Создание векторов для тканеспецифической экспрессии генов эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека в молочной железе животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Иванова, Лариса Борисовна

• Иванова, Лариса Борисовна
• кандидат биологических наук
• 2002

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванова, Лариса Борисовна

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Продукция рекомбинантных белков в составе молока трансгенных животных

1.2. Гены казеинов молока

1.3. Получение и использование рекомбинантных белков эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека

2. Материалы и методы исследований

2.1. Используемые материалы и объекты исследований

2.2. Выделение ДНК

2.3. Расщепление плазмидной ДНК рестриктазами

2.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

2.5. Элюция фрагментов ДНК из геля и их очистка

2.6. Лигирование

2.7. Трансформация плазмидной ДНК

2.8. Детекция трансгена методом ПЦР-амплификации ДНК

2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Создание вектора, содержащего структурный ген эритропоэтина человека и регуляторные районы гена asi- казеина быка

3.2. Выделение, молекулярное клонирование структурной части гена гранулоцит колониестимулирующего фактора человека

3.3. Некоторые аспекты подготовки раствора ДНК для микроинъекций

3.4. Идентификация трансгена с использованием полиме-разно-цепной реакции

3.5. Использование полученных генных конструкций при создании ретровирусных векторов 78 Выводы 84 Практические предложения 85 Список используемой литературы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание векторов для тканеспецифической экспрессии генов эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека в молочной железе животных»

Актуальность исследований. В последние годы быстрыми темпами развиваются биотехнологические программы по получению трансгенных животных с измененным генотипом. Одним из перспективных направлений в этой области является создание и использование сельскохозяйственных животных, синтезирующих ре-комбинантные белки человека.

Развитие этого направления связано с возможностью создания генных конструкций, которые при интеграции способны обеспечивать экспрессию данного гена в определенное время и в определенных органах или тканях.

Во всем мире существует огромный коммерческий интерес к производству целого ряда белков, необходимых для проведения диагностических, терапевтических и профилактических мероприятий в медицине и ветеринарии. Преимущества использования сельскохозяйственных животных в качестве биореакторов очевидны. Молочная железа сельскохозяйственных животных обладает огромным потенциалом синтеза белков и является идеальным источником производства рекомбинантных белков.

Необходимым условием для направленной экспрессии рекомбинантных белков в молочной железе трансгенных животных является использование в генных конструкциях регуляторных элементов генов белков молока. Анализ литературных данных (Clark R.A. et al. 1994; Korhonen V.P.et al., 1997; Volf E. et al., 1997; и др.) позволяет сделать вывод, что регуляторные последовательности гена as 1-казеина быка (Bos taurus) могут успешно использоваться для тканеспецифической экспрессии экзогенных белков в молочной железе сельскохозяйственных животных.

В рамках данной проблемы интересными представляются эксперименты с генами, кодирующими белки, минимальные количества которых способны оказывать существенное влияние на физиологические процессы организма. В частности, к ним относятся белки, стимулирующие рост и дифференцировку клеток крови: эритропоэтин (ЭПО) и гранулоцит колониестимулирующий фактор (Г-КСФ) человека.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось создание векторов, содержащих гены, кодирующие эритропоэтин и гранулоцит колониестимулирующий фактор человека, для тканеспецифической экспрессии в молочной железе животных при проведении биотехнологических исследований по трансгенозу. В связи с этим решались следующие задачи:

1. создать рекомбинантную плазмиду, содержащую структурный ген эритропоэтина человека под контролем регулятор-ных элементов гена asi-казеина быка;

2. выделить нуклеотидную последовательность гена гранулоцит колониестимулирующего фактора человека и клонировать в вектор, включающий регуляторные районы гена asi-казеина быка;

3. разработать способ обработки эмбрионов на ранней стадии их развития с целью достоверного анализа интеграции трансгена.

