Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Евлашкина, Вера Францевна

• Евлашкина, Вера Францевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Евлашкина, Вера Францевна

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. МИКРОФЛОРА КИШЕЧНИКА И ЕЕ РОЛЬ В ОБЕСПЕЧЕНИИ

СОСТОЯНИЯ ЗДОРОВЬЯ ОРГАНИЗМА-ХОЗЯИНА.

ГЛАВА 2. МИКРОБНЫЕ БИОПРЕПАРАТЫ В СИСТЕМЕ МЕР ПО КОРРЕКЦИИ БАКТЕРИОЦЕНОЗА КИШЕЧНИКА И СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ОЦЕНКИ ИХ АКТИВНОСТИ.

ЧАСТЬ II. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1 Материалы.

3.2 Методы исследований.

ГЛАВА 4. АНАЛИЗ СТАНДАРТНОСТИ ПРОИЗВОДСТВЕННЫХ СЕРИЙ БИФИКОЛА ПО СОДЕРЖАНИЮ ЖИЗНЕСПОСОБНЫХ B.bifidum 1 и E.coli М-17 И РАЗРАБОТКА ОТРАСЛЕВОГО СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА БИФИДУМБАКТЕРИНА.

4.1. Изучение характера роста штаммов B.bifidum I и E.coli М-17 в жидких питательных средах.

4.2 Разработка и изготовление первой серии Отраслевого стандартного образца (ОСО) бифидумбактерина.

4.3 Изучение свойств ОСО бифидумбактерина.

4.4 Результаты применения ОСО бифидумбактерина для оценки содержания живых особей бифидобактерий в бифидумбактерине.

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ УСТОЙЧИВОСТИ ШТАММОВ B.bifidum 1 и E.coli М-П В СОСТАВЕ БИФИКОЛА К ТЕРМИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЯМ И АНТИБИОТИКАМ РАЗНЫХ ХИМИЧЕСКИХ ГРУПП

5.1. Изучение влияния термического воздействия на жизнеспособность бифидобактерий и кишечной палочки.

5.2 Изучение чувствительности штаммов В.bifidum 1 и

E.coli М-17, входящих в бификол, к действию антибиотиков разных химических групп.

ГЛАВА 6. РАЗРАБОТКА МЕТОДА ОЦЕНКИ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ БИФИДОБАКТЕРИЙ В БИФИКОЛЕ ПО АКТИВНОСТИ КИСЛОТООБРАЗОВАНИЯ ШТАММОВ B.bifidum I и E.coli М

6.1 Кислотообразующая активность бифидобактерий и кишечной палочки в монокультурах.

6.2. Кислотообразующая активность искусственно смоделированного препарата бификола в сравнении с бифидумбактерином и колибактерином.

6.3. Применение кислотообразующей активности бифидобактерий для контроля коммерческих серий бификола.

ГЛАВА 7. ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬ ШТАММОВ В.bifidum 1 и E.coli М-17, ВХОДЯЩИХ В БИФИКОЛ, К АЗИДУ НАТРИЯ И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЕГО ИНГИБИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ В ОТНОШЕНИИ КИШЕЧНОЙ ПАЛОЧКИ ДЛЯ УЧЕТА РОСТА БИФИДОБАКТЕРИЙ

7.1. Влияние разных концентраций азида натрия на рост бифидобактерий и кишечной палочки в монокультурах.

7.2. Испытание ингибирующего действия азида натрия в отношении кишечной палочки на искусственно смоделированных вариантах бификола и коммерческих сериях бифидумбактерина и колибактерина.

7.3. Разработка условий приготовления модифицированной питательной среды Блаурокка с азидом натрия и ее апробация на коммерческих сериях бификола.

7.4. Сравнение двух новых разработанных методов оценки количественного содержания бифидобактерий в бификоле.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Специфическая активность бифидосодержащих моно- и комплексных биопрепаратов и усовершенствование методов их контроля»

Актуальность проблемы.

Широкое распространение различных болезней, патогенетически связанных с дисбактериозом, и высокая частота выделения лекарственно-устойчивых форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, высеваемых при обследованиях на дисбактериоз, делает актуальной проблему обеспечения практического здравоохранения средствами коррекции микробиоценоза разных биотопов организма человека [3,26,90,108,194,198].

Применение бактерийных препаратов (пробиотиков) разнонаправленного действия неуклонно расширяется и включает не только заболевания желудочно-кишечного тракта, но и разные формы патологии полости рта, женских гениталий, кожные болезни, нарушения иммунного статуса и др.

• [3,5,15,26,29,35,44,91,93,138,142,165].

Для целей бактериальной терапии используют биопрепараты из живых микроорганизмов нормального микробиоценоза человека: бифидобакте-рий, лактобацилл, кишечной палочки, энтерококков и других представителей нормофлоры [2,4,13,22,46,52,55,92,94,103,115,118,126]. В Российской Федерации зарегистрированы отечественные и зарубежные моно- и комплексные биопрепараты (бифидумбактерин, бификол, пробифор, бифилиз, колибактерин, ацилакт, аципол, флорин форте, споробактерин, биоспорин, гастрофарм, бифиформ, бифиформ Кидс, линекс, экофемин, бактисубтил и

ДР)

Первый отечественный бифидосодержащий биопрепарат бифидумбактерин содержит в своем составе бифидобактерии вида В. bifidum, штаммы № 1, 791 или JIBA-3 [21,22,47]. В настоящее время бифидумбактерин сухой выпускают 10 предприятий РФ. Кроме препарата во флаконах и порошке выпускают бифидумбактерин в форме таблеток, капсул и суппозиториев.

Комплексный биопрепарат бификол создан, на основе таксономически отдаленных микроорганизмов двух видов - B.bijidum 1 и E.coli М-17, один из которых строгий анаэроб, а другой растет в условиях аэробиоза. Препарат получают путем совместного культивирования обоих штаммов. В основе композиции препарата лежит природный синергизм бактерий названных видов [88,97]. По данным Государственных клинических испытаний бификола выявлена его высокая терапевтическая эффективность и отмечено оптимальное соотношение производственных штаммов, позволяющее уменьшить на 3 порядка содержание колибактерий, предусмотренное для.колибактерина без ущерба для клинической эффективности препарата [26,27,89,96,195]. Выпуск бификола освоен 7 предприятиями РФ и 2 зарубежными.

Созданные в 70-е^годы прошлого столетия пробиотики бифидумбак-терин и бификол не утратили своего значения и продолжают пользоваться спросом в здравоохранении [14,71,80]. Согласно современным тенденциям развития проблемы бактериальной, терапии будущее, несомненно, принадлежит поликомпонентным препаратам-пробиотикам [3,15].

Качество бактерийных препаратов формируется на всех технологических этапах, начиная от штаммов и сырья, используемых питательных сред, условий культивирования бактерий, замораживания, способа» их высушивания и кончая готовой продукцией в зависимости от формы выпуска, условий хранения, транспортирования и определяется адекватностью методов контроля. Биопрепараты должны быть стандартными, стабильными, соответствовать требованиям нормативной документации (НД) в течение всего срока годности, поэтому важное значение имеет контроль готовой продукции [79,121,205].

Основным показателем качества бифидумбактерина и бификола является* специфическая активность, под которой для бактерийных препаратов понимается количество живых бактерий в дозе (ОСТ 91500.05.001.00, ФС на бифидумбактерин и бификол).

Разработанная технология производства бификола в условиях стационарного культивирования штаммов на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского обеспечивала требуемое количественное соотношение живых микроорганизмов обоих видов в дозе препарата - не менее 107 КОЕ бифидо-бактерий и колибактерий (ФС на бификол).

Однако освоение производства бификола на новых предприятиях и модификация исходной технологии (использование нового оборудования, глубинного культивирования без соблюдения коррекции кислотности с аэрацией различной степени интенсивности и разных по составу питательных сред) привело к нестандартности препарата по специфической активности. Показатели жизнеспособности колебались на предприятиях от серии к серии. Неконтролируемый рост кишечной палочки и низкое содержание бифидобакте-рий не позволяли с помощью существующего метода контроля объективно определять количество живых бифидобактерий в дозе бификола как в готовом препарате, так и в полуфабрикате.

Опыт работы контролирующих организаций показывает, что улучшению качества коммерческих препаратов способствует наличие стандартных образцов разных уровней: международных, национальных, отраслевых и стандартных образцов предприятий, использование которых обеспечивает стандартизацию и сравнительное изучение контролируемых параметров препаратов, выпускаемых на разных предприятиях [9,33].

Разработанный ранее Отраслевой стандартный образец (ОСО) колибак-терина с успехом применяется в течение многих лет для контроля колисо-держащих препаратов [57,125]. До настоящего времени разработок ОСО би-фидумбактерина не предпринималось.

