. С помощью Ь2ГР образуется димерный белок, благодаря связыванию двух параллельных а-спиралей

подобно застёжке молнии. В результате лейциновые остатки оказываются лежащими по одну сторону спирали, образуя амфифильную спираль, в которой одна сторона обладает гидрофобными свойствами. К-концевая область, состоящая преимущественно из основных аминокислот, локализуется в большой бороздке при связывании с молекулой ДНК, определяя таким образом большинство прямых контактов с основаниями ДНК и фосфатами. Лейциновая молния и основные области связаны через спейсер длиной 6 аминокислот [34-35].

Рисунок 2 - Комплекс «лейциновой застежки» с ДНК. На рисунке серым цветом отмечен регион bZIP, синим цветом выделены остатки лейцина, желтым - остальные аминокислотные остатки. Фиолетовым цветом выделена N-концевая «основная» область, участвующая в связывании с ДНК [36].

Мотив «лейциновая застежка» считается самым распространенный типом ДНК-связывающего домена среди эукариотических факторов транскрипции, участвующих в контроле клеточного роста. Также следует отметить, что формирование характерной конформации домена в виде «лейциновой застежки» происходит только в присутствии молекулы ДНК. С термодинамической точки зрения образование комплекса белков с доменом bZIP с ДНК имеет неблагоприятный энтропийный вклад (-TAS), возникающий из-за потери степеней свободы при складывании полипептидной цепочки в a-спираль. Именно изменение энтальпии от одновременного взаимодействия двух цепей в виде гомо- или гетеродимеров обеспечивает условия для компенсации неблагоприятного энтропийного вклада. Таким образом реализуется образование комплекса с ДНК-мишенью [5].

Было показано, что основным этапом взаимодействия bZIP белков с ДНК является начальное связывание мономера с низкой аффинностью и последующая димеризация белков на ДНК. Такой механизм обеспечивает быструю сборку димера на специфическом участке ДНК и позволяет избежать кинетического захвата неспецифических последовательностей [37].

Структура ДНК-связывающего домена также может быть представлена в форме Р-складчатостей, хотя их распространенность существенно ниже, чем для а-спиралей. Структура мотива, содержащие Р-нити и промежуточные петли, внедренные в преимущественно Р-доменные структуры, используются белками в семи суперсемействах SCOP для распознавания специфических последовательностей ДНК. Например, TBP используют поверхность Р-складчатости для связывания с ДНК по малой бороздке [38]. Вставка вогнутого 10-цепочечного Р-листа домена белка TBP в малую бороздку приводит к глубокому нарушению структуры ДНК. Участок TATA-бокса подвергается сильному «разматыванию» и изгибу, что позволяет создавать контакты между вогнутой поверхностью белка и краями пар оснований в малой бороздке.

Другим вариантом мотива домена в Р-конформации является имуноглобулиноподобный Р-сэндвич. Иммуноглобулиноподобные структурные домены используются для связывания c ДНК различных семейств белков, таких как р53-подобные транскрипционные факторы [39]. Последовательности иммуноглобулиноподобных доменов обладают низкой консервативностью в разных семействах невелика, а структуры белков за пределами области домена значительно расходятся. Хотя общей конформацией является Р-сэндвич, распознавание ДНК достигается, в основном, за счет промежуточных петель. Подобно а-спиральным ДНК-связывающим доменам, ориентация доменов Р-сэндвича относительно ДНК варьируется среди разных белков и различных семейств белков.

Помимо вышеназванных мотивов, другими примерами мотивов с доменами в Р-конформации являются Р-трилистник и Р-Р-Р-сэндвич [40]. Также следует отметить, что большое количество белков, принадлежащих к 48 суперсемействам SCOP, используют смешанные а/р домены для связывания с ДНК. Широко распространенным примером служит домен «цинковые пальцы».

«Цинковые пальцы» являются одним из самых широко распространенных доменов для распознавания ДНК, среди используемых регуляторными ДНК-связывающими белками. «Цинковые пальцы» - это компактный, состоящий из всего 30 а. о. ДНК-связывающий домен с относительно короткой а-спиралью, двумя антипараллельными Р-складчатыми листами и

2+

двухвалентным ионом цинка (Zn ), связанным координационной связью с остатками цистеина и гистидина [41]. «Цинковые пальцы» классифицируются по типу и порядку связанных с

цинком а.о., например, Cys2 His2 , Cys4 , и Cys6 . Специфичное распознавание последовательности ДНК достигается путем расположения а-спирали белка в большой бороздке ДНК для связывания с сайтом длиной в 3-4 пары оснований. Следует отметить, что для специфического считывания определенной последовательности ДНК требуется несколько доменов, соединённых короткими линкерами. Таким образом, цинковые пальцы часто встречаются в виде тандемных повторов (два, три или более), которые могут связываться по большой бороздке, как правило, c интервалами в 3 пары оснований. За создание специфичных для определенных последовательностей ДНК контактов отвечает а-спираль каждой области («спираль распознавания») [42]. А.о. а-спирали распознавания могут контактировать с четырьмя или более основаниями ДНК, для получения перекрывающегося рисунка контактов с соседними «цинковыми пальцами». В дополнение к вышеупомянутой группе белков, существуют другие семейства 2п2+-содержащих транскрипционных факторов, например, гормоны ядерных рецепторов, связывающихся с ДНК в виде нековалентных димеров [43].

В семействе факторов транскрипции бактерий содержится мотив лента-спираль-спираль (ribbon-helix-helix, RHH) [44], который состоит из двухцепочечной антипараллельной ß-ленты, за которой следуют две а-спирали. Распознавание ДНК достигается путем расположения ß-ленты в большой бороздке, тогда как две а-спирали содержат большую часть гидрофобного ядра и участвуют в димеризации. Примерами являются Met-репрессор MetJ [45] и Arc-репрессор [46].

Структурные исследования разнородных редукционных эндонуклеаз с высокой специфичностью к ДНК-последовательности показали, что все они имеют общее структурное ядро со смешанной a/ß-архитектурой [47, 19]. Большое количество структурных данных также показывает, что ДНК-полимеразы, ферменты репарации ДНК и модифицирующие ДНК ферменты имеют смешанные a/ß-доменные структуры [19].

Многие ДНК-связывающие белки содержат множественные домены, функционирующие в совокупности для распознавания разных областей последовательности. Таким образом достигается высокая аффинность и специфичность распознавания. Примерами являются белки домена Rel-гомологии, такие как NF-kB p50, которые имеют два иммуноглобулиноподобных домена в каждом мономере: N-концевой домен обеспечивает контакты с ДНК, главным образом, по большой бороздке, а С-терминальный домен отвечает за гомо- и гетеродимерные взаимодействия в дополнение к контакту с ДНК [48]. Боковые цепи, связанные с формированием димеров, лежат вдоль одной грани ß-сэндвича, оставляя петли свободными для контакта с ДНК. Фактор транскрипции Escherichia coli Rob, принадлежащий к семейству AraC / XylS, имеет два домена HTH: один специфически связывается с ДНК, тогда как другой

образует единственный солевой мостик с сахаро-фосфатным остовом ДНК [49, 50]. ТСБ (фактор Т-клеток) связывается со специфическими последовательностями ДНК через домен группы высокой подвижности (НМО).

Таким образом, уникальность архитектуры ДНК-связывающих доменов белков и широкое разнообразие мотивов определяют специфичность взаимодействия молекул. Однако как упоминалось выше, в реализации взаимодействия помимо последовательности нуклеотидов важную роль играет также структура ДНК. Далее будут рассмотрены различные вариации последовательностей и конформаций ДНК, обеспечивающих связывание регуляторных белков.

1.1.1 Структурные характеристики ДНК

Анализ нуклеотидной последовательности ДНК сводится к определению одномерной строки текста, состоящего всего из четырех символов: А, С, О и Т. Чередование азотистых оснований, соединенных с сахаро-фосфатным остовом, составляет первичную структуру нуклеиновых кислот. Спаривание комплементарных оснований противоположных цепей с помощью водородных связей определяет вторичную структуру ДНК - двойную спираль. Заметим, что комплементарность оснований лежит в основе создания наноструктур на основе ДНК [51]. Известно, что при определенных условиях структура ДНК может меняться в зависимости от последовательности оснований [52, 53], и структурные изменения используются белками для распознавания нужных им последовательностей ДНК [54].

В Таблица 1 представлены основные виды ДНК-структур, определяемые последовательностью нуклеотидов в цепи.

Таблица 1 - Тип вторичной структуры ДНК в зависимости от последовательности нуклеотидов (адаптировано из [19])

Последовательность нуклеотидов Тип структуры

АТ-богатая В-форма или А-ДНК при низкой влажности

ОС-богатая А-ДНК при низкой влажности

А-тракт В'-ДНК, узкая малая бороздка, изгиб

ТАТА-бокс Высокая деформируемость, А-ДНК, ТА-ДНК после связывания ТВР

ЯУ-чередование (особенно ОС) Z-ДНК при высокой концентрации соли, при метилировании цитозина или при суперспирализации

УрЯ шаг (особенно ТрА шаг) Сжатая большая бороздка, высокая деформируемость, перегиб

YpR шаг Сжатая малая бороздка, низкая деформируемость

* А - аденин, Т - тимин, G - гуании, С - цитозин, R - пурин; Y - пиримидин. Нижний регистр «р» между нуклеотидами означает фосфат, чтобы отличить шаг пары оснований от пары оснований.

Таблица 1 отражает общие тенденции для некоторых последовательностей, имеющих особые структурные характеристики. Важно подчеркнуть, что конформация ДНК зависит от условий окружающей среды (например, концентрации, влаги, соли) [55, 56]. Например, хотя АТ-богатая ДНК обычно находится в форме В, олигонуклеотиды, содержащие TATA-бокс, кристаллизуются в форме A [57], которая является основой специфичности белкового взаимодействия с TATA. Кроме того, в силу высокой деформируемости TATA-боксов, на их структуру влияют эффекты длинной последовательности [58] и суперспирализация ДНК. TATA-бокс, фланкированный областями чередования GC, может также принимать конформацию Z-ДНК [59].

Различия в форме ДНК могут создавать разные электростатические потенциалы. Например, узкие малые бороздки локально усиливают отрицательный электростатический потенциал ДНК через электростатическую фокусировку [ 19, 60, 61]. Это явление было впервые описано для полости белка супероксид-дискатазы [62] и оно также играет роль в распознавании кодонов-антикодонов в передающих РНК [63, 64] и при сдвиге констант диссоциации в каталитических сайтах РНК [65]. Этот эффект играет важную роль в распознавании ДНК белком. Рисунок 3 иллюстрируют тесную связь между формой и электростатическим потенциалом в разных структурах ДНК.