Научная новизна работы. Впервые созданы отечественные векторные конструкции, содержащие кодирующие последовательности генов человека: эритропоэтина и гранулоцит колониестиму-лирующего фактора, тканеспецифическая экспрессия которых обусловлена наличием в рекомбинантных плазмидах регуляторных элементов гена asi-казеина быка. Определены оптимальные условия проведения анализа интеграции трансгена у эмбрионов млекопитающих ранних стадий развития.

Практическая значимость. Созданные рекомбинантные плазмиды могут быть использованы в разработке технологий по получению трансгенных сельскохозяйственных животных, продуцирующих рекомбинантные эритропоэтин и гранулоцит колоние-стимулирующий фактор человека в составе молока.

На основе этих генных конструкций были созданы ретрови-русные векторы для получения соматических трансгенных животных, продуцирующих клетками молочной железы белки, имеющие фармакологическое значение.

Рекомбинантные плазмиды могут найти применение не только при проведении исследований в области трансгеноза, но и в дальнейших молекулярно-генетических работах по клонированию с целью создания новых векторов.

Метод определения интеграции трансгена на стадии эмбриона пригоден для практического использования при проведении анализа генома зародышей млекопитающих. Этот метод также можно применять при взятии биопсии у бластоцист с целью детекции трансгена и дальнейшей трансплантации только трансгенных эмбрионов.

Положения, выносимые на защиту:

• Тканеспецифическую экспрессию эритропоэтина и грану-лоцит колониестимулирующего фактора человека в молочной железе трансгенных животных обеспечивают ре-гуляторные элементы гена asi-казеина быка (Bos taurus).

• Нуклеотидная последовательность ОС1/ОС2-фрагмента созданной рекомбинантной плазмиды pGCm идентична опубликованной первичной структуре гена гранулоцит колониестимулирующего фактора человека.

• Предварительная обработка эмбрионов рестриктазой Dpnl и протеиназой К перед проведением ПЦР-анализа позволяет более достоверно определить интеграцию трансгена у бластоцист млекопитающих.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Одним из основных факторов, необходимых для производства высококачественных продуктов животноводства, наряду с улучшением кормовой базы, является повышение генетического потенциала сельскохозяйственных животных, призванного обеспечить более эффективное использование кормов и значительное повышение продуктивности. Однако для существенного повышения генетического потенциала методами классической селекции требуется не одно десятилетие. В связи с этим возникает необходимость в разработке технологий, позволяющих более быстрыми темпами создавать новые генотипы животных с желаемыми признаками, и, таким образом, резко ускорить селекционный процесс.

Исследования, проведенные в последние годы в области эм-бриоинженерии, молекулярной биологии и генной инженерии свидетельствуют о принципиальной возможности применения биоинженерных технологий для получения и ускоренного размножения высокоценных племенных животных. Разработка эффективных технологий получения трансгенных и клонированных животных в принципе позволяет за одно поколение достигать большего генетического прогресса, чем методами классической селекции за десятилетия.

Биоинженерные технологии, основанные на прямом переносе дополнительных генов в геном животных, с целью генетического совершенствования животных, дают возможность:

1) получать селекционный эффект по отдельным признакам в несколько раз быстрее, чем при обычной селекции;

2) внедрять в популяцию определенный ген, не комбинируя, как при естественном скрещивании, множеством неизвестных, и часто нежелательных генов, а вводя в геном животного отдельный ген или группу генов, определяющих конкретный признак.

3) достигать изменения признаков, которые до последнего времени не поддавались селекции (устойчивость к вирусным инфекциям);

4) создавать генетические варианты, которые никогда не существовали у животных данного вида (например, продукция лекарственных веществ с молоком);

Все эти преимущества биоинженерных технологий послужат основой для резкого ускорения селекционного процесса, что позволит существенно повысить продуктивность сельскохозяйственных животных и качество полученной продукции и, возможно, изменят наши представления о коммерческой значимости сельскохозяйственных животных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Иванова, Лариса Борисовна

ВЫВОДЫ

1. Выделены и клонированы регуляторные последовательности гена asi-казеина быка. Амплифицированные 5'- и 3'- фрагменты ДНК включают функциональные элементы (промоторную область, ТАТА-бокс, сигналы сплайсинга и полиаденилирования) гена asi-казеина быка, обеспечивающие тканеспецифическую экспрессию генов в молочной железе животных.

