Сперматогенез: внутригонадные механизмы регуляции, их нарушения в модели локального β-облучения семенников, реабилитация экзогенными факторами роста тромбоцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, доктор наук Демяшкин Григорий Александрович

• Демяшкин Григорий Александрович
• доктор наук
• 2023

Оглавление диссертации доктор наук Демяшкин Григорий Александрович

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Воздействие облучения на органы/ткани

1.2. Воздействие электронов на ткани

1.3. Воздействие облучения на сперматогенез

1.4. Факторы роста. Синтез, эффекты, влияние на сперматогенез

1.5. Плазма, обогащенная тромбоцитами (PRP). Влияние на ткани и сперматогенез

1.6. PRP и облучение

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Общее положение, методологическое пособие

2.2. Дизайн эксперимента

2.3. Методы исследования

2.3.1. Приготовление плазмы, содержащей высокую концентрацию тромбоцитов

и низкую концентрацию лейкоцитов - LP-PRP

2.3.2. Протокол введения инсулиноподобного фактора роста-1

(Insulin-like growth factor-1)

2.3.3. Описательное исследование

2.3.4. Гистологическое исследование

2.3.5. Иммуногистохимическое исследование

2.3.6. Морфометрическое исследование

2.3.7. Вестерн-блоттинг (Western blot)

2.3.8. Конфокальная микроскопия

2.3.9. TUNEL-метод

2.3.10. Иммунофлуоресцентный анализ y-H2AX

2.3.11. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени (ПЦР-РВ)

2.3.12. Анализ морфофункциональных свойств тромбоцитов

иммунофлуоресцентным методом

2.3.13. Проточная цитометрия

2.3.14. Статистические методы

Глава 3. Результаты исследования

3.1. Морфофункциональная характеристика семенников после локального облучения электронами в дозе 2 Гр и на фоне реабилитации сперматогенеза

введением экзогенных факторов роста а-гранул тромбоцитов

3.1.1. Морфофункциональная характеристика семенников через неделю после локального облучения электронами в дозе 2 Гр

3.1.1.1. Макро-, микроскопическая и морфометрическая характеристика

3.1.1.2. Протеомика размножения и гибели сперматогенных клеток и их микроокружения

3.1.1.3. Иммуногистохимическая характеристика универсальных факторов

роста в сперматогенных клетках и их микроокружении

Резюме

3.1.2. Морфофункциональная характеристика семенников через месяц после локального облучения электронами в дозе 2 Гр и введения LP-PRP

3.1.2.1. Макро-, микроскопическая и морфометрическая характеристика

3.1.2.2. Протеомика размножения и гибели сперматогенных клеток и их микроокружения

3.1.2.3. Иммуногистохимическая характеристика универсальных факторов

роста в сперматогенных клетках и их микроокружении

Резюме II

3.1.3. Морфофункциональная характеристика семенников через два месяца после локального облучения электронами в дозе 2 Гр и введения LP-PRP

3.1.3.1. Макро-, микроскопическая и морфометрическая характеристика

3.1.3.2. Протеомика размножения и гибели сперматогенных клеток и их микроокружения

3.1.3.3. Иммуногистохимическая характеристика универсальных факторов

роста в сперматогенных клетках и их микроокружении

Резюме III

3.1.4. Морфофункциональная характеристика семенника через три месяца

после локального облучения электронами в дозе 2 Гр и введения LP-PRP

3.1.4.1. Макро-, микроскопическая и морфометрическая характеристика

3.1.4.2. Протеомика размножения и гибели сперматогенных клеток и их микроокружения

3.1.4.3. Иммуногистохимическая характеристика универсальных факторов роста в сперматогенных клетках и их микроокружении

3.1.5. Молекулярно-биологический анализ (вестерн-блоттинг) гомогената

семенников

Резюме IV

3.2. Морфофункциональная характеристика семенников после локального облучения электронами в дозе 8 Гр и на фоне реабилитации сперматогенеза введением экзогенных факторов роста а-гранул тромбоцитов

3.2.1. Макро-, микроскопическая и морфометрическая характеристика

3.2.2. Протеомика размножения и гибели сперматогенных клеток и их микроокружения

3.2.3. Иммуногистохимическая характеристика универсальных факторов

роста в сперматогенных клетках и их микроокружении

3.2.4. Молекулярно-биологический анализ (вестерн-блоттинг) гомогената

семенников

Резюме V

Обобщение ключевых данных гистологического и иммуногистохимического исследований

3.3. Морфофункциональная характеристика сустентоцитов после локального облучения электронами в дозах 2 Гр и 8 Гр и на фоне введения LP-PRP

3.4. Характеристика молекулярно-генетического материала семенников после локального облучения электронами в дозах 2 Гр и 8 Гр и на фоне введения LP-PRP

3.4.1. Результаты Полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ) после локального облучения электронами в дозах 2 Гр/ 8 Гр и

введения LP-PRP

3.4.2. у-Н2АХ после локального облучения электронами в дозах 2 Гр /8 Гр и введения LP-PRP

3.5. Морфофункциональная характеристика семенников необлученные животные, получавших LP-PRP

3.6. Морфофункциональная характеристика яичек на фоне реабилитации сперматогенеза введением экзогенных факторов роста а-гранул тромбоцитов

Резюме VI

Глава 4. Обсуждение

4.1. Влияние нестерилизующей и стерилизующей доз электронов на сперматогенез

4.2. Влияние факторов роста на физиологический и патологический

сперматогенез

Патогенез азооспермии

Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

«... всестороннее познание организма всегда будет представлять собой одну из трудных и благородных задач науки»

проф. П.Д. Горизонтов

Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сперматогенез: внутригонадные механизмы регуляции, их нарушения в модели локального β-облучения семенников, реабилитация экзогенными факторами роста тромбоцитов»

Актуальность темы исследования

Полиэтиологичность и сложность механизмов патологического сперматогенеза, тесная функциональная зависимость гонад от деятельности других систем организма создают немалые трудности в диагностике, разработке адекватных методов лечения и профилактики. С каждым годом наблюдается рост частоты мужского бесплодия при сопутствующей низкой эффективности распознавания причин различных его форм (Демяшкин Г.А., 2018; Епифанова М.В. с соавт., 2017; Stephen E.H. et al., 2012).

В основе патологии сперматогенеза, помимо нарушений в системе центральной регуляции, не поддающихся детекции существующими на сегодня методами, и разного рода сложных лигандно-рецепторных нарушений, могут находиться измененные механизмы внутригонадной пара- и аутокринной регуляции (в том числе, - генетически детерминированные). С внедрением новых диагностических и лечебных методов в радиобиологии и лучевой терапии встает вопрос об их безопасности для человека, в том числе, - для его репродуктивной функции. В этой связи подбор оптимальных доз облучения, своевременная корректировка и нивелирование токсичности лучевой терапии являются ключевыми для оптимизации диагностики и лечения в онкологии. Данные литературы по воздействию ионизирующего излучения на яичко неоднозначны. С одной стороны, лучевая терапия доказанно влечет за собой риск возникновения бесплодия (Meistrich M.C. et al., 2013), однако, с другой стороны, - после лучевой терапии в половых железах могут сохраняться сперматогонии типа А, обеспечивающие в ряде случаев восстановление сперматогенеза (Sineath R.C. et al., 2019).

Несмотря на активное внедрение в медицинскую практику нового способа лучевой диагностики и терапии - локального облучения органов электронами, -его последствия для качества сперматогенеза и внутригонадных механизмов регуляции этого процесса не известны. Полагаем, что подробный анализ

морфогенетических и регуляторных взаимоотношений сперматогенеза в условиях локального облучения гонад разными дозами электронов представит не только новую фундаментальную информацию о реактивных изменениях семенников в условиях облучения электронами, но и послужит основой для расчета безопасных, пороговых и повреждающих значений рассматриваемого вида облучения по отношению к репродуктивной функции.

Перспективным в поиске новых способов коррекции нарушений сперматогенеза, и, что особенно актуально, - бесплодия как следствия лучевого воздействия, - представляется исследование роли ростовых факторов, которые в физиологических условиях выполняют важнейшую роль в пара- и аутокринной регуляции стадийности и эффективности сперматогенеза. Не исключено, что облучение провоцирует изменения или разбалансировку синтеза внутригонадных ростовых факторов, что может служить первопричиной гипосперматогенеза и бесплодия.

