Спектроскопия ЯМР высокого разрешения в изучении молекулярного механизма действия лекарственных препаратов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор химических наук в форме науч. докл. Польшаков, Владимир Иванович

• Польшаков, Владимир Иванович
• доктор химических наук в форме науч. докл.
• 2000

Оглавление диссертации доктор химических наук в форме науч. докл. Польшаков, Владимир Иванович

Актуальность проблемы

Медицинская химия стоит на пороге качественных изменений - переходе от стратегии поиска новых лекарственных соединений методом скрининга к рациональным подходам, основанным на знании структуры потенциальной мишени действия. Завершение работы по расшифровке генома человека, происходящее в наши дни, создает реальные предпосылки для установления многих новых мишеней действия лекарственных препаратов. Число биомишеней в ближайшие годы может возрасти на порядок. Б этой связи неизбежно возрастет значимость структурных исследований и вычислительных методов, используемых для поиска оптимальной структуры ингибитора фермента или лиганда, взаимодействующего с рецептором. Эффективность таких подходов основана на достижениях современной биохимии и молекулярной фармакологии, в том числе понимании факторов, контролирующих специфичность связывания лиганда с биомолекулой, а также знании путей биотрансформации препарата в организме. Несмотря на огромный объем знаний, накопленный в данной области, многие вопросы до сих пор еще остаются невыясненными. Недостаточно изучены особенности гидрофобных и кулоновских взаимодействий, и водородных связей, определяющих сродство биомишени к тому или иному лиганду, влияние динамических свойств биомолекул на их способность связывать низкомолекулярные соединения.

Спектроскопия ЯМР служит одним из важнейших инструментов для изучения строения молекул и механизмов протекания химических процессов. Быстрое развитие методов ЯМР в последние годы сделало возможным определять трехмерную структу

---------------------------г--------.------------ ' дажным

КНИГА ИМЕЕТ

В перепл. един, соедин. „\?Х« вып.

Л ж 'А и чрезвычаи-лектронных одействиях, ия ЯМР ис-молекуляр-!ия лекарст-юмолекулами, изучены динамические свойства образующихся комплексов, исследованы специфические взаимодействия между препаратом и биомолекулой, В этой связи, представлялось необходимым разработать целостный подход к решению некоторых сложных вопросов молекулярной фармакологии с применением методов ЯМР.

Одной из нерешенных до настоящего времени проблем было установление молекулярного механизма действия оригинальных противоопухолевых препаратов -производных диспиротрипиперазиния. Биологические особенности действия резко отличали их от большинства известных алкилирующих агентов. Поэтому, предстояло решить вопрос о том, имеют ли указанные соединения свойства алкилирующих препаратов и каковы в этом случае их потенциальные мишени. Представлялось необходимым установить биологическую роль фрагмента диспиротрипиперазиния и терминальных остатков в указанных препаратах. Крайне важной представлялась также информация о путях биотрансформации соединений этого класса.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Спектроскопия ЯМР высокого разрешения в изучении молекулярного механизма действия лекарственных препаратов»

Цель работы

Целью настоящей работы являлась разработка подходов, направленных на эффективное использование новейших достижений спектроскопии ЯМР высокого разрешения для решения проблем молекулярной фармакологии и биохимии. В их числе были вопросы механизма биотрансформации лекарственных препаратов, их взаимодействия с потенциальными биологическими мишенями, определение структурных и динамических факторов, контролирующих процессы связывания лиганда с биомолекулой, установления природы специфических взаимодействий между биомолекулой и лигандом. Значительное внимание в работе было уделено созданию новых методов и компьютерных программ, призванных сделать более совершенным и быстрым процесс расчета структуры биомолекул в растворе, анализа их динамических свойств и других характеристик.

Целью работы было также решение ряда прикладных вопросов, таких как установление путей превращений в организме противоопухолевых препаратов диспирот-рипиперазиниевой группы, определение механизма их действия и потенциальных мишеней связывания, определение структуры комплексов дигидрофолатредуктазы с ингибиторами, установление природы высокой селективности связывания антибактериального препарата триметоприм с бактериальным ферментом. Решение всех указанных вопросов необходимо для рационального поиска новых, более совершенных противоопухолевых и антибактериальных препаратов.

Научная новизна работы

В работе впервые были изучены детали молекулярного механизма действия двух важных классов лекарственных препаратов: противоопухолевых соединений из группы производных диспиротрипиперазиния, впервые созданных в ЦХЛС-ВНИХФИ, и широко применяемых в медицинской практике ингибиторов дигидрофолатредуктазы.

Для препаратов, производных диспиротрипиперазиния, впервые установлены пути их биотрансформации, изучены их алкилирующие свойства и определены потенциальные мишени действия. Впервые метод ЯМР был применен для изучения динамики выведения лекарственных соединений из организма.

В работе детально изучены комплексы Lactobacillus casei ДГФР с препаратами метотрексат, триметрексат и триметоприм. Установлена структура высокого разрешения в растворе для их бинарных комплексов и тройного комплекса с ТМП и НАДФ-Н. По результатам работы 4 структуры были переданы в банк данных Brookhaven Protein Databank (PDB). Следует отметить, что две из них были первыми опубликованными структурами ДГФР в растворе. Впервые детально изучены динамические свойства фермента в ряде его комплексов и специфические взаимодействия между ферментом и лигандами. В работе продемонстрирована необходимость получения комплексной информации об изучаемых объектах при установлении факторов, контролирующих связывание лиганда с белком. Показано, что структурные данные должны быть дополнены информацией о характере молекулярных движений и особенностях специфических взаимодействий.

Очерчен крут вопросов молекулярной фармакологии, который может эффективно решаться с применением методов спектроскопии ЯМР. Показаны возможности метода ЯМР и его сочетания с вычислительными методами квантовой химии для решения сложных проблем, возникающих при изучении взаимодействия лекарственных препаратов с биомишенями. Комплекс задач, которые могут быть решены с применением метода ЯМР и совокупность возможностей этого метода, продемонстрированных в настоящей работе, могут быть объединены в новое научное направление «Спектроскопия ЯМР в молекулярной фармакологии».

Практическая значимость работы

Практическая значимость проведенной работы обусловлена выбором изучаемых объектов - препараты из группы производных диспиротрипиперазиния (проспидин и спиробромин) и антифолатные препараты (метотрексат, триметоприм, триметрексат и др.) широко применяются в медицинской практике. Поэтому, установление деталей их молекулярного механизма действия представляет безусловную практическую ценность, в частности, для поиска новых, более эффективных лекарственных средств.

Важное практическое значение имеет установление путей превращений препаратов - производных диспиротрипиперазиния. По результатам работы были даны рекомендации по использованию ряда новых лекарственных форм препаратов, в частности была показана целесообразность замены основания проспидина его гидрохлоридом, ввиду существенно более высокой стабильности последнего. Установленные особенности биотрансформации препаратов и динамики их выведения из организма также необходимы для разработки наиболее совершенных схем применения препаратов.

Для проведения поисковых работ, направленных на создание новых антифолат-ных препаратов, большую практическую значимость представляют опубликованные структуры высокого разрешения ряда комплексов ДГФР. Практическую важность имеют также фундаментальные результаты проведенного исследования. Они вносят свой вклад в понимание природы процессов молекулярного узнавания и характера специфических взаимодействий между лигандами и биомишенями.

Практическую ценность представляют и разработанные методики расчета структуры комплексов белок-препарат, в частности метод докинга с наложенными ограничениями. Компьютерные программы, разработанные в ходе выполнения работы, также имеют практическую значимость. Так, программа AngleSearch, предназначенная для выполнения стереоспецифического отнесения сигналов и расчета торсионных углов в белках по данным ЯМР, уже используется рядом научных групп в мире, Эта программа, а также программа NMRTABLE, бесплатно предоставляется всем заинтересованным в их использовании.

Апробация работы

Отдельные части работы были доложены на III Всесоюзной конференции по химии азотистых гетероциклов (Ростов-на-Дону, 1983); II Всесоюзном совещании по фарма-кокинетике противоопухолевых препаратов (Киев, 1996); III Всесоюзном совещании «Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей» (Черноголовка, 1987); I Международной конференции «Использование стабильных изотопов для исследования структуры, динамики и функций белков методом ЯМР» (Париж, 1994); XII Международной конференции по спектроскопии ЯМР (Манчестер, 1995); XVI, XVII и XIX Международных конференциях по магнитному резонансу в биологических системах (Вельдховен, 1994; Колорадо, 1996 и Флоренция, 2000); X Международной конференции «Магнитный резонанс в химии и биологии» (Суздаль, 1998); Международной конференции «ЯМР в молекулярной биологии: структура, связывание и молекулярное узнавание» (Гренада, 1999); III Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в структурных исследованиях» (Казань, 2000); Международной конференции «Биокатализ-2000: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2000); Международных конференциях участников научной программы Медицинского Института Говарда Хьюза (Прага, 1996; Варшава, 1997; Будапешт, 1998; Москва, 1999 и Вашингтон, 2000).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 24 статьи в научных журналах, 2 статьи в сборнике научных трудов, 14 тезисов докладов и 1 руководство по пользованию научной компьютерной программой.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Спектроскопия ЯМР в изучении биотрансформации лекарственных соединений.

1.1. Превращения противоопухолевых препаратов диспиротрипиперазиниевого ряда в водных средах, в условиях, близких к физиологическим.

Противоопухолевые препараты - производные диспиротрипиперазиния (3,12-диаза-6,9-диазониадиспиро[5,2,5,2]гексадекана) - были разработаны во ВНИХФИ в 60-х - 80-х годах. Первым препаратом из этой группы был спиразидин 1. В последующем были созданы более эффективные лекарственные соединения: проспидин 2 и спиробромин 3, которые в настоящее время применяются в медицинской практике. Последним синтезированным соединением этого ряда был карбоспирин 4, также проявляющий высокую противоопухолевую активность в опытах на экспериментальных животных.

От большинства противоопухолевых агентов соединения 2 - 4 отличает их низкая токсичность и практически полное отсутствие угнетающих эффектов на кроветворение. В этой связи представляло значительный интерес установление молекулярного механизма действия указанных препаратов, в частности изучение путей их биотрансформации в организме и связывание их с потенциальными биомишенями. Для этого было необходимо детально изучить превращения препаратов в физиологических условиях. Превращения соединений 1-4 изучали в водных растворах в диапазоне концентраций от 20 тМ до 0.6 М, рН от 1 до 9 и температуре от 25 до 70°С. Строение и количественный состав продуктов превращений контролировался с помощью Ш и 2В спектров ЯМР на ядрах 'Н, 13С и 31Р, причем все превращения изучали т зИи, в ампуле ЯМР. Проведенное исследование показало, что в указанных выше условиях превращения всех изученных соединений были обусловлены изменением строения только концевых группировок. Реакций, связанных со структурными изменениями диспиротрипиперазиниевого остатка, не наблюдалось.

Спиразидин 1 в водных растворах претерпевает реакции гидролиза и полимеризации (см. схему 1). Известно, что в основе высокой реакционной способности (3-хлорэтиламинов в реакциях нуклеофильного замещения лежит их способность тауто

2СГ

I? = СН2СН2С1

1 спиразидин

2 проспидин

3 спиробромин

4 карбоспирин

СН2СН(ОН)СН2С1

СОСН2СН2Вг

СОМНСН2СН2С1 мерно превращаться в высоко реакционноспособные азиридиниевые производные. Установлено, что данный механизм превращений имеет место и в случае спиразиди-на, претерпевающего внутримолекулярную циклизацию до 5. Об этом свидетельствует, в частности тот факт, что протонированная форма 1+2, в которой исключена возможность внутримолекулярной циклизации вследствие связывания неподеленной электронной пары концевых атомов азота, устойчива в водных растворах даже при длительном нагревании при высокой температуре. В пользу предложенного механизма реакции свидетельствует также высокая реакционная способность 1 по отношению к тиосульфат-ионам, которые используются для количественного определения ионов азиридания. Следует отметить, однако, что сигналов 5 в спектрах ЯМР изученных реакционных смесей обнаружено не было, что свидетельствует о малом времени жизни этого интермедиата ввиду его высокой реакционной способности.

Схема 1. Превращения спиразидина в водных средах.

-сг =

X = ЭзОз НРО. 9

10 а-О-Ис-РОз" 11 чАа

В процессе гидролиза 1 выделяется кислота: рН раствора падает с 6 - 7 до 1-2. Поскольку выделяющаяся кислота может протонировать как исходное соединение, так и продукт гидролиза, были измерены величины констант ионизации указанных соединений (см. табл. 1). Ввиду большей основности 6, выделяющаяся в процессе гидролиза 1 кислота расходуется в большей степени на протонирование продукта гидролиза, что обеспечивает возможность достаточно быстрого и полного протекания реакции гидролиза (время полупревращения 1 6 при 60°С - около 2 часов).

Известно, что (3-хлорэтиламины легко димеризуются до гшперазиниевых производных. Данная реакция в случае 1 приводит к полимеризации: раствор мутнеет, выпадает белый осадок. При этом может образовываться как полимер спиранового строения, так и соединения 8 с частично разомкнутыми циклами, образующиеся при конденсации 5 и 6. Образование 8 было установлено по данным ИК спектроскопии. Относительное количество образующихся полимеров растет с повышением исходной концентрации 1. В то же время в присутствии ионов ЭгОз"2 и НР04"2 как продукты полимеризации, так и продукты гидролиза практически не образуются, вследствие протекания более быстрых реакций алкилирования (время полупревращения 1 -> 10 при 60°С - 15 мин).

Таблица 1. Величины констант ионизации соединений 1, 2, 6 и 13 рассчитанные по данным спектров ЯМР-13С, измеренных в диапазоне рН от 0 до 7.

Соединение

1 2 6 13 рКа" 1.41 ±0.03 1.90 ±0.04 1.98 ±0.02 2.45 ± 0.03

1) Величины констант соответствуют процессу дипротонирования. Значения рКа для первой и второй ионизации практически равны между собой, ввиду разделения центров протонирования протяженной и заряженной диспиротрипиперазиниевой системой.

Превращения проспидина 2 в водных средах при рН от 1 до 8 включают две последовательные стадии: внутримолекулярную циклизацию до азетидиниевого производного 12 и гидролиз последнего до диола 13 (см. схему 2). Строение 12 было установлено по данным спектров ЯМР 'Ни !3С. Так, наиболее характерный сигнал в спектре монорезонанса 13С соединения 12 - триплет при 72.4 м.д. с КССВ 'j(CH) = 155.0 Гц, принадлежащий атомам углерода в а-и у-положениях азетидиниевого цикла.