Кривизна поверхности

Распределение электростатического потенциала А-ДНК(вС) В-ДНК(вС) В-ДНК(АТ) г-днк(вс)

Рисунок 3 - Форма спирали (А-ДНК, В-ДНК и 2-ДН и электростатический потенциал (адаптировано из [19])

Как отмечали ранее, глобальные вариации формы ДНК включают полиморфизм двойной спирали: выделяют В-ДНК, А-ДНК, ТА-ДНК и 2-ДНК. Наиболее распространенной формой двухцепочечной ДНК является В-ДНК, которая обычно реализуется в водном растворе и в клетках [66]. Большинство ДНК-связывающих белков распознают В-ДНК и ее структурные варианты. В-ДНК - это правозакрученная двойная спираль с парами оснований, плоскости которых ориентированы приблизительно перпендикулярно оси спирали. В-ДНК имеет широкую и неглубокую большую бороздку и узкую глубокую малую бороздку (Рисунок 3 б, в) [19, 53]. Как видно из Рисунок 3 (е, ж), малая бороздка В-ДНК обычно обладает большим электроотрицательным потенциалом, чем большая бороздка. Различия в потенциалах в любой канавке между последовательностями, обогащенными AT и GC, обусловлены расположением полярных групп оснований; в частности, насыщенные АТ-последовательности формируют больший отрицательный электростатический потенциал в малой бороздке, по сравнению с последовательностями, обогащенные GC (Рисунок 3 е, ж) [19, 53, 67]. Эти эффекты дополнительно усиливаются зависящими от последовательности эффектами ширины канавки.

Конформация A-ДНК характерна для дегидратированных сред. Она также реализуется в некоторых комплексах белок-ДНК [68]. GC-богатые последовательности имеют повышенную

тенденцию к образованию промежуточных конформаций А-ДНК или А/В [69]. Это свойство частично определяется тем, что пары ОС оснований имеют три водородные связи, тогда как пары АТ имеют только две. Это может способствовать переходу ДНК из А-формы в В [70]. Также такая тенденция наблюдается и для ТАТА-боксов, частично из-за того, что шаг ТрА вызывает скручивание спирали в виде «пропеллера». А-ДНК также представляет собой правую двойную спираль с парами оснований, сдвинутыми к малой бороздке, и, по сравнению с В-ДНК, они наклонены относительно оси спирали примерно на 20°. Это приводит к образованию глубокой большой бороздки и очень мелкой малой бороздки (Рисунок 3 а) [19, 36]. На основе этой геометрии большая бороздка А-ДНК напоминает форму малой бороздки В-ДНК, что объясняет, почему большая бороздка А-формы, в отличие от В-ДНК, имеет более отрицательный электростатический заряд, чем малая (Рисунок 3 д) [19, 64].

ТА-ДНК представляет собой вариант А-ДНК, наблюдаемый в ТАТА-боксах, специально распознающихся ТВР. ТА-ДНК отличается от А-ДНК, главным образом, большим наклоном пары оснований (около 50°, относительно оси спирали).

Было показано, что чередующиеся пурин-пиримидиновые последовательности образуют левую двойную спираль (2-ДНК) при высоких концентрациях солей [72, 73]. Из-за зигзагообразной конформации спирали эта топология была названа 2-ДНК. 2-ДНК не имеет ярко выраженной большой бороздки, но малая бороздка имеет размеры малой бороздки В-ДНК, но с зигзагообразной траекторией основной цепи (Рисунок 3 ё) и равномерным отрицательным электростатическим потенциалом (Рисунок 3 з) [19].

К вариантам изменения топологии двойной спирали также относят изгибы спирали. Изгибы определяются как кривизна, распределенная на участке нескольких пар оснований. Часто наблюдается изгиб для последовательностей, которые содержат А-тракты, представляющие собой участки пар оснований АТ, которые включают шаги АрА (ТрТ) и АрТ, но не ТрА, [74]. Для объяснения происхождения изгиба были предложены различные модели [75]. Эти модели либо связывают изгиб с углами клина между соседними парами оснований, которые могут включать как крен, так и наклон, либо с переходами между областями с отрицательным наклоном базовой пары (А-тракты) и областями с положительными наклонами [76, 77].

Также большое значение в распознавании последовательностей ДНК белками отводится локальным топологиям структуры (например, локальные изломы двойной спирали и сужение малой бороздки). Изломы ДНК являются результатом полной или частичной потери стэкинг-взаимодействий. Шаги пиримидин-пурин (УрЯ) ТрА, СрА (ТрО) и СрО наименее стабилизированы посредством стэкинг-взаимодействий, причем в особенности шаг ТрА [78].

Поэтому этот участок является наиболее гибким из 10 уникальных динуклеотидов и упоминается как шаг «шарнира» [79, 80]. Изломы образуются на отдельных шагах пар оснований и области, прилегающие к ним, могут оставаться В-форме или могут быть изогнуты. Изгиб и перегиб могут усиливать друг друга, как в случае шагов CpA, смежных с A-трактом

[81]. Изломы часто стабилизируются связыванием белка в тех случаях, когда потеря стэкинг-взаимодействия компенсируется интеркаляцией гидрофобных боковых цепей белка, обычно дополнительно деформирующих перекрученный динуклеотид.

Сужение малой бороздки - еще одна особенность структуры ДНК [54]. Различия в ширине малых бороздок возникают из-за различий в схеме водородных связей каждой пары оснований и стэкинг-взаимодействиях для каждой ступени динуклеотида. Для оптимизации обоих типов взаимодействий структуры ДНК изменяются по трем параметрам вращения: относительное вращение между соседними парами оснований по отношению к оси спаривания оснований, скручивание спирали (относительное вращение между соседними парами оснований по отношению к оси спирали) и прокручивание пропеллера (относительное вращение между основаниями в паре оснований по отношению к оси спаривания основания)

[82]. Шаги пары оснований ApT обычно имеют отрицательные углы наклона, что приводит к сжатию малой бороздки [83]. В последовательности A-трактов шаги ApT и ApA (TpT) исключают отрицательное вращение, а водородные связи в паре оснований A:T приводят к скручиванию пропеллера, что усиливает незначительное сужение бороздок [84, 85]. Кроме того, несколько пар A:T в ряду улучшают скручивание пропеллера за счет образования межзонных парных водородных связей в большой бороздке [74]. В отличие от ApA (TpT) и ApT, скрученные пропеллером шаги TpA приводят к стерическому столкновению поперечных аденинов [86]. Следовательно, шаги TpA обычно расширяют бороздку и разрушают жесткие структуры A-тракта и за счет этого называются шарнирными шагами [87].

1.1.2 Механизмы распознавания сайтов связывания на ДНК белками

Сайты связывания ДНК и белков обычно включают с себя в среднем около 24 а.о. и 12 нуклеотидов [88]. Хотя все взаимодействия определяются афинностью, специфичность можно рассматривать как результат множества взаимодействий, характерных для этих последовательностей. Именно эти специфические контакты представляют наибольший интерес. Переходя к рассмотрению основных механизмов ДНК-белкового взаимодействия, важно отметить, что сам процесс распознавания белком целевой последовательности ДНК включает в себя множество подэтапов. Известно, что большинство гомеодоменов содержат остаток

аспарагина в положении 51 (Asn51), что определяет связывание с АТ-богатыми последовательностями, такими как ТААТ [89]. Таким образом, Asn51 можно рассматривать как критическую детерминанту гомеодоменной ДНК-связывающей специфичности. Однако, поскольку все гомеодомены имеют Asn51, этот остаток не может способствовать специфике этого суперсемейства. На более тонком уровне позиция 50 гомеодомена частично выполняет эту роль: если на позиции 50 находится глутамин (Gln50), то предпочтительными сайтами связывания являются TAATTG или TAATTA (подчеркнуты контакты для глутамина), но если это лизин, предпочтительным сайтом связывания является TAATCC [90, 91]. Однако подмножество гомеодоменных белков, которые имеют глутамин в положении 50, по-прежнему очень велико и включает в себя все гомеодомены Hox, только 39 из которых встречаются у людей. В дополнение к Asn51 и Gln50, которые представлены в мотиве HTH в большой бороздке, белки Hox связываются с малой бороздкой [92]. Как обсуждается ниже, этот способ распознавания белком ДНК способствует специфике внутри семейства Hox. Из этого примера мы видим, что ДНК-связывающие белки используют множественные механизмы считывания. Таким образом, специфика достигается комбинациями механизмов, предопределяющих выбор сайтов связывания.

Считается, что контакты между белками и сахаро-фосфатным остовом ДНК обычно мало влияют на специфичность [93]. Тем не менее, такие контакты могут обеспечивать выгодное позиционирование других элементов белка, участвующих в специфическом взаимодействии. Так, за счет контактов с сахаро-фосфатным остовом, обеспечивающих выгодное сближение белка с молекулой ДНК, могут реализовываться водородные связи белкового ДНК-связывающего домена с основаниями в большой бороздке [21]. Белковые семейства часто содержат консервативные остатки, контактирующие с сахаро-фосфатным остовом ДНК. Наличие консервативных остатков определяет выгодную ориентацию относительно ДНК определенного участка при взаимодействии [94]. Кроме того, специфичность может зависеть напрямую от контактов с остовом ДНК, если эти контакты детерминированы отклонениями конформации ДНК от идеальной B-формы (ниже она упоминается как неидеальная B-ДНК). Примером может служить считывание узких областей малой бороздки, в которых фосфаты расположены в положениях, отличных от идеальной B-ДНК. Репрессор Arg из Mycobacterium tuberculosis, в частности, распознает сужение малой бороздки через множественные контакты домена в виде четырехцепочечного Р-листа с фосфатными группами. При этом белковый домен перекрывает сверху часть малой бороздки, не интеркалируя в неё какую-либо из своих боковых цепей [95].

На Рисунок 4 схематично представлены основные типы ДНК-белковых взаимодействий и то, на каком уровне структурной организации ДНК реализуются определенные типы связывания.

Рисунок 4 - Классификация основных видов ДНК-белковых взаимодействий (адаптировано из [19])

Остановимся более подробно на основных типа прямого считывания при связывании белков с ДНК.