В связи с изложенным представлялось необходимым разработать, изучить и внедрить в практику производства ОСО бифидумбактерина для более достоверного определения количества живых бифидобактерий в дозе бифидосодержащих препаратов, а также изучить разные способы ингибирования кишечной палочки в смешанной культуре, не влияющие на бифидобактерии и позволяющие учитывать количественное содержание бифидо- и колибак-терий при совместном выращивании.

Цель и задачи исследования

Цель исследования - экспериментально разработать и апробировать в производственных условиях новые методы контроля специфической активности бифидосодержащих моно- и комплексного биопрепаратов (бифидумбактерина и бификола). г

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1.Оценить информативность метода контроля содержания живых бифидо- и колибактерий в дозе бификола по ВФС 42-65ВС-86.

2. Разработать, изучить и внедрить в практику Отраслевой стандартный образец бифидумбактерина, предназначенный для сравнительной оценки специфической активности бифидумбактерина и бификола.

3. Изучить чувствительность штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17, входящих в бификол, к воздействию высоких температур и к 19 антибиотикам разных химических групп.

4. Изучить кислотообразующую активность бифидо- и колибактерий в смешанной культуре.

5. Изучить чувствительность штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17, составляющих бификол, к ингибирующему действию азида натрия и разработать условия приготовления питательной среды с этим ингибитором, готовой к применению, для контроля содержания живых бифидо- и колибактерий в бификоле.

6. Разработать и апробировать в условиях производства точный метод контроля специфической активности бификола (по содержанию живых би-фидо- и колибактерий в дозе).

Диссертация выполнена в соответствии с основными планами научных исследований ГИСК им. J1.A. Тарасевича:

- Характеристика производственных штаммов-продуцентов колибакте-рина, бифидумбактерина и лактобактерина по антагонистической активности, устойчивости к антибиотикам и жизнеспособности. УДК 578.085.1612.336.3, № гос. Регистрации 79049914.

- Разработка, усовершенствование и стандартизация методов контроля лекарственных форм биопрепаратов из лакто- и бифидобактерий. УДК 612.336.3 58.09.003.12:658.516. № Гос. Регистрации 0186. 0 067168.

- Договоры № 737/089/024 и 034/ 089/009 с Минздравом России - Отраслевая научно-исследовательская программа «Эпидемиология и микробиология» и договор с Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека № 73-Д в рамках отраслевой научно-исследовательской программы «Научные аспекты обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия в Российской Федерации на 2006-2010 годы».

Научная новизна

1. Выявлено избирательное действие азида натрия по отношению к кишечной палочке в смешанных культурах с бифидобактериями в жидких питательных средах. Подобраны концентрации и показана возможность использования азида натрия для ингибирования роста кишечной палочки, что позволило разработать, апробировать и внедрить надежный метод оценки количества жизнеспособных бифидобактерий в препарате бификол.

2. Изучена кислотообразующая активность бифидо- и колибактерий при совместном культивировании и выявлена прямая связь между содержанием в исследуемом разведении бифидобактерий (чувствительность до 1 колонии) и показателем титруемой кислотности питательной среды. Показатель кислотности не ниже 100 °Т свидетельствует о присутствии бифидобактерий в данном разведении и позволяет определить количество бифидобактерий в препарате.

3. Показано, что чувствительность к антибиотикам культур B.bifiduml и E.coli М-17 в моно- и комплексном препаратах изменяется в зависимости от состава питательных сред, используемых для культивирования штаммов и условий культивирования.

4. Разработана модификация питательной среды Блаурокка с использованием азида натрия, обеспечивающая точность количественного учета бифидобактерий в препарате.

Практическая значимость работы

1. Разработан, апробирован на разных предприятиях и внедрен в нормативную документацию метод контроля количественного содержания живых бифидобактерий и кишечной палочки в комплексном препарате бификол.

2. - Разработан и апробирован на предприятиях Отраслевой стандартный образец бифидумбактерина (ОСО-42-28-161-89), предназначенный для контроля содержания жизнеспособных бифидобактерий в производственных сериях бифидумбактерина, бификола и других бифидосодержащих препаратов. ОСО внесен в Государственный реестр.

3. Новый метод учета количества живых микроорганизмов в бификоле с использованием модифицированной питательной среды Блаурокка позволил усовершенствовать технологию совместного культивирования штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 и способствовал повышению качества препарата.

Результаты научной работы отражены в НД:

1. Изменения № 2 к ВФС 42-65ВС-86 на бификол (ФС 42-3268-96, ФСП 42-0010160601, ФСП 42-0028220201, ФСП 42-0109220501, ФСП 42-0108220601, ФСП 42-0381241702, ФСП 42-0100375302, ФСП 42-0061231902, ФСП 42-0504676205, ФСП 42-6203-06, ФСП 42-1606-06).

2. РП на бификол

3. Свидетельство на ОСО бифидумбактерина 42-28-161-89. Утв. ГИСК им. JI.A. Тарасевича 5.01.89. ОСО бифидумбактерина внесен в Государственный Реестр.

4. Инструкция по применению ОСО бифидумбактерина.

5. Бифидумбактерин сухой (ФС 42-132 ВС-94, ФС 42- 3947-00; ФСП 420028-212701, ФСП 42-0135112201, ФСП 42-0100228902, ФСП 42-0110332002, ФСП 42-0338284602, ФСП 42-0269231802, ФСП 42-0109453403, ФСП 420108453203, ФСП 42-0381454003, ФСП 42-0022580804, ФСП 42-0010508904, ФСП 42-0504722405).

6. Бифидумбактерин в свечах (ВФС 42-224ВС-89, ФС 42-3240-95; бифидумбактерин суппозитории ФСП 42-0109027000, ФСП 42-0108027100, ФСП

42-0100-229002, ФСП - 42-0504229004, ФСП 42-0109027005, ФСП 42-0108027105, ФСП 42-0107026605).

7. Бифидумбактерин в таблетках (ФС 42-3449-97, ФСП 42-0107061700, ФСП 42-0135112201, ФСП 42-0107061705).

8. Биомасса бифидобактерий (ВФС 42-3378-99, ФСП 42-01341375-01, ФСП 42-0110305402).

9. Бифидумбактерин в капсулах (ВФС 42-3356-99, ФСП 42-0109137801, ФСП 42-0108138101, ФСП 42-0338353202, ФСП 42-0109137806,).

10. Бифидумбактерин форте (ВФС 42-2459-95, ФС 42-3784-99).

11. Бифилиз сухой (ВФС 42-2631-95, ФСП 42-0110027200, ФСП 4201081380-01, ФСП 42-0109137901, ФСП 42- 0110027205).

12. РП на бифидумбактерин сухой, таблетки, свечи, капсулы и порошки.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Евлашкина, Вера Францевна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что метод контроля по ВФС 42-65ВС-86 двухкомпо-нентного пробиотика бификол не обеспечивал точного учета содержания живых бифидо- и колибактерий в дозе препарата.

2. Выявлены различия по кислотообразующей активности у штаммов B.bifdum 1 ( не ниже 100 °Т) и E.coli М-17 (не выше 75 °Т), что служит одним из надежных показателей для определения количества живых бифидо-и колибактерий в дозе препарата бификол.

3. Предложена готовая к применению на производстве модифицированная среда Блаурокка с добавлением азида натрия, ингибирующая рост штамма E.coli М-17 в смешанных культурах и сохраняющая ростовые свойства штамма В. bifidum 1. Это позволяет надежно определять количество бифидо- и колибактерий в двухкомпонентном препарате бификол.

4. Разработан, апробирован и утвержден Отраслевой стандартный образец (ОСО-42-28-161-89) бифидумбактерина, который обеспечивает точный учет содержания живых B.bifidum 1 в моно- и комплексных бифидо содержащих препаратах (бифидумбактерин, бификол, бифилиз, бифидумбактерин форте и т.д.).

5. Показано, что ингибирующее действие высоких температур и различия по чувствительности к антибиотикам разных химических групп не могут быть использованы для надежного разделения бифидо- и колибактерий в препарате бификол.

6. Разработанные методы оценки количества жизнеспособных бифидо- и колибактерий (кислотообразующая активность, определение КОЕ штаммов на модифицированной среде Блаурокка с азидом натрия и использование ОСО бифидумбактерина) обеспечили стандартизацию основных этапов технологии совместного культивирования штаммов B.bifidum 1 и E.coli

М-17. Это положительно отразилось на количественном соотношении бифидо- и колибактерий в готовом препарате и привело к повышению качества и стандартности производственных серий бификола на всех выпускающих его предприятиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Широкое распространение различных болезней, патогенетически связанных с дисбактериозом, и высокая частота выделения лекарственноустой-чивых форм патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, высеваемых при обследованиях на дисбактериоз, делает актуальной проблему обеспечения практического здравоохранения средствами коррекции микробиоценоза разных биотопов организма человека [3,26,90,108,194,198]. Применение бактерийных препаратов разнонаправленного действия неуклонно расширяется и включает не только заболевания желудочно-кишечного тракта, но и разные формы патологии полости рта, женских гениталий, кожные болезни, нарушения иммунного статуса и др.[3,5,15,26,29,35,44,91,93,138, 142, 165].