Вывод о последовательности двух стадий гидролиза 2 следует из анализа кинетических кривых, построенных по интегральным интенсивностям сигналов 2, 12 и 13 в спектрах ЯМР-13С, Таким образом, как и в случае 1 ключевой стадией превращений 2 является реакция внутримолекулярной циклизации. Поэтому связывание неподелен-ной электронной пары азота при протонировании препарата препятствует дальнейшим его превращениям: дигидрохлорид 2+2 устойчив в водных растворах даже при длительном надевании.

Стадия внутримолекулярной циклизации обратима, что подтверждается образованием продуктов замещения галогена 14 и 15 в у-положении боковой цепочки при проведении реакции в присутствии галогенидов щелочных металлов.

Схема 2. Превращения проспидина2 в водных средах в диапазоне рН от 1 до 8.

Второй стадией реакции является раскрытие азетидиниевых циклов 12 водой с образованием диола 13. Выделяющаяся при этом кислота протонирует как конечный, так и исходный продукты и приводит к постепенному замедлению скорости суммарной реакции 2 13. Вместе с тем, как и в случае превращений 1, большая основность продукта гидролиза 13 по сравнению с исходным препаратом 2 (см табл. 1) определяет возможность практически полного гидролиза проспидина в водных растворах.

При переходе к щелочным средам (рН > 8) превращение 2 в 13 протекает через стадию образования эпокиси 17 (см. схему 3).

Схема 3. Превращения проспидина 2 в водных средах при рН > 8.

-СГ

ОН

II

НС1

Н,0

Н,0

91

13"

17 легко гидролизуется до диола 13. Скорость реакции 17 -> 13 в сходных условиях значительно превышает скорость гидролиза 2 через стадию образования 12. Раскрытие эпоксидных циклов еще более ускоряется в кислых средах, при этом первой стадией реакции является протонирование до 17+2. При концентрации HCl в четыре и более раз превышающей концентрацию 17 единственным продуктом реакции является 2*2, однако при понижении концентрации HCl наблюдается также и образование 13+2.

Таким образом, превращения 2 в слабощелочных средах протекают через образование оксирана, а в нейтральных и слабокислых средах - через стадию внутримолекулярной циклизации.

Ключевой стадией превращений карбоспирина 4 также является реакция внутримолекулярной циклизации (см. схему 4), в результате которой образуется оксазоли-ниевое производное 18+2. Раскрытие оксазолинового цикла водой приводит к образованию окси-производного 19. В пользу предложенного механизма реакции свидетельствуют кинетические кривые накопления и расходования 4, 18 и 19, построенные по данным ЯМР.

Схема 4. Превращения карбоспирина 4 в водных средах.

18 у Т ° у Y\ 7 VY

0 4 О--/ О 19

18+2 НР04'г н

Г-OW

V Y о сГ0' 20

Строение 18 установлено на основании данных спектров ЯМР-'Н и 13С. Так, в спектре ЯМР-'Н наиболее характерным сигналом является триплет при 4.94 м.д. с КССВ 3J(HH) = 8.4 Гц, принадлежащий метиленовым протонам в положении 5\ Образование 18 определяет алкилирующие свойства карбоспирина: в присутствии фосфат-ионов наблюдается образование эфира 20.

Во многом отличается от 1, 2 и 4 характер превращений спиробромина 3. В водных растворах при pH от 5 до 9 не наблюдается реакций внутримолекулярной циклизации, а протекает реакция дегидробромироваяия с образованием акрилоильного производного 21 и реакция обмена галоида в у-положение боковой цепочки с образованием 22 (см. схему 5). Строение указанных продуктов реакции установлено по данным ЯМР-'Н и 13С.

Схема 5. Превращения спиробромина 3 в водных средах о а = Суэ 25 у-аи-Суэ-Иу 26

Скорость реакции дегидробромирования зависит от рН среды, возрастая в ~2.5 раза при увеличении рН на единицу. В интервале 5 < рН < 8 константа скорости этой реакции удовлетворительно описывается уравнением ^ к = 0.4хрН - 6.4 (к - в с"1).

В условиях, близких к физиологическим (рН = 7.0, 37°С), реакция дегидробромирования протекает с высокой скоростью (время полупревращения 3 —> 21 составляет около 50 мин). Процесс 3 -> 21 практически необратим: проведение его в БгО не приводит к образованию продуктов дейтерозамещения в Р-положение боковой цепочки 3 или 21, что следовало ожидать при наличии обратной реакции. Нагревание 20 в слабокислой среде (рН > 1) в присутствии избытка ионов С1" или Вг' не приводит к образованию 3 или 22, а при повышении концентрации кислоты наблюдается лишь гидролиз 20 до тетрахлорида 3,6,9,12-тетраазониадиспиро[5,2,5,2]-гексадекана 23 и акриловой кислоты 24.

Вторым направлением превращений 3 при 5 < рН < 8 является реакция обмена галоида, приводящая к образованию 22 и протекающая, по-видимому, по механизму

8ц2 типа, однако ее скорость в сходных условиях оказывается значительно ниже скорости реакции дегидробромирования.

Высокая скорость превращения 3 -> 21 в условиях, близких к физиологическим, позволяет предполагать важную роль акрилоильного производного 21 в механизме действия спиробромина. Известно, что соединения, содержащие сопряженную с карбонильной группой двойную связь, обладают высокой алкилирующей способностью в отношении сульфгидридных групп. БН-группы в виде аминокислотных остатков цис-теина входят в состав белковых систем и играют важную биологическую роль. В этой связи представлялось целесообразным изучить взаимодействие восстановленной формы цистеина с 21. Установлено, что 21 чрезвычайно легко взаимодействует с цистеи-ном, образуя тиоэфир 25. При этом кислотность среды не оказывает заметного влияния на скорость реакции в диапазоне 4 < рН < 9, что свидетельствует об участии в реакции неионизированных БН-групп (рКа сульфгидридных групп цистеина = 10.0). Высокая алкилирующая способность 21 показана и в отношении сульфгидридных групп глутатиона (ввН, у-Ии-Сув-Иу), играющего важную роль в целом ряде биохимических процессов. Следует отметить, что взаимодействия 3 с цистеином и ОЭН при рН < 5 (т.е. в условиях, когда скорость превращения 3 —> 21 мала) не наблюдается.

Полученные данные о превращениях 1 - 4 в водных средах послужили базой для изучения метаболизма (раздел 1.2) и алкилирующих свойств исследуемых препаратов по отношению к нуклеиновым кислотам (раздел 2.1).

1.2. ЯМР в изучении метаболизма и динамики лекарственных средств.

Вопросы метаболизма и динамики выведения лекарственных соединений из организма играют весьма важную роль в изучении их молекулярного механизма действия. Эти исследования необходимы также для выбора рациональных методов применения препаратов, поиска путей снижения их токсичности и побочных эффектов. Хотя спектроскопия ЯМР используется в этих исследованиях существенно реже таких методов, как хроматография или масс-спектрометрия (ввиду своей относительно низкой чувствительности), она все же занимает в них свою нишу. В большинстве случаев методы ЯМР используют для подтверждения строения метаболитов, в особенности тогда, когда не удается получить однозначный ответ масс-спектратьными методами.

В качестве примера применения спектроскопии ЯМР в качестве вспомогательного метода при исследовании строения продуктов биотрансформации можно привести изучение метаболизма оригинальных антидепрессантов пиразидол, тетриндол и инказан. Было установлено, что метаболизм пиразидола протекает по двум главным направлениям: дегидрированию пиперазинового цикла и окислению метальной группы до карбоксильной. В случае тетриндола, основным направлением биотрансформации было гидроксилирование цикло-гексильного фрагмента с последующим его дегидрированием до циклогексадие-новых производных. Процессы дегидрирования были доминирующими и в метаболизме инказана. Во всех случаях, информация, полученная из спектров ЯМР-'Н, вносила свой вклад в определение структуры метаболитов. Строение тетрациклических антидепрессантов и их аналогов было также детально изучено с помощью спектроскопии ЯМР-13С. Однако для выделения продуктов метаболизма использовались методы хроматографии, а для первоначальной оценки структуры - методы масс-спектрометрии1. Указанные методы не могли быть использованы при изучении биотрансформации производных диспиротрипиперазиния, ввиду особенностей строения и физических свойств последних. Учитывая это обстоятельство, нами был разработан подход, основанный на применении только методов спектроскопии ЯМР. Продукты биотрансформации противоопухолевых препаратов диспиротрипиперазиниевого ряда выделяли из биологических жидкостей путем их осаждения ацетоном. Этот метод не исключает потери продуктов глубокой деструкции, однако, было показано, что производные диспиротрипиперазиния выделяются количественно. Строение продуктов выведения препаратов и их количественное соотношение было установлено на основании анализа спектров ЯМР-'Н. Эксперименты проводили на беспородных крысах-самцах весом 120-140 г, у которых через определенные интервалы времени собирали мочу, поскольку ранее радиоизотопными методами было показано, что этим путем выводится основное количество от введенной дозы препаратов. Препараты вводили внутривенно в виде водных растворов в количестве от 30 до 300 мг/кг.2

Продуктом выведения спиразидина 1 был только сам препарат, его максимальное количество выводится за период от 1 до 2 часов с момента внутривенной инъекции. Несмотря на высокую реакционную способность препарата, его концентрация в

1 Масс-спектрометрическое исследование выполнено канд. хим. наук О.С.Анисимовой и ее сотрудниками.

2 Опыты с экспериментальными животными проводились канд. биол. наук Ж.Ф.Пресновой л» н,с— пиразидол

N ЫН'НС! тетриндол

N МСН.-НС1 организме поддерживается на высоком уровне в течение 3-4 часов, чего нельзя было предполагать a priori. Через 6 часов обнаруживаются лишь следы препарата.

Существенно отличается от 1 динамика выведения проспидина 2. Максимальная концентрация препарата в моче достигается уже через 15 мин после внутривенной инъекции. Однако далее его количество уменьшается со скоростью значительно меньшей, чем в случае 1 (рис 1 А) и даже через 24 ч обнаруживаются следы препарата.

После инъекции раствора 3, кроме неизмененного препарата наблюдается также выведение двух его метаболитов - 21 и 22. Максимальное количество 3, 21 и 22 выводится за период от 1 до 2 часов с момента инъекции (рис. 1В). Далее их количество быстро уменьшается, и через 8 ч обнаруживаются лишь следы производных диспиротрипи-перазиния. Суммарное количество спиробромина и его метаболитов, обнаруженное за 7 часов с момента инъекции составляет 50-60%. Интересно, что относительное содержание метаболита 21 среди продуктов выведения оказывается ниже рассчитанного исходя из скорости превращения 3 —> 21 в физиологических условиях. Причиной данного расхождения является, по-видимому, связывание 21 с белками крови и тканей, как это предполагалось выше (раздел 1.1). Была также изучена динамика выведения и метаболизм 3, введенного перорально в виде суспензии в масле. Пути метаболизма в обоих случаях были одинаковы, однако, препарат и его метаболиты выводятся из организма более равномерно в течение длительного времени (до 48 часов), при этом максимум концентрации наблюдается в интервале от 4 до 7 часов. Характер выведения циклоспирина 4 был, в целом, близок к 3. Так, после внутривен

Среди продуктов выведения 1 обнаружены 13 и 17.

01234бе78 24 0123456 7 8 2А Время ч Время, ч

Рис, 1. Динамика выведения проспидина (А), спиробромина (В) и их метаболитов с мочой крыс после внутривенной инъекции в дозе 300 мг/кг. Суммарная доза при введении 2-1.0 ммоль, 3 - 0,9 ммоль. ной инъекции препарат довольно быстро выводится из организма, и уже через 0.5 ч обнаруживается его значительное количество в моче. Максимум приходится на 2 ч и далее его концентрация быстро падает, так что через б ч он обнаруживается лишь в следовых количествах. Неизмененный препарат был основным продуктом выведения. Метаболит 18 выводится в интервале от 2 до 3 ч в количестве до 10% от 4.

Таким образом, спектроскопия ЯМР была успешно применена для решения вопросов метаболизма препаратов и установления динамики их выведения из организма. Полученные результаты были далее использованы при разработке оптимальных схем введения препаратов и создания новых лекарственных форм.

2. Методы ЯМР высокого разрешения в изучении взаимодействия препарат -биомолекула.

Взаимодействие биологически активного соединения со своей мишенью, которой может быть биомолекула белковой природы (рецептор или фермент) или нуклеиновая кислота (ДНК или РНК), является ключевой стадией воздействия лекарственного препарата на организм. При этом действующим началом может быть либо сам препарат, либо один из продуктов его бцотрансформации. Установление характера взаимодействия препарата с биомишенью на молекулярном уровне является основой рационального поиска новых, более эффективных лекарственных соединений.

В настоящей работе были изучены две группы лекарственных соединений: оригинальные противоопухолевые препараты диспиротрипиперазиниевого ряда (раздел 2,1) и ингибиторы дигидрофолатредуктазы (раздел 2.2). Для первой группы соединений ранее не был известен молекулярный механизм действия, и результатом настоящей работы явилось установление алкилирующиих свойств у этих препаратов. При этом изучались реакции коватентного и, следовательно, необратимого их связывания с потенциальными мишенями. Для второй группы препаратов была известна мишень их действия - фермент дигидрофолатредуктаза, с которым они образуют комплекс, связываясь обратимо. В этом случае предстояло установить те факторы, которые определяют специфичность взаимодействия препарата с ферментом. Таким образом, проведенное исследование охватывает широкий спектр возможных механизмов биологического действия препаратов и, как следствие, подходов к его изучению.

2.1. Ковалентное связывание препарат - биомолекула. Взаимодействие препаратов - производных диспиротрипиперазиния с компонентами нуклеиновых кислот.

Результаты изучения превращений препаратов 1 - 4 в физиологических условиях позволяли предполагать наличие у них алкилирующих свойств. ДНК и РНК являются важнейшими мишенями действия большинства алкилирующих агентов, поэтому в рамках изучения молекулярного механизма действия 1-4 были исследованы взаимодействия препаратов с нуклеиновыми кислотами и их компонентами. Надежные результаты исследования строения образующихся продуктов и реакционной способности как препаратов, так и нуклеофильных центров нуклеиновых кислот могли быть получены только при постепенном усложнении моделей биологических субстратов. Поэтому первоначально были изучены реакции 1 - 4 с нуклеозидами, далее - с нук-леотидами, и, наконец, с РНК.