2. Создана рекомбинантная плазмида paslEpo, содержащая ген эритропоэтина человека. Сконструированный вектор обладает необходимыми компонентами для тканеспецифической экспрессии гена эритропоэтина человека в клетках молочной железы животных.

3. Выделен и клонирован фрагмент ДНК, содержащий ген гранулоцит колониестимулирующего фактора человека, рестрикт-ный анализ которого соответствует опубликованной рестриктной карте, а нуклеотидная последовательность фрагмента идентична последовательности нуклеотидов гена гранулоцит колониестимулирующего фактора человека, за исключением позиции 548 во втором интроне, в которой выявлена замена С на Т.

4. Получена рекомбинантная плазмида pGCm, включающая структурный ген гранулоцит колониестимулирующего фактора человека и регуляторные элементы гена asi-казеина быка, наличие которых позволяет обеспечивать специфическую экспрессию гена в тканях молочной железы трансгенных животных.

5. Предложенный способ предварительной обработки эмбрионов с использованием рестриктазы Dpnl и протеиназы К позволяет исключить ложноположительные ответы при проведении детекции трансгена у эмбрионов ранних стадий развития.

6.Созданная генная конструкция, содержащая ген эритропо-этина человека под контролем промотора гена asi-казеина быка, при ее использовании в составе ретровирусного вектора проявляет тканеспецифическую экспрессию в эпителиальных клетках молочной железы сельскохозяйственных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При анализе интеграции трансгена на стадии эмбриона рекомендуется использовать предложенный способ предамплифи-кационной обработки образцов ферментами Брп1 и протеиназой К для снижения ложноположительных ответов и более точной идентификации трансгена.

2. Созданные генные конструкции, содержащие гены эри-тропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека, могут быть использованы и используются в разработке технологии трансгенеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванова, Лариса Борисовна, 2002 год

1. Амиров А.Р. Совершенствование некоторых этапов технологии получения трансгенных сельскохозяйственных животных / автореф. дисс. на соиск. уч. ст., 1997

2. Брэм Г., X. Кройслих, Г. Штранцингер. Экспериментальная генетика в животноводстве. Основы методов в биотехнологии. 1995.-М. - С. 183

3. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйственных животных, М.: Агропромиздат. - 1990. - 511С.

4. Гловер Д. Клонирование ДНК. Методы. М.: Мир. - 1988. -С. 538

5. Гольдман И.Л., Захарова Е.С., Якубовская Р.И.и др. Лакто-феррин: свойства и перспективы биотехнологического производства // Биотехнология. 1998. - N 4. - С. 3-16

6. ДыбанАЛ. Трансгенные млекопитающие в биологии развития // Онтогенез. 1989. - Т. 6. - С. 577-589

7. Зиновьева H.A., Эрнст Л.К., Брем Г. / Трансгенные животные и возможности их использования. ВИЖ. - 2000. - С. 37-39

8. Иванова М.М., Народицкий Б.С. Перспективы использования современных методов введения генетического материала вэмбрионы млекопитающих // Сельскохозяйственная биология. 2000.-N 2.

9. Ю.Кетлинский С.А., Симбирцев A.C., Воробьев A.A./ Эндогенные иммуномодуляторы 1992. - С.-Пб. - Гиппократ.- 256 С.