В последнее время одним из успешно разрабатываемых направлений в тканевой инженерии и клеточной терапии (сперматогенеза, - в том числе) является применение плазмы, обогащенной тромбоцитами. Потенциальный терапевтический эффект PRP обусловлен наличием в ней факторов роста, способствующих повышению качественных и количественных функциональных характеристик клеток и тканей (Dehghani F. et а1., 2019; Bos-Mikich А. et а1., 2018; A1-Nasser Я. et а1., 2018). Присутствующие в грануломерах тромбоцитов множественные факторы роста (PDGF, IGF-1, TGF-P, VEGF, EGF, HGF, FGF), а также естественные полипептиды, обладающие широким спектром воздействия на клетки и ткани (хемотаксис, клеточную пролиферацию, миграцию, дифференцировку, реструктуризацию и ангиогенез), активизируют восстановление поврежденных тканей (Кубатиев А.А. с соавт., 2017). Более того, постоянно образующиеся в плазме колоссальные количества тромбоцитарных микрочастиц способны активировать внутриклеточные сигнальные пути, задействованные в регуляции широкого спектра биосинтезов, процессов пролиферации и самосохранения клеток, трансдукции молекулярных сигналов и

др. Учитывая сказанное, перспектива реабилитации возможных повреждений сперматогенеза и разбалансировки внутригонадных факторов пара- и аутокринной регуляции в результате локального облучения семенников электронами может быть основана на модулирующем эффекте плазмы, обогащенной тромбоцитами. Усиление этого эффекта, с определенной степенью вероятности, можно ожидать при дополнительном введении облученным животным инсулиноподобного фактора роста - универсального регулятора биологических процессов в организме млекопитающих (Cannarella R. et al., 2018; Griffeth R.J. et al., 2014; Laron Z., 2001).

Степень ее разработанности В результате анализа специальной литературы нами обнаружены единичные исследования, описывающие токсические эффекты разных типов облучения (X-, у-лучи) в тканях некоторых органов (почки, кожа), а также - в семенниках, где ионизирующее излучение генерирует большое количество разрывов и сшивок ДНК, а также активных форм кислорода и азота, запуская оксидативный стресс, нарушение клеточного деления и гибель радиочувствительных сперматогенных клеток. Однако полученные данные противоречивы. В то же время, отсутствуют исследования, посвященные влиянию облучения электронами на сперматогенные клетки, хотя данный способ является новым и перспективным в клинической работе (преимущественно для интраоперационной радиотерапии) ввиду его относительной безопасности по сравнению с другими видами ионизирующего излучения.

В опытах на многих органах (кожа, мышцы, яичники) была доказана регенеративная эффективность LP-PRP, однако исследования, описывающие эффекты факторов роста LP-PRP в семенниках, единичны и их результаты достаточно противоречивы. Таким образом, влияние LP-PRP остается малоизученным и требует получения новых фактов, позволяющих раскрыть механизмы, запускаемые факторами роста в клетках сперматогенного эпителия, а также их влияние на эндокринный аппарат семенников.

Несмотря на достаточно успешное применение различных видов ионизирующего излучения для лучевой терапии опухолей яичка, использование электронов для этих целей представляет большой практический интерес в плане повышения эффективности радиотерапии.

С означенных позиций представляется актуальной экспериментальная разработка выбранных нами тематических аспектов проблемы облучения электронами для решения конкретных клинических задач. Отечественных работ по анализу сперматогенеза при облучении электронами и его реабилитации плазмой, обогащенной факторами роста тромбоцитов, не проводится, а данных зарубежных исследований явно недостаточно.

Цель

Выявление зависимости структурно-функциональных изменений семенника (как предикторов азооспермии) от дозы локального облучения семенников электронами; обоснование эффективности применения плазмы, обогащенной тромбоцитами, для восстановления сперматогенной и эндокринной активности гонад.

Задачи

1. Создать модель локального облучения семенников электронами на линейном акселераторе, имитирующую способ локального облучения, применяемого в лечебно-диагностической практике. Провести морфологический анализ семенников, подвергнутых облучению различными дозами в динамике, определив дозу облучения, приводящую к азооспермии.

2. Оценить уровни экспрессии внутригонадных факторов пара- и аутокринной регуляции в сперматогенных клетках, интерстициальных эндокриноцитах и сустентоцитах после облучения электронами в зависимости от дозы, а также на фоне введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и LP-PRP в комбинации с инсулиноподобным фактором роста-1:

0 универсального фактора пролиферации - Кь67, факторов инициации и терминации апоптоза (caspase 9, caspase 8, caspase 3), ключевых факторов антиапоптоза (Вс1-2) и проапоптоза (р53);

0 ключевых ростовых факторов - инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1), трансформирующего фактора роста-в (TGF-b), васкулярно-эндотелиального фактора роста (VEGF-A);

0 виментина - важнейшего элемента плотных контактов в составе гемато-тестикулярного барьера.

3. Оценить особенности амплификации генов Kras, Myc, Met, Yapl у животных для прогнозирования возможных мутаций: после облучения электронами, введения плазмы, обогащенной тромбоцитами, и LP-PRP в комбинации с инсулиноподобным фактором роста-1.

4. Провести морфологический анализ и иммуногистохимическую оценку ключевых слагаемых пролиферативной (Ki-67), апоптотической (caspase 3), анти-и проапоптотической (Bcl-2 и р53) активности, универсальных факторов роста (IGF-1, TGF-b, VEGF-A) в сперматогенных клетках, интерстициальных эндокриноцитах и сустентоцитах у пациентов с азооспермией, а также после введения плазмы, обогащенной тромбоцитами.

Научная новизна

Впервые создана и использована для изучения нарушений сперматогенеза модель локального облучения семенников животных электронами на линейном акселераторе «NOVAC-11», которая имитирует способ локального облучения, применяемый в лечебно-диагностической практике.

Впервые, в результате экспериментального исследования изучены закономерности биологического распределения и особенности поглощенных доз в 2 Гр и 8 Гр в семенниках лабораторных животных после облучения электронами. Проведен комплексный морфологический анализ семенников и анализ рисков мутаций регуляторных генов сперматогенеза, позволившие определить физиологически безопасную дозу воздействия электронами (с возможностью естественной реабилитации сперматогенной и эндокринной функций) и стерилизующую дозу облучения.

Впервые использован иммуногистохимический метод как приоритетный для разработки эффективного алгоритма диагностики временной азооспермии, вызванной облучением электронами в дозах 2 Гр и 8 Гр.

Впервые дана оценка роли ключевых внутригонадных ростовых факторов в физиологии сперматогенеза, определены характер и степень поражения исследованных факторов при локальном в-облучении семенников и конкретизированы клетки-мишени сперматогенного эпителия и эндокринного компартмента семенников, чувствительные к этим факторам, а также эффекта «наблюдателя».

Впервые приведены доказательства эффективной роли плазмы, обогащенной тромбоцитами и LP-PRP в комбинации с IGF-1 в реабилитации структурных, пара- и аутокринных нарушений генеративной и эндокринной функций семенников, вызванных облучением с использованием дозы 2 Гр и 8 Гр, доказательства важнейшего значения биологически активных веществ, содержащихся в плазме, обогащенной тромбоцитами, и роли IGF-1 в восстановлении физиологического тканевого гомеостазиса семенников после облучения. Обоснована целесообразность комбинирования аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, с IGF-1 с целью профилактики возникновения азооспермии и лучевых повреждений при проведении локального облучением электронами.

Впервые, в сравнительном плане, были исследованы эффекты LP-PRP в семенниках интактных животных.

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическая значимость работы заключается в том, что полученные результаты исследования закономерностей биологического распределения дозы в 2 Гр в семенниках лабораторных животных после облучения электронами по морфофункциональным характеристикам являются оптимальными при выборе вида и способа облучения при лучевой терапии.

В результате проведенного исследования выявлены: диапазон и глубина структурных изменений сперматогенного эпителия и эндокринных элементов

семенников в зависимости от дозы нового вида облучения (облучения электронами), используемого в клинике; впервые определены нестерилизующая доза (2 Гр) и стерилизующая доза (8 Гр), приводящая к необратимой азооспермии.

Подробно охарактеризована модуляция внутригонадных факторов регуляции сперматогенеза после локального облучения нестерилизующей дозой (2 Гр) и дозой, вызывающей необратимую азооспермию (8 Гр), а также после применения LP-PRP и LP-PRP+IGF-1.

Доказана эффективность экзогенной плазмы, обогащенной тромбоцитами, для восстановления внутриорганной регуляции семенников и полной или частичной реабилитации сперматогенеза после облучения в экспериментальной модели, а также потенцирующий реабилитацию эффект у пациентов с азооспермией.

Раскрыта взаимосвязь изменений ключевых факторов пара- аутокринной системы семенника с нарушениями сперматогенеза и функции эндокринных элементов в условиях локального облучения электронами. В совокупности полученные данные способствуют детализации и более глубокому пониманию механизмов и роли, исследованных пара- и аутокринных факторов в процессе формирования компенсаторно-приспособительных реакций мужской гонады.

Таким образом, результаты исследования существенно дополняют представления о морфофункциональной перестройке в сперматогенном эпителии под влиянием нестерилизующих доз ионизирующего излучения.