Взаимодействие 1 - 4 и 21 с нуклеозидами - гуанозином 27, аденозином 28 и ци-тидином 29 были изучены в среде ДМСО - БгО (1:1).

Установлено, что взаимодействие 1 - 4 с гуанозином 27 приводит к образованию продукта алкилирования в положение N7. При этом наблюдается характерный сдвиг сигнала С5 в спектре ЯМР-13С на~9 м.д. в сильное поле и исчезает сигнал Не в спектре ЯМР-'Н вследствие дейтерообмена, что характерно для 7-алкильных производных гуанозина. Наблюдается также сдвиг сигнала Нг на -0.2 м.д. в слабое поле и существенное уменьшение величины КССВ ^(НрДгО (от 6.5 Гц до 3.5 - З.б Гц), что обусловлено изменением конформаци

Таблица 2. Константы скоростей (х 104 М' с", ± 15%) онного состояния рибозного цикла. реакций взаимодействия 1 - 4 и 18 с нуклеозидами

Аденозин 28 взаимодействует с 1 и ПРИ 65°С в сРед£ ДМСО^О (1 = 1)-2, образуя продукт замещения в положение N1. В спектрах ЯМР-'3С при этом сигналы С2 и С4 смещаются более чем на 1 м.д. в сильное поле, а в спектрах ЯМР-'Н сигналы Нг и Нз смещаются на 0.2 - 0.3 м.д. в слабое поле. Взаимодействия спи

Алкилирующий агент

Нуклеозид

1 2 3 4

Гуанозин 27 17 5 1.3 1.5

Цитидин 29 1.3 0.5 0.2 0.3

Аденозин 28 0.5 0.2 - робромина 3, продукта его дегидробромирования 21, карбоспирина 4 и интермедиата его превращений 18 с аденозином не обнаружено. Цитидин 29 взаимодействует с 1 - 4 и 18, при этом центром его алкилирования является N3. Об этом свидетельствует сдвиг сигналов протонов Н5 и Н6 на ~ 0.2 - 0.3 м.д. в слабое поле в продуктах реакции. Реакционная способность нуклеозидов в реакциях с 1 - 4 убывает в ряду: гуанозин > цитидин > аденозин (см табл. 2).

При переходе к нуклеотидам появляется дополнительный центр связывания 1, 2 и 4 - первичная фосфатная группа, поскольку, как отмечалось выше, указанные соединения обладают сравнительно высокой алкилирующей способностью по отношению к органическим фосфатам. При взаимодействии 1 с 5'-ГМФ и 5'-АМФ в обоих случаях наблюдается образование трех продуктов реакции: продукта алкилирования азотистого основания (в положение N7 гуанильного или N1 аденильного остатков), продукта этерификации фосфатной группы и продукта алкилирования нуклеотида двумя молекулами препарата по обоим нуклеофильным центрам. Указанные продукты образуются приблизительно в равных количествах при взаимодействии 1 с 5'-ГМФ: после 3 часов реакции при 37°С около 30% гуанильных остатков и около 20% фосфатных групп связываются с препаратом. Реакционная способность аденильного остатка значительно уступает реакционной способности первичных фосфатных групп, но превосходит таковую для вторичных фосфатов, что было установлено при изучении взаимодействия препаратов с 2',3-цАМФ. Характер взаимодействия 4 в целом аналогичен 1, за исключением существенно меньшей реакционной способности данного препарата.

Наиболее интересный характер реакции наблюдается при взаимодействии про-спидина 2 с 5'-ГМФ (схема 6). В этом случае образуются два продукта реакции: ди-эфир фосфорной кислоты 30 и продукт алкилирования азотистого основания в положение N7 (диастереомеры 31а и 31Ь). В то же время не наблюдается образования продукта алкилирования двух нуклеофильных центров нуклеотида одновременно. Строение продуктов реакции и их количественный состав определены на основании анализа спектров ЯМР-13С, 'Н и Установлено, что между положительно заряженным диспиротрипиперазиниевым остатком проспидина и анионом фосфатной группой нуклеотида возникает прочное кулоновское взаимодействие. Об этом свидетельствует ряд экспериментальных фактов. Так, константа ионизации первичной фосфатной группы продуктов реакции 31а и 31Ь уменьшается на 0.4 - 0.5 (рК85"гмф = 6.25; рКа31 = 5.85 и 5.75), что свидетельствует об экранировании фосфатной группы в 31. Диастереомеры 31а и 31Ь существуют исключительно в анти-конформации, с существенно меньшей конформационной подвижностью гуанильного остатка по сравнению с 5'-ГМФ. Кроме того, диастереомерии не наблюдается для продукта взаимодействия 2 с гуанозином, несмотря на то, что хиральные центры в нем те же, что и в 31. В продукте алкилирования гуанозина остаток проспидина имеет достаточно высокую подвижность, о чем свидетельствуют, в частности результаты измерения времен спин-решеточной релаксации, а в 31 он фиксирован вдоль молекулы нуклеотида и диасте-реомерия при этом сводится к различию в ориентации гидроксильной группы остатка проспидина по отношению к рибозному циклу нуклеотида.

Схема 6. Взаимодействие проспидина с 5'-ГМФ.

2 + 5'-ГМФ

Показано, что кулоновское взаимодействие между фосфатной группой ГМФ и аммониевым центром проспидина предшествует акту алкилирования азотистого основания. Это следует из анализа количественного соотношения продуктов 30 и 31 реакции 2 с 5-ГМФ, проведенной при нескольких температурах: если при 85°С соотношение продуктов [31]/[30] = 1.4, то при 37°С оно достигает уже 5.3. Это обусловлено разницей в энтальпии (АДН^.] =25.1 ± 0.8 кДж/моль) и энтропии (ДД8*г-1 = 69.9 ± 2.5 кДж/молЬ'Град) между переходными состояниями реакций 2 31 и 2 30. Совокупность полученных данных свидетельствует о большей упорядоченности и ббльшей энергетической стабильности переходного состояния реакции алкилирования ГМФ по N7 по сравнению с переходным состоянием реакции алкилирования фосфатной группы. Следовательно, фиксация двух взаимодействующих молекул - препарата и его мишени - играет важную роль в механизме алкилирующего действия проспидина, определяя селективность действия препарата.

Суммируя полученные результаты, можно представить ряд изменения реакционной способности нуклеофильных группировок, входящих в состав ДНК и РНК по отношению к 1 - 4, из которого следует, что наиболее вероятными центрами связывания препаратов с нуклеиновыми кислотами являются гуанильные остатки: первичная вторичная

N7 (О) > фосфатная > N3 (С) > N, (А) » фосфатная , U, Т группа группа

Изучение взаимодействия 1 - 4 с полиуридиловой кислотой, являющейся моделью одноцепочечной ДНК и РНК, показало, что препараты не обладают заметной ал-килирующей способностью по отношению к межнуклеозидным фосфатным группам полимера. Изучение растворов ДНК методом ЯМР не представлялось возможным ввиду их высокой вязкости. Поэтому, было изучено взаимодействие 1 - 4 с дрожжевой РНК. В спектре ЯМР-1 "'С сигналы С5 гуанильных остатков (116,5 м.д.) лежат в относительно свободной области спектра, и хорошо наблюдается их сдвиг на ~ 8.5 м.д. в сильное поле при модификации гуанина в положение N7. Из анализа интенсивностей указанных сигналов следует, что при взаимодействии 1 с РНК уже через 1.5 ч при 37°С около 30% гуанильных остатков связываются с препаратом. Алкилирующая способность 2, как и следовало ожидать, ниже, однако и в этом случае через 5 ч реакции, проведенной при 37°С, около 15% гуанильных остатков взаимодействуют с препаратом. Взаимодействия 3 и 4 с РНК в описанных условиях не наблюдается.

Таким образом, установлено, что 1 и 2 взаимодействуют с нуклеиновыми кислотами в условиях, близких к физиологическим, алкилируя гуанильные остатки в положение N7. Скорость этой реакции при 37°С достаточно высока для проявления биологических свойств исследованных препаратов.

2.2. Обратимое связывание препарат - биомолекула. Взаимодействие препаратов -антагонистов фолиевой кислоты с дигидрофолатредуктазой.

Одной из фундаментальных задач биохимии и молекулярной фармакологии является установление факторов, контролирующих специфичность связывания лиганда с его мишенью. Высокоспецифичное связывание является молекулярной основой протекания большинства биохимических процессов. Многие лекарственные препараты также воздействуют на рецепторные или ферментные системы клетки посредством высокоспецифичного связывания с ними. Хорошей моделью для изучения процессов связывания лигандов с белками служит фермент дигидрофолатредукта-за (ДГФР), имеющая два центра связывания (субстрата и кофермента) и представляющая большой интерес в медицинской химии как мишень действия ряда лекарственных препаратов.

Дигидрофолатредуктаза (ДГФР) катализирует восстановление 7,8-дигидрофо-лата 32 до 5,6,7,8-тетрагидрофолата 33; используя НАДФ-Н в качестве кофермента:

9 J'';G

COO"

H,N N N' НАДФ-Н -► ^ - " + НАДФ*

ДГФ, 32 ТГФ, 33

Продукт этой реакции, тетрагидрофолат 33, участвует в ряде внутриклеточных процессов, включая биосинтез пуринов, пиримидинов и некоторых аминокислот. Нарушение работы каталитической системы ДГФР приводит к нарушению процесса деления клетки и дальнейшей ее гибели. Вследствие своей важной биохимической роли, фермент представляет собой отличную мишень для действия лекарственных средств. Такие препараты должны селективно ингибировать ДГФР паразитических или злокачественных клеток. В ряду найденных к настоящему моменту антифолатных препаратов находятся такие высокоэффективные и широко применяемые в лекарственной практике лекарственные средства, как антибактериальный препарат триметоприм, противоопухолевые препараты метотрексат, триметрексат, противомалярийный препарат хлороидин и другие. Их эффективность и токсические свойства определяются высокой специфичностью связывания с ДГФР клеток, являющихся мишенью их действия, в сравнении с ферментом нормальных клеток организма. Следует отметить, что во всех случаях антифолатные препараты конкурируют за место связывания с субстратом фермента - дигидрофолатом, поэтому только тонкие различия в структуре, например, человеческой и бактериальной форм фермента определяют селективность связывания препарата с одной из форм. Вследствие этого, данная система является отличной моделью для изучения структурных и динамических факторов, контролирующих специфичность связывания лиганда с белком,

2.2.1. Структура высокого разрешения в растворе бинарных комплексов Lactobacillus casei дигидрофолатредуктазы с противоопухолевыми препаратами метотрексат и триметрексат.

Быстро пролиферирующие опухолевые клетки требуют активной работы ферментов, участвующих в биосинтезе ДНК. Ингибирование ДГФР вызывает значительное снижение пула ТГФ, вызванную этим остановку синтеза (1ТМФ и пуриновых оснований, и как следствие, прекращение деления клеток. Этот механизм лежит в основе антибластического действия препаратов - антагонистов фолиевой кислоты. Эффективность действия таких препаратов зависит, в основном, от двух факторов - специфичности их связывания с ДГФР и механизмом проникновения препаратов в раковую клетку. Метотрексат (MTX) 34 - один из важнейших противоопухолевых препаратов, используемых в настоящее время в медицинской практике - обладает чрезвычайно высоким сродством к ДГФР (константа связывания Ка с Lactobacillus casei ДГФР ~ 2x109 М'1). Однако MTX проникает в клетку посредством активного транспорта, используемого для доставки фолатов и лейковорина (5-формил-5,6,7,8-тетрагидрофолиевой кислоты), что определяет возможность возникновения клеточной устойчивости к действию MTX.

О СОО"

NH, ГП N ^ СОО"

N. J> Н N

Л Л^ сн,

H2N N" N

МТХ, 34

В новом антифолатном препарате триметрексат (ТМТХ) 35 остаток глутамино-вой кислоты отсутствует, что с одной стороны уменьшает его сродство к ДГФР (Ка для Lactobacillus casei ДГФР ~ 2x10s М"'), а с другой стороны наделяет этот препарат липофильными свойствами, и, следовательно, для его проникновения в клетку уже не требуется активного транспорта. Это обуславливает то, что ТМТХ проявляет активность и в отношении клеток, резистентных к действию МТХ. В последние годы установлена антибактериальная активность ТМТХ при его совместном введении с лейко-ворином, что определило его использование при лечении пневмонии (Pneumocystis carinii) у ВИЧ-инфицированных.

В связи с тем, что оба препарата прочно связываются с ДГФР и в то же время существенно отличаются по своему строению, представлялось важным определить строение бинарных комплексов и установить те взаимодействия, которые определяют специфичность связывания препарата с ферментом.

Фермент Lactobacillus casei ДГФР состоит из 162 а.о., имеет сравнительно небольшую молекулярную массу ( -18300 Да) и хорошо растворим в воде, поэтому представлялось возможным провести структурные исследования методом ЯМР высокого разрешения. Для исследований были использованы как немеченый белок, так и белок, содержащий -100% изотопов 3>1 и 13С/15К Серии 20, ЗЭ и 40 спектров ЯМР (КОЕЭУ, ТОСЭУ, Н>ШВ, НИНА и т.д.) были измерены для обоих бинарных комплексов, на их основе проведено полное отнесение сигналов 'Н, 15И и 13С и определены экспериментальные параметры, используемые для расчета структуры. К ним относятся ядерные эффекты Оверхаузера (ЯЭО), константы спин-спинового взаимодействия, химические сдвиги *Н и времена релаксации ядер 13М.

Таблица 3. Статистические данные рассчитанных структур комплексов Lactobacillus casei ДГФР и полипептида pNR-2/pS22>.

ДГФР-МТХ ДГФР-ТМТХ ДГФР-ТМП-НАДФ-Н ДГФР- ТМП0 PNR-2/pS22'

Число экспериментальных ограничений ЯЭО Водородные связи Диэдральные углы Диполярные константы 2531 48 364 2214 72 345 • 2417 72 343 152 2286 58 342 623 8 137

Число структур в семействе 21 22 25 23 19

Среднеквадратичное отклонение (А) координат атомов белкового хребта (С, С", N) / всех тяжелых атомов 0.46 ± 0.07 / 0.82 + 0.05 0.50 ± 0.07 / 1,0810.11 0.45 ±0.12/ 0.96 ±0.13 0.63 ±0.18/ 1.14 ±0.23 0.59 ±0.19/ 1.24 + 0.19 а.о. белка, находящихся в наиболее вероятной области карты Рамачандрана 78.0 79.4 86.3 82.2 83.0

Код структуры в банке данных белковых структур (Brookhaven protein databank). 1А08 1BZF 3) - 1PS2 Расчет структуры ДГФР-ТМП не закончен, предполагается включение диполярных констант на завершающей стадии.2) См. раздел 3.2 о белке рЖ-2/р823) подготавливается к депонированию.