10. J1 урияС., Дарнслл Дж., Балтимор Д. и др. Общая вирусология. М. - 1981

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир. - 1984. - С. 479

12. Попов JI.C., Коробко И.В., Андреева JT.E. и др., О функциональной значимости 5'-области гена k-казеиа быка // Доклады Академии наук.- 1995.-Т. 340.-N 1.-С. 111-113

13. Попова Е.А. Эмбриоинженерные аспекты повышения эффективности получения трансгенных животных / автореф. дисс. на соиск. уч. ст., 2000.

14. П.Свердлов Е. В. Очерки современной молекулярной генетики. // Мол. генетика, микробиология и вирусология. 1996. - N 4

15. Сойфер В.Н. Исследования геномов к концу 1999 года // Со-росовский образовательный журнал 2000. - Т. 6.-N 1.-С. 24

16. Титова В.А. Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве / автореф. дисс. на соиск. уч. ст., 2001

17. Транскрипция и трансляция. Методы, под ред. Б. Хеймса, С.Хиггинса. М. - Мир. - 1987. - С.69

18. America society of Clinical Oncology. Recommendation for the us hemapoetic colony-stimulating factorts: evidence-based, clinical practice guidelines // Jour, of Clinical Oncology. 1994. - N 12.-P. 2471-2508

19. Alexander L.J., SteWart A.F., Mackinlay A.G. et al. // Eur. J. Biochem. 1988. - Y. 178. - P. 395-401

20. Archibald A.L., McClenaghan M., Hornsey V. et al. High-level expression of biologically active human pi-antitrypsin in the milk of transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 1990. - V. 87. -P. 5178-5182

21. Bayna E.M., Rosen J.M. Tissue-specific, high-level expression of the rat whey acidic protein gene in transgenic mice // Nucl. Acids Res.-1990. -V. 18. -N 10. P. 2977-2985

22. Birnboim N.C., Doly J. A rapid alcaline extraction procedure for serening recombinant plasmid DNA // Nucl. Aids Res.- 1979. -V.7.-P. 1513-1523

23. Bischff R., Degryse E., Perraud F. et al. A 17.6 kbp region lo-calisated upstream of the rabbit WAP gene directs high level expression of a functional human protein variant in transgenic mouse milk // FEBS Lett. 1992. - V. 305. - P. 265-268.

24. Blin N., Stefford D.W. A general method for isolation of high molecular weight DNA from eucaryotes // Nucl. Asids Res. -1976. -V.3.- P. 2303-2308

25. Bonsing J., Ring J.M., Stewart A.F. et al. // Aust.J.Biol. 1988. -V. 41.-P. 527-537

26. Bowen R.A., Reed M., Schnieke A. et al. Production of transgenic cattle from PCR-screened embryos // Thereogenology.1993.-V. 39.-P. 194

27. Brem G., Harti P., Besenfelder U. et al. Expression of synthetic cDNA sequences encoding hums insulin-like growth factor-1 (IGF-1) in to mammary gland of transgenic rabbits // Gene.1994.-V. 149.-P. 351-355

28. Brem G., Harti P. High-level expression of pro- chymosin in the of transgenic rabbits // Frontiers of Biotechnology in Agriculture. 1991. - Sea of Galilee. Israel. - V. 22. - Abstr.

29. Brinster R. L., Chen H. Y., Traumbauer M. E. et al. Factors affecting the efficiency of introducting foreing DNA into mice by microinjection eggs // Proc. Natl. Acad. Sei USA. 1985. - V. 82. . p. 4438-4442

30. BuhlerTh.A., Bruyere Th., Went D.R. et al. Rabbit B-casein promoter directs secretion of human interleukin-2 in the milk of transgenic rabbits // Bio/Technology. 1990. - V. 8. - P. 140-143

31. Burdon T.G. and Wall R.J. Fate of microinjected genes in preim-plantation mouse embryos // Mol. Rep. Dev. 1992. - N 33. - P. 436-442

32. Butler S.P., van Cott K., Subrumanian A. et al. Current progress in the production of recombinant human fibrinogen in the milk of transgenic animals // Thromb Haemost. 1997. - V. 78. - P. 537542