Известно, что лечебное действие пробиотиков обусловлено биологическими свойствами штаммов, входящих в их состав, а также метаболитами, продукцией бактериоцинов, витаминов, ферментов и других биологически активных веществ, антагонистической активностью против патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, стимуляцией специфических и неспецифических факторов иммунитета. Эти свойства проявляются в зависимости от физиологического состояния микроорганизмов, на основе которых изготовлен бактерийный препарат, и условий технологического процесса приготовления препарата.

Первый отечественный бифидосодержащий биопрепарат бифидумбактерин содержит в своем составе бифидобактерии вида B.bifidum, штаммы № 1, 791 или ЛВА-3 [21,22,47]. Комплексный биопрепарат бификол (приказ МЗ СССР от 30.09.1975 о разрешении к промышенному изготовлению и реализации) создан на основе совместно выращиваемых микроорганизмов двух видов — B.bifidum .1 и Е.coli.М-17, представителей нормофлоры организма человека, один из которых строгий анаэроб, а другой растет в условиях аэробиоза. В основе композиции препарата лежит природный синергизм бактерий названных видов [88,97]. По данным Государственных клинических испытаний бификола, выявлена его высокая терапевтическая эффективность и отмечено удачное соотношение составляющих производственных штаммов, позволяющее уменьшить на 3 порядка содержание колибактерий, предусмотренное-для монопрепарата колибактерина, без ущерба для клинической эффективности препарата [26,27,89,96,195].

Высокая терапевтическая эффективность отечественных бифидосо-держащих препаратов бифидумбактерина и бификола привела к расширению масштабов их выпуска и увеличению числа производящих предприятий. В настоящее время-бифидумбактерин сухой выпускают 10 предприятий России. Кроме препарата во флаконах и порошке выпускают бифидумбактерин в* форме таблеток, капсул и суппозиториев. Выпуск бификола- освоен 7 предприятиями России и 2 зарубежными предприятиями.

Выпускаемые предприятиями препараты должны быть стандартными и стабильными, соответствовать требованиям НД'и обеспечивать эффективное лечебное действие, установленное при клиническом испытании препарата на больных на протяжении всего срока годности. Лечебная эффективность бификола зависит не только от количественного содержания живых B.bifidum 1 и E.coli М-17, но и от их соотношения в препарате, поэтому ведущим показателем качества бификола является специфическая активность, определяемая по содержанию в дозе живых КОЕ бифидобактерий и колибактерий [79,121, 205].

Однако расширение производства на новых предприятиях и модификация- исходной технологии при использовании нового оборудования привели к нестандартности препарата по специфической активности.

Анализ* результатов контроля с помощью дополнительных методов (окраски мазков, приготовленных из учитываемых разведений препарата) выявил, что часть производственных серий бификола не соответствовала требованиям НД (107 КОЕ\доза) по количеству живых бифидобактерий.

Неконтролируемый рост кишечной палочки и низкое содержание бифидобактерий не позволяли с помощью существующего метода контроля объективно определять количество живых бифидобактерий в дозе бификола как в готовом препарате, так и в полуфабрикате.

Доказано, что различия в показателях контроля коммерческих серий бифидосодержащих препаратов нередко связаны с несовершенством питательных сред, используемых при изготовлении и контроле препарата, а также с условиями проведения контроля. В этой связи оценку количества КОЕ бифидобактерий в дозе препарата целесообразно проводить в сравнении с ОСО, активность которого известна, а его использование позволило бы оценивать и стандартизовать условия проведения контроля [9,33].

В связи с изложенным, представлялось необходимым разработать, изучить и внедрить в практику производства ОСО бифидумбактерина для более достоверного определения содержания живых бифидобактерий в дозе бифидосодержащих препаратов, а также изучить разные способы ингибиро-вания кишечной палочки в смешанной культуре, не влияющие на бифидо-бактерии и позволяющие учитывать количественное содержание бифидо- и колибактерий при совместном выращивании.

Согласно исходной НД на бификол, определение количества живых би-фидо- и колибактерий в бификоле проводили при совместном культивировании штаммов в среде КД-5. Однако трудность определения количественного содержания бифидобактерий заключается в том,, что этот микроорганизм является строгим анаэробом и при культивировании на полужидкой среде КД-5 характерные колонии бифидобактерий видны только на 3 - 4 сутки инкубации. Колибактерии обладают на этой среде более высокой скоростью роста с визуальным проявлением мутности на первые сутки роста и не формируют четких изолированных колоний, поэтому регламентированный метод был неприемлем для количественной оценки содержания бифидобактерий в бификоле.

На первом этапе исследований изучали характер роста бифидо- и колибактерий при культивировании в средах КД-5 и Блаурокка. Для этой цели использовали штаммы B.bifidum I и E.coli М-17, ОСО колибактерина, коммерческие серии колибактерина, бифидумбактерина, бификола и экспериментальные варианты бификола. Испытуемые препараты разводили согласно НД, титровали методом десятикратных разведений в пробирках со средой КД-5 и Блаурокка и инкубировали при температуре (38+1) °С в течение 4 суток. В посевах бифидумбактерина в среде Блаурокка вырастали изолированные колонии в форме «гвоздиков» и плотных «тяжиков» длиной 2-5 мм. При посеве колибактерина отмечали неравномерное помутнение среды с удлиненными рыхлыми «тяжами» длиной 15-20 мм. В опытах с бификол ом отмечался рост, аналогичный росту при посеве колибактерина. Таким образом, было доказано, что удлиненные рыхлые «тяжи» в препарате бификол не являются бифидобактериями, за которые их принимали длительное время.

В среде КД-5, регламентированной НД, морфология роста кишечной палочки была аналогична росту в среде Блаурокка, тогда как у бифидобактерий в среде КД-5, в отличие от роста на среде Блаурокка, отмечена нечеткая форма колоний: они были мелкими и более рыхлыми. Поэтому дальнейшее изучение препаратов проводили на среде Блаурокка.

Для стандартизации условий проведения испытаний специфической активности бифидосодержащих препаратов был приготовлен ОСО бифидумбактерина. Изучены 4 серии бифидумбактерина и выбрана одна, которая соответствовала требованиям, предъявляемым к Стандартным образцам. Разработанный ОСО бифидумбактерина апробирован на предприятии МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского и в Тюменском НИИКИП и введен в НД

ФС и РП на бифидосодержащие препараты). Свидетельство на ОСО-42-28-161-89 бифидумбактерина и Инструкция по применению утверждены Ученым Советом ГИСК им. JI.A. Тарасевича 05.01.89 г, служит эталоном показателя жизнеспособности бифидобактерий и постоянно используются производствами при контроле коммерческих серий бифидумбактерина с 1989 г, бификола - с 1992 г и других бифидосодержащих препаратов.

ОСО позволил выявить нестандартность по качеству контрольных питательных сред. В связи с этим во всех предприятиях была проведена научная работа по стандартизации физико-химических показателей питательной среды Блаурокка, КД-5 и их основ. Следует подчеркнуть, что особенно важно использовать ОСО при проведении арбитражного, рекламационного и предварительного контроля, когда имеется необходимость выявить активные серии от неактивных и исключить влияние на результаты экспериментов побочных факторов (условий проведения опыта, а главное - качества среды). Применение его в практике контроля способствовало стандартизации выпускаемых серий бификола и бифидумбактерина, а также возможности дать дифференцированную оценку качества препарата разных производств.

Далее были изучены различные способы угнетения роста кишечной палочки в бификоле с целью выявления роста бифидобактерий.

Изучено влияние термического воздействия на жизнеспособность бифидобактерий и кишечной палочки. Исследование показало, что попытка ингибировать кишечную палочку путем термической обработки не дала положительных результатов. При прогревании образцов бификола, бифидумбактерина и колибактерина на водяной бане при температуре 56 °С и 100 °С количество КОЕ бифидо- и колибактерий снижалось с одинаковой закономерностью.

Для выбора антибиотика, способного ингибировать рост кишечной палочки и не влиять на рост бифидобактерий, проведены исследования по определению чувствительности штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 к 19 различным антибиотикам. Наиболее подходящим антибиотиком оказался канамицин. Однако при анализе чувствительности к канамицину штаммов, входящих в бификол, было выявлено, что после совместного культивирования устойчивость штамма E.coli М-17 повышалась до МИК 128 мкг/мл. При выращивании штамма B.bifidum 1 в среде с концентрацией канамицина 128 мкг/мл снижалось количество колоний, изменялась их форма и уменьшался размер. Это не позволило использовать канамицин для ингибирования роста кишечной палочки с целью учета количества бифидобактерий в комплексном препарате бификол.