Практическая значимость работы состоит в том, что результаты исследования структурно-функциональных изменений семенников после облучения в дозах 2 Гр и 8 Гр, а также введения LP-PRP могут послужить основой выбора способа облучения новообразований яичка и/или состава лекарственных форм для лечения и профилактики азооспермии. Это позволит расширить спектр уже существующих репараторов и протекторов с целью повысить эффективность диагностики и терапии опухолевых заболеваний яичек и/или обеспечить профилактику постлучевых и иных нарушений сперматогенеза.

В результате проведенного исследования решена актуальная научная проблема - раскрыты нарушения внутригонадной регуляции сперматогенеза и эндокринной функции семенника в условиях локального облучения электронами, с применением доз, вызывающих временную и необратимую азооспермию (гипосперматогенез); доказана эффективность экзогенного введения LP-PRP и LP-PRP+IGF-1 экспериментальным животным с временной азооспермией и у пациентов с азооспермией.

Методология и методы исследования

Методология исследования базировалась на традиционных теоретических и практических методологических принципах.

Для достижения необходимого качества результатов был проведен анализ специализированной доступной литературы по научной теме, на основании которого был составлен дизайн исследования и разработан комплексный подход с использованием рутинных и современных методов.

Работа была выполнена на семенниках крыс породы Вистар (п=235) в модели гипосперматогенеза, индуцированного облучением электронами в дозах 2 Гр и 8 Гр, а также на архивных парафиновых блоках биоптатов яичек с азооспермией (Д-з: необструктивная азооспермия, код МКБ 10 - N46).

Семенники фиксировали в забуференном формалине или в растворе Буэна, дальнейшее гистологическое исследование проводили по стандартной методике (срезы толщиной 2 - 3 мкм).

Использованный комплексный подход позволил оценить гистологические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические особенности пролиферативных, апоптотических и репаративных процессов в семенниках в норме, при гипосперматогенезе и азооспермии, его закономерностях с точки зрения взаимодействия факторов роста и сперматогенных клеток на клеточном и тканевом уровнях, и включал следующие методы исследования:

1. Гистологический метод - окраска гематоксилином и эозином для общего анализа;

2. Иммуногистохимический метод с использованием антител к: Ki-67, Bcl-2, p53, Caspase 3, Caspase 8, Caspase 9, IGF-1, TGF-b, VEGF-A, Vimentin для анализа репаративной активности сперматогенных клеток, а также их пролиферации, детерминации с выходом в дифференцировку и гибели;

3. ПЦР-РВ и амплификация генов Kras, Myc, Met, Yapl;

4. Иммуноблоттинг (Western blot),

5. Фрагментация ДНК гамет (TUNEL),

6. Анализ Y-H2AX,

7. Биохимический (гормоны) и

8. Статистический.

Положения, выносимые на защиту

1. Физиологический процесс внутригонадной пара- и аутокринной регуляции сперматогенеза характеризуется: доминированием экспрессии в клетках сперматогенного эпителия фактора пролиферации Ki-67 при «зыбком» равенстве экспрессии ключевых про- и антиапоптотических факторов (Bcl-2 и p53), высоким уровнем экспрессии факторов роста IGF-1, TGF-в и VEGF, а также TUNEL-позитивным маркированием некоторой части сперматогенных клеток на предмет фрагментации ДНК. Указанные факты дополняют информацию о сложном механизме внутригонадной регуляции сперматогенеза и свидетельствуют о потенциально высокой степени его чувствительности к внешним повреждающим воздействиям, в том числе, - к облучению электронами.

2. Локальное облучение семенников электронами в дозе 2 Гр вызывает развитие гипосперматогенеза, сохраняющегося в течение трех исследованных циклов сперматогенеза. Основу гипосперматогенеза составляют индуцированный облучением пролиферативно-апоптотический дисбаланс в сторону доминирования апоптоза, наиболее выраженного в пуле сперматогоний, при резком возрастании количества TUNEL-позитивных сперматогенных клеток, происходящем на фоне (или вследствие) снижения активности экспрессии сперматогенными клетками факторов роста IGF-1, TGF-в и VEGF. Доза 2 Гр не является стерилизующей, в то время как воздействие в дозе 8 Гр приводит к

необратимой азооспермии. Независимо от дозы, облучение электронами индуцирует нестабильность генов Kras, Myc, Met, Yapl у части сперматогенных клеток и интерстициальных эндокриноцитов.

3. Реактивные изменения эндокринного компартмента облученных семенников в дозе 2 Гр заключаются в нарастающей гиперплазии пула интерстициальных эндокриноцитов, направленной, вероятно, на репарацию сперматогенеза, вызванную воздействием электронами. Отсутствие при этом значимых позитивных изменений сперматогенеза, а также снижение уровня тестостерона в плазме периферической крови указывают на функциональную несостоятельность гиперпластической реакции интерстициальных эндокриноцитов после облучения. Основу выявленной гиперплазии интерстициальных эндокриноцитов, как реакции на облучение, составляет резкое нарушение регуляции апоптоза, подтверждаемое доминированием в большей части клеток экспрессии антиапоптотического фактора Bcl-2 при менее значимых показателях уровней экспрессии Ki-67 и р53.

4. Снижение экспрессии виментина в сустентоцитах после облучения указывает на деструктивные изменения плотных контактов как главного элемента гемато-тестикулярного барьера и несостоятельность механизма прикрепления сперматогенных клеток к «карманам» сустентоцитов.

5. Экзогенные факторы роста, воздействуя на семенник, облученный электронами в дозе 2 Гр, индуцируют пролиферацию и созревание сперматогенных клеток, снижая риск развития нестабильности генов Kras, Myc, Met, Yapl; усиливают экспрессию IGF-1, TGF-в и VEGF в сперматогенных клетках и интерстициальных эндокриноцитах; способствуют повышению уровня тестостерона в плазме крови и экспрессии виментина в сустентоцитах. Дополнительное введение рекомбинантного инсулиноподобного фактора роста-1 усиливает позитивный эффект аутологичной плазмы на все слагаемые репаративного процесса после облучения. Аналогичный позитивный эффект оказывает LP-PRP на восстановление пула сперматогенных клеток у пациентов с азооспермией.

Личный вклад

Автор самостоятельно выбрал направление научной работы, обозначил цели и задачи исследования, моделировал облучение, выполнил все запланированные эксперименты с привлечением обозначенного комплекса методик, провел количественный анализ и статистическую обработку, интерпретировал результаты, решив научную проблему, которую реализовал в практических рекомендациях.

Автором было выполнено облучение семенников электронами в дозах 2 Гр и 8 Гр для моделирования гипосперматогенеза у лабораторных животных, освоены и применены методы гистологического, иммуногистохимического, молекулярно-биологического, генетического и компьютерного анализа; математическая обработка полученных данных; выбор и описание иллюстративного материала, написание выводов и практических рекомендаций. Вклад автора является определяющим в обсуждении результатов исследования в научных публикациях и их внедрения в практику. Автором выявлены определенные патоморфологические механизмы влияния универсальных ростовых факторов на сперматогенный эпителий и его микроокружение в условии экспериментального гипосперматогенеза, а также иммунофенотипические признаки интраорганной регуляции в норме.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов обусловлена проведением множества исследований с использованием достаточного количества лабораторных животных - крыс породы Вистар (п=235) и биоптатов человека (п=11). Проведенный анализ специализированной литературы (литературная справка) позволяет оценить и обосновать актуальность выбранной темы научной работы и степень ее изученности, а используемый материал и выбранные методы соответствуют поставленной цели и сформулированным задачам. Морфологические, иммуногистохимические, молекулярно-генетические исследования проводили на современном сертифицированном научном оборудовании. Морфометрические показатели измеряли на базах ФГАОУ ВО

Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет) и ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России, они были обработаны адекватными методами математической статистики с использованием современных компьютерных программ.

Полученные основные результаты научной работы были доложены и обсуждены на научной конференции - «60 лет НИИ Морфологии человека им. акад. А.П. Авцына» (г. Москва, 2022 г.); ежегодная научно-практическая конференция «Радиация и организм» (г. Обнинск, 2022 г., 2021 г.), конгрессах российского общества урологов (г. Москва, 2021 г., г. Сочи 2020 г.); конференции «Education. Practice: proceedings of the International university science forum» (г. Торонто, Канада, 2021 г.); Société Internationale d'Urologie (г. Париж, Франция, 2022 г.); 11th Emirates Urological Conference (г. Дубаи, ОАИ, 2022 г.); UAA 2022 Congress (г. Сидней, Австралия, 2022 г.); научных заседаниях Института трансляционной медицины и биотехнологий.