А) Водородные связи и солевые мостики между сахаро-фосфатным остовом ДНК и основными аминокислотными остатками белка (лизин, аргинин и гистидин). Это тип взаимодействия не отличается специфичностью, но обладает высокой термодинамической стабильностью и может способствовать расположению распознающего домена в правильной ориентации относительно ДНК.

Б) Водородные связи между остатками сахаров или основаниями ДНК и полярными боковыми цепями белков. Такое взаимодействие, наоборот, обеспечивает высокую степень специфичности. Анализ имеющихся рентгеновских снимков структур ДНК-белковых комплексов показывает, что аргинин, лизин, серин и треонин являются наиболее распространенными аминокислотами, участвующими в этом типе водородных связей. Любопытно, что а. о. аспаргин или глутаминовая кислота почти не используются, вероятно, из-за их неблагоприятного электростатического взаимодействия с остовом ДНК. Особенно

важными являются бидентатные водородные связи, образованные одной боковой цепью белка с основанием или парой оснований. Такие взаимодействия обеспечивают термодинамически выгодный способ увеличения энергии связи аминокислота-основание при реализации более высокой степени специфичности для данной последовательности.

В) Неполярные контакты между парами оснований ДНК и неполярными участками аминокислотных цепей. Хотя считается, что они играют меньшую роль в специфичности, чем водородные связи, в настоящее время они признаны важным компонентом в связывании белка с ДНК. Например, было обнаружено, что гидрофобные взаимодействия между боковыми цепями белка и метильной группой тимина играют ключевую роль в специфичности [96].

Г) Водородные связи, опосредованные молекулами воды. Такое взаимодействие широко распространенно между остовом ДНК и полярными или заряженными аминокислотами (аргинин, лизин, аспарагин, глутамин) и даже отрицательно заряженными остатками глутаминовой и аспарагиновой кислот. Было показано, что около 30% такого взаимодействия занимает связывание с азотистыми основаниями ДНК [19]. Как правило, те же молекулы воды, которые образуют гидратную оболочку ДНК, участвуют в образовании водородных связей с белком и тем же участком ДНК. Таким образом, реализуется сайт-специфичность за счет взаимодействия с гидратированными участками ДНК. В другом случае белок связывается с ДНК за счет водородных связей не опосредованных молекулами воды (но ранее этот участок ДНК был также гидратирован). Считается, что большинство опосредованных водой контактов функционируют как «наполнители пространства» для улучшения комплементарности взаимодействующих поверхностей и улучшения электростатических взаимодействий [97]. Так, молекулы воды, участвующие во взаимодействии, экранируют электростатическое отталкивание между отрицательно заряженными участками ДНК и белков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Морозова Екатерина Алексеевна, 2019 год

- т

—

Ё * •

Е т ^^^ 9 •

Е

Е • -"

Е •

~ ш

— У* • Г У. "

- 1 1 1 1 i i > > 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 i i i i i i i > i i

7 10

1 15

Г 20

25

Т

30

т

35

номер инъекции

Рисунок 66 - Калориметрическая изотерма связывания KEDW с ДНК: зависимость удельной теплоты, выделившейся при каждой инъекции соединения, от номера инжекции. Сплошная линия соответствует модели идентичных независимых мест связывания.

Для исследуемого пептида полученное значение Ка = 6.7*10-3 М.

Измерение приведенной вязкости раствора ДНК при увеличении концентрации пептида KEDW показало (Рисунок 67 А), что, как и для других пептидов, в условиях малой ионной силы раствора вязкость уменьшается, а при больших концентрациях соли в растворе она остается неизменной.

Изменение вязкости сопровождается падением оптической анизотропии ДНК (Рисунок 67 Б). Эти данные были получены методом динамического двойного лучепреломления с использованием значений приведенной вязкости для каждого из растворов. Измеряли величину двойного лучепреломления Дп, затем с учетом относительной вязкости используемого раствора

ДНК определяли величину ~(а! — а2). Эта величина пропорциональна оптической

анизотропии статистического сегмента (разности поляризуемостей жесткого участка ДНК в направлениях параллельном и перпендикулярном оси спирали). Оптическая анизотропия статистического сегмента, в свою очередь, связана с жесткостью макромолекулы. Эта величина равна произведению числа пар оснований в сегменте и разности поляризуемостей пары оснований в тех же осях. Как видно из Рисунок 67 Б, изменение оптической анизотропии статистического сегмента примерно соответствует изменению приведенной вязкости раствора ДНК при увеличении концентрации пептида. Так как приведенная вязкость зависит от жесткости макромолекулы, учет только этой зависимости должен был привести к меньшему падению вязкости. Тем не менее, падение вязкости возможно, обусловлено частичным нарушением вторичной структуры ДНК (например, большей подвижностью А-Т пары из-за

разрыва одной водородной связи). Такое изменение в структуре может привести к локальному изгибу спирали, что и проявляется в методе вискозиметрии.

А Б

Рисунок 67 - Относительное изменение приведенной вязкости раствора ДНК (А) и относительное изменение оптической анизотропии статистического сегмента ДНК (Б) в присутствии пептида KEDW при его разных концентрациях. Измерения проведены в растворителе 5 мМ, 0.15М и 1М №С1, рН фиксирован с помощью Тш-НО буфера, рН=6.8, С(ДНК)=0.008%.

Таким образом, падение вязкости на Рисунок 67 А, как и ранее, может быть обусловлено связыванием пептида с ДНК и падением объема макромолекулы. Отсутствие изменений приведенной вязкости растворов ДНК, содержащих комплексы ДНК с KEDW, при больших ионных силах (ц=0.15, ц=1) ранее отмечался и для других пептидов.

Интересно сопоставить падение вязкости растворов ДНК в присутствии различных пептидов при малой концентрации соли в растворе (Рисунок 68). Как видно из рисунка, для КEDW падение вязкости чуть меньше, чем для других пептидов, хотя для растворов ДНК с AEDR, АЕОЬ, KEDW приведенная вязкость раствора падает примерно до одного значения. Исключение составляет пептид EDR. Так как зарядовые свойства у пептидов различны, а также так как нет корреляции между зарядом пептидов и фиксируемым изменением вязкости, можно заключить, что только электростатические взаимодействия не могут нести ответственность за изменение объема молекулярного клубка.

1 .00

0.75 -

0.50 -

КЕй\Л/ АБОв АЕЭЬ

-■- ЕС«

0.25 -

С =0,12 по.)

0.00

0.0

2.5

5.0

7.5

1 0.0

Г

Рисунок 68 - Результат изучения систем методом вискозиметрии. Показана зависимость относительного изменения приведенной вязкости от величины г в 0.005 М №С1.

Как было показано, в формировании комплекса KEDW с ДНК непосредственное участие принимает аминокислота триптофан. Понижение оптической анизотропии ДНК при образовании комплексов KEDW с ДНК в растворах малой ионной силы могло бы указывать на снижение жесткости ДНК, но одна эта причина не может объяснить полученный методом вискозиметрии результат. Кроме того, и для других пептидов фиксировалось падение вязкости, но оптическая анизотропия ДНК оставалась неизменной. Так как пептид KEDW содержит ароматическую группу, обладающую значительной оптической анизотропией, ориентация этой группы в составе триптофана при связывании с ДНК может повлиять на измеряемую оптическую анизотропию статистического сегмента. Именно этим объясняется полученный результат, который ранее не фиксировался при исследовании других пептидов. Таким образом, мы можем предположить, что при связывании KEDW с ДНК происходит формирование комплекса, в котором ароматическая группа триптофана достаточно жестко закреплена (при большой подвижности этой группы ее беспорядочная ориентация относительно плоскостей оснований препятствовала бы ее заметному вкладу в измеряемую оптическую анизотропию статистического сегмента ДНК. Полагаем, что ее плоскость не параллельна плоскости азотистых оснований. Достаточно жесткая фиксация этой группы предполагает ее расположение в одной из бороздок ДНК.

3.5 Ядерно-магнитный резонанс систем ДНК-пептиды. Метод WaterLOGSY

В эксперименте использовали короткие синтетические пептиды AEDG, AEDL, КEDW и EDR и синтетические короткие олигонуклеотиды (18 п.о.). Исследовалась возможность связывания исследуемых пептидов с олигонуклеотидами. Олигонуклеотиды были выбраны исходя из данных молекулярного докинга [179]. Ниже приведены структуры синтетических олигонуклеотидов:

ДНК1: GCCCAGCATTTCACCCAG ДНК2: CCGGATCCTGCCCACTGG ДНК3: GCAGCCGGGCAGGCACG

Были получены Н-спектры пептидов и олигонуклеотидов, спектры WaterLOGSY. Спектры чистых пептидов были сняты при концентрации C=10-2 М. Спектры олигонуклеотидов при концентрации C=0.8 М. Комплексы были приготовлены в соотношении г= 50, где г^^У^ДНК). В качестве растворителя использовали 50 мМ натрий-фосфатный буфер. 1)

2)

3)

Рисунок 69 - ^спектры олигонуклеотидов ДНК1 (1), ДНК2 (2) и ДНК3 (3).

Ниже представлены Н-спектры пептидов. 1)

2)

3)

[ррт]

Рисунок 70 - Н-спектры пептидов ЕБЯ (1), АЕБЬ (2), КЕБ\У (3) и АЕБО (4).

Были получены Н-спектры комплексов пептида ЕБЯ с тремя различными олигонуклеотидами, а также \Уа1егЬСЮ8¥ спектры.

Рисунок 71 - Н-Спектр комплекса пептида ЕБЯ и ДНЮ.

[ррт]

Рисунок 72 - \Уа1егЬСЮ8¥ спектр комплекса пептида ЕБЯ и ДНЮ.

На спектрах ЯМР видно отсутствие значимых положительных сигналов NOE пептида при связывании с олигонуклеотидом ДНК1. Аналогичные результаты были получены и с другими последовательностями олигонуклеотидов (данные не приведены).

Были получены Н-спектры комплексов пептида AEDL с тремя различными олигонуклеотидами, также WateгLOGSY спектры.

8 6 4 2 [ррт]

Рисунок 73 - ^Спектр комплекса пептида AEDL и ДНК 1.

Рисунок 74 - WateгLOGSY спектр комплекса пептида AEDL и ДНК1.

Были получены Н-спектры комплексов пептида KEDW с тремя различными олигонуклеотидами, а также WaterLOGSY спектры.