Расчет структур проводился методами дистанционной геометрии и молекулярной динамики с наложенными ограничениями, и полученные результаты соответствуют структурам ЯМР высокого разрешения (табл. 3).

Антифолатные препараты занимают центральную полость фермента, используемую для связывания субстрата. Ключевым взаимодействием, определяющим связывание препаратов с активным центром ДГФР, является кулоновское взаимодействие между положительно заряженным гетероциклическим фрагментом, протонированным по положению Ni, и отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка аспараги-новой кислоты Asp 26. Важную роль в связывании препаратов играет также гидрофобное взаимодействие (рис. 2) и кулоновское взаимодействие между отрицательно заряженными карбоксильными группами глутаминового остатка метотрексата и двумя положительно заряженными аминокислотными остатками - His 28 и Arg 57. Все указанные кулоновские взаимодействия были детально изучены методами ЯМР и квантовой химии (см. раздел 2.2.3).

Рис. 2 Структура Lactobacillus casei ДГФР. А. Топология белка в его комплексе с метотрексатом. Латинскими буквами обозначены 3-лксты (A-G) и сс-спирали (В, С, Е и F). В, Препараты метотрексат и три-метрексат в активном центре фермента и положение боковых остатков белка, участвующих в образовании гидрофобных контактов. Структуры ДГ'ФР-ТМТХ и ДГФР-МТХ суперимлозированы по белковому остову. Более темный цвет аминокислотных остатков соответствует комплексу ДГФР-МТХ. Шарами обозначены метильные группы.

Гидрофобные контакты были определены из величин ЯЭО между протонами препаратов и липофильных аминокислотных остатков. Важная информация об энергии гидрофобных взаимодействий была также получена из анализа динамических характеристик процесса переворота гриметоксафенильного остатка триметраксата. Измерение скоростей переворота в диапазоне температур от 27&К до 313К. выполненное методами динамического ЯМР, позволило вычислить энергетические параметры процесса: ДН'- 62 ±2 кДж/моль, AS*= -5 ± 10 ,;Дж/мольтрад. Сравнивая эти величины с аналогичными значениями, полученными ранее для переворота фенилы-юго остатка метотрексата (ДН1= 48 кДж/моль, 4S~= -15 Дж/мольтрад) можно заметить, что энтальпия переходного состояния для триметрексата выше на -14 кДж/моль. Существует два вклада в ДН*: внутренний барьер вращения вокруг связи Кю-С и дополнительный барьер, который обусловлен взаимодействием фенильиого цикла с окружающими аминокислотными остатками. Внутренний барьер вращения фенильного цикла для триметрексата, согласно литературным данным, не может быть выше такового для метотрексата. Поэтому, энергия гидрофобных взаимодействий между триметоксифенильным циклом триметрексата и ДГФР, которые нарушаются при перевороте цикла, равна как минимум 14 кДж/моль. Указанные гидрофобные контакты в случае триметрексата частично компенсируют потерю двух кулоновских взаимодействий, играющих важную роль в связывании молекулы метотрексата. Интересно отметить, что ориентация боковых цепей аминокислотных остатков (углы xi и хг), участвующих в гидрофобных взаимодействиях, и даже их пространственное положение не изменяются существенным образом при переходе от одного комплекса к другому. Фермент сохраняет свою пространственную структуру при связывании с тем или иным лигандом, лишь немного адаптируя центр связывания к его структуре.

Методом ЯМР было изучено конкурентное связывание препаратов 34, 35 и три-метоприма 36 с L.casei ДГФР и определена константа связывания Ка триметрексата (~ 2х10"8 М"1), исходя из известных в литературе данных для метотрексата (2х1(Г9 М"1) и триметоприма (2х10"7 М"1). Сравнение структур бинарных комплексов ДГФР-МТХ, ДГФР-ТМТХ и ДГФР-ТМП (см. также разделы 2.2.2.1 и 3.1) позволило установить причины уменьшения констант связывания препаратов с ДГФР в указанном ряду. Так, при переходе от MTX к ТМТХ потеря двух электростатических взаимодействий лишь частично компенсируется улучшенным гидрофобным контактом ТМТХ. При переходе к ТМП гидрофобное взаимодействие с аминокислотными остатками белка становится еще более слабьм. Оно возрастает лишь в тройном комплексе ДГФР-ТМП-НАДФ-Н.

2.2.2. Связывание антибактериального препарата триметоприм с бактериальной дигидрофолатредуктазой.

Эффективность действия триметоприма (ТМП, 36), как антибактериального препарата, определяется тем, что он связывается с бактериальной ДГФР как минимум в 3000 раз прочнее, чем с человеческой ДГФР. Значительная доля в уменьшении способности ТМП связываться с человеческой ДГФР обусловnh2

53~.чт2^ г.ОСНз лена потерей кооперативных эффектов, которые наблюда- ^^ N н ОСНз + U ются при связывании препарата и НАДФ-Н с бактериаль- h2N N s\ ОСН3 ным ферментом. Природа указанных кооперативных эффек

ТМП, 36 тов до настоящего времени оставалась невыясненной, и ее установление являлось важной задачей, необходимой для понимания факторов, контролирующих селективность связывания ингибитора с ферментом. С целью определения природы кооперативных эффектов связывания была получена детальная информация о структуре и динамических свойствах в растворе ряда комплексов L.casei

ДГФР с ТМП и коферментом. Полученные результаты позволили искать ответы на следующие вопросы:

• каковы различия в структуре комплексов ТМП с бактериальной и человеческой формами фермента, и как они могут быть соотнесены с различной специфичностью связывания препарата? Ответ на данный вопрос требует получения структурной информации о комплексах, образованных человеческой формой ДГФР - работа в этом направлении проводится в настоящее время;

• какова природа кооперативного эффекта в связывании ТМП и НАДФ-Н с бактериальной формой ДГФР? Объясняется ли данный кооперативный эффект связывания лишь чисто структурными факторами, или его природа включает также различия в динамических свойствах указанных комплексов?

• каким образом молекулярные движения в образованных комплексах влияют на прочность специфических взаимодействий мржду ТМП, коферментом и дигидрофолатредуктазой?

Ответы на поставленные вопросы важны не только для установления причин высокой селективности действия триметоприма, что необходимо для поиска новых ан-тифолатных препаратов, но и для понимания природы связывания других ингибиторов с мишенями их действия, что имеет более фундаментальное значение.

2,2.2.1. Структура комплексов ¿.сазе: ДГФР с триметопримом и коферментом НАДФ-Н.'

Структуры высокого разрешения для бинарного комплекса ДГФР-ТМП и тройного комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ-Н были получены методом ЯМР и молекулярной динамики с наложенными ограничениями, аналогично тому, как это было сделано для комплексов с метотрексатом и триметрексатом (см. раздел 2.2.1).

Для достижения наилучшего качества и достоверности при расчете структур стандартно используемые экспериментальные ограничения (ЯЭО, торсионные углы и водородные связи) были дополнены химическими сдвигами метальных протонов и остаточными диполярными константами ^('^-'Н), измеренными в среде, частично ориентированной в магнитном поле. Диполярные константы оказались исключительно полезными экспериментальными параметрами, поскольку они характеризуют ориентацию амидных связей ЫН относительно внешнего магнитного поля и, следовательно, несут не локальную (как в случае с ЯЭО - взаимное расположение двух ядер), а глобальную информацию о структуре. Диполярные константы были измерены в разбавленных (-5%) растворах липидных бицелл, образованных при гидрофобном взаимодействии димиризтоилфосфатидилхолина ФМРС) с дигексоноилфосфатидилхолином (ОНРС) в молярном отношении 3:1. Образованные бицеллы обладают диамагнитными свойствами жидких кристаллов, что и обуславливает частичную ориентацию (около 0.! %) молекул растворенного белка.

В табл. 3 (стр. 22) приведены статистические данные об основных экспериментальных параметрах и качестве рассчитанных структур ДГФР-ТМП и ДГФР-ТМПструктуры центра связывания кофермента при переходе от бинарного комплекса, в котором эта область белка не занята, к тройному комплексу. Таким образом, фермент оказывается оптимизирован по структуре к связываемым лигандам и не тратит дополнительной энергии на структурную адаптацию, что согласуется с выводами, сформулированными выше (см. разд. 2.2.1).

Положение обоих лигандов (ТМП и НАДФ-Н) в структуре комплекса хорошо определено и позволяет установить основные взаимодействия, обеспечивающие их прочное связывание с ферментом (рис. 3). Так, для НАДФ-Н наиболее характерными взаимодействиями оказываются водородные связи и кулоновские взаимодействия, включающие фосфатные группы. Наибольшее их количество обнаружено для адени-нового фрагмента НАДФ-Н и мостикового пирофосфатного остатка. Так. 5'-Р(М) группа образует прочные водородные связи с амидными протонами остатков А1а-100,

Рис. 3 Семейство 25 структур ЯМР тройного комплекса Ь.саэе) ДГФР с антибактериальным препаратом триметоприм и кофермен-том НАДФ-Н.

НАДФ-Н, Из таблицы видно, что структуры, рассчитанные при использовании ди-полярных констант, отличает высокое качество: более 85% аминокислотных остатков попадают в наиболее благоприятную область карты Рамачандрана. На рис. 3 показано семейство 25 структур ЯМР тройного комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ-Н. Структура белка в целом близка таковой в бинарных комплексах с метотрексатом и триметрексатом. Это позволяет сделать два вывода: (1) изменение структуры лиганда не вызывает значительного изменения структуры центра связывания белка; (2) не наблюдается существенного изменения

01п-Ю1 и частично Не-102 (рис. 4А). Указанные остатки принадлежат а-спирали и, образуя выгодную геометрию для связывания с фосфатной группой, оказываются относительно малоподвижными. Это обеспечивает низкую энтропию системы в свободном ферменте и, как следствие, высокую энергию связывания. Указанный центр связывания оказывается столь выгодно организован, что и в отсутствии кофермента, в бинарном комплексе ДГФР-ТМП, он занят группой неорганического фосфата из буферного раствора.

Рис. 4 НАДФ-Н и триметоприм в центрах их связывания с IасюЬасШиз са$е1 ДГФР. (А) Центр связывания аденинового фрагмента НАДФ-Н; (В) положение никотинамидного фрагмента НАДФ-Н; (С) центр связывания ТМП.

Для молекулы препарата наиболее важными являются взаимодействие с карбоксильной группой Азр-26 и гидрофобные контакты между триметоксифенидьным фрагментом и окружающими его аминокислотными остатками. ТМП имеет также прямой гидрофобный контакт с никотинамидной группой кофермента. что представляется исключительно важным для понимания природы кооперативного эффекта связывания двух лигандов. Такое гидрофобное взаимодействие может отсутствовать в комплексе с человеческой формой фермента (расчет структуры последнего проводится в настоящее время). Маловероятно, однако, что его энергия достаточна для почти 3000-кратного увеличения константы связывания препарата с бактериальным ферментом. В этой связи, представлялось необходимым более широко изучить свойства комплексов ТМП с ДГФР с целью поиска факторов, контролирующих специфичность связывания препарата. Так, были изучены динамические свойства как препарата, так и белка в ряде комплексов, и характер специфических взаимодействий между препаратом и аминокислотными остатками центра связывания фермента.

2.2.2.2. Подвижность триметоприма в его комплексах с ¿.сше/ ДГФР.

Информация о динамических процессах вносит важный вклад в понимание функций макромолекулярных систем. Представляется, что наиболее важны с функциональной точки зрения медленные процессы (со скоростями от 10° до 104 сек"1). В комплексах белок-лиганд такие процессы могут быть связаны либо с переходом из одного конформационного состояния в другое, либо с переходом между идентичными состояниями при заторможенном вращении молекулярного фрагмента вокруг кова-лентной связи. В обоих случаях кинетические и термодинамические аспекты указанных процессов несут информацию о возбужденных состояниях комплекса, которая важна для понимания особенностей функционирования ферментных систем.

Спектроскопия ЯМР предоставляет уникальные возможности для исследования динамических свойств молекул в широком диапазоне временной шкалы. Для изучения быстрых движений (со временем корреляции от пико- до наносекунд) используют релаксационные методы (см. раздел 2.2.2.3), а для изучения более медленных движений (от мсек до долей секунд) используют анализ формы линии ЯМР и измерение скоростей переноса намагниченности. Эти подходы были применены для изучения движения триметоприма в ряде его комплексов с ДГФР. С этой целью был использован триметоприм, меченый 13С по 3',5'-метокси-группам. В свободном ТМП обе метокси-группы эквивалентны, однако, в комплексе с ДГФР они становятся магнитно-неэквивалентными, вследствие различия в их окружении (рис. 4С), и при соответствующих температурах наблюдаются как два раздельных сигнала. Повышение температуры приводит к их коалесценции, вследствие ускорения процесса 'ring-flipping'. Энергетические параметры процесса были получены путем анализа формы линии в 1D спектрах 1Н-13С HSQC (рис. 5), а также расчета скоростей переноса намагниченности в спектрах zz-HSQC. При этом спектры zz-HSQC позволяют измерять

Рис. 5. Экспериментальный и рассчитанный спектры ЯМР Ш '^'Н-Нвдс |3С-ТМП в комплексе с Ь.сазе1 ДГФР и НАДФТ. Рассчитанные спектры получены при оптимизации параметров (ДН* и ДБ'), При 318К в спектре обнаруживается небольшое количество сигнала свободного ЬС-ТМП (*), образуемого вследствие частичной денатурации белка. Сигналы при 3.25 и 3.49 м.д. соответствуют форме I (см. текст), а сигналы при 3.32 и 3.75 принадлежат форме И. скорость переноса намагниченности в тех случаях, когда не удается наблюдать коа-лесценции сигналов.

В ряду изученных комплексов (табл. 4) были бинарный ДГФР-ТМП и тройные комплексы ДГФР-ТМП-PADPR, ДГФР-ТМП-НАДФ-Н и ДГФР-ТМП-НАДФ+ (PADPR - аналог НАДФ, в котором никотинамидный фрагмент замещен на оксиметильную группу). Комплекс с НАДФТ состоит из равного количества двух форм (I и II), находящихся в медленном равновесии друг с другом. Форма I (in) соответствует структуре, в которой никотинамидный фрагмент находится внутри белка, а в форме II (out) он располагается на поверхности фермента, в удалении от препарата.