Апробация диссертации состоялась 29 апреля 2022 г. (протокол №3) на научной конференции Института трансляционной медицины и биотехнологий ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский университет).

Публикации по теме диссертации

По результатам исследования автором опубликовано 17 работ, в том числе 13 научных статей в журналах, включенных в Перечень рецензируемых научных изданий Сеченовского Университета/ Перечень ВАК при Минобрнауки России, в которых должны быть опубликованы основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора наук; 2 статьи в изданиях, индексируемых в международных базах Web of Science и Scopus, 2 публикации в сборниках материалов международных и всероссийских научных конференций.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, собственных результатов, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 169 источник отечественных (28) и

зарубежных (141) авторов. Материалы диссертации изложены на 266 страницах машинописного компьютерного текста и иллюстрированы 144 рисунками (микрофотографиями, рисунками-графиками), 39 таблицами.

Внедрение результатов диссертации в практику Результаты исследования используются в диагностике, лечении и профилактики нарушений сперматогенеза, лучевых повреждений яичек в подразделениях ФГБУ НМИЦ радиологии Минздрава России и ФГАОУ ВО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России (Сеченовский Университет), а также при чтении лекций и проведении практических занятий по гистологии и патологической анатомии.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует отрасли медицинских наук, паспортам научных специальностей 1.5.22. Клеточная биология и 3.3.2. Патологическая анатомия, а также областям исследования согласно пунктам 2, 4, 5, 7 и 1, 3, 4 соответственно.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Воздействие облучения на органы/ткани

История изучения воздействия ионизирующего излучения на живую материю ведет свое начало с открытия в 1895 г. Рентгеном неизвестных ранее лучей, способных проникать сквозь тело человека. Последующие исследования многих поколений ученых позволили выявить многообразие ионизирующих излучений (ИИ). Было установлено, что ИИ имеет природу либо электромагнитных волн (рентгеновское излучение, гамма-излучение, и тормозное излучение, возникающее при прохождении через вещество сильно заряженных частиц), либо корпускулярную: потоки частиц, характеризующихся различной массой и зарядом. К последним относятся a-частицы, электроны (в-частицы), протоны, нейтроны и тяжелые заряженные ионы. При проникновении в живой организм энергия ионизирующего излучения разрушает природные структуры.

Важнейшей структурой организма млекопитающих является молекула дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Ее повреждение может происходить как прямым образом («теория мишени, или принцип попадания в радиобиологии», Тимофеев-Ресовский Н.В. с соавт., 1968; Timoféeff-Ressovsky N.V. et al., 1935), т.е. вследствие образования одиночных и/или двойных разрывов в молекуле ДНК и повреждения азотистых оснований под воздействием прямого точечного попадания лучевой энергии, так и опосредованным, в результате повреждающего воздействия химически активных свободных радикалов и их перекисных соединений с растворенным кислородом, которые образуются вследствие радиолиза внутриклеточной воды (Hall E.J. et al., 2019; Sekerci C.A. et al., 2017; Meistrich M.L., 2013).

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Демяшкин Григорий Александрович, 2023 год

Список литературы

1. Демяшкин Г. А. Апоптоз в семенных канальцах человека в норме и при идиопатическом бесплодии / Г. А. Демяшкин // Цитология. - 2018. - Т. 60. - № 3. - С. 208-218.

2. Демяшкин Г. А., Боровая Т. Г., Андреева Ю. Ю., Корякин С. Н., Вадюхин М. А., Щекин В. И. Влияние факторов роста тромбоцитов на сперматогенез после облучения электронами // Архив патологии. - 2022. - Т. 84. - №2. - С. 20-28.

3. Демяшкин Г. А. Морфологическая характеристика сперматогенеза у крыс после прицельного облучения разными дозами электронов // Клиническая и экспериментальная морфология. - 2021. - Т. 10. - №2. - С. 40-49.

4. Демяшкин Г. А., Цибулевский А. Ю., Недорубов А. А., Батов М. А., Щекин В. И. Особенности активации апоптоза в клетках семенных канальцев крыс при азооспермии после воздействия бета-излучения в дозах 2 и 8 Грэй // Морфологические ведомости. - 2021. - Т. 29. - №3. - С. 70-75.

5. Демяшкин Г. А., Цибулевский А. Ю., Недорубов А. А., Ивченко Ю. В., Щекин В. И. Морфологическая характеристика потомства облученных электронами дозой 2 грея и получавших обогащенную тромбоцитами плазму крыс-самцов // Морфологические ведомости. - 2021. - Т. 29. - №4. - С. 49-55.

6. Демяшкин Г. А., Боровая Т. Г., Андреева Ю. Ю., Корякин С. Н., Вадюхин М. А., Щекин В. И., Лысанская Е. В. Влияние факторов роста тромбоцитов на пролиферацию сперматогенного эпителия после локального облучения электронами в нестерилизующей дозе // Вестник российского научного центра рентгенорадиологии. - 2021. - Т. 21. - №4. - С. 51-68.

7. Демяшкин Г. А., Боровая Т. Г., Андреева Ю. Ю., Корякин С. Н., Щекин В. И., Мамзеров А. В. Особенности S-периода митоза в семенных канальцах». после облучения электронами дозой 2 Гр и введения PRP // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2021. - Т.11.- № 4.- С. 6 - 10.

8. Демяшкин Г. А., Никитин П. В., Беркетова А. М., Марьевская Д. С., Петухова П. С. Молекулярно-генетическая характеристика хромосомных

аберраций в семенниках после облучения электронами дозой 2 Гр и введения PRP // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2021. -Т.11- № 4.- С. 27 - 32.

9. Демяшкин Г. А. Иммунофенотипические особенности пролиферации и апоптоза гамет самцов крыс после локального облучения // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2021. - Т.11.- № 3.- С. 6 - 11

10. Демяшкин Г. А., Корякин С. Н., Вадюхин М. А., Щекин В. И. Морфологическая характеристика семенников в условии коррекции гипосперматогенеза (экспериментальное исследование) // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2021. - Т.11.- № 2.- С. 6 - 10.

11. Демяшкин Г. А. Влияние факторов роста на сперматогенез после прицельного облучения семенников крыс электронами в дозе 8 Грей // Вестник Волгоградского государственного медицинского университета. - 2021. - Т.78.-№ 2.- С. 52 - 55.

12. Демяшкин Г. А., Бондурко Л. Н., Фомина Н. К., Севанькаева Л. Е., Михина Л. Н., Глушак В. В., Щекин В. В. Влияние васкулярного эндотелиального фактора роста на сперматогенез после облучения электронами дозой 2 Гр // Ульяновский медико-биологический журнал. - 2022. - Т.1.- С. 87 - 93.

13. Демяшкин Г. А., Боровая Т. Г., Корякин С. Н., Вадюхин М. А., Щекин В. И. Реабилитация экспериментально нарушенного сперматогенеза применением факторов роста плазмы, обогащенной тромбоцитами // Крымский журнал экспериментальной и клинической медицины. - 2022. - Т.12.- № 2.- С. 28 - 33.

14. Демяшкин Г. А., Епифанова М. В., Костин А. А., Гамеева Е. В., Артеменко С. А., Епифанов А. А. Иммунофенотипическая характеристика волокнистого компонента гематотестикулярного барьера у пациентов с необструктивной азооспермией после применения клеточной терапии // Андрология и генитальная хирургия. - 2022. - Т.23.- № 2.- С. 27 - 33.

15. Демяшкин Г. А. Новые подходы диагностики мужского бесплодия: анализ биоптатов яичка с нормальным и нарушенным сперматогенезом / Г. А. Демяшкин

// Вестник медицинского института "РЕАВИЗ": реабилитация, врач и здоровье. -2016. - № 2(22). - С. 170-186.

16. Демяшкин Г. А. Морфологическая характеристика сперматогенеза в норме и при идиопатическом бесплодии (иммуногистохимический аспект) / Г. А. Демяшкин // Вестник медицинского института "РЕАВИЗ": реабилитация, врач и здоровье. - 2015. - № 4(20). - С. 107-119.

17. Демяшкин, Г. А. Апоптоз в семенных канальцах человека в норме и при идиопатическом бесплодии / Г. А. Демяшкин // Цитология. - 2018. - Т. 60. - № 3. - С. 208-218. - DOI 10.31116^ко1.2018.03.07.

18. Демяшкин Г. А. Структурно-функциональная характеристика фокального варианта синдрома клеток Сертоли (иммуногистохимический аспект) / Г. А. Демяшкин // Вестник медицинского института "РЕАВИЗ": реабилитация, врач и здоровье. - 2016. - № 1(21). - С. 123-129.

19. Демяшкин Г. А. Морфологический анализ сперматогенеза-основа диагностики мужского идиопатического бесплодия (иммуногистохимический аспект): специальность 14.03.02 "Патологическая анатомия": диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / Г. А. Демяшкин. -Москва, 2017. - 142 с.