При изучении возможности использования кислотообразующей активности двух компонентов бификола для оценки специфической активности препарата было установлено, что разная кислотообразующая активность штаммов В.bifidum. 1 и E.coli М-17 позволяет оценить количество бифидобактерий в дозе препарата бификол. Следует отметить, что учесть бифидо-бактерии возможно и в случае, когда для определения кислотности берут разведение препарата, содержащее только одну видимую колонию. При этом о при пересеве из разведения 10', в котором отмечался рост 1-2 колоний бифидобактерий, в пробирку со средой Блаурокка и последующей инкубацией в течение 72 часов кислотность среды с выросшей культурой соответствовала не менее 100-125 °Т. Таким образом, установлено, что бифидобактерии (при использовании метода кислотообразующей активности) находятся в том разведении, где показатель кислотности по Тернеру не ниже 100 °Т. Этот метод позволяет определить количество бифидобактерий в бификоле. Однако метод не позволяет увидеть форму колоний, к тому же он продолжителен (7 суток) и достаточно трудоемок.

При подборе ингибитора роста кишечной палочки в смешанных культурах мы остановили свой выбор на азиде натрия, который известен своим подавляющим действием в отношении грамотрицательных бактерий [45,56].

Исследование влияния разных концентраций азида натрия на рост кишечной палочки и бифидобактерий в монокультурах и в смоделированных вариантах бификола показало, что азид натрия в концентрации 0,5; 1,0; 1,5 мг на 10 мл среды Блаурокка не оказывал существенного влияния на жизнеспособность бифидобактерий, в концентрации 2 и 2,5 мг угнетал рост бифидобактерий, а в концентрации 3 и 3,5 мг полностью подавлял его. В опытах с колибактерином установили, что между количеством живых колибактерий и концентрацией азида натрия, необходимой для подавления роста кишечной палочки, существует прямая зависимость. Так, для ингибирования роста кишечной палочки в количестве 10 КОЕ требуется 0,6 мг азида натрия на 10 мл среды Блаурокка, а при содержании

107 КОЕ нужно 1,6 мг ингибитора.

В результате исследований установлено, что подобранная концентрация азида натрия 1мг на 10 мл среды Блаурокка оптимальна для количественного учета бифидобактерий в препарате, так как не угнетает рост бифидобактерий и достаточна для ингибирования роста кишечной палочки в учитываемых f\ П Я разведениях (10" ,10" и 10" ).

Изучение возможности использования азида натрия для подавления роста кишечной палочки при контроле определения количества живых бифидобактерий в бификоле привело к разработке модификации питательной среды Блаурокка с азидом натрия, оптимальной по составу и способу приготовления, обеспечивающей точность и надежность количественного учета бифидобактерий. Апробированы разные режимы стерилизации (120 °С - 15 мин; 112 °С - 20 мин; 110 °С - 30 мин) и доказано, что автоклавирование при температуре 110 °С в течение 30 минут не разрушает азида натрия, сохраняет оптимальные ростовые свойства для бифидобактерий и высокую ингибирую-щую активность в отношении кишечной палочки.

Таким образом, проведенные нами исследования способствовали разработке 2 методов, позволяющих точно определить разведение бификола, в котором имеется рост бифидобактерий.

Культуральный метод с использованием среды Блаурокка с азидом натрия более нагляден, не требует дополнительных пересевов и, следовательно, менее трудоемок и экономичен по времени и по использованию питательных сред, лабораторной посуды и времени сотрудника. Корреляция показателей кислотообразующей активности с наличием выросших видимых колоний бифидобактерий при использовании метода с азидом натрия свидетельствует о надежности обоих разработанных методов контроля содержания жизнеспособных бифидобактерий в комплексном препарате бификол.

При использовании новых методов контроля была подтверждена . нестандартность технологии изготовления препарата на вновь открывшихся производствах, что выражалось в занижении количественного содержания бифидобактерий в бификоле. Из 40 серий бификола, выпущенных до внедрения нового метода контроля, только 11 содержали необходимое количество бифидобактерий. Остальные 29 серий содержали заниженное количество бифидобактерий при завышенном количестве колибактерий.

Применение надежного метода контроля количественного содержания живых бифидобактерий и колибактерий в дозе бификола способствовало стандартизации на каждом предприятии технологии совместного культивирования обоих компонентов, что отразилось на их соотношении в готовом препарате и привело к повышению качества и стандартности коммерческих серий бификола.

Широкое применение нового метода контроля специфической активности бификола (на среде Блаурокка с азидом натрия) и использование ОСО бифидумбактерина внесло коррективы в оценку питательных сред как производственных для культивирования микроорганизмов, так и контрольных.

Возникла необходимость повсеместно проводить контроль питательных сред по физико-химическим параметрам: общему и аминному азоту, содержанию пептидов, триптофана, натрия хлорида и др. Полученные результаты позволили производителям внести единые требования к качественным показателям питательных основ и сред в нормативную документацию (РП). Эти мероприятия положительно отразились на показателе количественного содержания двух микробных компонентов в бификоле. Так, из 87 серий, выпущенных после внедрения в НД нового метода, не соответствовала требованиям НД только 21 серия, которые были забракованы на этапе предварительного контроля.

Многократно подтвержденная достоверность и воспроизводимость разработанного метода контроля, а также его апробация на различных предприятиях отрасли послужили основанием для введения данного метода в действующую НД (Изменение N 2 ВФС 42-65ВС-86 на бификол сухой, РП на бификол) для количественной оценки бифидобактерий и колибактерий в бификоле.

После перехода на новый метод контроля и доработки технологического процесса производства на каждом конкретном предприятии, разработки и обеспечении таких режимов культивирования в реакторе, где соблюдау ется количественное соотношение штаммов B.bifidum 1 и E.coli М-17 (10 КОЕ\доза), производители в Российской Федерации выпускают бификол, соответствующий требованиям НД.

Таким образом, разработанные и внедренные в производство новый метод контроля специфической активности бификола и ОСО бифидумбактерина способствовали усовершенствованию и стандартизации на каждом предприятии технологии производства бифидосодержащих препаратов, что привело к повышению качества и стандартности бифидумбактерина, бификола. .

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Евлашкина, Вера Францевна, 2009 год

1. Алешкин В.А., Тихонова Н.Т. и др. Новое направление бактериотерапии — комплексные пробиотики//Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. -М., 2002, С. 47.

2. Алешкин В. А., Афанасьев С. С., Поспелова В. В. и др. Становление пробио-тикотерапии в России //Вестник Российской академии медицинских наук 2005. -№ 12,С. 3-13.

3. Алешкин В. А., Афанасьев С. С., Поспелова В. В. и др. Пробиотики, пребио-тики, синбиотики и их роль в поддержании иммуномикроэкологического статуса человекаУ/Materia Medica, 2006 «Фармарус Принт», Москва, с 43-57.

4. Амерханова A.M. Дифференцированный подход к возрастным группам больных залог эффективности применения пробиотических средств//Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация. - М., 2003. - вып. 7, С.9-17.

5. Анкирская А.С., Муравьева В.В. Видовой состав и некоторые биологические свойства лактобацилл при различных состояниях микроэкологии влагалища //Акушерство и гинекология,- 2000.- № 3. С. 26-28.

6. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях //Л., 1962. 180 с. ,

7. Бабин В.Н., Домарадский И.В., Дубинин А.В., Кондракова О.А. Биохимические и молекулярные аспекты симбиоза человека и его микрофлоры//Журн. Рос-хим. им. Д.И.Менделеева. 1994. - Т. 38. - № 6, С. 66-78.

8. Бектимиров Т.А. Экспертиза и испытание иммунобиологических препаратов// Тез. Первой Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» М., 2004. С.10-11.

9. Бланков Б.И., Казьмина Ю.Г. Особенности антагонистической активно• сти E.coli'М-17//В кн.: Кишечные и воздушнокапельные инфекции: Труды МНИИЭМ, т. 13.- М. -1969. - С.387-389.'

10. Блинкова Л.П., Альтшулер М.Л., Горобец О.Б., Дорофеева Е.С. Бактериоци-ны и бактериоциноподобные вещества как биологически активные средства// Клиническое питание 2007, № 1-2, С. 22.

11. Бондаренко В.М., Грачева Н.М., Мацулевич Т.В. Дисбактериоз кишечника у взрослых//КМК Scientific Press. -М., 2003,- 220 с.

12. БондаренкоВ.М. Прикладные аспекты молекулярной биологии бифидобактерий и лактобацилл.//Журн. микробиол., 2006, №2, С.89-97.

13. Бондаренко В.М. Характеристика и терапевтический потенциал проби-отиков по данным клинических испытаний.//Биопрепараты.- 2007. -№1. С.11-15.