Установлено, что присутствие никотинамидного фрагмента вблизи препарата резко замедляет скорость процесса переворота метоксифенильного цикла (табл. 4). Комплексы с аналогами кофермента, в которых либо отсутствует никотинамидный фрагмент (PADPR), либо он расположен в удалении от препарата (форма П комплекса с НАДФ'*) обнаруживают скорости указанного процесса, сравнимые с бинарным комплексом.

Табл. 4. Скорости и термодинамические параметры процесса переворота триметоксифениль-ного цикла триметоприма в его комплексах с ¿со^ег ДГФР и относительные константы связывания ТМП.

Комплекс скорость (сек'1) при 278К ДН® (кДж/моль) TAS1 (кДж/моль)а Кь

ДГФР-ГМПе 119 ±20 63 ± 1 8+1 1

ДГФР-ТМП-PADPR0 68 ± 10 64 ±1 8± 1 4.7

ДГФР-ТМП-НАДФ-Н11 0.9 ±0,5 81 ±5 15 ±2 135

ДГФР-ТМП-НАДФ*(оШ)с 23 ±5 71 ±3 13 ±2 5

ДГФР-ТМП-НАДФ*(т)" 1.9 ±0.5 109 ±5 45 ±3 0.8

8 Измерено при 298К; ь К - отношение константы связывания в тройном комплексе в сравнении с бинарным ДГФР-ТМП, для которого константа связывания триметоприма равна 2.0x107 моль'1; с определено из анализа формы линии в Ш спектре !Н-|3С Н8С.)С; А измерено методом 20 77-1 спектроскопии.

В то же время, скорость переворота существенно ниже в комплексе ДГФР-ТМП-НАДФ-Н и в форме I комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ+. В обоих случаях никотинамидный фрагмент находится в непосредственной близости с препаратом, и замедление скорости, на первый взгляд, очевидно. Однако характер замедления обменного процесса в двух названных случаях оказывается различным. Если определяющим фактором для формы I комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ+ является высокая энтальпия активации (табл. 4), то для комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ-Н повышение энтальпии не столь значительно, и важным фактором оказывается небольшая энтропия переходного состояния.

Высокая энтальпия активации процесса свидетельствует о том, что значительное число электростатических и гидрофобных взаимодействий должны быть разорваны и/или серьезные стерические и конформационные проблемы должны быть преодолены на его пути. Высокая энтропия переходного состояния для комплекса с НАДФ указывает на его меньшую упорядоченность по сравнению с НАДФ-Н. Следовательно, существует меньшее число путей достижения переходного состояния в случае НАДФ-Н, что говорит о наличии выгодных специфических взаимодействий (прежде всего гидрофобного характера), которые поддерживаются, по крайней мере, на части траектории переворота цикла. Такие энергетически выгодные взаимодействия отсутствуют в случае комплекса с НАДФ', и достижение переходного состояния носит менее упорядоченный характер. Эти данные свидетельствуют о наличии кооперативных движений препарата и кофермента, которые могут вносить вклад и в кооперативный эффект при связывании лигандов, тем более что конформационные изменения белка, происходящие при перевороте триметоксифенильного цикла, могут быть аналогичны тем, которые протекают и при более медленных процессах ассоциации/диссоциации препарата.

Таким образом, результаты измерения скоростей относительно простого процесса переворота ароматического цикла несут ценную информацию о гораздо более сложных движениях и конформационных перегруппировках в комплексе белок-лиганд. Эта динамическая информация существенно дополняет знания о структуре комплексов и константах связывания лигандов.

2.2.2.3. Быстрые движения белковой цепи в комплексах ДГФР с ТМП и НАДФ.

Спектроскопия ЯМР является уникальным методом для изучения быстрых (от пико- до мсек) движений белковой цепи с разрешением на атомном уровне. Эксперименты по измерению гетероядерных эффектов Оверхаузера и времен спин-спиновой (Тз) и спин-решеточной (Ti) релаксации служат важным источником информации о динамических свойствах биомолекул. Нами были измерены величины ЯЭО 1"N {1Н}, Т|. Тз и Т|Р (время релаксации во вращающейся системе координат) для ряда комплексов L.casei ДГФР (с ТМТХ, ТМП, НАДФ-Н и НАДФ"), а также для апо-формы фермента. Экспериментальные данные анализировались с использованием модели Липари и Сабо, предполагающей суперимпозицию броуновского движения молекулы, как целого (со временем корреляции т„,) и более быстрых внутренних движений изучаемых связей (в нашем случае амидных связей 15К-Н). Движения связей характеризуются их амплитудой (параметр порядка в2) и частотой колебаний (время корреляции т^). Были использованы и более сложные модели, разделяющие движения связей на более быстрые (до 20 пс) и более медленные (до 200-500 пс). Во всех случаях были проанализированы возможности как изотропных, так и анизотропных движений молекул. Все указанные модели были использованы для оптимизации параметров, описывающих молекулярные движения. Критерием оптимальности было соответствие рассчитанных и экспериментальных значений времен релаксации и ЯЭО. Расчеты проводились с использованием оригинальных компьютерных программ (см. раздел 3.2), а эксперименты ЯМР были выполнены при двух значениях магнитного поля спектрометра (соответствующего резонансу ядер 'Н 500 и 600 МГц), что позволило рассчитать параметры движения более точно.

Было установлено, что все комплексы ДГФР представляют собой довольно жесткие молекулярные системы с относительно небольшими амплитудами внутренних движений (среднее значение в2 = 0.85 и его среднеквадратичное отклонение ~ 0.10). Время корреляции вращательной диффузии молекул для всех изученных комплексов лежит в пределах 8 - 9 не при 308К и 12-13 не при 288К. Вращательное движение молекул ДГФР анизотропно. Так, тензор вращения для тройного комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ-Н имеет значения компонент Вхх = (1.90 ± 0.08)х107 с"1, Иуу = (2.05 ± 0.09)х107 с1 и Ои = (2.46 ± 0.09)х107 с"1 (рис. 6). В приближении аксиальной симметрии отношение длин осей эллипсоида, описывающего вращательные движения молекулы, Г>||/Ох равно 1.25 ± 0.05 для всех изученных комплексов.

Наиболее важна информация о внутренних движениях в биомолекуле. Наименьшие значения Э2 (т.е. наибольшие амплитуды движения) наблюдаются для аминокислотных остатков, расположенных в петлевых фрагментах белка (остатки 51 -52, 65-73, 109-110, 123-125, 161-162). Участки регулярной структуры (а-спирали и |3-листы) имеют значения Э2 от 0.85 до 0.9. Времена корреляции для всех указанных

Рис. 6 Тензор диффузии молекулы комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ-Н (показаны только координаты атомов С„ белкового остова) движений лежат в пределах 20-150 пс. Быстрые молекулярные движения с описываемыми параметрами, как правило, не имеют серьезного значения для проявления биологических свойств. Единственным фактором, который может играть определенную роль, является рост энтропии (т.е. понижение энергии) тех участков белка, которые претерпевают большие амплитуды движений.

Параметры движения, полученные из анализа релаксационных измерений, находятся в хорошем соответствии с результатами расчета 1 не траектории молекулярной динамики апо-формы ДГ'ФР. Расчет проводился в присутствии 3120 молекул ШО в кубе 5x5x5 нм с использованием периодических граничных условий и силового поля CVFF. Расчет показал, что петлевые участки белка и аминокислотные остатки, находящиеся в незанятом центре связывания кофермента, 'обладают большей подвижностью. В целом, однако, белок характеризуется небольшими амплитудами движений (S~ - 0,9 для большинства аминокислотных остатков), что согласуется с данными ЯМР.

Однако наиболее интересными представляются более медленные движения, протекающие в мс шкале времени. Сигналы аминокислотных остатков, претерпевающих указанные движения, как правило, уширены, вследствие протекания химического обмена между двумя и более конформерами. Измерение времен релаксации Тг и Т|Р позволяет определить сигналы, претерпевающие конформационный обмен, а также оценить время корреляции указанного процесса.

Рис. 7 Относительные амплитуды медленных (мс) движений, полученные из анализа экспериментов по измерению времен релаксации '"К-Т; и :

Проведенное исследование показало, что наиболее конформационно мобильной системой является апо-форма ДГФР. Значительная часть аминокислотных остатков апо-ДГФР претерпевает химический обмен. Прежде всего, это а-спираль В (25-30), образующая центр связывания субстрата или ингибитора, большинство аминокислотных остатков, расположенных в центре связывания кофермента, а также остатки 1215, 56-57,110, 151-153. Переход от апо-формы к бинарному комплексу с любым ли-гандом (препарат или кофермент) резко понижает конформационную мобильность белка. При этом для бинарного комплекса ДГФР-ТМП наблюдаются движения аминокислотных остатков 56-57, а для бинарного комплекса с НАДФ-Н - движения начального участка а-спирали В (остатки 25-27, рис. 7). Переход к тройному комплексу ДГФР-ТМП-НАДФ-Н делает белок еще более конформационно жестким.

Интересно отметить, что если связывание препарата понижает конформационную мобильность близкорасположенных аминокислотных остатков (25-27), то кофермент оказывает эффект дальнего действия - остатки 56 и 57 расположены на расстоянии около 20.4 от НАДФ. При этом Arg-57 играет ключевую роль в связывании глута-минового фрагмента дигидрофолата, метотрексата и их аналогов (см. раздел 2.2.3.2). Следовательно, связывание кофермента оказывает влияние на свойства аминокислотных остатков, участвующих в связывании субстрата, т.е. происходит передача информации между лигандами без заметных структурных изменений в белке. Эти факторы могут играть роль и в возникновении кооперативных эффектов связывания лигандов.

2.2.2.4. Скорость обмена протонов на дейтерий в комплексах ДГФР.

Как было показано выше, медленные движения белка играют более важную роль в проявлении биохимических функций, по сравнению с быстрыми движениями. В случае взаимодействия фермента с ингибитором значительный интерес могут представлять также движения, протекающие в шкале времени от секунд до часов. Основным инструментом изучения указанных процессов служит измерение скоростей обмена амидных протонов белка на дейтерий. В работе были измерены скорости обмена Н —> D в комплексах ДГФР-ТМП, ДГФР-НАДФ-Н, ДГФР-НАДФ+, ДГФР-ТМП-НАДФ-Н и в апо-форме белка. Установлены места образования внутримолекулярных водородных связей и их прочность в указанных комплексах. Разрыв водородных связей сопровождает медленные сегментарные движения белка, поэтому полученная информация представляет интерес для установления характера этих движений. Кроме того, обмен протонов на дейтерий возможен только при их контакте с молекулами D2O. Конформационные переходы белка позволяют экранированным протонам вступать в контакт с растворителем. В литературе известны параметры скоростей обмена амидных протонов для всех аминокислотных остатков (km, измеренные в соответствующих трипептидах), что позволяет вычислить для каждого амидного протона в изучаемом белке так называемый защитный фактор - отношение k¡n/kobs (kobs - измеренная скорость обмена). Величина защитного фактора для структурно-экранированного амидного протона обратно пропорциональна скорости перехода закрытой конформации белка в форму, открытую для контакта группы NH с молекулами воды.

Установлено, что подвижность апо-формы ДГФР существенно выше подвижности белка в его бинарных комплексах с ТМП и коферментом. Практически все NH протоны белка, кроме тех, которые принадлежат центральным фрагментам р-листов, быстро обмениваются на дейтерий. В тоже время, подвижность ДГФР в бинарных комплексах значительно превышает подвижность белка в тройном комплексе ДГФР-НАДФ-Н-ТМП. В последнем наблюдается замедление скоростей обмена даже для протонов, расположенных в петлевых участках. Наблюдаются различия в скоростях обмена Н —> D и в бинарных комплексах: конформационная мобильность белка уменьшается в ряду ДГФР-НАДФ+ > ДГФР-НФДФ-Н > ДГФР-ТМП. Полученные результаты свидетельствуют о том, что существует корреляция между прочностью связывания лиганда и мобильностью белка в комплексе. Это позволяет предположить модель, в которой сегментарные движения белка играют роль в связывании лиганда. В самом деле, места связывания как НАДФ, так и препарата расположены не на поверхности белка, а, практически, в его центре. Следовательно, для связывания препарата необходима стадия раскрытия белка Р (схема 7) и, ввиду высокой энергии формы Popen, именно эта стадия должна быть лимитирующей для процесса связывания. Стадия раскрытия белка в его комплексе LP необходима и при диссоциации лиганда. Если предположить, что ее скорость меньше скорости ухода лиганда из комплекса LP0pen, то динамические свойства комплекса определяют суммарную скорость диссоциации лиганда. L

Схема7 Pelosa ^ P0pen ^ LPopen^ LPclose

Таким образом, в рамках данной модели скорость ассоциации лиганда зависит от конформационной мобильности белка, а скорость диссоциации - от мобильности комплекса. Поэтому, константа связывания лиганда (т.е. отношение указанных скоростей) зависит от характера изменения конформационной мобильности белка при переходе от апо-формы к комплексу. Представленная выше модель имеет ряд допущений и предположений, однако, хорошее соответствие экспериментальных результатов (скоростей дейтерообмена амидных протонов и параметров движения белка в мс шкале времени) известным значениям констант связывания лигандов в изученных комплексах (табл. 4) свидетельствует о наличии основы для ее дальнейшего уточнения и развития.

2.2.3. Методы ЯМР и квантовой химии в изучении кулоновских взаимодействий лиганд - белок и водородных связей.

В ряду различных типов межмолекулярных взаимодействий, определяющих связывание лиганда с белком, кулоновские взаимодействия наиболее трудны для изучения методом ЯМР. Это во многом относится и к водородным связям, для которых основная информация, получаемая из анализа спектров ЯМР, относится к донорам водородной связи, т.е. к протонам, в то время, как электронное состояние акцепторов водородной связи, а также ее геометрические и энергетические характеристики, более трудны для изучения. Принимая во внимание указанные обстоятельства, ЯМР был дополнен квантово-химическими расчетами, и этот подход доказал свою состоятельность при изучении взаимодействия лигандов с дигидрофолатредуктазой.

2.2.3.1. Взаимодействие антифолаткых препаратов с остатком Asp-26.