33. Chada K., Magran J., Raphael K. et al // Nature. 1985. - V. 314. -P. 377

34. Clark A.J., Bessos H., Bishop J.O. et al. Expression of human antihemophilic Factor IX in the milk of transgenic sheep // Bio/Technology. 1989. - V. 7. - P. 487-492

35. C h a n A.W., H o m a n E.J., B a 1 1 o u L.U. Transgenic cattle produced by re verse transcribed gene transfer in oocytes // Proc. Natl. Acad. Sci. 1998. - V. 95. - N 24. - P. 14028-14033

36. Cousens C., Carver A.S., Wilmut I. et al. Use of PCR-based methods for selection of integrated tragenes in preimplantation embryos // Mol. Rep. Dev. 1994. - V. 39. - P. 384-391

37. Denivoy E., Thepot D., Stinnakre M.-G. // Transgene Res. 1994. -V. 3.-P. 79-89

38. Denman J., Hayes M., O'Day C. et al. Transgenic expression of a variant of human tissue-type plasminogen activator in goat milk: Purification and characterization of the recombinant enzyme // Bio/Technol. 1991. - V. 9. - P. 839-843

39. Di Fruscio M., WeiherH., Vanderhyden B.C. et al. Proviral inac-tivation ol the Npat ysrve of Mpy 20 mice results in early embi-yonic arrest // Mol. Cell. Biol. 1997. - V. 17. - N 7. - P. 40804086

40. Doppler W., Groner B., Ball R.K. Prolactin and glucocorticoid hormones synnergistically induce expression of transfected rat a-casein gene promoter constructs in a mammary epithelial cell line // PNAS. 1989. - V. 86. - P. 104-108

41. Drohan W.N., Young J.M., Lubon H. et al. Expression of human protein C in the milk c transgenic mice and pigs // Thromb. Haemostasis. 1991. - V. 65. - P. 465

42. Ebert K.M., Schlndler J.E.S. Transgenic farm animals: progress report // Theriogenology. 1993. - V. 39. - P. 121-135

43. Ebert K.M., Selgrath J.P., DiTullio P. et al. Transgenic production of a variant of human tissue-type plasminigen activator in goat milk: generation of transgenic goats and analysis of expression // Bio/Technol. 1991. -V. 9. - P. 835-838

44. Ferretti C., Leont P., Scaramella V., // Nucleic Acids Res. -1990.-V. 18.-P. 6829-6833

45. Gasson J.C., Weisbart R.H., Kaufman S.E. // Science. 1984. - V. 226.-P. 1339-1342

46. Gordon K., Lee E., Vitale J.A., Smith A. I., Westphal H. et al., Production human tissue plasminogen activator in transgenic mouse milk // Bio/Thechnology. 1987. - V. 5. - P. 1183-1187

47. Green E.D. and Olson M.V. Systematic screening of yeast artificial- chromosome libraries by use of the polymerase chain reaction // Proc. Natl. Acad. Sci., 1990, 87:1213-1217.

48. Greenberg N.M., Anderson J.W., Hsueh A.J.W. et al. Expression of biologically active heterodimeric bovine follicle-stimulating hormone in milk of transgenic mice // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1991. -V. 88. - P. 8327-8331

49. Groenem M.A.M., Dijkhof R.J.M., Verstege A.G.M. // Gene. -1993.-V. 123.-P. 187-193

50. Grosclande F., Mahe M.F., Brignon G., Di Statio L., Jennet R. // Genetic Sil. Evol. 1987. - V. 19. - P. 199-412

51. Gunzburg W.H., Salmons B., Zimmermann B. et al. A mammary-specific promoter directs expression of growth hormone not only to the mammary gland, but also to Bergman glia cells intransgenic mice // Molec. Endoorinol. 1991. - V. 5. - P. 123133