14. Бондаренко В.М., Лиходед В.Г. Идеи И.И.Мечникова и современная микроэкология кишечника человека//. Журн. микробиол., 2008, №5, С.23-29.

15. Брашкина Н.П., Самсыгина Г.А., Першина Г.Д. и др. Линекс в лечении дис-бактериоза кишечника у детей раннего возраста//Сб.: «Человек, и лекарство».-М.,1998. С.257.

16. Брюханов А.Л., Нетрусов А.И. Аэротолерантность строго анаэробных микроорганизмов: факторы защиты от окислительного стресса (обзор)//Прикладная биохимия и микробиология, 2007, том 43, № 6, С. 635-652.

17. Вилыианская Ф.Л., Щетинин И.Н., ГавриловЛ.Ф. и др. Изучение процесса заселения E.coli М-17 кишечника больных острой дизентерией леченных бифико-лом.// Журн. микробиол., 1981, № 6, С. 107-110.

18. Воробьев А.А., Лыкова Е.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции // Журн. микробиол., 1999.- № 6, С. 102- 105.

19. Гивенталь Н.И., Соболев В.Р., Ведьмина Е.А. и др.- Лабораторное дело, 1982, № 1, С. 44-48.

20. Гончарова Г.И. Изучение бифидобактерий, разработка препарата «Сухой бифидумбактерин» и его эффективность при кишечных заболеваниях детей первого года жизни: Автореф. дис. кан. биол. наук. -М., 1970. -20 с.

21. Гончарова Г.И. Бифидофлора человека, ее защитная роль в организме и обоснование сфер применения препарата бифидумбактерина: Автореф. дис. док.биол. наук.- М., 1982. 38 с.

22. Гончарова Г.И., Семенова Л.П., Лянная A.M. и др. Бифидофлора человека, ее нормализующие и защитные функции //Антибиотики и мед. биотехнол. 1987, № 3 -С. 179-183.

23. Горская Е.М. Гнотобиологические исследования в определении колонизационной резистентности кишечника.//Антибиотики и химиотер.-1989.-Т.34.-№.-С.601.

24. Горская Е.М. Механизмы развития микроэкологических нарушений в кишечнике и новые подходы к их коррекции.// Научн. доклад па соискание степени док. мед. наук.- Москва.- 1994.- 53с.

25. Грачева Н.М, Поспелова В.В., Трембовля С.И., Вильшанская Ф.Л, Курносо-ва Н.А., Гаврилов А.Ф., Плотникова Л.В., Одинцова И.Л. Бификол в комплексном лечении больных с острыми кишечными инфекциями// Экспресс- информация. М., 1982. -вып. 10. -С.13-18.

26. Грачева Н.М, Гаврилов А.Ф., Щербаков И.Т., Леонтьева Н.И. Эффективность коротких курсов лечения бактериальными биопрепаратами у больных с острыми кишечными инфекциями// Новые лекарственные препараты. Экспресс информация. М., 1990. -вып. 5. -С.9-16.

27. Грачева Н.М., Поспелова В.В., Аваков А.А. и др. Новый бифидосодержащий пробиотик «Бифидин сухой»// Новые лекарственные препараты. Экспресс- информация. М., 2000. -вып.З. -С.37-42.

28. Грачева Н.М., Колганова Н.А., Щербаков И.Т. с соавт. Микробная экология и состояние слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта у больных аллергическими заболеваниями//Журн. микробиол., 2004, №2, С.79-81.

29. Григорьев А.В., Бондаренко В.М., Абрамов Н.А. и др. Разработка и клиническая оценка пробиотика «Бифидумбактерин форте»//Журн. микробиол., 1997, №3, С. 92-96.

30. Григорьева В.М, Астанина Л.Н , С.В. Лесняк С.В., Евтухова Л.Н. Чувствительность к антибиотикам бифидобактерий и лактобактерий, используемых для приготовления бифидум- и лактобактерина//Антибиотики и медицинская биотехнология, 1983, N6 с 418-421.

31. Гриценко В. А., Бухарин О. В. Экологические и медицинские аспекты симбиоза Escherichia coli и человека// Журн. микробиол., 2000, № 3, С. 92-99.

32. Дзагуров С.Г. Проблема стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов//В кн.: Материалы XV Всесоюзного съезда эпидемиологов, микробиологов, инфекционистов.- Тбилиси 1970, ч. 2, с. 174-177.

33. Евтухова JI.H. Восстановление жизнеспособности бактерий, поврежденных некоторыми физическими факторами: Автореф.дисс.канд.биол.наук.-М.,1969.-14 с.

34. Добрица В.П., Петров Л.Н., Симбирцев А.С., Лобзин Ю.В. Иммунорегуля-ция бактериальными пробиотиками//Тез. Всеросс. научно-практ. конф.«Вакциноло-гия 2008». 11-12 ноября М., 2008, с.49.

35. Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И., Коршунов В.М. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека//Ж. микробиол., 2002, № 5, С. 98 104.

36. Злобин В.Н., Осин Н.С., Помелова В.Г. Перспективы совершенствования средств индикации на основе иммунофлюоресцентного анализа// Вестник РАМН, 1999, № 8, С. 6-8.

37. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Бондаренко В.М. Модуляция иммунной системы лактобактериями//Журн. микробиол., 2004, №6, С.57-60.

38. Зорина В.В., Николаева Т.Н., Шаповалова О.В. Влияние бактерий рода Lactobacillus на миграционную активность макрофагов//Журн. микробиол., 2006, № 6, С.40-44.

39. Ивановская Н.П., Осин Н.С., Храмов Е.Н., Злобин В.Н. Люминесцентноци-тохимические методы индикации микроорганизмов//Вестник РАМН, 1999, № 8, С.33-39.

40. Иммунобиологические препараты и перспективы их применения в инфекто-логии /под ред. Онищенко Г.Г., Алешкина В.А., Афанасьева С.С., Поспеловой В.В. ГОУ ВУНМЦ МЗ РФ, М., 2002. 595 с.

41. Карапетян А.О. Биологический антагонизм некоторых представителей кишечной микрофлоры и опухолевых клеток (в свете данных морфологических и бактериологических исследований).//Автореф. дис. канд. мед.наук. -М., 1987.-17 с.

42. Карпушина С.Г., Тюрин М.В., Иванов А.А. и др. Выделение, идентификация и некоторые биологические свойства бифидобактерий' из кишечника человека/Биотехнология. -1998, № 2; С.28-36.

43. Кашковская Н.В. Экспериментально-клиническое обоснование применения биологических микробных препаратов-в гинекологии л и стоматологии: Автореф. дис.канд.биол.наук. -М., 1992. -17 с.

44. Квасников Е.И., Нестеренко О.А. Молочнокислые бактерии и пути их использования. М. "Наука", 1975. - 392 с.

45. Коваленко Н.К, Биология молочнокислых бактерий пищеварительного тракта человека и животных: Автореф. дис. докт. биол. наук. -Киев, 1991.-29 с.

46. Козлова Э.П., Гончарова Г.И., Лянная-А.М. и др.Бифидумбактерин*в,лечении и профилактике дисбактериоза кишечника//Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация: -М., 1987. вып.4. -С.6-13.

47. Козлова4Э.П., Грачева Н:М:, Лянная A.M. и др. Перспективы использования бифидобактерий разных видов в составе лечебно-профилактических средств// Новые лекарственные препараты. Экспресс-информация:-М.,1987.- вып.4.-С.14-19.

48. КоротяеВ'А.И. Механизмы саморегуляции бактериальной клетки. М., «Медицина», 1973.

49. Коршунов В.М. Дисбактериозы кишечника и коррекция микрофлоры анти-биотикоустойчивыми бифидобакгериями: Автореф.дис.док.мед.наук.-М., 1983.-42с.

50. Курепина Н.Е., Хмель И.А. Микроцины: природа и генетическое детерминирование//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1986, № 4, С.3-10.

51. Ленцнер А.А. Лактобациллы микрофлоры человека: Автореф. дис. док. мед. наук.- Тарту, -1973, 32 с.

52. Ленцнер А.А., Ленцнер Х.П., Микельсаар М.Э. и др. Лактофлора и колонизационная резистентность // Антибиот. и мед. биотех.- 1987. -32, № З.-С. 173-179.

53. Лизько Н.Н., Шилов В.М. Ж. Применение метода часовых стекл при исследовании кишечной микрофлоры //Лабораторное дело. 1979, № 7, С. 430-433.

54. Лесняк С.В., Шимчук Л.Ф., Евтухова Л.Н. и др. Разработка и изучение предполагаемого референс-препарата колибактерина // В кн.: Стандарты, штаммы и методы контроля вирусных, бактерийных препаратов и аллергенов. Сб. научных трудовМ., 1975.-С. 115-121.