- ф

_ 03 о

10 8 б 4 2 [ррт]

Рисунок 75 - Н-спектр комплекса пептида KEDW и ДНК1.

Были получены Н-спектры комплексов пептида AEDG с тремя различными олигонуклеотидами, а также WaterLOGSY спектры.

8 9 4 2

Рисунок 77 - Н-спектр комплекса пептида AEDG и ДНК1.

Рисунок 78 - WateгLOGSY спектр комплекса пептида AEDG и ДНК1.

Для всех изученных пептидов AEDG, AEDL, EDR и KEDW не было получено положительного NOE сигнала при взаимодействии с олигонуклеотидами, что согласуется с данными изотермического калориметрического титрования, согласно которому значения

2 3 1

констант связывания для пептидов лежат в интервале от 10 до 10 М" . Взаимодействие пептидов с ДНК относится к слабому связыванию. Значения констант связывания находятся за пределами чувствительности метода ЯМР, которым возможно зарегистрировать взаимодействие со значениями констант связывания, лежащими в интервале от 104 до 109 М-1.

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе проведено исследование взаимодействия четырех коротких пептидов с макромолекулой ДНК в растворе. Рассмотренные пептиды обладают различными аминокислотными последовательностями, суммарным зарядом и индексом гидрофобности. Тем не менее, для всех исследованных молекул пептидов выявлены общие характерные закономерности в их взаимодействии с молекулой ДНК.

Методом калориметрического титрования для комплексов пептидов с ДНК проведена оценка константы диссоциации, которая для всех изученных в работе пептидов составила величину порядка 10 М. Для пептидов эта величина несколько различается: для KEDW она составляет К = 6.7х10-3М; для AEDL К = 1.5х10-3М; для AEDG К = 1.67х10-3М; для EDR Ка = 10-3М. Для констант диссоциации такого порядка характерно слабое связывание Исследования указывают на реализацию одного типа связывания пептидов с ДНК.

Спектральными методами было изучено влияние пептидов на вторичную структуру ДНК. Для оценки взаимодействия были применены методы УФ-спектрофотометрии, спектроскопии кругового дихроизма и анализа кривых плавления.

Методом УФ-спектрофотометрии было показано, что пептиды различной структуры изменяют спектральные свойства двойной спирали ДНК. Так, для ДНК в присутствии всех пептидов характерно наличие гиперхромного эффекта без сдвига полосы поглощения ДНК. Гиперхромизм зависит от концентрации пептидов в растворе ДНК. Так, для пептида AEDG характерно присутствие гиперхромного эффекта при отношении концентраций пептида и ДНК г больше 3. Рост гиперхромного эффекта наблюдается до г=7 и при дальнейшем повышении концентрации пептида повышения оптической плотности ДНКне происходит. Для пептида AEDL было показано появление гиперхромного эффекта ДНК при г=2. Последующее повышение концентрации пептида приводило к некоторому понижению гиперхромного эффекта. Тем не менее, оптическая плотность ДНК в присутствии пептида AEDL оставалась выше, чем у свободной ДНК. Добавление трипептида EDR к ДНК приводило также к гиперхромному эффекту. Эффект проявлялся уже при г=1 и оставался постоянным при дальнейшем повышении количества пептида в растворе. Таким образом, все рассмотренные выше пептиды способствовали некоторому нарушению стэкинга оснований ДНК. На степень и характер гиперхромизама оказывали влияние как структура, так и количество пептидов по отношению к ДНК. Можно полагать, что в связывании пептидов с ДНК участвуют азотистые основания. Если полагать, что пептиды могут формировать водородные связи в большой бороздке ДНК, можно понять появление некой дестабилизации вторичной структуры

макромолекулы. Особенно ярко это проявится при нарушении одной водородной связи в А-Т паре). Исходя из этого, можно полагать, что реализуются контакты кислорода пептидов с ЫН2 группой аденина в большой бороздке ДНК.

Анализ температуры плавления ДНК в присутствии пептидов показал, что только при очень больших г наблюдается видимая дестабилизация ДНК (это выражается в понижении температуры плавления ДНК при ее взаимодействии с пептидом AEDG при г=10). При меньших г температура плавления ДНК существенно не менялась, хотя и наблюдалось уширение интервала плавления.

Спектры кругового дихроизма ДНК в присутствии пептидов также отражали наличие взаимодействия пептид-ДНК, что также указывало на вовлеченность в связывание азотистых оснований ДНК.

Особый интерес представляет изучение комплекса ДНК и тетрапептида KEDW методом УФ-спектрофотометрии, а также при использовании метода флуоресценции. В структуре пептида KEDW содержится а.о. триптофана содержащий хромофор с максимумом

поглощения на 280 нм, что спектрально близко к максимуму полосы поглощения ДНК (260 нм). Наличие остатка триптофана в структуре KEDW дает возможность зафиксировать изменения спектральных свойств помимо ДНК также и для пептида. Анализ УФ-спектров пептида KEDW с ДНК показал изменение спектральных свойств хромофора остатка триптофана уже при г=1. Спектральные свойства ДНК также изменялись в комплексе, что показано качественным изменением спектров кругового дихроизма. Данные УФ-спектрофотометрии согласуются с результатами метода флуоресценции, в котором по тушению флуоресценции а.о. триптофана в тетрапептиде KEDW в присутствии ДНК оценивалось взаимодействие пептида с ДНК. Было показано, что в присутствии ДНК происходит как тушение флуоресценции триптофана, так и пептида. Характер тушения флуоресценции пептида схож с таковым для свободной аминокислоты триптофана. Совокупность данных однозначно указывает на взаимодействие тетрапептида с ДНК и на непосредственное участие остатка триптофана во взаимодействии молекул.

Также для пептидов AEDL и EDR, не имеющих в структуре ароматических аминокислот, был применен метод флуоресценции с добавлением молекул, конкурирующих с пептидами за связывание с ДНК (краситель DAPI). Высокий квантовый выход люминесценции красителя при связывании с ДНК в малой бороздке, а также возможность различить локализацию красителя на ДНК при анализе спектров его люминесценции дает возможность сделать вывод о возможной локализации пептида при связывании с ДНК. Краситель DAPI обладает способностью образовывать комплексы с ДНК в малой бороздке, а при заполнении

таких мест связывания он формирует связи с фосфатными группами. При г<30 присутствие пептидов в растворе не влияет на люминесценцию DAPI, связанного с ДНК в малой бороздке. Иными словами, то есть пептиды не связывается с ДНК по малой бороздке. Было показано, добавление AEDL и EDR к растворам ДНК-DAPI при очень больших г>30 приводит к изменению соотношений связанных форм DAPI: увеличивается доля связанного с ДНК по малой бороздке DAPI и уменьшается доля связанного DAPI по фосфатам. Люминесценция красителя, связанного с фосфатными группами ДНК, претерпевает изменение уже при г>1. Это указывает на вовлеченность фосфатной группы в связывание пептидов с ДНК. Учитывая изменение вязкости растворов ДНК при добавлении пептидов только при малой ионной силе, можно полагать, что электростатические взаимодействия играют заметную роль в связывании пептидов с ДНК. Действительно, для оценки влияния различных соединений на третичную структуру ДНК традиционно используется метод низкоградиентной вискозиметрии, так как измеряемые параметры при этом дают информацию об изменении объема молекулярного клубка. Остальные методы (седиментация, диффузия, динамическое светорассеяние) позволяют оценить изменение линейных размеров клубка, что существенно затрудняет анализ. Варьируя концентрацию низкомолекулярного поддерживающего электролита (№0) изучали вклад электростатических взаимодействий в связывание пептидов с ДНК. Так же как и в предыдущих экспериментах, в растворитель добавляли буфер, сохраняя при этом концентрацию противоионов (по ионам №). В растворах с большей ионной силой изменения вязкости не наблюдается, что указывает на значимость вклада внешнего электростатического связывания коротких пептидов с ДНК. Методом двойного лучепреломления в потоке было показано отсутствие изменения оптической анизотропии ДНК в присутствии пептидов AEDL, AEDG, EDR, а для пептида KEDW было показано уменьшение оптической анизотропии статистического сегмента макромолекулы при связывании, что обусловлено не столько падением жесткости макромолекулы в комплексе с пептидом (что мы также не можем исключить), сколько вкладом связавшегося пептида, и особенно ароматической группы триптофана в измеряемую оптическую анизотропию ДНК. Ориентация этой группы при этом должна быть таковой, что измеряемая средняя (отрицательная) оптическая анизотропия пары оснований ДНК при связывании должна изменяться. Мы полагаем, что ее плоскость ориентирована перпендикулярно плоскости пар оснований ДНК. Для того, чтобы фиксировалось изменение средней оптической анизотропии статистического сегмента, эта ароматическая группа должна быть достаточно жестко закреплена в комплексе. Мы полагаем ее локализацию в большой бороздке ДНК, возможно, с формированием водородных связей с атомными группами ДНК.

5 ВЫВОДЫ

1. Все используемые в работе пептиды AEDG, AEDL EDR и KEDW взаимодействуют с

-3

молекулой ДНК со значением константы диссоциации порядка 10 М. Это взаимодействие проявляется при малых ионных силах и не фиксируется при больших концентрациях поддерживающего электролита (№С1), что указывает на важную роль электростатических взаимодействий при связывании.

2. В присутствии пептидов наблюдаются незначительные изменения спектральных свойств ДНК, указывающие, что в связывании участвуют азотистые основания макромолекулы. Аминокислоты, входящие в состав пептидов, взаимодействуют с атомными группами оснований, выходящими в большую бороздку ДНК. Малая бороздка при связывании пептидов с ДНК остается свободной.

3. Атомы и группы атомов ДНК, связывающиеся с пептидами в большой бороздке, участвуют в образовании водородных связей, поэтому их участие в связывании с пептидами приведет к нарушению стэкинга оснований, что проявляется в появлении гиперхромизма в спектре поглощения ДНК при связывании с пептидами.

4. Показано уменьшение квантового выхода флуоресценции пептида KEDW при связывании с ДНК, при этом в комплексообразовании непосредственное участие принимает аминокислотный остаток триптофана.

5. В присутствии пептидов наблюдается уменьшение объема молекулярного клубка ДНК в растворе: для пептидов АББЬ, АББО и KEDW на 20%, для пептида ББЯ до 50% при максимальной концентрации пептида в эксперименте, которое можно объяснить появлением локальных «шарнирных» участков из-за нарушения стэкинга оснований в результате связывания пептидов. Для пептида KEDW фиксировали также уменьшение оптической анизотропии ДНК, связанное с жесткой ориентацией аминокислотного остатка триптофана в комплексе.