52. H a s k e 1 1 R.E., B o w e n R.A. Efficient production of transgenic cattle by retroviral infection of early embryos // Mol. Re-prod. Dev. 1995. - V. 40. - P. 386-390

53. Hall L., Emery D.C., Davles M.S. et al. Organization and sequence of the human a-lactalbumin gene // Biochem. J. 1987. -V. 242.-P. 735-742

54. Henninghausen L. The mammary gland as a bioreactor: Production of foreign protein in milk // Protein expression and purification. 1990. - V. l.-P. 3-8

55. Hill K.L., Curry J., DeMayo F.J. et al. Production of transgenic cattle by pronuclear injection // Theriogenology. 1992. - V. 37. -P. 222

56. Horvat S., Medrano J.F., Behboodi E. et al. Sextingand detection gene construct in microinjected bovine blastocysts using the PCR // Transgene Res. 1993. - V. 2. - P. 134-140

57. Jaenisch R., Dausman J., Cox V. et al. Infection of developing mouse embryos with murine leukemia virus: tissue specificity and genetic transmission of the virus // Hamatol. Bluttransros. 1976. -V. 19.-P. 341-356

58. Jaenish R. Transgenic animals // Science. 1988. - V. 240. - P. 1468-1474

59. Jang Ho Ko, Chul-Sand Lee, Kui Huin Kim et al. Production of biologically active human granulocyte colony stimulating factor in the milk of transgenic goat // Transgenic Research. 2000. - V. 9. -P. 215-222

60. Janne J., Hyttinen J.-M., Peura T. et al. Transgenic animals as bioproducers of therapeutic proteins // Ann.Med. 1992. - V. 24. -P. 273-280

61. Kay M.A., Liu D., Hoogerbrugge P.M. Gene therapy // Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 1997. - V. 94. - P. 12744-12746

62. Korhonen V.P., Tolvanen M., Hyttinen J.M. et al. Expression of bovine beta-lactoglobulin/human erythropoetin fusion protein in the milk of transgenic mice and rabbits // Eur J Biochem. 1997. -V. 245.-P. 482-489

63. Kozan D., Hobon G., Seifert H.M. Genomic organization of the bovine a -SI-casein gene // Nucleic Asids Res. 1991. - P. 5591-5596

64. Krimpenfort P., Rademakers A., Eyestone W. et al. Generation of transgenic dairy cattle using "in vitro" embryo production // Bio/Technology. -1991. -V. 9. P. 844-847

65. Krisher R. L., Gibbons J. R., Canseco R. S. et al. Influence of time of gene microinjection on development and DNA detection frequency in bovine embryos // Transgenic Res. 1994. - V. 3. - N 4. - P. 226-231

66. Kushner S.R. An improved method for transformation of E.coli with ColEl-derived plasmids // Genetic engeneering.- Amsterdam ets: Elsier. 1978. - P. 17-23.

67. Li Q., Zhou B., Powers P. et al. Primary structure of the goat ß-globin locus control region // Genomics. 1991. - 9. - P. 488-499

68. Lieshke G.J., Cebon J., Morstyn G. 11 Blood. 1989. - V. 74. - P. 2634- 2643

69. Lu Y.F., Tian C., Deng J.X. et al. Cloning of human G-CSF genomic gene and its expression transgenic mice mammary gland // ChuanNsuehPao. 1999. -V. 26. -N4. - P. 281-287

70. Magram J., Chada K., Constantini F. // Nature. V. 315. - P. 388

71. Marcowitz D., Goff S., Bank A. Construction and use of a safe and efficient amphotrofic packaging cell line // Virology. 1988. -V. 167.-P. 400-406

72. Massoud M., Attal J., Thepot D. et al. The deleterious effectc of human erythropoietin gene driven by the rabbit wtey acidic protein gene promoter in transgenic rabbits // Reprod. Nutr. Dev.-1996. V. 36. - N 5. - P. 555-563