55. Лиходед В. Г., Яковлев М. Ю, Лиходед Н. В. и др. Состояние антиэндоток-синового иммунитета при экспериментальном кишечном дисбакгериозе у мышей.// Журн. микробиол.;.1998, №4, С. 14-16.

56. Лыкова Е.А., Бондаренко В.М., Изачик Ю.А. и др. Коррекция про-биотиками микроэкологических и иммунных нарушений при гастродуоденальной патологии у детей//Журн. микробиол., 1996, № 2, С. 88-91.

57. Лянная A.M. Видовой состав коллекции бифидобактерий и их биологические свойства: Автореф. дис.канд.биол.наук. -М., 1981. -21 с.

58. Лях С.П. Адаптация микроорганизмов к низким температурам.// М., «Наука». 1976.- с. 1-160.

59. Малик Н.И., Панин А.Н., Вершинина И.Ю. Пробиотики: теоретические и практические аспекты// Био № 3(18), март 2002.

60. Мейсель М.Н. Люминесцентно-микроскопический анализ функционального состояния живого вещества-Изв. АН СССР. Сер. физ., 1951, т. 15, № 6, 778.

61. Методы контроля медицинских иммунобиологических препаратов, вводимых людям. Методические указания. М. : Информационно-издательский центр МЗ России, 1998.- 128 с.

62. Мечников И.И. Молочнокислые микробы и польза, приносимая ими здоровью СПБ изд. М.П. Петрова.-1911. 32 с.

63. Митрохин С.Д. Метаболиты нормальной микрофлоры человека в экспресс -диагностике и контроле лечения дисбиоза толстой кишки: Автреф. дис. докт. мед. наук. 1998. -37 с.

64. Митрука Б.М. Применение газовой хроматографии в микробиологии и медицине, (пер. с англ.). М., «Медицина», 1978.- 600 с.

65. Мухаммедов И.М., Шадиев Х.К., Абдуллаев М.И. с соавт. Нарушения микрофлоры кишечника и иммунной системы у детей, больных витилиго. Журн. микробиол., 2004, №2, С.74-76.

66. Навашин С.М., Фомина И.П. Рациональная антибиотикотерапия. М., 1982.-С. 38-49.

67. Несчисляев В.А. Пробиотики: микробиологические и технологические аспекты получения, контроля и конструирования препаратов: Автореф. дисс.докт.мед.наук. Пермь, 2005, 47 с.

68. Николаева Т.Н., Зорина В.В., Бондаренко В.М., 2004; Роль цитокинов в модуляции иммунореактивности организма бактериями родаLactobacillus Л Журн. микробиол., 2004, №6, С. 101-106.

69. Новик Г.И. Исследование' структурно-функциональной организации бифиг добактерий//Микробиология. Ж. -1998, № 3, С.376-383.

70. Осипова И.Г. Экспериментально-клиническое изучение споровых пробиог тиков//Автореф. дисс:докт.бйол.наук.-М;-2006.-48 с.

71. Пёретц Л.Г. Значение нормальной, микрофлоры;для организма человека -М., 1955.- 431 с.

72. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. М: «Мир», 1978.

73. Петров Л.Н., Вербицкая Н:Б., Дабрица В.П1, Галкин Г.Н., Петров Н.Л. Бактериальные пробиотики. Биотехнология, клиника, алгоритмы выбора. С-Петербург, 2008,- 136 с.

74. Пинегин Б.В:, Коршунов В.М., Гладько Я.А. и др. Совместное использование антибиотиков- и антибиотикоустойчивых бифидобактерий при лечении острых кишечных инфекций//Журн. микробиол., 1983, № 5; С. 28-32.

75. Подопригора Г.И. Иммунные и неспецифические механизмы колонизационной резистентности.//Антибиотики и колонизационная резистентность./Труды ВНИИ антибиотиков .- М. -1990. -вып.Х1Х. -С.15-25.

76. Поспелова В.В. Микробные биопрепараты для коррекции бакгериоценоза кишечника, их конструирование и применения. Автореф. дисс. докт. мед. наук. -М., 1979.-38 с.

77. Поспелова В.В., Черепанова Ю.В., Волкова Е.В., Лахтин В.М., Агапова Ю.В. Разработка пробиотиков наружного применения на основе лактобацилл// Клиническое питание, 2007.- №1-2, с.А 63.

78. Ратникова И.А., Гаврилова Н.Н., Колокова Н.Н. Идентификация антибиотических веществ молочнокислых бактерий//Биотехнология.-1995. № 5-6. - С. 19-20.

79. Рахимова Н.Г. Комплексный биологический препарат бификол и его осо-бенности//В кн: Эпидемиология, клиника, профилактика и лечение острых и хронических кишечных инфекций. М., 1975,т. 15, с. 113-116.

80. Рахимова Н.Г. Разработка комплексного бактерийного препарата бификол и его эффективность при кишечных расстройствах, связанных с дисбактериозом: Ав-тореф. дис.кан.биол.наук. -М., 1977. -16 с.

81. Савицкая И.С., Бондаренко В.М. Подавление мутагенной активности метаболитов кишечника при нормобиоценозе//Журн. микробиол., 2008, №3, С.53-58.

82. Сакович Г.С., Безматерных М.А. Физиология и количественный учет мик-роорганизмов//ГОУ ВПО УГТУ-УПИ 2005.

83. Саливан А., Норд К. Место пробиотиков в терапии инфекций желудочно-кишечного тракта у человека.// Клинич. микробиол. и антимикробная химиотерапия 2003, Т.5, № 3, С. 275-284.

84. Суворов А.Н., Захаренко С.М., Алехина Г.Г. Энтерококки как пробиотики выбора// Клиническое питание. 2003. № 1. С 26-29.

85. Сундукова М.Б. Исследование размножения бифидобактерий в стерильном молоке//В кн: Использование микробиологических процессов при производстве цельномолочных продуктов и молочных консервов. -М, 1983. -С. 14-18.

86. Тюрин М.В., Шендеров Б.А., Поспелова В.В. и др. К механизму антагонистической активности лакгобацилл// Журн. микробиол, 1989, № 2, С.3-8.

87. Ушакова А.Ю., Феклисова Л.В. Мескина Е.Р. Тедер Ю.Г. Волохович Т.Т., Пожалостина Л.В. Клинико-лабораторная эффективность применения различных схем аципола в лечении детей, больных острыми кишечными инфекциями// Биопрепараты. 2008, №2, С. 19-21.

88. Фихман Б.А. Рефрактометрия бактерий. В кн.: Эксериментальная микроио-логия. София, 1965, С. 207-230.

89. Халенева М.П. Эффективность разных составов накопления и обезвоживания биомассы в производстве таблетированного бифидумбактерина: Авто-реф.дис.канд.био.наук. М., 1989. -23 с.

90. Чард Т. Радиоиммунологические методы: Пер. с англ./ Перевод Морозовой М.С.; Под ред. и с предисл. Я. М. Варшавского.- М., Мир, 1981,- 248 с.

91. Чахава О.В. Гнотобиологические аспекты изучения нормальной микрофлоры// В кн.: Тез.докл.ХУТ Всесоюз.съезда микробиологов и эпидемиологов. -ч.1.-М., 1977.-С.255-256.

92. Чахава О.В., Горская Е.М., Рубан С.З. Микробиологические и иммунологические основы гнотобиологии//М.- Медицина.- 1982.- 152 с.

93. Червин В.В., Червинец В.М., Бондаренко В.М., Базлов С.Н. Язвенная болезнь, хронический гастрит и эзофагит в аспекте дисбактериоза эзофагогастродуо-денальной зоны. Тверь: ООО «изд. «Триада», 2004. - 200 с.

94. Червинец В.М., Бондаренко В.М., Самоукина A.M., Червинец Ю.В Скрининг непатогенных антагонистически активных штаммов Enterococcus faecium// Журн. микробиол., 2007, № 1, С.57-61.

95. Червинец Ю.В., Бондаренко В.М., Шабанова Н.А. и др. Бактериоциноген-ные высокоантагонистические штаммы лактобацилл. //Журн. микробиол., 2006, №7, С.78-82.

96. Черняховер С.И., Кожевникова Т.П. Использование окислительных ферментов в качестве теста определения количества живых бактерий в вакцине БЦЖ// В кн.: Вакцины и сыворотки. Сб. трудов ГИСК им. JI.A. Тарасевича. М., 1971, вып. 10, С. 24-26.

97. Чеснокова BJI. Варианты штамма E.coli М17, перспективные для получения эубиотиков: Автореф. дис.канд.мед.наук., М. 1998,- 20 с.

98. Чешева В.В., Манвелова М.А. Питательные среды для культивирования бифидобактерий. Обзор. Проблемы медицинской биотехнологи и иммунологии инфекционных болезней//Сб.науч.тр. -М., 1996. -т.2. -С.84-90.