6 ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

а.о. аминокислотным остаток

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

ДЛП двойное лучепреломление

КД круговой дихроизм

РНК рибонуклеиновая кислота

ЯМР ядерно-магнитный резонанс

ИКТ изотермическое калориметрическое титрование

АМП антимикробный пептид

ПНК пептидная нуклеиновая кислота

БХ болезнь Хантингтона

ЦНС центральная нервная система

оцДНК одноцепочечная ДНК

дцДНК двухцепочечная ДНК

п.о. пара оснований

ф.г. фосфатная группа

AEDG Ala-Glu-Asp-Gly, эпиталон

AEDL Ala-Glu-Asp-Leu, бронхоген

EDR Glu-Asp-Arg, пинеалон

KEDW Lys- Glu-Asp-Trp, панкраген

PDB рго!ет data bank, база данных белков

TCF T-клеточный фактор

НТН helix-turn-helix, спираль-поворот-спираль

HLH helix-loop-helix, спираль-петля-спираль

bZIP basic zipper, лейциновая застежка

RHH ribbon-helix-helix, лента-спираль-спираль

CPP cell penetrating peptides

FITC fluorescein isothiocyanate

HMG high mobility group, группа высокой подвижности

TCF T-cell factor, фактор Т-клеток

TBP TATA-binding protein, ТАТА-связывающий белок

SLPI secretory leukocyte protease inhibitor, ингибитор секреторной

протеазы лейкоцитов

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole, 4',6-диамидино-2-фенилиндол

WaterLOGSY Water-Ligand Observed via Gradient Spectroscopy

BSA Bovine serum albumin, бычий сывороточный альбумин

NOE nuclear Overhauser effect, ядерный эффект Оверхаузера

Tris trisaminomethane, трисаминометан

7 СПИСОК ТЕРМИНОВ

Гидродинамический радиус - размер объекта, который рассчитывается, исходя из предположения о его сферической форме, по величине коэффициента диффузии в жидкости.

Гиперхромный эффект - повышение оптической плотности за счет увеличения адсорбции УФ в растворе двухцепочечной ДНК по мере ее денатурации в результате повышения температуры, щелочной обработки или действия других факторов.

Оптическая анизотропия макромолекулы - разность поляризуемостей макромолекулы в двух взаимно перпендикулярных направлениях независимо от ее модели.

8 БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю, доктору физико-математических наук, профессору Касьяненко Нине Анатольевне за активную помощь и поддержку при проведении исследования. Особую благодарность выражает кандидату физико-математических наук, сотруднику физического факультет Санкт-Петербургского государственного университета Бакулеву Владимиру Михайловичу за помощь в проведении экспериментов по люминесцентной спектроскопии.

Автор благодарит коллектив сотрудников ресурсных центров СПбГУ «Термогравиметрические и калориметрические методы исследования» и «Магнитно-резонансные методы исследования» за бесценную помощь при проведении отдельных экспериментов и интерпретацию результатов.

9 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Пептидные биорегуляторы и старение - СПб.: Наука, 2003.

203 с.

2. Romero Romero M. L., Rabin A., Tawfik D. S. Functional proteins from short peptides: Dayhoffs

hypothesis turns 50 // Angewandte Chemie International Edition. - 2016. - Т. 55. - №. 52. - P. 15966-15971.

3. Ivanov V. T., Karelin A. A., Yatskin O. N. Generation of peptides by human erythrocytes: facts and

artifacts // Peptide Science. - 2005. - Т. 80. - №. 2-3. - P. 332-346.

4. Jen-Jacobson L., Engler L. E., Jacobson L. A. Structural and thermodynamic strategies for site-

specific ДНК binding proteins // Structure. - 2000. - Т. 8. - №. 10. - P. 1015-1023.

5. Vázquez M. E., Caamaño A. M., Mascarenas J. L. From transcription factors to designed sequence-

specific ДНК-binding peptides // Chemical Society Reviews. - 2003. - Т. 32. - №. 6. - P. 338349.

6. Stormo G. D. Introduction to protein-ДНК interactions: structure, thermodynamics, and

bioinformatics / G. D.Stormo - Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2013.

7. Watson J. D. et al. Molecular structure of nucleic acids // Nature. - 1953. - Т. 171. - №. 4356. - PP.

737-738.

8. Berger M. F. et al. Variation in homeodomain ДНК binding revealed by high-resolution analysis of

sequence preferences // Cell. - 2008. - Т. 133. - №. 7. - P. 1266-1276.

9. Noyes M. B. et al. Analysis of homeodomain specificities allows the family-wide prediction of

preferred recognition sites // Cell. - 2008. - Т. 133. - №. 7. - P. 1277-1289.

10. Badis G. et al. A library of yeast transcription factor motifs reveals a widespread function for Rsc3 in targeting nucleosome exclusion at promoters // Molecular cell. - 2008. - Т. 32. - №. 6. - P. 878887.

11. Zhu C. et al. High-resolution ДНК-binding specificity analysis of yeast // Genome Res. - 2009. -T. 19. - P. 556-566.

12. Badis G. et al. Diversity and complexity in ДНК recognition by transcription factors // Science. -2009. - Т. 324. - №. 5935. - P. 1720-1723.

13. Parker S. C. J. et al. Local ДНК topography correlates with functional noncoding regions of the human genome // Science. - 2009. - Т. 324. - №. 5925. - P. 389-392.

14. Viswamitra M. A. et al. ДНК double helical fragment at atomic resolution // Nature. - 1978. - Т. 273. - №. 5664. - P. 687.

15. Kim J. L., Nikolov D. B., Burley S. K. Co-crystal structure of TBP recognizing the minor groove of a TATA element // Nature. - 1993. - Т. 365. - №. 6446. - P. 520.

16. Kramm K., Engel C., Grohmann D. Transcription initiation factor TBP: old friend new questions // Biochemical Society Transactions. - 2019. - Т. 47. - №. 1. - P. 411-423.

17. Mondal M. et al. Role of indirect readout mechanism in TATA box binding protein-ДНК interaction // Journal of computer-aided molecular design. - 2015. - Т. 29. - №. 3. - P. 283-295.

18. Travers A., Muskhelishvili G. ДНК structure and function // The FEBS journal. - 2015. - Т. 282.

- №. 12. - P. 2279-2295.

19. Rohs R. et al. Origins of specificity in protein-ДНК recognition // Annual review of biochemistry.

- 2010. - Т. 79. - P. 233-269.

20. Andreeva A. et al. SCOP database in 2004: refinements integrate structure and sequence family data // Nucleic acids research. - 2004. - Т. 32. - №. suppl_1. - P. D226-D229.

21. Jolma A. et al. ДНК-dependent formation of transcription factor pairs alters their binding specificity // Nature. - 2015. - Т. 527. - №. 7578. - С. 384.

22. Garvie C. W., Wolberger C. Recognition of specific ДНК sequences // Molecular cell. - 2001. - Т. 8. - №. 5. - P. 937-946.

23. Santana P. A. et al. Alpha-helical domain from IL-8 of salmonids: Mechanism of action and identification of a novel antimicrobial function // Biochemical and biophysical research communications. - 2018. - Т. 498. - №. 4. - P. 803-809.

24. Schumacher M. A. et al. Crystal structure of LacI member, PurR, bound to ДНК: minor groove binding by alpha helices // Science. - 1994. - Т. 266. - №. 5186. - P. 763-770.

25. Lewis M. et al. Crystal structure of the lactose operon repressor and its complexes with ДНК and inducer // Science. - 1996. - Т. 271. - №. 5253. - P. 1247-1254.

26. Edgell D. R. et al. Intron-encoded homing endonuclease I-TevI also functions as a transcriptional autorepressor // Nature Structural and Molecular Biology. - 2004. - Т. 11. - №. 10. - P. 936.

27. Biswas A., Mandal S., Sau S. The N-terminal domain of the repressor of Staphylococcus aureus phage Ф11 possesses an unusual dimerization ability and ДНК binding affinity // PloS one. - 2014.

- Т. 9. - №. 4. - P. e95012.

28. Joshi R. et al. Functional specificity of a Hox protein mediated by the recognition of minor groove structure // Cell. - 2007. - Т. 131. - №. 3. - P. 530-543.

29. AlQuraishi M., Tang S., Xia X. An affinity-structure database of helix-turn-helix: ДНК complexes with a universal coordinate system // BMC bioinformatics. - 2015. - Т. 16. - №. 1. - P. 390.

30. Struhl K. Helix-turn-helix, zinc-finger, and leucine-zipper motifs for eukaryotic transcriptional regulatory proteins //Trends in biochemical sciences. - 1989. - Т. 14. - №. 4. - С. 137-140.

31. Murre C. Helix-loop-helix proteins and the advent of cellular diversity: 30 years of discovery // Genes & development. - 2019. - Т. 33. - №. 1-2. - P. 6-25.

32. Van Moerkercke A. et al. The basic helix-loop-helix transcription factor BIS 2 is essential for monoterpenoid indole alkaloid production in the medicinal plant Catharanthus roseus // The Plant Journal. - 2016. - Т. 88. - №. 1. - P. 3-12.

33. Heim M. A. et al. The basic helix-loop-helix transcription factor family in plants: a genome-wide study of protein structure and functional diversity // Molecular biology and evolution. - 2003. - Т. 20. - №. 5. - P. 735-747.

34. Tarazona N. A. et al. Role of leucine zipper-like motifs in the oligomerization of Pseudomonas putida phasins // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-General Subjects. - 2019. - Т. 1863. - №. 2. - P. 362-370.

35. Landschulz W. H., Johnson P. F., McKnight S. L. The leucine zipper: a hypothetical structure common to a new class of ДНК binding proteins // Science. - 1988. - Т. 240. - №. 4860. - P. 1759-1764.

36. Glover J. N., Harrison S. C. Crystal structure of the heterodimeric bZIP transcription factor c-Fos-c-Jun bound to DNA //Nature. - 1995. - Т. 373. - С. 257-261.

37. Kohler J. J., Schepartz A. Effects of nucleic acids and polyanions on dimer formation and ДНК binding by bZIP and bHLHZip transcription factors // Bioorganic & medicinal chemistry. - 2001. - Т. 9. - №. 9. - P. 2435-2443.