20. Деньгина Н. В., Родионов В. В. - Основы лучевой терапии злокачественных новообразований: учебно-методическое пособие для врачей и студентов / Ульяновск: УлГУ, 2013. - 87 с.

21. Дергилев А.А., Палыга Г.Ф., Чибисова О.Ф. [и др.] / Радиация и сперматогенез: экспериментальная оценка онтогенетических эффектов при остром облучении в нестерилизующих дозах // Радиация и риск (Бюллетень Национального радиационно-эпидемиологического регистра). - 2012. - Т. 21. -

№ 4. - С. 51-60.

22. Епифанова М.В. Клеточные технологии в лечении мужского бесплодия, обусловленного необструктивной азооспермией / М. В. Епифанова, М. Е. Чалый, Н. О. Переверзина, С. А. Артеменко // Урология. - 2017. - № 4. - С. 103-106.

23. Кубатиев А.А. Микрочастицы тромбоцитов: образование и свойства / А. А. Кубатиев, Т. Г. Боровая, В. Г. Жуховицкий [и др.] // Патогенез. - 2017. - Т. 15. -№ 2. - С. 4-13.

24. Маланичев М. Ю. Моделирование молекулярных и клеточных механизмов регуляции тканевого гомеостаза кожи при сепсисе в эксперименте: специальность 03.03.04 "Клеточная биология, цитология, гистология": диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук / М. Ю. Маланичев. - Симферополь, 2021. - 119 с.

25. Солодкий В.А., Павлов А.Ю., Паньшин Г.А., Гафанов Р.А., Полушкин П.В., Измайлов Т.Р. Режим гипофракционирования при лечении рака предстательной железы. РМЖ «Медицинское обозрение». 2018. - №12. - С. 52-56.

26. Столбовой А. В., Залялов И. Ф. Радиобиологические модели и клиническая радиационная онкология. Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. 2016. - Т. 5. - № 6. - С. 88-96.

27. Тимофеев-Ресовский Н.В., Иванов В.И., Корогодин В.И. Применение принципа попадания в радиобиологии. — Москва: Атомиздат, 1968. — С. 228.

28. Л. Е. Юркова, А. М. Червяков, Н. А. Чижова; патент № 2395314 C2 Российская Федерация, МПК A61N 5/06, A61B 17/00. Способ лечения распространенного рака яичников с отдаленными метастазами: № 2008113883/14: заявл. 08.04.2008: опубл. 27.07.2010.

29. Abou Nader N., Levasseur A., Zhang X., Boerboom D., Nagano M.C., Boyer A. Yes-associated protein expression in germ cells is dispensable for spermatogenesis in mice. Genesis. 57(10):e23330, 2019.

30. Adams G.R. Invited review: autocrine/paracrine IGF-I and skeletal muscle adaptation. J Appl Physiol. 93:1159-1167, 2002.

31. Ahmad S.S., Ahmad K., Lee E.J., Lee Y.-H., Choi I. Implications of Insulin-Like Growth Factor-1 in Skeletal Muscle and Various Diseases. Cells. 9(8):1773, 2020.

32. Ahmed E.A., Velaz E., Rosemann M., Gilbertz K.P., Scherthan H. DNA repair kinetics in SCID mice Sertoli cells and DNA-PKcs-deficient mouse embryonic fibroblasts. Chromosoma. 126(2):287-298, 2017.

33. Aktoz T., Caloglu M., Uurut-Caloglu V., Yalcin O., Aydogdu N., Vurlu D., Arda E., Inci O. Histopathological and biochemical comparisons of the protective effects of amifostine and L-carnitine against radiation-induced acute testicular toxicity in rats. Andrologia. 49, e12754, 2017.

34. Al-Nasser R, Khrait Z, Jamali S. The Effectiveness of Autologous Platelet-Rich Plasma (PRP) in the Therapy of Infertile Men with Non-Abstractive Azoospermia. J Reprod Med Gynecol Obstet. 3:11, 2018.

35. Albuquerque A.V., Almeida F.R., Weng C.C., Shetty G., Meistrich M.L., Chiarini-Garcia H. Spermatogonial behavior in rats during radiation-induced arrest and recovery after hormone suppression. Reproduction. 146, 363-376, 2013.

36. Alsemeh A.E., Samak M.A., El-Fatah S.S.A. Therapeutic prospects of hydroxytyrosol on experimentally induced diabetic testicular damage: potential interplay with AMPK expression. Cell Tissue Res. 380(1):173-189, 2020.

37. Aoki C.A., Borchers A.T., Li M., Flavell R.A., Bowlus C.L., Ansari A.A., Gershwin M.E. Transforming growth factor b (TGF-b) and autoimmunity. Autoimmun Rev. 4:450-459, 2005.

38. Asadian S, Mirzaei H, Kalantari BA, et al. P-radiating radionuclides in cancer treatment, novel insight into promising approach. Pharmacol Res. 160:105070, 2020.

39. Azzam EI, Jay-Gerin J-P, and Pain D. Ionizing radiation-induced metabolic oxidative stress and prolonged cell injury. Cancer Lett 327: 48-60, 2012.

40. Bamatraf MMM, O'Neill P, and Rao BSM. Redox dependence of the rate of interaction of hydroxyl radical adducts of DNA nucleobases with oxidants: consequences for DNA strand breakage. J Am Chem Soc 120: 11852-11857, 1998.

41. Bernardino R.L., Alves M.G., Oliveira P.F. Evaluation of the purity of sertoli cell primary cultures. In: Sertoli Cells. Humana Press, New York; 9-15, 2018.

42. Berridge M., Tan A., Mccoy K., Wang R. The biochemical and cellular basis of cell proliferation assays that use tetrazolium salts. Biochem. 4:14-19, 1996.

43. Blumenfeld Z. Chemotherapy and fertility. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 26(3):379-390, 2012.

44. Borrione P., Grasso L., Racca S., Abbadessa G., Carriero V., Fagnani F., Quaranta F., Pigozzi F. Systemic effects of locally injected platelet rich plasma in a rat model: an analysis on muscle and bloodstream. J Biol Regul Homeost Agents. 29:2518, 2015.

45. Borselli C., Storrie H., Benesch-Lee F., Shvartsman D., Cezar C., Lichtman J.W., Vandenburgh H.H., Mooney D.J. Functional muscle regeneration with combined delivery of angiogenesis and myogenesis factors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 107, 3287-3292, 2010.

46. Bos-Mikich A, de Oliveira R, Frantz N. Platelet-rich plasma therapy and reproductive medicine. J Assist Reprod Genet. 35(5):753-756, 2018.

47. Boudaiffa B, Cloutier P, Hunting D, Huels MA, and Leon S. Resonant formation of DNA strand breaks by low-energy (3 to 20 eV) electrons. Science 287: 1658-1660, 2000.

48. Cannarella R, Condorelli RA, La Vignera S, Calogero AE. Effects of the insulinlike growth factor system on testicular differentiation and function: a review of the literature. Andrology. 6(1):3-9, 2018.

49. Castillo L. A., Craft A. W., Kernahan J., Evans R. G. B., and Aynsley-Green A. Gonadal function after 12-Gy testicular irradiation in childhood acute lymphoblastic leukaemia. Med. Pediatr. Oncol. 18: 185-189, 1990.

50. Cheng C.Y., Mruk D.D. The blood-testis barrier and its implications for male contraception. Pharmacol. Rev. 64, 16-64, 2012.

51. Clemmons D.R. Insulin-like growth factor binding proteins and their role in controlling IGF actions. Cytokine Growth Factor Rev. 8: 45-62, 1997.

52. Clemmons D.R. Role of IGF-I in skeletal muscle mass maintenance. Trends Endocrinol Metab. 20, 349-356, 2009.

53. Cordelli E., Fresegna A.M., Leter G., Eleuteri P., Spano M., Villani P. Evaluation of DNA damage in different stages of mouse spermatogenesis after testicular X irradiation. Radiat. Res. 160, 443-451, 2003.

54. Dabbs D.J. Diagnostic immunohistochemistry. 4th ed. Philadelphia (USA): Elsevier Saunders. 2014.

55. Dehghani F, Sotoude N, Bordbar H, Panjeshahin MR, Karbalay-Doust S. The use of platelet-rich plasma (PRP) to improve structural impairment of rat testis induced by busulfan. Platelets. 2019;30(4):513-520.

56. Demyashkin G, Borovaya G, Andreeva Yu, Nedorubov A, Stepanova Yu, Vadyukhin M, Shchekin V, Koryakin S, Shegay P, Kaprin A. An experimental approach to comprehend the influence of platelet rich growth factors on spermatogenesis // International Journal of Radiation Biology. - 2022.