Все известные ингибиторы ДГФР относительно легко протонируются по гете-роароматическому остатку, взаимодействие которого с карбоксильной группой белка во многом определяет прочность связывания препарата с ферментом. В случае Lactobacillus casei ДГФР указанная карбоксильная группа принадлежит остатку аспарагиновой кислоты в положении 26 (см. схему 8). Информация о геометрии и энергии взаимодействия Asp-26 с протонированным гетероароматическим остатком тримето-прима была получена на основании квантовохимических расчетов, проведенных методом ССП МО в параметризации РМЗ. В качестве моделей взаимодействия были изучены системы DAP (2,4-диаминопиримидин, 37) / уксусная кислота и ТМП / пропионовая кислота. Исходная геометрия для ее дальнейшей квантово-химической оптимизации была взята из семейства структур ЯМР комплекса ДГФР-ТМП, рассчитанных методом ЯМР-докинга (см. раздел 3.1). В результате были найдены три возможные структуры взаимодействия (рис. 8), в том числе и вариант А, имеющий минимальную энтальпию образования.

Схема 8. Взаимодействие Asp-26 с ТМП.

Рис. 8 Оптимизированная геометрия взаимодействия DAP с уксусной кислотой в расчетах по методу РМЗ ССП МО исходя из различных исходных структур взаимодействующих фрагментов, полученных из семейства ЯМР-структур комплекса ДГФР-ТМП. (А) Структура, соответствующая глобальному минимуму энтальпии образования (АН = -245.6 кДж/моль); (В и С) структуры локальным минимумов (ДН = -221.8 и 219.2 кДж/моль соответственно).

Для учета эффектов среды (растворителя и белкового окружения) были также проведены расчеты с использованием модели реакционного поля Онсагера, расчеты системы взаимодействующих фрагментов в присутствии 1, 3, 6 и 9 молекул воды, размещенных случайным образом, и расчеты по методу ССП МО крупного фрагмента комплекса ДГФР-ТМП (130 атомов). Было установлено, что расчет системы в присутствии воды или атомов белка более точно воспроизводит экспериментальные данные, в частности характер протежирования триметоприма. Аналогичные расчеты были проведены и для системы триметрексат / пропионовая кислота. Полученные результаты позволили установить геометрические и энергетические параметры взаимодействия положительно заряженного гуанидинового фрагмента, входящего в структуру практически всех известных ингибиторов ДГФР, с карбоксильной группой Asp-26. Эти данные были далее использованы при расчете структур ЯМР комплексов ДГФР с

ТМП, ТМТХ и MTX. На рисунке 9 показаны структуры комплекса ДГФР-ТМП, полученные как без учета, так и при использовании информации о геометрии указанного куло-новского взаимодействия. Большинство аминокислотных остатков белка не изменило своего пространственного положения, однако, те относительно небольшие изменения, которые наблюдаются для Asp-26, Leu-27 и препарата, характеризуют наиболее важный фрагмент комплекса и поэтому представляют значительный интерес.

Рис. 9 Суперимпозиция ЯМР-структур комплекса ¿.соте/ ДГФР-ТМП, рассчитанных только на основе величин ЯЭО (тонкая линия) и при использовании результатов квантово-химических (РМЗ) расчетов (толстая линия).

2.2.3.2. Взаимодействие карбоксильных групп лигандов с аминокислотными остатками аргинина.

Важным взаимодействием, обеспечивающим высокую специфичность связывания метотрексата с ДГФР, является кулоновское взаимодействие карбоксильных групп глутаминового остатка препарата с положительно заряженными аминокислотными остатками фермента. а-Карбоксильная группа при этом связывается с аргини-ном-57, а у-карбоксил - с гистидином в положении 28. Те же взаимодействия наблюдаются и при связывании субстратов ДГФР (фолиевой и дигидрофолиевой кислот). Метод ЯМР позволил установить некоторые особенности взаимодействия карбоксильных групп лигандов с Ш8-28, в частности, таутомерное состояние имидазольного остатка. Однако, наиболее интересные наблюдения были сделаны для взаимодействия метотрексата и его аналогов с остатком

В спектрах ЯМР, записанных при пониженной температуре (от +1 до +15°С), удается наблюдать сигналы, соответствующие иминным протонам - НЕ и Нп (рис. 10). Эти сигналы несут информацию о характере и геометрии кулоновских взаимодействий между заряженной головкой аргинина и отрицательно заряженньми группами лигандов. Так, для комплекса ДГФР с метотрексатом удается наблюдать сигналы всех пяти №1 протонов раздельно, что свидетельствует об их замедленном обмене с протонами воды. Величины химических сдвигов свидетельствуют о том, что два протона из пяти участвуют в сильной водородной связи (с а-карбоксильной группой метотрексата). Поскольку отнесение протонов НЫ1112 и Н№22 однозначно следует из их корреляции с соответствующими атомами 15Ы и величин их ЯЭО, геометрия водородной связи была определена как симметричное взаимодействие (рис. ПА). Такой же тип взаимодействия наблюдается и в комплексах ДГФР с ДГФ, 32 и РАВО (и-аминобензоил-Ь-глутамат, 38). В то же время

Н Chemical shift (ppm) Рис. 10 Часть 'H/'5N HSQC спектра (600 МГц, 281 К) комплекса L.casei ДГФР-МТХ-НАДФН, содержащего сигналы концевых иминных групп аргинина.

DAP, 37 PABG, 38 было установлено, что взаимодействие Arg-43 с фосфатной группой НАДФ-Н имеет асимметричную геометрию (рис ИВ).

Методы ЯМР позволили также определить динамические свойства кулоновских взаимодействий, включающих заряженную группу остатка аргинина. То обстоятельство, что все четыре протона Нл наблюдаются раздельно для Arg-57 (рис. 10), позволило использовать методы динамического ЯМР (анализ формы линии) и 20-обменной спектроскопии (спектры zz-HSQC) для измерения скоростей вращения вокрут связей Ivf-CS C^-N"11 и Было установлено в частности, что взаимодействие Arg-57 с

MTX замедляет скорость вращения вокрут связи N6-Cb в ~10 раз, а вокруг связей N4 - в -100 раз. При этом относительные скорости вращения вокруг указанных связей в комплексе с MTX оказываются обратными тому, что наблюдается в свободном аргинине. Аналогичные результаты были получены и для комплексов ДГФР с ДГФ и PABG. Полученные данные однозначно свидетельствуют о том, что в комплексах ДГФР с указанными лигандами происходит синхронное вращение вокруг связей N^CÍ и С'-Са остатка глутаминовой кислоты (рис. 11С). Такое коррелированное вращение взаимодействующих группировок обеспечивает высокую энергию взаимодействия, поскольку увеличивает энтропию системы не влияя на ее энтальпию (водородные связи не разрываются при вращении). Указанный механизм взаимодействия наблюдается

А Агд-57

Hv X л Hn» V ' v Hn"

N + N Nn, Ni),

12 Hn,, Hn„ о о в „Q

V^

NH, N

У О N. ■ Н О

N N

1 СН, H,N N N 3 I н н

Рис. 11 Взаимодействие положительно заряженной концевой группы аргинина с отрицательно заряженными группами лигандов. (А) Симметричное взаимодействие, наблюдаемое между а-карбоксильной группой метотрексата и Аг§-57; (В) асимметричное взаимодействие, наблюдаемое между А^-43 и фосфатной группой НАДФ-Н; (С) коррелированное вращение вокруг С-С' связи метотрексата и 1Че-С'' связи аргинина-57. как для прочного комплекса ДГФР-МТХ, так и для комплекса ДГФР с РАЕЮ, константа связывания которого почти в 107 раз меньше: скорости вращения связей в обоих случаях практически идентичны.

Приведенные результаты свидетельствуют о том, что гетероядерные методы ЯМР могут быть использованы для мониторинга кулоновских взаимодействий между ДГФР и новьми антифолатами с целью поиска оптимальной структуры ингибитора.

2.2.3.3. Водородные связи между никотинамидным фрагментом кофермента НАДФ-Н и атомами белкового остова ДГФР.

Известно, что восстановленный кофермент НАДФ-Н связывается в -5000 раз прочнее с ДГФР по сравнению с окисленной формой НАДФ+. Это свойство обуславливает работу каталитического цикла ДГФР - после переноса протона на субстрат окисленная форма НАДФ легко заменяется на восстановленную форму. Несмотря на многочисленные попытки до настоящего времени так и не установлена причина столь высокого различия в константах связывания восстановленной и окисленной форм НАДФ. Не исключено также, что сходные причины могут лежать и в основе различия в кооперативных эффектах: ТМП и НАДФ-Н имеют большой положительный кооперативный эффект при связывании с бактериальным ферментом, в то время как при связывании триметоприма и НАДФ+ с ДГФР кооперативный эффект отрицателен.

При анализе структуры ЯМР тройного комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ-Н было установлено, что никотинамидный фрагмент образует систему водородных связей с атомами белкового хребта (рис. 4В). Аналогичные водородные связи были обнаружены во всех известных структурах ДГФР с коферментом и, следовательно, указанное взаимодействие играет МА0РН А I «АВР* в

Рис. 12 Оптимизированная геометрия водородных связей между никотинамидным остатком и атомами центра связывания L.casei ДГФР в (А) восстановленной форме (НАДФ-Н) и (В) окисленной форме (НАДФ+), Расчет выполнен программой GAUSSIAN по методу DFT с использованием набора базисных функций 6-311G. важную роль при связывании НАДФ. Представлялось важным определить геометрические и энергетические параметры системы водородных связей в комплексах с восстановленной и окисленной формой НАДФ. Это было выполнено неэмпирическими методами расчета (GAUSSIAN-98) по методу Хартри-Фока (с использованием набора базисных функций

3-21G) и при использовании метода функционала плотности (в базисе B3LYP/6-311G). Фрагмент структуры ЯМР тройного комплекса ДГФР-ТМП-НАДФ-Н, в котором были оставлены только никотинамидный цикл и аминокислотные остатки А1а-6 и Gln-7, был взят для его дальнейшей оптимизации в GAUSSIAN. Было установлено, что при переходе от восстановленной к окисленной форме НАДФ принципиально изменилась геометрия водородных связей между амидной группой кофермента и атомами остатка А1а-6 (рис. 12). Для проверки соответствия полученных результатов экспериментальным данным нами были рассчитаны химические сдвиги ядер 15N остатков А1а-6 и Gln-7 методом GIAO в базисе 6-311G. Установлено, что при замене НАДФ-Н на НАДФ+, величина 6(ISN) амидного протона А1а-6 уменьшается на -7 м.д., a Gln-7, напротив, увеличивается на ~8 м.д. Это качественно согласуется с экспериментальными величинами (-3.2 и +3.3, соответственно). Абсолютные значения рассчитанных изменений х.с. завышены, поскольку расчет не учитывал влияния среды. Поэтому принципиально важным было именно качественное соответствие результатов: сдвиг сигнала 15N остатка А1а-6 в сильное, a Gln-7 в слабое поле при замене НАДФ-Н на НАДФ+.

Найденные изменения длин связей эквивалентны изменению ориентации нико-тинамидного фрагмента относительно А1а-6 на -15°. Следует учитывать, что А1а-6 находится в центре конформационно жесткой части белка, и такое изменение геометрии взаимодействия вызывает изменение положения никотинамидного остатка и понижает энергию связывания. Так, энергия комплекса с окисленной формой НАДФ+ (рис 12А), находящаяся в геометрии взаимодействия, соответствующей восстановленной форме кофермента (рис. 12В), оказывается на ~ 80 кДж/моль выше энергии комплекса в его оптимальной конформации. Безусловно, при переходе от НАДФ-Н к НАДФТ конфор-мация комплекса должна измениться, но такое изменение ограничено жесткостью р-листа, где расположены А1а-6 и Gln-7, а для уменьшения константы связывания в 5000 раз требуется всего ~ 21 кДж/моль. Следовательно, указанный эффект может лежать в основе различия в специфичности связывания восстановленной и окисленной форм НАДФ с ДГФР. Анализ доступных рентгеновских структур белков, связывающих НАДФ и НАД как коферменты, показал, что в большинстве случаев никотинамидный фрагмент связывается со структурно-жесткой частью белка (а-спираль или р-лист, как в случае ДГФР). Поэтому обнаруженный эффект изменения геометрии взаимодействия может иметь достаточно универсальный характер. Следует подчеркнуть то, что все изменения длин связей лежат ниже пределов точности определения структуры, как методом ЯМР, так и рентгеновским методом. Кроме того, рентгеновские структуры, как правило, не позволяют определить положения атомов водорода. Таким образом, сочетание экспериментальных методов (ЯМР) и квантово-химических методов расчета может служить незаменимым инструментом для исследования тонких структурных деталей, играющих важную роль в биологических процессах.

3. Новые методы определения структуры комплексов препарат - белок.

Несмотря на очевидный прогресс в использовании методов спектроскопии ЯМР для установления структуры биомолекул, этот метод все еще остается трудоемким, по сравнению, например, с рентгенструктурным методом. Это обусловлено необходимостью проведения тщательного отнесения большого числа сигналов (2 - 3 тысячи и более) в спектрах ЯМР. Усилия многих исследовательских групп в мире нацелены на создание подходов, ускоряющих указанные этапы работы и минимизирующие возможные ошибки при их проведении. Значительная часть настоящего исследования была посвящена решению данной проблемы.

3.1. Расчет структуры комплекса препарат - белок методом ЯМР-докинга препарата в центр его связывания в биомолекулой.

Результаты, представленные в настоящей работе, а также многочисленные литературные данные свидетельствуют о том, что структура белка в его комплексах лишь незначительно меняется при замене одного лиганда на другой. Более того, химические сдвиги сигналов белка позволяют надежно идентифицировать структурно идентичные области и места, где происходят наибольшие структурные изменения. В этой связи представлялось возможным осуществлять расчет структуры комплекса белок-лиганд, основываясь на уже известной структуре белка в сходном комплексе и информации лишь о ЯЭО между протонами лиганда и белка. Существует ряд методов ЯМР, позволяющих селективно определять такие межъядерные контакты. Так, в работе было использовано два подхода: использование препаратов, меченных изотопами 13С и 15Ы и комплексов немеченых препаратов с белком, имеющим -100% обогащение указанными изотопами. В первом случае для отнесения ЯЭО использованы традиционные методы гетероядерной корреляции. Во втором случае были использованы методы спиновой фильтрации, когда в спектре наблюдались лишь ЯЭО между протоном, связанным с |3С и протоном, связанным с 12С. Аналогичные эксперименты проводились и с использованием изотопа 15Ы.