99. Чудинов А.В., Савицкий А.П., Злобин В.Н.Люминесцентный ультрамикроанализ для одновременного определения биологических и химических веществ: методология и пути решения//Вестник РАМН № 8, 1999, С. 15-20.

100. Чупринина Р.П. Биопрепараты: требования к отбору производственных штаммов, оценка показателей, проблемы стандартизации // Пробиотические микроорганизмы — современное состояние вопроса и перспективы использования: Сб. мат. конф. -М ., 2002.-С. 10-11.

101. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание/Атом 1: Микрофлора человека и животных и ее функции.-«Грант»-М., 1998. -287 с.

102. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание// том 2: Социально-экологические и клинические последствия дисбаланса микробной экологии человека и животных. Грант». -М., 1998. - 413 с.

103. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.З: Пробиотики и функциональное питание. М, 2001. - 288 с.

104. Шимчук Л.Ф. Стандартизация колибактерина.// Автореф. кан. биол. наук -М. -1983. -22 с.

105. Щербаков И.Т., Гаврилов А.Ф., Грачева Н.М. и др. Влияние лакто-содержащих бактерийных биологических препаратов на процессы репарации в слизистой оболочке толстой кишки//Сб.науч.тр. МНИИЭМ: Иммунобиологические препараты.-М., 1989.-С 157-161.

106. Щербакова Э.Г., Грачева Н.М. Щербаков И.Т. и др. Морфофунк-циональное состояние слизистой оболочки кишечника при применении бифилиза у больных острыми кишечными инфекциями//Сб. статей: Пробл. лимфологии и количественной патологии. М., 1997. - С.114.

107. Янковский Д.С. Состав и функции микробиоценозов различных биотопов человека// Журн. Здоровье женщины 4(16)/2003. -с.145-158.

108. Agarwal R.K. Probiotics: the health friendly gut bacteria. Indian Pediatr. 2008 Dec; 45(12):953-4.

109. Amor K. Ben, Vaughan E.E., and de Vos W.M. Advanced molecular tools for the identification of lactic acid bacteria J. Nutr., March 1, 2007; 137(3): 741 747.

110. Bailey M. The mucosal immune system: Recent developments and future directions in the pig. Dev Comp Immunol. 2009; 33(3):375-83.

111. Begley M., Hill C., Gahan C.G. M. Bile salt hydrolase activity in probiotics. Appl. Environ. Microbiol. 2006, 72: 1729-1738.

112. Bengmark S. Ecological control of the gastrointestinal tract: the role of probiotic flora. Gut 1998; 42:2-7.

113. Bengmark S. Immunonutrition: role of biosurfactants, fiber and probiotic bacteria. Nitrition. 1998; 14 (7-8): 585-594.

114. Benno Y., Endo K., Takeo M., et al. Comparison of fecal microflora of elderly persons in rural and urban areas of Japan. Apl. Environ. Microbiol. 1989; 5:1100-1105.

115. Bergey's manual® of Systematic Bacteriology. Williams & wilkins.1984., v.l, 964 c.

116. Bjoorksten B. Evidence of probiotics in prevention of allergy and asthma. Curr Drug Targets Inflamm Allergy. 2005; 4:599-604.

117. Bomba A., Nemcova R., Herich R. et al. Interaction of Lactobacillus spp. and enteropathogenic Escherichia coli under in vitro and in vivo conditions. Vet. med. 1996; 41(5):155-158.

118. Brown A.C., Valiere A. Probiotics and medical nutrition therapy. Nutr Clin Care. 2004; 7(2):56-68. Review.

119. Callaway T.R., Edrington T.S., Anderson R.C., Harvey R.B., Genovese K.J., Kennedy C.N., Venn D.W., Nisbet D.J. Probiotics, prebiotics and competitive exclusion for prophylaxis against bacterial disease. Anim Health Res Rev. 2008 Dec;9(2):217-25.

120. Camilleri M. Probiotics and irritable bowel syndrome: rationale, mechanisms and efficacy. J Clin Gastroenterol. 2008; 42 (suppl 3): 123-5.

121. Carr F.J., Chill D., Maida N. The lactic acid bacteria: a literature survey. Crit Rev Microbiol. 2002; 28(4):281-370.

122. Corcoran B.M., Ross R.P., Fitzgerald G.F., Stanton C. Comparative survival of probiotic lactobacilli spray-dried in the presence of prebiotic substances. J Appl Microbiol. 2004; 96(5): 1024-39.

123. Cross M.L. Microbes versus microbes: immune signals generated by probiotic lactobacilli and their role in protection against microbial pathogens. FEMS Immunol Med Microbiol. 2002; 34:245-53.

124. Cross M.L., Ganner A, Teilab D, Fray L.M. Patterns of cytokine induction by gram-positive and gram-negative probiotic bacteria. FEMS Immunol Med Microbiol. 2004;42:173-80.

125. Drago L, Gismondo M.R., Lombardi A. et al. Inhibition of in vitro growth of enteropathogen by new lactobacillus isolates of human intestinal origin. FEMS microbial Lett, 15:153(2):455-463, 15 Aug 1997.

126. Drasar В., Hill M. Human intestinal flora. London: Acad, press, 1974. 261 p.

127. Elliott S.J., Krejany E.O., Mellies J.L. et al. Esp G, a novel type III system-secreted protein from enteropathogenic Escherichia coli with similarities to VirA of Shigellaflexneri. Infect Immun. 2001; 69(6):4027-4033.

128. Galdeano C.M., Perdigon G. Role of viability of probiotic strains in their persistence in the gut and in mucosal immune stimulation. J Appl Microbiol. 2004; 97(4):673-81.

129. Gibson D.L., Vallance B.A. Intestinal microbiota are transiently altered during Salmonella-induced gastroenteritis. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; 2(4):525-9.

130. Gibson G.R., Roberfroid M.B. Dietary modulation of the human colonic micro-biota: introducing the concept of prebiotics. J. Nutr. 1995; 125(6):1401-1412.

131. Goerg K.J., Schlorer E. Probiotic therapy of pseudomembranous colitis. Combination of intestinal lavage and oral administration of Escherichia coli. Dutsch. Med. Wochenschrift. 1998; 123(43):1274-1278.

132. Gratz S, Mykkanen H, Ouwehand A.C., Juvonen R, Salminen S, El-Nezami H. Intestinal mucus alters the ability of probiotic bacteria to bind aflatoxin Bi in vitro. Appl Environ Microbiol. 2004 Oct;70(10):6306-8.

133. Guarino A, Lovecchio A, Canani R.B. Probiotics as prevention and treatment for diarrhea. Curr Opin Gastroenterol. 2009 Jan;25(l):18-23.

134. Haskard C. A., El-Nezami H.S., Kankaanpaa P.E., Salminen S., Ahokas J.T. Surface binding of aflatoxin Bi by lactic acid bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 2001; 67:3086-3091.

135. Hoffman F.A. Development of probiotics as biologic drugs. Clin Infect Dis. 2008 Feb 1; 46 (suppl 2): 125-7.

136. Howarth G.S. Inflammatory bowel disease, a disregulated host-microbiota interaction: are probiotics a new therapeutic option? J Gastroenterol Hepatol. 2008; 23(12):1777-9.

137. Hsieh M.H., Versalovic J. The human microbiome and probiotics: implications for pediatrics. Curr Probl Pediatr Adolesc Health Care. 2008 Nov-Dec; 38(10):309-27.

138. Hsu C.A., Yu R.C., Chou C.C. Production of beta-galactosidase by Bifidobacteria as influenced by various culture conditions. Int J Food Microbiol. 2005 Oct 15; 104(2): 197-206.

139. Huebner E.S., Surawicz C.M. Probiotics in the prevention and treatment of gastrointestinal infections. Gastroenterol Clin North Am. 2006 Jun; 35(2):355-65.

140. Isolauri E, Arvola T, Siitas Y, Salminen S. Probiotics in the management of atopic eczema. Clin Exp Allergy. 2000; 30: 1605-10.

141. Kailasapathy K., Chin J. Survival and therapeutic potential of probiotic organisms with reference to Lactobacillus acidophilus and Bifidobacterium spp. Immunol Cell Biol. 2000 Feb;78(l):80-8.

142. Kasper H. Protection against gastrointestinal diseases present facts and future developments. J. Food Microbiol. 1998; 41(2):127-131.

143. Kim G.B., Yi S.H., Lee B.H. Purification and characterization of three different types of bile salt hydrolase from Bifidobacterium strains. J. Dairy Sci. 2004; 87:258-266.

144. Kim G.B., Brochet M., Lee B.H. Cloning and characterization of a bile salt hydrolase (bsh) from Bifidobacterium adolescentis. Biotechnol. Lett. 2005; 27:817-822.

145. Klayraung S., Viernstein H., Okonogi S. Development of tablets containing probiotics: Effects of formulation and processing parameters on bacterial viability. Int J Pharm. 2009; 370(l-2):54-60.