38. Kim Y. et al. Crystal structure of a yeast TBP/TATA-box complex // Nature. - 1993. - Т. 365. -№. 6446. - P. 512.

39. Cho Y. et al. Crystal structure of a p53 tumor suppressor-ДНК complex: understanding tumorigenic mutations // Science. - 1994. - Т. 265. - №. 5170. - P. 346-355.

40. Kovall R. A., Hendrickson W. A. Crystal structure of the nuclear effector of Notch signaling, CSL, bound to ДНК // The EMBO journal. - 2004. - Т. 23. - №. 17. - P. 3441-3451.

41. Eom K. S. et al. Structural analyses of zinc finger domains for specific interactions with ДНК // J Microbiol. Biotechnol. - 2016. - Т. 26. - №. 12. - P. 2019-2029.

42. Garcia-Bloj B. et al. Waking up dormant tumor suppressor genes with zinc fingers, TALEs and the CRISPR/dCas9 system // Oncotarget. - 2016. - Т. 7. - №. 37. - P. 60535.

43. Mackeh R. et al. C2H2-type zinc finger proteins: evolutionarily old and new partners of the nuclear hormone receptors // Nuclear receptor signaling. - 2018. - Т. 15. - P. 1-22.

44. Sheppard C., Werner F. Structure and mechanisms of viral transcription factors in archaea // Extremophiles. - 2017. - Т. 21. - №. 5. - P. 829-838.

45. Somers W. S., Phillips S. E. V. Crystal structure of the met represser-operator complex at 2.8 Â resolution reveals ДНК recognition by P-strands // Nature. - 1992. - Т. 359. - №. 6394. - P. 387.

46. Raumann B. E. et al. ДНК recognition by P-sheets in the Arc represser-operator crystal structure // Nature. - 1994. - Т. 367. - №. 6465. - P. 754.

47. Pingoud A. et al. Type II restriction endonucleases: structure and mechanism // Cellular and molecular life sciences. - 2005. - Т. 62. - №. 6. - P. 685.

48. Ghosh G. et al. Structure of NF-kB p50 homodimer bound to a kB site // Nature. - 1995. - Т. 373.

- №. 6512. - P. 303.

49. Kwon H. J. et al. Crystal structure of the Escherichia coli Rob transcription factor in complex with ДНК // Nature Structural and Molecular Biology. - 2000. - Т. 7. - №. 5. - P. 424.

50. Müller C. W. Transcription factors: global and detailed views // Current opinion in structural biology. - 2001. - Т. 11. - №. 1. - P. 26-32.

51. Seeman N. C., Rosenberg J. M., Rich A. Sequence-specific recognition of double helical nucleic acids by proteins // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1976. - Т. 73. - №. 3. - P. 804-808.

52. Rohs R. et al. Nuance in the double-helix and its role in protein-ДНК recognition // Current opinion in structural biology. - 2009. - Т. 19. - №. 2. - P. 171-177.

53. Shakked Z., Rabinovich D. The electrostatic potential of B-ДНК // Progress in biophysics and molecular biology. - 1986. - Т. 47. - №. 3. - P. 159-195.

54. Rohs R. et al. The role of ДНК shape in protein-ДНК recognition // Nature. - 2009. - Т. 461. - №. 7268. - P. 1248.

55. Maity A., Singh A., Singh N. Differential stability of ДНК based on salt concentration // European Biophysics Journal. - 2017. - Т. 46. - №. 1. - P. 33-40.

56. Borochov N., Eisenberg H., Kam Z. Dependence of ДНК conformation on the concentration of salt // Biopolymers: Original Research on Biomolecules. - 1981. - Т. 20. - №. 1. - P. 231-235.

57. Shakked Z. et al. Sequence-dependent conformation of an A-ДНК double helix: the crystal structure of the octamer d (GGTATACC) // Journal of molecular biology. - 1983. - Т. 166. - №. 2. - P. 183-201.

58. Gutiérrez-Flores J. et al. Electronic properties of ДНК: Description of weak interactions in TATA-box-like chains // Biophysical chemistry. - 2018. - Т. 233. - P. 26-35.

59. Ellison M. J. et al. An assessment of the Z-ДНК forming potential of alternating dA-dT stretches in supercoiled plasmids // Biochemistry. - 1986. - Т. 25. - №. 12. - P. 3648-3655.

60. Abe N. et al. Deconvolving the recognition of ДНК shape from sequence // Cell. - 2015. - Т. 161.

- №. 2. - P. 307-318.

61. Honig B., Nicholls A. Classical electrostatics in biology and chemistry // Science. - 1995. - Т. 268. - №. 5214. - P. 1144-1149.

62. Klapper I. et al. Focusing of electric fields in the active site of Cu-Zn superoxide dismutase: Effects of io Изучение взаимодействия молекулы ДНК с ионами двухвалентных металлов в присутствии катехина, эпикатехина и кофеина nic strength and amino-acid modification // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. - 1986. - Т. 1. - №. 1. - P. 47-59.

63. Sharp K. A., Honig B., Harvey S. C. Electrical potential of transfer RNAs: codon-anticodon recognition // Biochemistry. - 1990. - Т. 29. - №. 2. - P. 340-346.

64. Chin K. et al. Calculating the electrostatic properties of RNA provides new insights into molecular interactions and function // Nature Structural & Molecular Biology. - 1999. - Т. 6. - №. 11. -P. 1055.

65. Tang C. L. et al. Calculation of pKas in RNA: on the structural origins and functional roles of protonated nucleotides // Journal of molecular biology. - 2007. - Т. 366. - №. 5. - P. 1475-1496.

66. Leslie A. G. W. et al. Polymorphism of DNA double helices // Journal of molecular biology. -1980. - Т. 143. - №. 1. - P. 49-72.

67. Lavery R., Pullman B. The molecular electrostatic potential and steric accessibility of poly (dl. dC). Comparison with poly (dG. dC) // Nucleic acids research. - 1981. - Т. 9. - №. 24. - P. 70417052.

68. Lu X. J., Shakked Z., Olson W. K. A-form conformational motifs in ligand-bound DNA structures // Journal of molecular biology. - 2000. - Т. 300. - №. 4. - P. 819-840.

69. Shakked Z. et al. The conformation of the DNA double helix in the crystal is dependent on its environment // Nature. - 1989. - Т. 342. - №. 6248. - С. 456.

70. Ng H. L., Kopka M. L., Dickerson R. E. The structure of a stable intermediate in the A^ B DNA helix transition // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2000. - Т. 97. - №. 5. - P. 2035-2039.

71. Shakked Z., Rabinovich D. The effect of the base sequence on the fine structure of the DNA double helix // Progress in biophysics and molecular biology. - 1986. - Т. 47. - №. 3. - P. 159195.

72. Zhang Y. et al. Topologically constrained formation of stable Z-ДНК from normal sequence under physiological conditions // Journal of the American Chemical Society. - 2019. - T. 141. - №. 19. -P. 7758-7764.

73. Arnott S. et al. Left-handed ДНК helices // Nature. - 1980. - Т. 283. - №. 5749. - P. 743.

74. Nelson H. C. M. et al. The structure of an oligo (dA)* oligo (dT) tract and its biological implications // Nature. - 1987. - Т. 330. - №. 6145. - P. 221.

75. Zhurkin V. B. et al. Sequence-dependent variability of B-DNA // DNA conformation and transcription. - Springer, Boston, MA, 2005. - P. 18-34.

76. Haran T. E., Mohanty U. The unique structure of A-tracts and intrinsic DNA bending // Quarterly reviews of biophysics. - 2009. - Т. 42. - №. 1. - P. 41-81.

77. Crothers D. M., Shakked Z. DNA bending by adenine-thymine tracts // Oxford Handbook of Nucleic Acid Structures. - Oxford University Press, 1999. - P. 455-470.

78. Mack D. R., Chiu T. K., Dickerson R. E. Intrinsic bending and deformability at the TA step of CCTTTAAAGG: a comparative analysis of TA and AT steps within A-tracts // Journal of molecular biology. - 2001. - Т. 312. - №. 5. - P. 1037-1049.

79. Koo H. S., Wu H. M., Crothers D. M. DNA bending at adenine* thymine tracts // Nature. - 1986. -Т. 320. - №. 6062. - P. 501.

80. Schlundt A. et al. Structure-function analysis of the DNA-binding domain of a transmembrane transcriptional activator // Scientific reports. - 2017. - Т. 7. - №. 1. - P. 1051.

81. Tolstorukov M. Y. et al. A novel roll-and-slide mechanism of DNA folding in chromatin: implications for nucleosome positioning // Journal of molecular biology. - 2007. - Т. 371. - №. 3.

- P. 725-738.

82. Lu X. J., Olson W. K. DNA: a versatile, integrated software system for the analysis, rebuilding and visualization of three-dimensional nucleic-acid structures // Nature protocols. - 2008. - Т. 3. - №. 7. - P. 1213.

83. Chen C., Pettitt B. M. DNA shape versus sequence variations in the protein binding process // Biophysical journal. - 2016. - Т. 110. - №. 3. - P. 534-544.

84. Connolly M. et al. To Kink or Not to Kink: Sequence-Dependent DNA Flexibility Unveiled in Complex with DNA-Bending Protein IHF // Biophysical Journal. - 2019. - Т. 116. - №. 3. - P. 499a-500a.

85. Rohs R., Sklenar H., Shakked Z. Structural and energetic origins of sequence-specific DNA bending: Monte Carlo simulations of papillomavirus E2-DNA binding sites // Structure. - 2005. -Т. 13. - №. 10. - P. 1499-1509.

86. Kulkarni M., Mukherjee A. Understanding B-DNA to A-DNA transition in the right-handed DNA helix: Perspective from a local to global transition // Progress in biophysics and molecular biology.

- 2017. - Т. 128. - P. 63-73.

87. Olson W. K. et al. ДНК sequence-dependent deformability deduced from protein-DNA crystal complexes // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1998. - Т. 95. - №. 19. - P. 11163-11168.

88. Janin J. et al. Macromolecular recognition in the protein data bank // Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. - 2007. - T. 63. - №. 1. - P. 1-8.

89. Ades S. E., Sauer R. T. Specificity of minor-groove and major-groove interactions in a homeodomain-DNA complex // Biochemistry. - 1995. - T. 34. - №. 44. - P. 14601-14608.

90. Tucker-Kellogg L. et al. Engrailed (Gln50^ Lys) homeodomain-DNA complex at 1.9 A resolution: structural basis for enhanced affinity and altered specificity // Structure. - 1997. - T. 5.