57. Demyashkin G, Koryakin S, Moiseev A, Saburov V, Zatsepina M, Epifanova M, Stepanova Y, Shchekin V, Vadyukhin M, Shegay P, et al. Assessment of Proliferation and Apoptosis in Testes of Rats after Experimental Localized Electron Irradiation // Current issues in molecular biology. - 2022, 44, 5768-5777. https:// doi.org/10.3390/cimb44110391.

58. Dizdaroglu M and Jaruga P. Mechanisms of free radical-induced damage to DNA. Free Radic Res 46: 382-419, 2012.

59. Duncan-Lyngdoh RH and Schaefer HF. Elementary lesions in DNA subunits: electron, hydrogen atom, proton, and hydride transfers. Acc Chem Res 42: 563-572, 2009.

60. El-Missiry MA, Fayed TA, El-Sawy MR, and El-Sayed AA. Ameliorative effect of melatonin against gamma irradiation-induced oxidative stress and tissue injury. Ecotoxicol Environ Saf 66: 278-286, 2007.

61. Ergur B.U., Kiray M., Pekcetin C., Bagriyanik H.A., Erbil G. Protective effect of erythropoietin pretreatment in testicular ischmia-reperfusion injury in rats. J. Pediatr. Surg. 43, 722-728, 2008.

62. Erkekoglu P., Zeybek N.D., Giray B., Asan E., Hincal F. The effects of di (2-ethylhexyl) phthalate exposure and selenium nutrition on sertoli cell vimentin structure and germ-cell apoptosis in rat testis. Arch Environ Contam Toxicol. 62(3):539-547, 2012.

63. Everts P., Onishi K., Jayaram P., Lana J.F., Mautner K. Platelet-Rich Plasma: New Performance Understandings and Therapeutic Considerations in 2020. Int J Mol Sci. 21(20):7794, 2020.

64. Fanning A.S., Jameson B.J., Jesaitis L.A., Anderson J.M. The tight junction protein ZO-1 establishes a link between the transmembrane protein occluding and the actin cytoskeleton. J. Biol. Chem. 273, 29745-29753, 1998.

65. Feigerlova E., Hwa V., Derr M.A., Rosenfeld R.G. Current issues on molecular diagnosis of GH signaling defects. Endocrine Development. 24: 118-127, 2013.

66. Fu S., Yin L., Lin X., Lu J., Wang X. Effects of cyclic mechanical stretch on the proliferation of L6 myoblasts and its mechanisms: PI3K/Akt and MAPK signal pathways regulated by IGF-1 receptor. Int. J. Mol. Sci. 19, 1649, 2018.

67. Gale N.W., Yancopoulos G.D. Growth factors acting via endothelial cell-specific receptor tyrosine kinases: VEGFs, angiopoietins, and ephrins in vascular development. Genes Dev. 13: 1055-1066, 1999.

68. Galluzzi L., Vitale I., Aaronson S. et al. Molecular mechanisms of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018. Cell Death Differ 25, 486-541, 2018.

69. Girotti AW. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems. J Lipid Res 39: 1529-1542, 1998.

70. Giwercman A, von der Maase H, Berthelsen JG, Rorth M, Bertelsen A, Skakkebaek NE. Localized irradiation of testes with carcinoma in situ: effects on Leydig cell function and eradication of malignant germ cells in 20 patients. J Clin Endocrinol Metab. 73(3):596-603, 1991.

71. Griswold M.D. 50 years of spermatogenesis: Sertoli cells and their interactions with germ cells. Biol Reprod. 99(1):87-100, 2018.

72. Griffeth RJ, Bianda V, Nef S. The emerging role of insulin-like growth factors in testis development and function. Basic Clin Androl. 24:12, 2014.

73. Guitton N., Brouazin-Jousseaume V., Dupaix A., Jegou B., Chenal C. Radiation effect on rat Sertoli cell function in vitro and in vivo. Int. J. Radiat. Biol. 75, 327-333, 1999.

74. Gupta G.S. Proteomics of Spermatogenesis. Springer Science and Business Media. 855, 2006.

75. Haber AH, Rothstein BE. Radiosensitivity and rate of cell division: "law of Bergonie and Tribondeau". Science. 163(3873):1338-1339, 1969.

76. Haimovitz-Friedman A, Kan C, Ehleiter D, Persaud R, McLoughlin M, Fuks Z, and Kolesnick R. Ionizing radiation acts on cellular membranes to generate ceramide and initiate apoptosis. J Exp Med 180: 525-535, 1994.

77. Hall Eric J., Giaccia Amato J. / Radiobiology for the radiologist / Eighth edition. / Philadelphia: Wolters Kluwer, 2019; LCCN 2017057791 / ISBN 9781496335418

78. Halper J. Growth factors as active participants in carcinogenesis: a perspective. Vet Pathol, 47(1):77-97, 2010.

79. Hamer G., Roepers-Gajadien H.L., van Duyn-Goedhart A., et al. DNA doublestrand breaks and gamma-H2AX signaling in the testis. Biol Reprod. 68(2):628-634, 2003.

80. Hasegawa M., Wilson G., Russell L.D. Radiation-induced cell death in the mouse testis: Relationship to apoptosis. Radiat. Res. 147, 457-467, 1997.

81. Hosoki A, Yonekura S, Zhao QL, Wei ZL, Takasaki I, Tabuchi Y, Wang LL, Hasuike S, Nomura T, Tachibana A, Hashiguchi K, Yonei S, Kondo T, and Zhang-Akiyama QM. Mitochondria-targeted superoxide dismutase (SOD2) regulates radiation resistance and radiation stress response in HeLa cells. J Radiat Res 53: 58-71, 2012.

82. Houee-Levin C and Bobrowski K. The use of the methods of radiolysis to explore the mechanisms of free radical modifications in proteins. J Proteomics 92: 51-62, 2013.

83. Hussein M. R., Abu-Dief E. E., Abou El-Ghait A. T., Adly M. A., Abdelraheem M. H. Morphological evaluation of the radioprotective effects of melatonin against X-ray-induced early and acute testis damage in Albino rats: an animal model. International journal of experimental pathology, 87(3), 237-250, 2006.

84. Hu W, Feng Z, Eveleigh J, Iyer G, Pan J, Amin S, Chung F-L, and Tang M-S. The major lipid peroxidation product, trans-4-hydroxy-2-nonenal, preferentially forms DNA adducts at codon 249 of human p53 gene, a unique mutational hotspot in hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis 23: 1781-1789, 2002.

85. Itman C., Mendis S., Barakat B., Loveland K.L. All in the family: TGF-beta family action in testis development. Reproduction. 132(2):233-246, 2006.

86. Jackson M.R., Falzone N., Vallis K.A. Advances in anticancer radiopharmaceuticals. Clin Oncol (R Coll Radiol). 25(10):604-609, 2013.

87. Jenkins P.J., Bustin S.A. Evidence for a link between IGF-I and cancer. Eur J Endocrinol. 151: S17-S22, 2004.

88. Jiang Z., Xu B., Yang M., Li Z., Zhang Y., Jiang D. Protection by hydrogen against gamma ray-induced testicular damage in rats. Basic Clin. Pharmacol. Toxicol. 112, 186-191, 2013.

89. Kaur G., Thompson L.A., Dufour J.M. Sertoli cells-immunological sentinels of spermatogenesis. In: Seminars in Cell & Developmental Biology. 30: 36-44, 2014.

90. Kelley K.M., Schmidt K.E., Berg L., Sak K., Galima M.M., Gillespie C., Balogh, Hawayek A., Reyes J.A., Jamison M. Comparative endocrinology of the insulin-like growth factor-binding protein. J Endocrinol. 175:3-18, 2002.

91. Kesari, K.K., Agarwal, A. & Henkel, R. Radiations and male fertility. Reprod Biol Endocrinol 16, 118, 2018.

92. Kiang JG, Cannon G, Olson MG, et al. Female Mice are More Resistant to the Mixed-Field (67% Neutron + 33% Gamma) Radiation-Induced Injury in Bone Marrow and Small Intestine than Male Mice due to Sustained Increases in G-CSF and the Bcl-2/Bax Ratio and Lower miR-34a and MAPK Activation. Radiat Res. 2022.

93. Kim H.J., Lee J.W., Hwang B.R., Lee Y.A., Kim J.I., Cho Y.J. et al. Protective effect of pterostilbene on testicular ischemia/reperfusion injury in rats. Journal of pediatric surgery 2016.

94. Kineman R.D., Del Rio-Moreno M., Sarmento-Cabral A. 40 YEARS of IGF1: Understanding the tissue-specific roles of IGF1/IGF1R in regulating metabolism using the Cre/loxP system. J Mol Endocrinol. 61(1):T187-T198, 2018.