73. McFadden T.B., Akers R.M., Karmer G.W. a-lactalbumin in bovine serum: relationship with udder development and function // J. Dairy Sci. 1987. - V. 70. - P. 259-264

74. Mead H., Gates L., Lacy E., Lonberg N. Bovine alpha asl- casein gene sequences direct high level expression of active human urokinase in mouse milk // Bio/Technol. 1990. - V. 8. - P. 443446

75. Miller D.A., Rosman G.J. Impruved retroviral vectors for gene transfer and expression // BioTechniques. 1989. - V. 7. - N 9. -P. 980-990

76. Nagato S., Tsuchiya M., Asano S., Yamamoto O., Hirata Y., Ki-bota N., Oheda M., Nomura H. and Yamazaki T. The chromosomal gene structure and two mRNAs for human granulocyte colony-stimulating factor // EMBO. 1986. - V. 5. - N 3. - P. 575581

77. Nhreadhill D.W., Womack J.K. // Nucleic Acids Res.- 1990. V. 18.- P. 6935-6942

78. Nicola N.A., Begley C.G., Metcalf D. // Nature. 1985. - V. 321.- P. 625-628

79. Nimoniya T., Hoshi M., Mizuno et al. Selection of mouse preim-plantation embryos earring DNA by polymerase chain reaction // Mol. Reprod. Develop. 1989. - V.l. - P. 242-248

80. Ninomiya T., Hirabayashi M., Sagara J., Yuki A. // Mol. Reprod. Dev. 1994. -V. 37. -P. 273-2830

81. Page R.L. Caneso R.S., Russell C.G. et al. Transgene detection during early murine embryonic development after pronuclear microinjection// Transgenic Res. 1995. - V.4. - P. 12-17

82. Palmiter R.D. and Brinster R.L. Germ-line transformation of mice // Ann.Rev.Genet. 1986. - V. 20. - P. 465-499

83. Peura T., Hyttinen J.-M., Turunen M. et al. Birth of calves developed from embryos of predetermined sex // Acta vet. scand. -1991.-V. 32.-P. 283-286

84. Pittius C.W., Henninghausen L., Lee E. et al. A milk protein gene promoter directs the expression of human tissue plasminogen activator cDNA to the mammary gland in transgenic mice // Proc.Natl.Acad.Sci. U.S.A. 1988. - V. 85. - P. 5874-5878

85. Reddy V.B., Vitale J.A., Wei C. et al. Expression of human growth hormone in the milk of transgenio mice // Anim. Bitech-nol. 1991. - V.2.-P. 15-29

86. Rlego E., Limonta J., Auguilar A. et al. Production of transgenic mice and rabbits that carry and express human tissue plasminogen activator cDNA under the control of a bovine al-pha-sl- casein promoter // Theriogenology. 1993. - V. 39. - P. 1173-1185.

87. Robinson G.W, McKnight R.A, Smith G.H. et al. Mammary epithelial cells undergo transient differentiation in cycling virgins but require pregnancy for the establishment of terminal differentiation // Development. 1995. -V. 121. - P. 2079-2083

88. Sambrook J, Fritsch E.F, Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual / Cold Spring Harbor Laboratory Press. -1989

89. Seo B.B, Kim C.H, Yamanouchi K. et al, Co-injection of restriction enzime with foreing DNA into the pronucleus for elevating prodaction efficiencies of transgenic animals // Anim. Reprod. Sci. 2000. - V. 63.-N 1-2.-P. 113-122

90. Serizawa I, Amano K, Ishii H. et al. Long-term overexpression of human granulocyte colony-stimulating factor in transgenic mice: neutrophilia with no increased mortality for more than one year // Cytokine. 2000. - V. 12. - N 6. - P. 630-635

91. Shu-Hua Y, Deen K.C, Lee E. et al. Functional human CD4 protein produced In milk of transgenic mice // Mol. Biol. Med. -1988.-V. 6.-P. 255-261

92. Siemieniak D.R, Sieu L.C. Slightom J.L. Strategy and methods for directly sequencing cosmid clones // Analytical Biochemistry. -1991.-V. 192.-P. 441-448.