Для проведения докинга лиганда в белок были разработаны подходы, основанные на использовании структуры последнего как в кристалле, так и в растворе. Эти методы были применены для расчета бинарных комплексов ДГФР с триметопримом, бродимоприм-4;6-дикарбоксилатом 39 и триметрексатом. В первых двух случаях в качестве базовой структуры была использована рентгеновская структура белка из тройного комплекса ДГФР-МТХ-НАДФ-Н. Алгоритм расчета предполагал возможность оптимизации структуры аминокислот- 900" ных остатков, расположенных в центре г^ if С00связь1вания ингибитора. Остальные ами- H2N N^ ^^ нокислотшле" остатки были жестко за- н3с''0 фиксированы. Полученные структуры Бродимоприм 4,6-дикарбоксилат, 39 содержали цепную информацию о конформации связанного лиганда и его взаимодействии с окружающими атомами. Так, например, было установлено, что карбоксильные группы 39 Занимают положение, близкое к положению карбоксильных групп MTX или ДГФ, что обуславливает их взаимодействие с His-28 и Arg-57. Указанные электростатические контакты существенно повышают прочность связывания 39 с ферментом по сравнению, например, с ТМП. Преимущество метода докинга для расчета структуры состоит в быстроте экспериментов ЯМР, необходимых для получения исходных экспериментальных данных, и относительной простоте расчетов. Основным недостатком метода является предположение о сохранении структуры белка в случае замены лиганда.

С целью преодоления указанного недостатка был разработан новый подход, названный докингом с наложенными ограничениями (restrained docking method). Его принципиальное отличие от описанного выше метода состоит в том, что структура белка фиксируется не жестко, а посредством набора экспериментальных ограничений, использованных при расчете модельного комплекса. В работе в качестве модельного был использован комплекс ДГФР-МТХ, а для проверки метода рассчитывали строение комплекса ДГФР-ТМТХ, для которого уже была известна структура в растворе. Сравнение химических сдвигов белка в указанных комплексах позволило установить те его области, которые претерпевают структурные изменения. Для них, как и для самого лиганда, были измерены экспериментальные ограничения (ЯЭО и торсионные углы), а для остальных аминокислотных остатков был взят набор ограничений ЯМР из модельного комплекса. Окончательный расчет структуры комплекса ДГФР-ТМТХ проводили, используя оба указанных списка. Полученная структура с высокой степенью точности совпала со структурой того же комплекса, рассчитанной традиционным образом. В то же время, метод докинга с наложенными ограничениями потребовал использования лишь около 20% от числа ЯЭО, использованных для традиционного подхода, что значительно ускоряет этапы выполнения их отнесения. Указанный метод чувствителен к любым структурным изменениям, даже происходящим вдали от центра связывания лиганда. Использование докинга с наложенными ограничениями в сочетании с легко измеряемыми дополнительными экспериментальными параметрами, такими как диполярные константы, представляется наиболее перспективным.

3.2. Разработка пакета компьютерных программ для расчета структуры и динамики биомолекул и их комплексов.

Важным разделом представленной работы было создание пакета компьютерных программ, предназначенных для расчета спектральных и структурных параметров, а также для автоматизации процессов анализа спектров ЯМР и расчета структуры биомолекул. Были разработаны следующие программы: NMRTABLE, AngleSearch, NMRest, RelaxFit и Muses.

NMRTABLE - программа, предназначенная для создания базы спектральных данных для сложных биомолекул и их комплексов. База данных может содержать информацию о химических сдвигах сигналов, величинах ЯЭО, константах спин-спинового взаимодействия и других дополнительных параметрах, таких как скорости обмена Н -> D, времена релаксации и т.п. Программа имеет удобный графический интерфейс, встроенный макроязык, позволяющий контролировать формат ввода/вывода данных и многочисленные инструменты для контроля данных и их анализа. С помощью этой программы можно проводить сравнение спектральных параметров в ряду сходных комплексов, что представляется особенно важньм для изучения комплексов белок-лиганд.

AngleSearch - программа для проведения стереоспецифического отнесения сигналов в спектрах ЯМР и расчета ограничений на торсионные углы. Программа вычисляет величины констант спин-спинового взаимодействия и межъядерные расстояния для любого молекулярного фрагмента и осуществляет поиск конформационного пространства, в котором рассчитанные параметры соответствуют экспериментальным.

В качестве примера, можно рассмотреть дипептидный фрагмент белка. В таблице 5 приведены параметры ЯМР (КССВ и межъядерные расстояния) и эксперименты, которые могут быть использованы для их определения.

Табл. 5 Эксперименты ЯМР, используемые для определения межьядерных расстояний и КССВ, необходимых для расчета торсионных утлов ф, у, в белке.

КССВ Угол Эксперименты ЯМР

3J(HN,Ha) Ф HNHA, DQF-COSY

3J(Ha,Hp's) Xi TOCSY-HSQC, PE-COSY

3J(I5N,H(3'S) Xi HNHB

3J(l5N,HaM) Ц1 HNHB, НМВС

3J(13CO,HP's) Xi HN(CO)HB

3J(13CO,H<xi+') Ф • HN(CO)HB

CO.HNT1) Ф HNCA, E.COSY

3J(!3CH3v,Ha) Xi LRCH

Расстояние Угол Эксперименты ЯМР d(HN,Ha) Ф 3D 15n roesy-hsqc d(HN,HP's) Ф, ъ 3D ,SN ROESY-HSQC

D(Hcx,H(3's) Xi 3D 13C ROESY-HSQC d(HN'+1,Ha) Ц1, (со) 3D I5N ROESY-HSQC

D(HN'+I,HP's) V, Хь (ш) 3D 15N ROESY-HSQC d(H8's,Ha) 3D 1SC ROESY-HSQC

Для каждой точки конформационного пространства белка (т.е. значений углов ф, \|/, хь и т.д., изменяемых с шагом 6°) программа рассчитывает величины КССВ и межъядерные расстояния и сравнивает их с экспериментальными значениями. Данная процедура повторяется для всех вариантов отнесения диастереотоптых протонов, таких как р-метиленовые протоны, в результате чего, удается провести стереоспецифи-ческое отнесение сигналов. AngleSearch отличается от других известных программ (HABAS, STEROSEARCH, TALOS) рядом важных функций. Прежде всего, это то, что может быть изучен любой молекулярный фрагмент, не только белковой природы. Это особенно важно при изучении взаимодействия белка с лигандам. Кроме конфор-мационно жесткой модели программа рассматривает также модель быстрых колебаний боковых аминокислотных остатков вокруг преимущественной конформации, а также модель полного усреднения по трем энергетически выгодным ротамерам. Программа не ограничена в выборе экспериментальных параметров и любые КССВ и ЯЭО могут быть использованы для расчета.

Программа была интенсивно протестирована на двух объектах: комплексах ДГФР и полипептиде PNR-2/pS2. pS2 - это важный в биологическом плане белок - состоящий из 60 аминокислотных остатков с молекулярной массой 6.5 кДа. Он является родоначальником класса полипептидов из т.н. группы трилистника ('trefoil peptides') и обнаруживается в высоких концентрациях при раке молочной железы, а также в клетках слизистой оболочки кишечника. В настоящее время проводятся интенсивные исследования белков из группы трилистника, показана важная биохимическая роль ряда представителей этой группы. Однако структура родоначальника группы долгое время оставалась неизвестной. Представлялось чрезвычайно важным установить трехмерную структуру данного белка для более точного понимания его функций в организме. С помощью программы AngleSearch были найдены практически все возможные ограничения на торсионные углы (см. табл. 3), проведено стереоспецифическое отнесение сигналов и рассчитаны населенности ротамеров. Это позволило рассчитать структуру белка pS2 с высокой степенью точности (рис. 13). Полученные результаты позволили предсказать особенности строения потенциальной мишени связывания полипептида.

Рис. 13 Стереоизображение семейства 19 структур ЯМР полипептида суперимпозированных по атомам белкового остова (К, Са и С). Структура центральной части белка хорошо определена, а С-терминальная часть белка (остатки 52 - 60) обладает высокой мобильностью. Обнаружено также наличие двух анти-параллельных р-листов (остатки 4 - 6 и 48 - 50), обладающих повышенной мобильностью.

Программа Ащ1е8еагсЬ. была также использована при расчете структуры ДГФР в их комплексах, включая установление конформации лигандов, связанных с ДГФР. Было проведено стереоспецифическое отнесение метиленовых атомов На остатков глицина, что невозможно при использовании других программ. Возможности программы позволили использовать ее рядом научных групп для изучения конформации нестандартных, а также О-аминокислотных остатков.

N1^651 - программа, предназначенная для автоматизации процесса расчета трехмерной структуры белка. Она работает с файлами данных, используемыми такими программами молекулярной динамики, как X-PLOR, CNS и DISCOVER. Программа позволяет анализировать набор экспериментальных данных на предмет его соответствия рассчитанным структурам, выявлять нарушения в ограничениях и ошибки, устанавливать качество полученных структур. Отличительной особенностью программы является то, что она работает со всеми возможными типами экспериментальных данных, такими как ЯЭО, в том числе с неоднозначным отнесением, КССВ, ограничения на торсионные углы, диполярные константы, водородные связи, связи S-S, параметры хиральности атомов, позволяя анализировать все их в совокупности.

RelaxFit - программа, предназначенная для обработки результатов релаксационных измерений и анализа экспериментальных данных с использованием нескольких моделей спектральной плотности и движения молекул в приближении как изотропной, так и анизотропной диффузии. При этом модули программы охватывают весь цикл работ - от считывания экспериментальных данных и вычисления скоростей релаксации методом нелинейной регрессии до оптимизации параметров движения методом сопряженных градиентов и расчета возможных ошибок по методу Монте-Карло.

Muses - программа расчета и анализа формы линии ЯМР при протекании обменных процессов между двумя и более конформационными состояниями. Программа позволяет рассчитывать значения энтальпии и энтропии процессов путем нахождения оптимального соответствия между рассчитанным и экспериментальным спектрами. При расчете формы линии ЯМР программа учитывает изменение вязкости раствора при изменении его температуры, что важно при исследовании биомолекул. В качестве примера использования программы можно привести результаты расчета скоростей процесса переворота триметоксифенильного цикла препаратов триметрексата (разд. 2.2.1) и триметоприма в ряде его комплексов (см. разд. 2.2.2.2 и рис. 5 в качестве иллюстрации).

Все разработанные в работе программы распространяются бесплатно, имеют удобный пользовательский интерфейс и предназначены для работы в среде Windows NT/9x.

ВЫВОДЫ

1. На примере двух классов лекарственных соединений показаны возможности метода спектроскопии ЯМР высокого разрешения для установления молекулярного механизма действия препаратов и их биотрансформации. Комплексный подход, предложенный в работе, включает установление путей превращений, строения и динамических свойств препаратов и продуктов их взаимодействия с биомолекулами.

2. Установлено, что противоопухолевые препараты диспиротрипиперазиниевого ряда (спиразидин, проспидин, спиробромин и карбоспирин) обладают выраженными алкилирующими свойствами. Все превращения указанных соединений в условиях, близких к физиологическим, связаны с изменением строения их концевых группировок. Превращения всех указанных препаратов, кроме спиробромина, включают стадию внутримолекулярной циклизации, приводящую к образованию активных интермедиатов. Спиробромин претерпевает реакцию дегидробромирования с образованием акрилоильного производного, содержащего активированную этиленовую связь.

3. Наиболее вероятными центрами связывания спиразидина, проспидина и карбоспи-рина являются положения N7 гуанильных остатков нуклеиновых кислот, а спиробромина - сульфгидридные группы белков. Наибольшая селективность связывания обнаружена у проспидина, при этом в ее основе лежит фиксация диспиротрипиперазиниевого остатка препарата у мишени его алкилирующего действия посредством электростатического взаимодействия.

4. На примере производных диспиротрипиперазиния показаны возможности использования спектроскопии ЯМР в качестве основного метода изучения биотрансформации и динамики выведения лекарственных препаратов. Установлены особенности выведения из организма препаратов проспидин, спиробромин и карбоспирин. Изучен характер выведения спиробромина и его метаболитов в двух его лекарственных формах.

5. Изучено взаимодействие противоопухолевых препаратов метотрексат и тримет-рексат с бактериальной (Lactobacillus casei) дигидрофолатредуктазой. При использовании методов многомерной гетероядерной спектроскопии ЯМР и молекулярной динамики с наложенными ограничениями рассчитаны структуры высокого разрешения бинарных комплексов ДГФР с указанными препаратами. Структуры депонированы в международный банк данных (Brookhaven protein databank). Установлены основные межмолекулярные взаимодействия, обуславливающие высокоспецифическое связывание препаратов с ферментом.

6. Установлена структура высокого разрешения для комплекса ДГФР с антибактериальным препаратом триметоприм и НАДФ-Н, в котором лиганды обладают высоким кооперативным эффектом связывания. Показано, что в основе кооперативного эффекта лежат специфические взаимодействия, прежде всего гидрофобного характера, между триметоксифенильной группой триметоприма, никотинамидным циклом НАДФ-Н и аминокислотными остатками белка, расположенньми в центре связывания лигандов.

7. Изучены движения препаратов триметоприм и триметрексат в центре их связывания с ДГФР. Определены кинетические и термодинамические параметры процесса переворота триметоксифенильного цикла препаратов в ряде их комплексов. Установлено наличие коррелированных движений триметоприма и восстановленной формы кофермента НАДФ-Н. Высказана гипотеза о вкладе коррелированных движений лигандов в кооперативный эффект их связывания с белком. Аналогичный вывод о важной роли коррелированных движений сделан и на основании изучения электростатического взаимодействия карбоксильных групп метотрексата и дигид-рофолата с положительно заряженным остатком А^-57.

8. Изучены динамические свойства белка в ряде комплексов I. са$е1 ДГФР. Показано, что связывание лигандов с ферментом вызывает значительные изменения в мобильности белка, в особенности в медленной (от 10"3 до 103 сек) шкале времени. Установлена корреляция .между изменением динамических свойств белка при переходе от апо-формы к комплексу и прочностью связывания лиганда. Предложена модель, объясняющая указанное явление.

9. Разработан подход для изучения электростатических взаимодействий и водородных связей между лигандом и белком, основанный на сочетании возможностей спектроскопии ЯМР и квантово-химических методов расчета. Изучена геометрия и энергетические параметры взаимодействия антифолатных препаратов с карбоксильной группой Авр-26 и НАДФ с атомами белкового остова ДГФР. В последнем случае показано изменение ориентации никотинамидного фрагмента НАДФ по отношению к белку при переходе от восстановленной к окисленной форме кофермента. Рассмотрена возможная роль указанного эффекта в изменении прочности связывания двух форм НАДФ с ферментом.