- №. 8. - P. 1047-1054.

91. Grant R. A. et al. Exploring the Role of Glutamine 50 in the Homeodomain-DNA Interface: Crystal Structure of Engrailed (Gln50^ Ala) Complex at 2.0 A // Biochemistry. - 2000. - T. 39. -№. 28. - P. 8187-8192.

92. Morgunova E. et al. Two distinct DNA sequences recognized by transcription factors represent enthalpy and entropy optima // Elife. - 2018. - T. 7. - P. e32963.

93. Pabo C. O., Sauer R. T. Transcription factors: structural families and principles of DNA recognition // Annual review of biochemistry. - 1992. - T. 61. - №. 1. - P. 1053-1095.

94. Siggers T. W., Silkov A., Honig B. Structural alignment of protein-DNA interfaces: insights into the determinants of binding specificity // Journal of molecular biology. - 2005. - T. 345. - №. 5. -P. 1027-1045.

95. Cherney L. T. et al. The structure of the arginine repressor from Mycobacterium tuberculosis bound with its DNA operator and Co-repressor, L-arginine // Journal of molecular biology. - 2009.

- T. 388. - №. 1. - P. 85-97.

96. Luscombe N. M., Laskowski R. A., Thornton J. M. Amino acid-base interactions: a three-dimensional analysis of protein-DNA interactions at an atomic level // Nucleic acids research. -2001. - T. 29. - №. 13. - P. 2860-2874.

97. Rice P. A., Correll C. C. (ed.). Protein-nucleic acid interactions: structural biology. - Royal Society of Chemistry, 2008. - T. 11.

98. Harrison S. C., Aggarwal A. K. DNA recognition by proteins with the helix-turn-helix motif // Annual review of biochemistry. - 1990. - T. 59. - №. 1. - P. 933-969.

99. Harish B. et al. Multiple helical conformations of the helix-turn-helix region revealed by NOE-restrained MD simulations of tryptophan aporepressor, TrpR // Proteins: Structure, Function, and Bioinformatics. - 2017. - T. 85. - №. 4. - P. 731-740.

100. Tateno M. et al. DNA recognition by p-sheets // Biopolymers. - 1997. - T. 44. - №. 4. - P. 335359.

101. Dhanaraj C. J. et al. Synthesis, spectral characterization, DNA interaction, anticancer and molecular docking studies on some transition metal complexes with bidentate ligand // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. - 2016. - T. 162. - P. 115-124.

102. Coulocheri S. A. et al. Hydrogen bonds in protein-DNA complexes: Where geometry meets plasticity // Biochimie. - 2007. - T. 89. - №. 11. - P. 1291-1303.

103. Hoogsteen K. The crystal and molecular structure of a hydrogen-bonded complex between 1-methylthymine and 9-methyladenine // Acta Crystallographica. - 1963. - T. 16. - №. 9. - P. 907916.

104. Patikoglou G. A. et al. TATA element recognition by the TATA box-binding protein has been conserved throughout evolution // Genes & development. - 1999. - T. 13. - №. 24. - P. 32173230.

105. Kitayner M. et al. Structural basis of DNA recognition by p53 tetramers // Molecular cell. - 2006.

- T. 22. - №. 6. - P. 741-753.

106. Aishima J. et al. A Hoogsteen base pair embedded in undistorted B-DNA // Nucleic acids research. - 2002. - T. 30. - №. 23. - P. 5244-5252.

107. Hudson N. O., Whitby F. G., Buck-Koehntop B. A. Structural insights into methylated DNA recognition by the C-terminal zinc fingers of the DNA reader protein ZBTB38 // Journal of Biological Chemistry. - 2018. - T. 293. - №. 51. - P. 19835-19843.

108. Rastinejad F. et al. Structure of the RXR-RAR DNA-binding complex on the retinoic acid response element DR1 // The EMBO journal. - 2000. - T. 19. - №. 5. - P. 1045-1054.

109. Aggarwal A. K. et al. Recognition of a DNA operator by the repressor of phage 434: a view at high resolution // Science. - 1988. - T. 242. - №. 4880. - P. 899-907.

110. Watkins D. et al. P22 c2 Repressor- Operator Complex: Mechanisms of Direct and Indirect Readout // Biochemistry. - 2008. - T. 47. - №. 8. - P. 2325-2338.

111. Max K. E. A. et al. Common mode of DNA binding to cold shock domains // The FEBS journal.

- 2007. - T. 274. - №. 5. - P. 1265-1279.

112. Max K. E. A. et al. T-rich DNA single strands bind to a preformed site on the bacterial cold shock protein Bs-CspB // Journal of molecular biology. - 2006. - T. 360. - №. 3. - P. 702-714.

113. Dragan A. I., Read C. M., Crane-Robinson C. Hydration differences between the major and minor grooves of DNA revealed from heat capacity measurements // European Biophysics Journal.

- 2018. - P. 1-8.

114. Inukai S., Kock K. H., Bulyk M. L. Transcription factor-DNA binding: beyond binding site motifs // Current opinion in genetics & development. - 2017. - T. 43. - P. 110-119.

115. Bewley C. A., Gronenborn A. M., Clore G. M. Minor groove-binding architectural proteins: structure, function, and DNA recognition // Annual review of biophysics and biomolecular structure. - 1998. - Т. 27. - №. 1. - P. 105-131.

116. Harika N. K., Wilson W. D. Bound Compound, Interfacial Water, and Phenyl Ring Rotation Dynamics of a Compound in the DNA Minor Groove // Biochemistry. - 2018. - Т. 57. - №. 33. -P. 5050-5057.

117. Withers J. M. et al. DNA minor groove binders as therapeutic agents // Comprehensive Supramolecular Chemistry II: Supramolecular Medicinal Chemistry and Chemical Biology. -Elsevier Inc., 2017. - P. 149-178..

118. Travers A. A. DNA conformation and protein binding // Annual review of biochemistry. - 1989.

- Т. 58. - №. 1. - P. 427-452.

119. Anisimov V. N., Morozov V. G. Effect of synthetic dipeptide Thymogen (Glu-Trp) on life span and spontaneoustumor incidence in rats // The Gerontologist. - 1998. - Т. 38. - №. 7. - P. 8.

120. Cherkashin V. A., Semin G. F., Veretenko A. A. Optimization of cardiovascular function by peptide bio-regulators // Klinicheskaia meditsina. - 2002. - Т. 80. - №. 5. - P. 30-34.

121. Sharova N. P. How does a cell repair damaged DNA? // Biochemistry (Moscow). - 2005. - Т. 70.

- №. 3. - P. 275-291.

122. J Kastin A., Pan W. Concepts for biologically active peptides // Current pharmaceutical design. -2010. - Т. 16. - №. 30. - P. 3390-3400.

123. Silman H. I., Karlin A. Effect of local pH changes caused by substrate hydrolysis on the activity of membrane-bound acetylcholinesterase // Proceedings of the National Academy of Sciences. -1967. - Т. 58. - №. 4. - P. 1664-1668.

124. Зиганшин Р. Х., Говорун В. М., Иванов В. Т. Поиск и идентификация пептидов мха Physcomitrella patens //Биоорганическая химия. - 2011. - Т. 37. - №. 1. - С. 108-118.

125. Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения. - СПб.: Наука, 2010. 48 с.

126. Хавинсон В. Х. и др. Пептиды тканеспецифически стимулируют дифференцировку клеток при их старении // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2012. - №. 1. - С. 34-37.

127. Хавинсон В. Х., Бондарев И. Э., Бутюгов А. А. Пептид эпиталон индуцирует теломеразную активность и элонгацию теломер в соматических клетках человека // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2003. - Т. 135. - №. 6. - С. 692-695.

128. В.Х. Хавинсон, Г.А. Рыжак, Н.С. Линькова. Перспективы применения тетрапептида в лечении хронического бронхита: молекулярные механизмы // Молекулярная медицина. -2014. - №.3. - С. 120-128.

129. Умнов Р.С., Линькова Н.С., Хавинсон В.Х., Пептиды стимулируют экспрессию сигнальных молекул в культурах клеток нейронов животных разного возраста // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2014. - № 2. - C. 123-126.

130. Хавинсон В.Х., Григорьев Е.И., Малинин В.В., Рыжак Г.А. Пептид, стимулирующий регенерацию нейронов центральной нервной системы, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения. Патент РФ № 2301678. 27.06.2007

131. Khavinson V. et al. Neuroprotective Effect of EDR Peptide in Mouse Model of Huntington's Disease // Journal of Neurology and Neuroscience. - 2017. - Т. 8. - №. 1. - C. 1-11.

132. Dolotov O. V. et al. Semax, an analog of ACTH (4-10) with cognitive effects, regulates BDNF and trkB expression in the rat hippocampus // Brain research. - 2006. - Т. 1117. - №. 1. - С. 5460.

133. Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Влияние тетрапептида панкрагена на течение экспериментального сахарного диабета // Проблемы эндокринной патологии. - 2010. - №. 4. - C. 61-70.

134. Ramsey J. D., Flynn N. H. Cell-penetrating peptides transport therapeutics into cells // Pharmacology & therapeutics. - 2015. - Т. 154. - P. 78-86.

135. Guidotti G., Brambilla L., Rossi D. Cell-penetrating peptides: from basic research to clinics //Trends in pharmacological sciences. - 2017. - Т. 38. - №. 4. - P. 406-424.

136. Prokop A. (ed.). Intracellular delivery: fundamentals and applications. - Springer Science & Business Media, 2011. - Т. 5.

137. Shin M. C. et al. Cell-penetrating peptides: Achievements and challenges in application for cancer treatment // Journal of Biomedical Materials Research Part A: An Official Journal of The Society for Biomaterials, The Japanese Society for Biomaterials, and The Australian Society for Biomaterials and the Korean Society for Biomaterials. - 2014. - Т. 102. - №. 2. - P. 575-587.

138. Milletti F. Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape // Drug discovery today. - 2012. - Т. 17. - №. 15-16. - P. 850-860.

139. Nan Y. H. et al. Antimicrobial activity, bactericidal mechanism and LPS-neutralizing activity of the cell-penetrating peptide pVEC and its analogs // Journal of Peptide Science. - 2011. - Т. 17. -№. 12. - P. 812-817.

140. Niidome T. et al. Influence of lipophilic groups in cationic a-helical peptides on their abilities to bind with ДНК and deliver genes into cells // The Journal of peptide research. - 1999. - Т. 54. -№. 4. - P. 361-367.