146. Kligler В., Cohrssen A. Probiotic. Am Fam Physician. 2008; 78(9): 1073-8.

147. Kocourkova I., Ladnikova R., Zizka J., Rosova V. Effect of oral application of a probiotic E. coli strain on the intestinal microflora of children of allergic mothers during the first year of life. Folia Microbiol (Praha). 2007; 52(2): 189-93.

148. Lee S.K., Kim V.B., Ji G.S. Note: purification of amylase secreted from Bifidobacterium adolescentis. J.Appl.Microbiol. 1997; 83(3):267-272.

149. Liong M.T. and Shah N.P. Acid and bile tolerance and cholesterol removal ability of lactobacilli strains. J. Dairy Sci. 2005; 88:55-66.

150. Liopis M., Antolin M., Guarner F., Salas A., Malagelada J.R. Mucosal colonization with Lactobacillus casei mitigates barrier injury induced by exposure to trinitroben-zene sulphonic acid. Gut. 2005; 54:955-9.

151. Lizko N.N., Vikha G.V., Korolkov V.I. et al. The effect of adaptohit on the state of intestine microbiocenosis on the primate experimental models. Bioscience and Microflora. 1997; 16 (suppl 2): 24-26.

152. Lyons T.P., Fallen R.J. The probiotic concept: coming of age. World Biotech. Report. 1986; 2(7): 69-80.

153. Marin M. L., Lee J.H., Murtha J. et al. Differential cytokine production in clonal macrophage and T-cell lines cultured with bifidobacteria. J. Daryg Sci. 1997; 80(11):2713-2720.

154. Marteau P., Pochart P., Dore J., Bera-Maillet C., Bernalier A., Corthier G. Comparative study of bacterial groups within the human cecal and fecal microbiota. Appl Environ Microbiol. 2001;67:4939-42.

155. Marteau P., Boutron-Ruault M.C. Nutritional advantages of probiotics and pre-biotics. British Journal of Nutrition. 2002; 87 (suppl. 2): 153-157.

156. Masco L., Van Hoorde K., De Brandt E., Swings J., Huys G. Antimicrobial susceptibility of Bifidobacterium strains from humans, animals and probiotic products. J An-timicrob Chemother. 2006 Jul; 58(l):85-94.

157. Mayer L. Mucosal immunity and gastrointestinal antigen presentation. Pediatr Gastroenterol Immunol 2000; 30(Suppl): 4-12.

158. Milinkovic M., Vlajinic S. Relationship between oxygen consumption and colony count test.//Symposia series Immunobiological standardization, 1971; 17:227-232.

159. Modler G.W., McKellar R.C., Yaguchi M. Bifidobacteria and bifidogenic factors. J Inst Can Sci Technol Ailment 1990; 23:29-41.

160. Nomoto K., Yokokura Т., Mitsuyama M. et al. Prevention of indigenous infection of mice with Escherichia coli by nonspecific immunostimulation. Antimicrob. Agents and Chemother. 1992; 36(2):361-367.

161. Orhage K., Nord C.E. Bifidobacteria and lactobacilli in human health. Drugs Exp. And Clin. Res. 2000; 26(3):95-lll.

162. Ouwehand A.C., Kurvinen Т., Rissanen P. Use of a probiotic Bifidobacterium in a dry food matrix, an in vivo study. Int J Food Microbiol. 2004; 95(l):103-6.

163. Pereira D.I., Gibson G.R. Effects of consumption of probiotics and prebiotics on serum lipid levels in humans. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2002; 37:259-281.

164. Posrigon G., Maldonado Galdeano C., de Moreno de LeBlanc A., Vinderola G., Bibas Bonet M.E. Proposed model: mechanisms of immunomodulation induced by probiotic bacteria. Clin. Vaccine Immunol. 2007; 14(5):485-492.

165. Reid G., Devillard E. Probiotics for mother and child. J Clin Gastroenterol. 2004; 38(suppl 6):94-101.

166. Rosenfeldt V., Michaelsen K.F., Jakobsen M. et al. Effect of probiotic Lactobacillus strains in young children hospitalized with acute diarrhea. Pediat. Infect. Disease J. 2002; 21(5):411-416.

167. Saarela M., Matto J., Mattila-Sandholm T. Safety aspects of Lactobacillus and Bifidobacterium species originating from human oro-gastrointestinal tract or from probiotic products. Microbial Ecology in Health and Disease. 2002; 14:233-240.

168. Saavedra J. M. Use of probiotics in pediatrics: rationale, mechanisms of action, and practical aspects. Nutr Clin Pract. 2007; 22(3):351-365.

169. Samartsev A.A., Astanovich N.L, Novik G.I. Features of growth and formation of extracellular proteinases of Bifidobacterium adolescentis 94-BJM. Microbiologic. 1997; 66(5):635-639.

170. Schultz M., Lindstrom A.L. Rationale for probiotic treatment strategies in inflammatory bowel disease. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 2008; 2(3):337-55.

171. Shi H.N., Walker A. Bacterial colonization and the development of intestinal defences. Can J Gastroenterol. 2004;,18(8):493-500.

172. Snelling A.M. Effects of probiotics on the gastrointestinal tract. Curr Opin Infect Dis 2005; 18:420-6.

173. Sutton A. Environmental assessment requirements for live biological drugs. Clin1.fect Dis. 2008; 46 Suppl 2:112-4.

174. Sutton A. Product development of probiotics as biological drugs. Clin Infect Dis. 2008; 46 (suppl 2): 128-32.

175. Tannock G.W., Dashkevicz M.P., Feighner S.D. Lactobacilli and bile salt hydrolase in the murine intestinal tract. Appl. Environ. Microbiol. 1989; 55:1989-1992.

176. Tannock G.W. Molecular assessment of intestinal microflora. Am. J. Clin. Nutr. 2001, 73(suppl):410-414.

177. Trois L., Cardoso E.M., Miura E. Use of probiotics in HIV-infected children: a randomized double-blind controlled study. J Trop Pediatr. 2008; 54(1): 19-24.

178. Troost F.J., van Baarlen P., Lindsey P., Kodde A., de Vos W.M., Kleerebezem M., Brummer R.J. Identification of the transcriptional response of human intestinal mucosa to Lactobacillusplantarum WCFS1 in vivo. BMC Genomics. 2008; 9:374.

179. Tsai Y.T., Cheng P.C., Fan C.K., Pan T.M. Time-dependent persistence of enhanced immune response by a potential probiotic strain Lactobacillus paracasei subsp. paracasei NTU 101. Int J Food Microbiol. 2008; 128(2):219-25.

180. Van der Kleij H., O'Mahony C., Shanahan F. et al. Protective effects of Lactobacillus reuteri and Bifidobacterium infantis in murine models for colitis do not involve the vagus nerve.Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 2008; 295(4): 1131-7.

181. Van der Waaij D. Antibiotic choice: The importance of colonization resistance. N.Y.: Acadlmic Press, 1983. 298 p.

182. Van-Laere K.M., Beldman G., Voragen A.G. A new arabinofuranohydrolase from Bifidobacterium adolescentis able to remove arabinosyl residues from doublesubstituted xylose units in arabinoxylan. Appl.Microbiol. Biotechnol. 1997;47(3):251-255.

183. Vinderola C.G., Mocchiutti P., Reinheimer J.A. Interactions among lactic acid starter and probiotic bacteria used for fermented dairy products. J Dairy Sci. 2002; 85(4):721-9.

184. Vinderola G., Matar C., Palacios J., Perdigon G. Mucosal immunomodulation by the non-bacterial fraction of milk fermented by Lactobacillus helveticus R389. International Journal of Food Microbiology. 2007; 115:180-186.

185. Wagner R.D. Effects of microbiota on GI health: gnotobiotic research. Adv Exp Med Biol. 2008; 635:41-56.

186. Watson D., Sleator R.D., Hill C., Gahan C.G. Enhancing bile tolerance improves survival and persistence of Bifidobacterium and Lactococcus in the murine gastrointestinal tract. BMC Microbiol. 2008; 8:176.

187. WHO/TB/Technical Guide 1977. № 9.

188. Ya Т., Zhang Q., Chu F. et al. Immunological evaluation of Lactobacillus casei Zhang: a newly isolated strain from koumiss in Inner Mongolia, China. BMC Immunol. 2008; 9:68.

189. Yan F., Polk D.B. Probiotic bacterium prevents cytokine-induced apoptosis in intestinal epithelial cells. J. Biol. Chem. 2002; 277:50959-50965.

190. Yaskari J., Kontula P., Siitoneri A. et. al. Oat betaglucan and xylan hydrolysates as selective substrates for Bifidobacterium and Lactobacillus strains. Appl. Microbiol. Biotechhnol. 1998: 49(2): 175-181.