10. Методом ЯМР-докинга рассчитаны структуры бинарных комплексов L.casei ДГФР с препаратом триметоприм и 4,6-дикарбоксильным производным препарата бро-димоприм. Установлена конформация препаратов в центре связывания с ферментом и характер специфических гидрофобных и электростатических взаимодействий между препаратами и аминокислотными остатками белка.

11. Предложен новый метод расчета структуры комплексов белок-лиганд в растворе -метод докинга лиганда с наложенными ограничениями. Указанный метод позволяет значительно сократить время расчета без потери качества полученных структур. Продемонстрировано использование данного метода на примере структуры бинарного комплекса ДГФР-тримегрексат. При этом.показано, что полученная структура хорошо совпадает со структурой, рассчитанной традиционными методами.

12. Установлена структура высокого разрешения в растворе полипептида PNR-2/pS2 -родоначальника важного класса белков (trefoil peptides). Координаты депонированы в банк белковых структур (Brookhaven protein databank). Установлены особенности строения белка и его потенциальной мишени связывания.

13. Разработан пакет компьютерных программ, предназначенных для расчета структурных параметров биомолекул на основании данных ЯМР, анализа динамических характеристик, расчета скоростей химического обмена и создания баз данных ЯМР для сложных комплексов белков с различными лигандами. Программы предназначены для бесплатного распространения и уже используются рядом научных групп в мире.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. В.И.Полыпаков, Г.Г.Дворянцева, Ю.Н.Шейнкер. (1983) Изучение ' механизма основного и кислотного гидролиза галоидокси и эпоксиалкильных производных диспйротршшперазиния. Успехи химии азотистых гетероциклов: Тезисы докладов Ш Всесоюз. конф. по химии гетероциклических соединений, Ростов-на-Дону, С. 87.

2. В.И.Полыпаков, Г.Г.Дворянцева, Ю.Н.Шейнкер, Т.С.Сафонова, В.А.Чернов. (1984) Изучение превращений противоопухолевого препарата проспидин в водных средах. Хим.-фарм. журн., № 8, С. 912-914.

3. В.И.Полыпаков, Г.Г.Дворянцева, Ю.Н.Шейнкер, В.А.Чернов, Т.С.Сафонова. (1985) Изучение алкилирующей способности проспидина в модельных реакциях с органическими фосфатами. Хим.-фарм. журн., № 6, С. 661-667.

4. G.G.Dvoryantseva, V.I.Polshakov, Yu.N.Sheinker, V.I.Shvedov, A.N.Grynev, M.D.Mashkovsky, H.A.Karapetyan, Yu.T.Struchkov. (1985) Structure-activity relationships in the pyrazino[3,3,l-j,k]-carbazole derivatives. A new antidepressant pirlindole and related compounds. Eur J.Med. Chem., v. 20, N. 5, P. 414-418.

5. В.И,Полыпаков, Г.Г.Дворянцева, Ю.Н.Шейнкер, Ж.Ф.Преснова, В.А.Чернов, Т.С.Сафонова (1986) Исследование путей биотрансформации спиробромина. Хим.-фарм. журн., № 8, С. 905-911.

6. В.И.Полыиаков, Г.Г.Дворянцева, Ю.Н.Шейнкер, Т.С.Сафонова (1987) Взаимодействие противоопухолевых препаратов проспвдина и спиробромина с нуклеотидами. Хим.-фарм. журн., № 5, С. 528-536.

7. О.В.Ольшанская, В.И.Полыпаков, Ж.Ф.Преснова, Л.А.Кострюкова (1987) Фармакокинетика, метаболизм и противоопухолевая активность суспензии спиробромина в масле при пероральном способе введения. Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей: Сборник научных трудов Всесоюзного совещания, Черноголовка, т. 1, С. 156-158.

8. В.И.Полыпаков, Ю.Н.Шейнкер В.А.Чернов Т.С.Сафонова (1987) Изучение алкилирующей способности противоопухолевых- препаратов - производных диспиротрипиперазиния. Актуальные проблемы экспериментальной химиотерапии опухолей: Сборник научных трудов Всесоюзного совещания, Черноголовка^ т. 2, С. 70-73.

9. О.В.Ольшанская^ ;: В.И.Полыпаков, Ж.Ф.Преснова, В.А.Чернов (1988) Фармакокинетика и метаболизм спиробромина при пероральном введении. Хим.-фарм. журн., № 8, С. 905-907.

10. В.И.Полыпаков,- Ю.Н.Шейнкер, В.А.Чернов (1988) Превращение спиразидина в водных средах. Хим.-фарм. журн,№ 12, С. 1413-1417.

11. В.И.Полыпаков, Ю.Н.Шейнкер (1989) Взаимодействие спиразидина, проспидина и спиробромина с компонентами нуклеиновых кислот. Хим.-фарм. журн. N 1, С. 10-16.

12. M.D.Carr, B.Birdsal, T.A.Frenkiel, C.J.Bauer, J.Jimenez-Barbero, V.I.Polshakov, J.E.McCormjc, G.C.K.Roberts, J.Feeney (1991) Dihydrofolate reductase: sequential resonance assignments using 2D and 3D NMR and secondary structure determination in solution. Biochemistry, v. 30, № 25, P. 6330-6341.

13. В.В.Чистяков, О.С.Анисимова, В.И.Полыпаков, И.А.Ермаченков, Ю.Н.Шейнкер (1993) Метаболизм тетриндола. Хим.-фарм. журн., № 1 .- С. 4-6.

14. C.J.Bauer, B.Birdsall, M.D.Carr, H.T.A.Cheung, J.Feeney, T.A.Frenkiel, M.J.Gradwell, G.Martorell, V.I.Polshakov, A.Soteriou (1994) Isotope aided NMR studies of the structure and specificity of drug-receptor complexes. The proceedings of 1-st International conference "The use of stable isotops in NMR studies ofprotein structure, dynamics and function. Paris.

15. V.I.Polshakov, T.A.Frenkiel, B.Birdsall, J.Feeney (1994) Determination of stereospecific assignment, dihedral angle constraints and rotamer populations in proteins using the program AngleSearch. The proceedings of XVIth International conference on magnetic resonance in biological systems. Veldhoven, The Netherlands, V. 2, P. 159

16. C.J.Bauer, B.Birdsall, M.D.Carr, H.T.A.Cheung, J.Feeney, T.A.Frenkiel, M.J.Gradwell, G.Martorell, V.I.Polshakov, A.Soteriou (1994) Isotope aided NMR studies of protein-ligand interactions. The proceedings of XVIth International conference on magnetic resonance in biological systems. Veldhoven, The Netherlands, V. 1, P. 62.

17. G.Martorell, M.J.Gradwell, B.Birdsall, C.J.Bauer, T.A.Frenkiel, H.T.A.Cheung, V.I.Polshakov, L.Kuyper, J.Feeney (1994) Solution structure of bound trimethoprim in its complex with Lactobacillus casei dihydrofolate reductase. Biochemistry, V. 33. № 41, P. 12416-12426

18. V.I.Polshakov, J.Feeney (1994) AngleSearch v. 2.10. Conformational grid search program from the NMRTABLE package for obtaining steieospecific assignments, torsion angle constraints and rotamer populations. The user guide. NIMR, London, England.

19. V.I.Polshakov, T.A.Frenkiel, B.Birdsall, A.Soteriou, J.Feeney (1995) Determination of stereospecific assignments, torsion-angle constraints and rotamer populations in proteins using the program AngleSearch. J. Magn. Res., Ser. В., V. 108, № 1, P. 31-43.

20. W.D.Morgan, B.Birdsall, V.I.Polshakov, D.Sali, I.Kompis, J.Feeney (1995) Solution structure of a brodimoprim analogue in its complex with Lactobacillus casei dihydrofolate reductase. Biochemistry, V. 34, № 37, P. 11690-11702.

21. M.J.Gradwell, V.I.Polshakov, W.D.Morgan, A.R.Gargaro, G.Martorell, B.Birdsall, J.Feeney (1995) An investigation of NOE-constrained docking of ligands to proteins. The proceedings of Xllth International meeting on NMR spectroscopy. UM1ST, Manchester, England.

22. J.Feeney, C.J.Bauer, B.Birdsall, H.T.A.Cheung, T.A.Frenkiel, A.Gargaro, I.P.Gerothanasis, M.Gradwell, G.Martorell, W.D.Morgan, V.I.Polshakov, A.Soteriou (1995) NMR studies of conformations and ionization states in protein-ligand complexes. The proceedings of Xllth International meeting on NMR spectroscopy. UMIST, Manchester, England.

23. V.I.Polshakov, T.A.Frenkiei, B.Westley, M.Chadwick, F.May, M.D.Carr, J.Feeney

1995) NMR-based structural studies of the pNR-2/pS2 single domain trefoil peptide. Similarities to porcine spasmolytic peptide and evidence for monomeric structure. Eur. J. Biochem., V. 233, № 3, P. 847-855.

24. V.I.Polshakov, B.Birdsall, M.J.Gradwell, J.Feeney (1995) The use of PM3 SCF MO quantum mechanical calculations to refine NMR-determined structures of complexes of antifolate drugs with dihydrofolate reductase in solution. J. Molecul. Struct. (Theochem), V. 357, P. 207-216.

25. A.R.Gargaro, T.A.Frenkiel, P.M.Nieto, V.I.Polshakov, W.D.Morgan, J.Feeney (1996) NMR detection of arginine-ligand interactions in complexes of Lactobacillus casei dihydrofolate reductase. Eur. J. Biochem., V. 238, № 2, P. 435-439.

26.0.С.Анисимова, А.В.Лопатин, В.В.Чистяков, В.И.Полыпаков, Н.П.Соловьева, А.В.Галушко, А.П.Плешкова, Ю.Н.Шейнкер (1996) Изучение метаболизма инказана методами ТСХ, ЯМР- и масс-спектрометрии. Хим.-фарм. жури., № 3, С. 3-6.

27. О.С. Анисимова, А.В.Лопатин, В.И.Польшаков, В.В.Чистяков, И.А.Ермаченков, И.В.Голованова, П.Ю.Иванов, А.П.Плешкова, Ю.Н.Шейнкер (1996) Изучение метаболизмапиразидола. Хцм.-фя/ш. журн., № 5, С. 15-17.

28. V.I. Polshakov, М.А. Williams, A.R. Gargaro, Т.А. Frenkiel, B.R. Westley, J. Feeney

1996) High-resolution solution structure of pNR-2/pS2 single-domain trefoil protein, The proceedings ofXVIIth International conference on magnetic resonance in biological systems, P. 122, Keystone, Colorado, USA.

29. P.M. Nieto, A.R. Gargaro, T.A. Frenkiel, W.D. Morgan, V.I. Polshakov, B. Birdsall, J. Feeney (1996) NMR detection of arginine-ligand interactions in complexes of dihydrofolate reductase, The proceedings ofXVIIth International conference on magnetic resonance in biological systems, P. 122, Keystone, Colorado, USA.

30. A.R. Gargaro, A. Soteriou, W.D. Morgan, T.A. Frenkiel, V.I. Polshakov, Ы.Т.А. Cheung, B. Birdsall, M.J. Gradwell, J. Feeney (1996) Structures of dihydrofolate reductase complexes in solution, The proceedings of XVIIth International conference on magnetic resonance in biological systems, P. 122, Keystone, Colorado, USA.

31. V.I. Polshakov, M.A. Williams, A.R. Gargaro, T.A. Frenkiel, B.R.Westley, M.P. Chad-wick, F.E.B. May, J. Feeney (1997) High-resolution solution structure of human pNR-2/pS2: a single trefoil motif protein. J. Mol. Biol., V. 267, P. 418-432.

32. A.R. Gargaro, A. Soteriou, T.A. Frenkiel, C.J. Bauer, B. Birdsall, V.I. Polshakov, I.L. Barsukov, G.C.K. Roberts, J. Feeney (1998) The solution structure of the complex of Lactobacillus casei dihydrofolate reductase with methotrexate. J. Mol. Biol., V. 277, P. 119-134.

33. V.I. Polshakov, J. Feeney (1998) NMR studies on the drug-dihydrofolate reductase interactions. The proceedings ofXth International conference "Magnetic resonance in chemistry and biology", p. 94-95, Suzdal, Russia.

34. V.I. Polshakov, E.G. Smirnov, B. Birdsall, T.A. Frenkiel, J. Feeney (1999) NMR studies of the drug-dihydrofolate reductase interactions, The proceedings of international conference "NMR in molecular biology: Structure, binding and molecular recognition", P50, Granada, Spain.

35. V.I. Polshakov, B. Birdsall, T.A. Frenkiel, A.R. Gargaro, J. Feeney, (1999): Structure and dynamics in solution of the complex of Lactobacillus casei dihydrofolate reductase with the new lipophylic antifolate drug trimetrexate, Protein Set, V. 8, P. 467-481.

36. V.I. Polshakov, M.D. Morgan, B. Birdsall, J. Feeney (1999) Validation of a new restraint docking method for solution structure determinations of proteindigand complexes, J. Biomel. NMR, V. 14, P. 115-122.

37. V.I. Polshakov, B. Birdsall, J. Feeney (1999) Characterisation of rates of ring-flipping in trimethoprim; in its ternary complexes with Lactobacillus casei dihydrofolate reductase and coenzyme.analogues, Biochemistry, V. 38, P. 15962-15969.

38. В.И. Польшаков, Е.Г. Смирнов, В. Birdsall, J. Feeney (2000) Методы ЯМР в молекулярной фармакологии: взаимодействие триметоприма с дигидрофолатредукта

1 ; • Тезисы докладов III Всероссийской конференции «Новые достижения ЯМР в 1. структурных исследованиях», Казань, С. 16.

39. V.I. Polshakov, E.G. Smirnov, В. Birdsall, J. Feeney (2000) Binding of inhibitors to dihydrofolate reductase: NMR studies of structure, dynamics and specific interactions, The proceedings of international conference "Biocatalysis-2000: Fundamentals and Applications", P. 46, Moscow, Russia.

40. B. Birdsall, V.I. Polshakov, J. Feeney (2000) NMR studies of ligand carboxylate group interactions with arginine residues in complexes of Lactobacillus casei dihydrofolate reductase with substrates and substrate analogues, Biochemistry, V. 39, P. 9819-9825.

41. V.I. Polshakov, E.G. Smirnov, B. Birdsall, T.A. Frenkiel, J. Feeney (2000) NMR in mo

• : lecular pharmacology: structure and dynamics of trimethoprim-dihydrofolate reductase complexes, The proceedings ofXIXth International conference on magnetic resonance in biological systems, P. 358, Florence, Italy.