95. Kolodynska A., Streit-Cieckiewicz D., Kot A., Kuliniec I., Futyma K. Radiation-Induced Recurrent Vesicovaginal Fistula-Treatment with Adjuvant Platelet-Rich Plasma Injection and Martius Flap Placement-Case Report and Review of Literature. Int J Environ Res Public Health. 18(9):4867, 2021.

96. Kumar V., Misro M.M., Datta K. Simultaneous accumulation of hyaluronan binding protein 1 (HABP1/p32/gC1qR) and apoptotic induction of germ cells in cryptorchid testis. JAndrol. 33(1):114-121, 2012.

97. Jeschke M.G., Barrow R.E., Hawkins H.K., Yang K., Hayes R.L., Lichtenbelt B.J., Perez-Polo J.R., Herndon D.N. IGF-1 gene transfer in thermally injured rats. Gene Ther. 6: 1015-1020, 1999.

98. Lacci K.M., Dardik A. Platelet-rich plasma: support for its use in wound healing. Yale J Biol Med. 83(1):1-9, 2010.

99. Laron Z. Insulin-like growth factor 1 (IGF-1): a growth hormone. Mol Pathol. 2001;54(5):311-316. doi:10.1136/mp.54.5.311

100. Leach JK, Van Tuyle G, Lin PS, Schmidt-Ullrich R, and Mikkelsen RB. Ionizing radiation-induced, mitochondria-dependent generation of reactive oxygen/nitrogen. Cancer Res 61: 3894-3901, 2001.

101. Lee K., Park J.S., Kim Y.J. Differential expression of Prx I and II in mouse testis and their up-regulation by radiation. Biochem. Biophys. Res. Commun. 296, 337-342, 2002.

102. Leung C.T., Yang Y., Yu K.N., et al. Low-Dose Radiation Can Cause Epigenetic Alterations Associated With Impairments in Both Male and Female Reproductive Cells. Front Genet. 12:710143, 2021.

103. Lewis K.A., Gray P.C., Blount A.L., MacConell L.A., Wiater E., Bilezikjian L.K., Vale W. Betaglycan binds inhibin and can mediate functional antagonism of activin signaling. Nature. 404 411-414, 2000.

104. Limoli CL, Rola R, Giedzinski E, Mantha S, Huang TT, and Fike JR. Cell-density-dependent regulation of neural precursor cell function. Proc Natl Acad Sci USA 101:16052-16057, 2004.

105. Liu M., Zhang S. Amphioxus IGF-like peptide induces mouse muscle cell development via binding to IGF receptors and activating MAPK and PI3K/Akt signaling pathways. Mol. Cell. Endocrinol. 343, 45-54, 2011.

106. Li Z., Tian J., Cui G., Wang M., Yu D. Effects of local testicular heat treatment on Leydig cell hyperplasia and testosterone biosynthesis in rat testes [published online ahead of print, 2015 Mar 18]. Reprod Fertil Dev. 2015.

107. Ma Y., Nie H., Sheng C., Chen H., Wang B., Liu T., Shao J., He X., Zhang T., Zheng C., et al. Roles of oxidative stress in synchrotron radiation X-ray-induced testicular damage of rodents. Int. J. Physiol. Pathophysiol. Pharmacol. 4, 108-114, 2012.

108. Makarevich P.I., Efimenko A.Y., Tkachuk V.A. Biochemical Regulation of Regenerative Processes by Growth Factors and Cytokines: Basic Mechanisms and Relevance for Regenerative Medicine. Biochemistry (Mosc), 85(1): 11-26, 2020.

109. Manda K, Ueno M, Moritake T, and Anzai K. Radiation-induced cognitive dysfunction and cerebellar oxidative stress in mice: protective effect of alpha-lipoic acid. Behav Brain Res, 177: 7-14, 2007.

110. Manna P.R., Chandrala S.P., King S.R. et al. Molecular mechanisms of insulinlike growth factor-I mediated regulation of the steroidogenic acute regulatory protein in mouse Leydig cells. Mol Endocrinol. 20(2):362-378, 2006.

111. Martins R.P., Hartmann D.D., de Moraes J.P., Soares F.A., Puntel G.O. Platelet-rich plasma reduces the oxidative damage determined by a skeletal muscle contusion in rats. Platelets. 27(8):784-790, 2016.

112. Marzban M, Anjamshoa M, Jafari P, Masoumi H, Ahadi R, Fatehi D. Effects of gamma rays on rat testis tissue according to the morphological parameters and immunohistochemistry: radioprotective role of silymarin. Electron Physician. 9(6):4524-4532, 2017.

113. Mauduit C., Siah A., Foch M., Chapet O., Clippe S., Gerard J.P., Benahmed M. Differential expression of growth factors in irradiated mouse testes. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 50(1): 203-212, 2001.

114. Meinhardt A., Hedger M.P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68, 2011.

115. Meistrich ML. Effects of chemotherapy and radiotherapy on spermatogenesis in humans. Fertil Steril. 2013;100(5):1180-1186.

116. Meistrich M.L., Shetty G. Inhibition of spermatogonial differentiation by testosterone. J. Androl. 24, 135-148, 2003.

117. Middleton K.K., Barro V., Muller B., Terada S., Fu F.H. Evaluation of the effects of platelet-rich plasma (PRP) therapy involved in the healing of sports-related soft tissue injuries. Iowa Orthop J. 32:150-163, 2012.

118. Mishra A., Harmon K., Woodall J., Vieira A. Sports Medicine Applications of Platelet Rich Plasma, Curr Pharm Biotechnol. 2011.

119. Morales A, Miranda M, Sanchez-Reyes A, Biete A, and Fernandez-Checa JC. Oxidative damage of mitochondrial and nuclear DNA induced by ionizing radiation in human hepatoblastoma cells. Int J Radiat Oncol Biol Phys 42:191-203, 1998.

120. Morita K., Furuse M., Fujimoto K., Tsukita S. Claudin multigene family encoding four-transmembrane domain protein components of tight junction strands. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 96, 511-516, 1999.

121. Morita, K.; Sasaki, H.; Fujimoto, K.; Furuse, M.; Tsukita, S. Claudin-11/OSP-based tight junction of myelin sheaths in brain and Sertoli cells in testis. J. Cell Biol. 145, 579-588, 1999.

122. Narayanan PK, Goodwin EH, and Lehnert BE. Alpha particles initiate biological production of superoxide anions and hydrogen peroxide in human cells. Cancer Res 57: 3963-3971, 1997.

123. Neirijnck Y., Calvel P., Kilcoyne K.R., et al. Insulin and IGF1 receptors are essential for the development and steroidogenic function of adult Leydig cells. FASEB J. 32(6):3321-3335, 2018.

124. Ogilvy-Stuart AL, Shalet SM. Effect of radiation on the human reproductive system. Environ Health Perspect. 101 Suppl 2(Suppl 2): 109-116, 1993.

125. O'kane S., Ferguson M.W.J. Transforming growth factor-bs and wound healing. Int J Biochem Cell Biol. 29:63-78, 1997.

126. Omaima S.E., Nehal A.M. The Protective Role of Septilin Against Gamma Radiation-Induced Testicular Toxicity in Rats. The Egyptian Journal of Hospital Medicine. 27: 176- 187, 2007.

127. Ozturk H., Ozturk H., Terzi E.H., Bugdayci G., Duran A. Interleukin 10 reduces testicular damage in experimental testicular ischemia/reperfusion injury. Urology. 83:508 e1-6, 2014.

128. Pashazadeh A, Boese A, Friebe M. Radiation therapy techniques in the treatment of skin cancer: an overview of the current status and outlook. J Dermatolog Treat. 30(8):831-839, 2019.

129. Petersen DR and Doorn JA. Reactions of 4-hydroxynonenal with proteins and cellular targets. Free Radic Biol Med 37: 937-945, 2004.

130. Qu N, Itoh M, Sakabe K. Effects of Chemotherapy and Radiotherapy on Spermatogenesis: The Role of Testicular Immunology. International Journal of Molecular Sciences. 2019; 20(4):957.

131. Reisz JA, Bansal N, Qian J, Zhao W, Furdui CM. Effects of ionizing radiation on biological molecules--mechanisms of damage and emerging methods of detection. Antioxid Redox Signal. 2014;21(2):260-292.

132. Reiter RJ, Korkmaz A, Ma S, Rosales-Corral S, and Tan D-X. Melatonin protection from chronic, low-level ionizing radiation. Mutat Res 751: 7-14, 2012.

133. Rotwein P. Mapping the growth hormone - Stat5b - IGF-I transcriptional circuit. Trends in Endocrinology and Metabolism. 23: 186-193, 2012.

134. Saif-Elnasr M., Abdel Fattah S.M., Swailam H.M. Treatment of hepatotoxicity induced by y-radiation using platelet rich plasma and/or low molecular weight chitosan in experimental rats. International Journal of Radiation Biology. 95(11): 1517-1528, 2019.