141. Wang G. Human antimicrobial peptides and proteins // Pharmaceuticals. - 2014. - Т. 7. - №. 5. -P. 545-594.

142. Wang G. et al. High-quality 3D structures shine light on antibacterial, anti-biofilm and antiviral activities of human cathelicidin LL-37 and its fragments // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Biomembranes. - 2014. - Т. 1838. - №. 9. - P. 2160-2172.

143. Park C. B., Kim H. S., Kim S. C. Mechanism of action of the antimicrobial peptide buforin II: buforin II kills microorganisms by penetrating the cell membrane and inhibiting cellular functions // Biochemical and biophysical research communications. - 1998. - Т. 244. - №. 1. - P. 253-257.

144. Miller K. W. et al. Secretory leukocyte protease inhibitor binding to mRNA and ДНК as a possible cause of toxicity to Escherichia coli // Journal of bacteriology. - 1989. - Т. 171. - №. 4. -P. 2166-2172.

145. Lindgren M. et al. Cell-penetrating peptides // Trends in pharmacological sciences. - 2000. - Т. 21. - №. 3. - P. 99-103.

146. Хавинсон В. Х. и др. Механизм биологической активности коротких пептидов: проникновение в клетку и эпигенетическая регуляция экспрессии генов //Успехи современной биологии. - 2013. - Т. 133. - №. 3. - С. 310-316.

147. Prochiantz A. Getting hydrophilic compounds into cells: lessons from homeopeptides // Current opinion in neurobiology. - 1996. - Т. 6. - №. 5. - P. 629-634.

148. Ludtke S., He K., Huang H. Membrane thinning caused by magainin 2 // Biochemistry. - 1995. -Т. 34. - №. 51. - P. 16764-16769.

149. Rychlik I. Some properties of polylysyl-transfer ribonucleic acid // Collection of Czechoslovak Chemical Communications. - 1965. - Т. 30. - №. 7. - P. 2259-2268.

150. Egorova A. А., Kiselev V. A. Peptide modules for overcoming barriers of nucleic acids transport to cells // Current topics in medicinal chemistry. - 2016. - Т. 16. - №. 3. - P. 330-342.

151. Kwok A. et al. Systematic Comparisons of Formulations of Linear Oligolysine Peptides with si RNA and Plasmid DNA // Chemical biology & drug design. - 2016. - Т. 87. - №. 5. - P. 747-76.

152. Campos J. L. et al. Influence of amino acid and peptide counterions on the conformation of DNA // Journal of molecular biology. - 1986. - Т. 187. - №. 3. - P. 441-447.

153. Portugal J. et al. Alteration of the B Form of DNA by Basic Peptides // Nucleic Acids: The Vectors of Life. - Springer, Dordrecht, 1983. - P. 317-330.

154. Wagle J. R. et al. Specific translocation of tuftsin (Thr-Lys-Pro-Arg), a natural immunomodulating peptide, into the nuclei of human monocytes // Biochemical and biophysical research communications. - 1989. - Т. 159. - №. 3. - P. 1147-1153.

155. Suzuki M., Gerstein M., Johnson T. An NMR study on the DNA-binding SPKK motif and a model for its interaction with DNA // Protein Engineering, Design and Selection. - 1993. - Т. 6. -№. 6. - P. 565-574.

156. Andrews C. T., Campbell B. A., Elcock A. H. Direct comparison of amino acid and salt interactions with double-stranded and single-stranded DNA from explicit-solvent molecular dynamics simulations // Journal of chemical theory and computation. - 2017. - Т. 13. - №. 4. - P. 1794-1811.

157. Singh J., Thornton J. M. The interaction between phenylalanine rings in proteins // FEBS letters. - 1985. - Т. 191. - №. 1. - P. 1-6.

158. Jones S. et al. Protein-DNA interactions: a structural analysis // Journal of molecular biology. -1999. - Т. 287. - №. 5. - P. 877-896.

159. Gunnoo S. B., Madder A. Chemical protein modification through cysteine // ChemBioChem. -2016. - Т. 17. - №. 7. - P. 529-553.

160. Toulmé J. J., Hélène C. Specific recognition of single-stranded nucleic acids. Interaction of tryptophan-containing peptides with native, denatured, and ultraviolet-irradiated DNA // Journal of Biological Chemistry. - 1977. - Т. 252. - №. 1. - P. 244-249.

161. Khamis M. I. et al. Specific recognition of single-stranded nucleic acids. Interaction of tryptophan-containing peptides with native, denatured, and ultraviolet-irradiated DNA. A study by optical detection of magnetic resonance and site-selected mutagenesis // Journal of Biological Chemistry. - 1987. - Т. 262. - №. 23. - P. 10938-10945.

162. Etheve L., Martin J., Lavery R. Protein-DNA interfaces: a molecular dynamics analysis of time-dependent recognition processes for three transcription factors // Nucleic acids research. - 2016. -Т. 44. - №. 20. - P. 9990-10002.

163. Zhang W. et al. Large electrostatic differences in the binding thermodynamics of a cationic peptide to oligomeric and polymeric DNA // Proceedings of the National Academy of Sciences. -1996. - Т. 93. - №. 6. - P. 2511-2516.

164. Спирин А.С. Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот // Биохимия. - 1958. - Т. 23. - N. 5. - C. 656-662.

165. Сибилева М.А., Морошкина Е.Б. Руководство к лабораторному практикуму по молекулярной биофизике (учебно-методическое пособие). - СПб, 2006.

166. Kuhn W., Über die Gestalt fadenförmiger Moleküle in Lösungen. Kolloid-Zeitschrift, 1934, V. 68, 1, pp 2-15.

167. Guth E., Mark H. Zur innermolekularen, Statistik, insbesondere bei Kettenmolekiilen I. Monatshefte für Chemie und verwandte Teile anderer Wissenschaften, 1934, Vol. 65, 1, 93-121

168. Flory P.J. Principles of Polymer Chemistry. Ithaka, N.Y., Cornell University Press. 1953, 399 p.

169. Yamakawa H. Modern theory of polymer solutions. Harper &Row. London, 1971, 419 p.

170. Гросберг А. Ю., Хохлов А. Р. Статистическая физика макромолекул. М., Наука, 1989, 344 с.

171. Doi M., Edwards S.F., The theory of polymer dynamics, Clarendon Press, London, 1986.

172. Цветков В.Н., Эскин В.Е., Френкель С .Я. Структура макромолекул в растворах. М., Наука, 1964, 720 с.

173. Касьяненко НА. Конформация биополимеров в растворе. Конформационные параметры биополимеров. Часть 2. - СПб, 2005. - 52 C.

174. Морошкин В. А. и др. Исследование комплексов ДНК с синтетическим фрагментом гистона Н4 и полипептидом (01у-0гп-С1у) // Молекулярная биология. - 1980. - Т. 14. - №. 4-6. - С. 795.

175. Щагина Л. В. и др. Влияние ионной силы раствора на термодинамическую жёсткость молекул нативной ДНК // Молекулярная биология. - 1969. - Т. 3. - №. 2. - С. 221-227

176. Демченко А.П. Ультрафиолетовая спектрофотометрия и структура белков. Киев: Наук. думка. 1981. 208 с.

177. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот, пер. с англ. М.: Мир. 1987. C. 58.

178. Веллюз Л., Легран М., Грожан М. Оптический круговой дихроизм. М : Мир. 1987. C. 58.

179. Zimm B.H., Crothers B.K. Simplified rotating cylinder viscometer for DNA // Proc. Natl. Acad. Sci., USA. - 1962. - Vol. 48. - P. 905-911.

180. Векшин Н. Флуоресцентная спектроскопия биополимеров. - Litres, 2017.

181. Бакулев В. М. и др. Люминесценция комплексов DAPI-ДНК при разных ионных силах раствора // Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 4. Физика. Химия. - 2014. -Т. 1. - №. 4. - СС. 491-497.

182. Freire E., Mayorga O. F., Straume M. Isothermal titration calorimetry // Analytical chemistry. -1990. - Т. 62. - №. 18. - P. 950A-959A.

183. Kim W., Yamasaki Y., Kataoka K. Development of a fitting model suitable for the isothermal titration calorimetric curve of ДНК with cationic ligands // The Journal of Physical Chemistry B. -2006. - Т. 110. - №. 22. - P. 10919-10925.

184. Antanasijevic A., Ramirez B., Caffrey M. Comparison of the sensitivities of WaterLOGSY and saturation transfer difference NMR experiments // Journal of biomolecular NMR. - 2014. - Т. 60. - №. 1. - P. 37-44.

185. Dalvit C. et al. WaterLOGSY as a method for primary NMR screening: practical aspects and range of applicability // Journal of biomolecular NMR. - 2001. - Т. 21. - №. 4. - P. 349-359.

186. Батуев Е. А. и др. ЯМР-скрининг потенциальных ингибиторов Citrobacter freundii метионин-лиазы // Молекулярная биология. - 2014. - Т. 48. - №. 6. - C. 1019.

187. Тарновская С. И., Якуцени П. П., Хавинсон В. Х. Исследование взаимодействия тетрапептидов с ДНК методами молекулярной механики // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2013. - Т. 156. - №. 11. - CC. 637-641.

188. Дрибинский Б. А., Касьяненко Н. А. Влияние длины олигопептида на процесс конденсации ДНК в водно-солевых растворах // Журнал структурной химии. - 2011. - Т. 52. - №. 6. - СС 1239-1245.

189. Пучкова А. О., Касьяненко Н. А. Изучение взаимодействия молекулы ДНК с ионами двухвалентных металлов в присутствии катехина, эпикатехина и кофеина // Вестник Санкт-Петербургского университета. Серия 4. Физика. Химия. - 2011. - №. 2. - CC. 96-102.

190. Komolkin A. V., Laaksonen A., Maliniak A. Molecular dynamics simulation of a nematic liquid crystal // The Journal of chemical physics. - 1994. - Т. 101. - №. 5. - P. 4103-4116.

191. Maier J. A. et al. ff14SB: improving the accuracy of protein side chain and backbone parameters from ff99SB // Journal of chemical theory and computation. - 2015. - Т. 11. - №. 8. - P. 36963713.

192. Silanteva I. A. et. al. A. Role of Mono and Divalent Ions in Peptide Glu Asp Arg-ДНК Interaction // The Journal of Physical Chemistry B. - 2019. - T123. - V. 9. - P. 1896-1902.