93. Steward C, Harbers K, Jahner D. et al. X-chromosome-linkedtransmission and expression of retroviral genomes microinjected into mouse zygotes // Science. 1983. - V. 221. - P. 760-762

94. Stinnacre M.S., Vilotte J.L, Soulier 3, et al. The bovine R-lact-albumin promoter directs expression of ovine trophoblast interferon in the mammary gland of transgenic mice // Fed. Eur. Bio-chem. Soc. 1991. - V. 284. - P. 19-22

95. S t u h I m a n n H, Jaenisch R,Mulligan R.C. Transfer of a mutant dihydrofo-late reductase gene into pre- and postimplantationmouse embryos by a replication-competeni retrovirus vector 11 J. Virol. 1989. - V. 63(11). - P. 4857-4865

96. Thredgill D.W., Womack J. E . // Nucleic Asids Res. 1990. -V. 23.-P. 6935-6942

97. Tomasetto C., Wolf C., Rio M.-C. et al. Breast cancer protein PS2 synthesis in mammary gland of transgenic mice and secretion into milk // Molec. Endocrinol. 1989. - V. 3. - P. 15791584

98. Townes T.M., Lingrel J.B., Chen H.J et al. // EMBO J. -1985. -V. 4.-P. 1715

99. Uusi-Oukari M., Hyttinen J.M., Korhonen V.P. et al. Bovine alpha sl-caseine gene stimulating factor in the milk of transgenic mice // Transgenic Res. 1997. - V. 6. - N 1. - P. 75-84

100. Van Cott K.E., Williams B., Velander W.H. et al. Affinity purification of biologically active and inactive forms of recombinant human protein C produced in porcin mammary gland // J. Mol. Recognit. 1996. - V. 9. - P. 407-414

101. Van den Ouweland Ans M.W., Kioschis P., Verdijk M. et al. Identification and characterization of a new gene in the human Xq28 region // Human Mol. Genet. 1992. - V. 1. - N 4. - P. 269-273

102. Van der Putten H.,Botteri P.M., Miller A.D. Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors // Proc. Natl. Acad. Sei. 1985. -V. 82. - P. 148-152

103. Van der Putten H.,Botteri P.M., Miller A.D. Efficient insertion of genes into the mouse germ line via retroviral vectors // Proc. Natl. Acad. Sei. 1985. - V. 82. - P. 148-152

104. Velander W.H., Johnson J.L., Page R.L. et al. High-level expression of a heterologous protein in the milk of transgenicswine using the DNA encoding human protein C // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1992. - V. 89. - P. - 12003-12007

105. Wall R.J. Biotechnology for the production of modified and innovative animal products: transgenic livestock bioreactors // Transgenic Res.- 1998. -P. 364-378

106. Wall R.J., Rexroad C.E., Powell A. et al. Synthesis and secretion of the mouse whey acidic protein in transgenic sheep // Transgenic Res. 1996. - 5. - P. 67-72

107. Wilmut I., Archibald A.L., Harris S. et al. Modification of milk composition // J. Reprod. Fert. 1990. - V. 41(Suppl). - P. 135146

108. Wright G., Carver A., Cottom D. et al. High level expression of active human alpha-1-antitrypsin in the milk of transgenic sheep // Bio/Technol. 1991. -V. 9. - P. 830-834

109. Yamada T., Kaneko H., Iizuka K. et al. Elevation of lymphocyte and hematopoetic stem cell numbers mice transgenic for human granulocyte CSF // Lab. Invest. 1996. - V. 74. -N 2. -P. 384-394

110. Yom H.C., Bremel R.D. Genetic enginiring of milk composition: modification of milk components in lactating transgenic mice // Am. J. Clin. Nutz. 1993. - V. 58. - P. 2995-3065