135. Sandri M., Barberi L., Bijlsma A.Y., Blaauw B., Dyar K.A., Milan G., Mammucari C., Meskers C.G., Pallafacchina G., Paoli A. et al. Signalling pathways regulating muscle mass in ageing skeletal muscle: The role of the IGF1-Akt-mTOR-FoxO pathway. Biogerontology. 14, 303-323, 2013.

136. Sekerci CA, Tanidir Y, Sener TE, Sener G, Cevik O, Yarat A, Alev-Tuzuner B, Cetinel S, Kervancioglu E, Sahan A, Akbal C. Effects of platelet-rich plasma against experimental ischemia/reperfusion injury in rat testis. J Pediatr Urol. 13(3): 317.E1-317.E9, 2017.

137. Sener G, Kabasakal L, Atasoy BM, Erzik C, Velioglu-Ogunc A, Cetinel S, Contuk G, Gedik N and Yegen BC. Propylthiouracil-induced hypothyroidism protects ionizing radiation-induced multiple organ damage in rats. J Endocrinol 189: 257-269, 2006.

138. Shalet S. M., Horner A., Ahmed S. R., and Morris-Jones P. H. Leydig cell damage after testicular irradiation for lymphoblastic leukaemia. Med. Pediatr. Oncol. 13: 65-68, 1985.

139. Shetty G., Meistrich M.L. Hormonal approaches to preservation and restoration of male fertility after cancer treatment. J. Natl. Cancer Inst. Monogr. 36-39, 2005.

140. Silber S.J., Nagy Z., Devroey P., Tournaye H., Van Steirteghem A.C. Distribution of spermatogenesis in the testicles of azoospermic men: the presence or absence of spermatids in the testes of men with germinal failure. Hum Reprod. 12:2422-8, 1997.

141. Silva A.M., Correia S., Casalta-Lopes J.E., Mamede A.C., Cavaco J.E., Botelho M.F., Socorro S., Maia C.J. The protective effect of regucalcin against radiation-induced damage in testicular cells. Life Sci. 164, 31-41, 2016.

142. Simons J. How do low energy (0.1 - 2 eV) electrons cause DNA strand breaks? Acc Chem Res 39: 772-779, 2006.

143. Sineath RC, Mehta A. Preservation of Fertility in Testis Cancer Management. Urol Clin North Am. 2019;46(3):341-351.

144. Soliman A.F., Saif-Elnasr M., Abdel Fattah S.M. Platelet-rich plasma ameliorates gamma radiation-induced nephrotoxicity via modulating oxidative stress and apoptosis. Life Science. 219: 238-247, 2019.

145. Son Y., Heo K., Bae M.J., Lee C.G., Cho W.S., Kim S.D., Yang K., Shin I.S., Lee M.Y., Kim J.S. Injury to the blood-testis barrier after low-dose-rate chronic radiation exposure in mice. Radiat. Prot. Dosim. 167, 316-320, 2015.

146. Sram RJ, Binkova B, and Rossner P, Jr. Vitamin C for DNA damage prevention. Mutat Res 733: 39-49, 2012.

147. Steiner D.F., Rubenstein A.H. Proinsulin C-peptide: biological activity? Science. 277:531-532, 1997.

148. Stephen EH, Chandra A. 2006. Declining estimates of infertility in the United States: 1982-2002. Fertil Steril. 86: 516-523.

149. Stone HB, Coleman CN, Anscher MS, McBride WH. Effects of radiation on normal tissue: consequences and mechanisms. Lancet Oncol. 2003;4(9):529-536.

150. Svendsen K, Guenot D, Svensson JB, Petersson K, Persson A, Lundh O. A focused very high energy electron beam for fractionated stereotactic radiotherapy. Sci Rep. 2021;11(1):5844.

151. Takahashi K, Nagahori K, Qu N, et al. The effectiveness of traditional Japanese medicine Goshajinkigan in irradiation-induced aspermatogenesis in mice. BMC Complement Altern Med. 19(1):362, 2019.

152. Take G., Erdogan D., Helvacioglu F. et al. Effect of melatonin and time of administration on irradiation-induced damage to rat testes. Braz J Med Biol Res. 42(7):621-628, 2009.

153. Tan D-X, Manchester LC, Terron MP, Flores LJ, and Reiter RJ. One molecule, many derivatives: a never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species? J Pineal Res 42: 28-42, 2007.

154. Thompson LH. Recognition, signaling, and repair of DNA double-strand breaks produced by ionizing radiation in mammalian cells: the molecular choreography. Mutat Res 751: 158-246, 2012.

155. Traber MG and Atkinson J. Vitamin E, antioxidant and nothing more. Free Radic Biol Med 43: 4-15, 2007.

156. Tsatsoulis A., Shalet S. M., Morris I. D., de Kretser D. M. Immunoactive inhibin as a marker of Sertoli cell function following cytotoxic damage to the human testis. Hormone Res. 34: 254-259, 1990.

157. Tohidnezhand M., Wruck C.J., Slowik A., Kweider N., Beckmann R., Bayer A., Houben A., Brandenburg L.O., Varoga D., Sönmez T.T., Stoffel M., Jahr H., Lippross S., Pufe T. Role of platelet-released growth factors in detoxification of reactive oxygen species in osteoblasts. Bone. 65:9-17, 2014.

158. Topcu A., Mercantepe F., Rakici S., Tumkaya L., Uydu H.A., Mercantepe T. An investigation of the effects of N-acetylcysteine on radiotherapy-induced testicular injury in rats. Naunyn-Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 392: 147-157, 2019.

159. Vergouwen R.P., Huiskamp R., Bas R.J. Radiosensitivity of testicular cells in the fetal mouse. Radiat. Res. 141, 66-73, 1995.

160. Vit JP and Rosselli F. Role of the ceramide-signaling pathways in ionizing radiation-induced apoptosis. Oncogene 22: 8645-8652, 2003.

161. Wang C-R, Nguyen J, and Lu Q-B. Bond breaks of nucleotides by dissociative electron transfer of nonequilibrium prehydrated electrons: a new molecular mechanism for reductive DNA damage. J Am Chem Soc 131: 11320-11322, 2009.

162. Wang X.W., Ding G.R., Shi C.H., Zeng L.H., Liu J.Y., Li J., Zhao T., Chen Y.B., Guo G.Z. Mechanisms involved in the blood-testis barrier increased permeability induced by EMP. Toxicology. 276, 58-63, 2010.

163. Wdowiak A, Skrzypek M, Stec M, Panasiuk L. Effect of ionizing radiation on the male reproductive system. Ann Agric Environ Med. 26(2):210-216, 2019.

164. Weidinger A., Kozlov A.V. Biological Activities of Reactive Oxygen and Nitrogen Species: Oxidative Stress versus Signal Transduction. Biomolecules. 5:47284, 2015.

165. Werner S., Grose R. Regulation of wound healing by growth factors and cytokines. Physiol Rev. 83(3):835-870, 2003.

166. Wu L-J, Randers-Pehrson G, Xu A, Waldren CA, Geard CR, Yu Z, and Hei TK. Targeted cytoplasmic irradiation with alpha particles induces mutations in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A 96: 4959-4964, 1999.

167. Zhang T., Liu T., Shao J., Sheng C., Hong Y., Ying W., Xia W. Antioxidant protects blood-testis barrier against synchrotron radiation X-ray-induced disruption. Spermatogenesis. 5, e1009313, 2015.

168. Zhao W and Robbins ME. Inflammation and chronic oxidative stress in radiation-induced late normal tissue injury: therapeutic implications. Curr Med Chem 16: 130143, 2009.

169. Zubair U., Salam O., Zubair Z. Role of Intra-articular Platelet Rich Plasma in the Management of Osteoarthritis: A Review. Cureus. 10(9):e3359, 2018.

Послесловие

Настоящая научная работа подчеркивает важность проведения морфологических

исследований в комбинации с молекулярно-биологическим и молекулярно-генетическим анализом в совокупности с полученными доклиническими данными показывает, что организм, представляет собой сложный инструмент, управление которым может приподносить совершенно различные, и, зачастую неожиданные, конечные результаты даже на одной и той же патогенетической основе.

Благодарность

Учитывая, что докторская диссертация является определенным итогом многолетней научной работы, я выражаю искренную благодарность многим коллегам, а особенно своим наставникам, учителям помощникам:

Ольге Васильевне Волковой, Боровой Татьяне Геннадьевне, Коган Евгении Александровне, Кругликову Герману Григорьевичу, Цибулевскому Александру Юрьевичу, Дубовой Татьяне Клеониковне, Южакову Вадиму Васильевичу, студентам и молодым ученым, лаборантам.