Создание молекулярных автоматов на основе олигонуклеотидов\nи их применение при выделении клеточных популяций\n тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Рудченко Мария Николаевна

• Рудченко Мария Николаевна
• кандидат наук
• 2016

Оглавление диссертации кандидат наук Рудченко Мария Николаевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Применение самособирающихся структур на основе нуклеиновых кислот

1.1.1. Аптамеры

1.1.2. Структуры и материалы

1.1.3. Подвижные молекулы

1.1.4. Элементы компьютеров

1.1.5. Ферменты

1.1.6. Молекулярные автоматы

1.1.7. «Умные» лекарства

1.2. Методы выделения клеточных популяций

1.2.1. Механические и гидродинамические методы разделения клеток

1.2.2. Электрофоретические методы разделения клеток

1.2.3. Микрофлюидные устройства

1.2.4. Оптофорез

1.2.5. Проточная цитофлуорометрия

1.2.6. Магнитная сепарация

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Выделение лейкоцитарной фракции клеток крови

2.2. Олигонуклеотиды и конъюгация олигонуклеотидов с антителами

2.2.1. Методика получения конъюгатов олигонуклеотид-антитело (на примере получения конъюгата Ритуксан-олигонуклеотид)

2.2.2. Определение концентрации олигонуклеотидов

2.3. Очистка конъюгатов олигонуклеотид-антитело с помощью гель-фильтрации

2.4. Аналитическая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

2.5. Последовательности олигонуклеотидов

2.6. Методика проведения каскада последовательного замещения олигонуклеотидов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности

2.7. Методика проведения каскада последовательного замещения олигонуклеотидов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности в цельной крови

2.8. Методика выделения клеточных популяций с помощью «молекулярных автоматов» на примере СБ3 Т-лимфоцитов

2.9. Проточная цитофлуорометрия и статистический анализ

2.10. Иммунофенотипическое окрашивание

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Конструирование «молекулярного автомата»

3.1.1. Введение

3.1.2. Теоритические основы для создания молекулярных автоматов

3.1.3. Апробирование работы молекулярного автомата в растворе

3.1.4. Оптимизация нуклеотидных последовательностей олигонуклеотидов, использованных для конструирования молекулярных автоматов

3.2. Создание молекулярного автомата для одновременного определения наличия двух маркеров на клеточной поверхности

3.2.1. Теоритические основы для создания молекулярных автоматов для одновременного определения двух маркеров на клеточной поверхности

3.2.2. Разработка методики прямого конъюгирования антител с олигонуклеотидами

3.2.3. Экспериментальная модель, использованная для изучения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов

3.2.4. Функциональное тестирование работы конъюгатов антитело-

олигонуклеотид

3

3.2.5. Апробация молекулярных автоматов с использованием конъюгатов олигонуклеотид-антитело

3.2.6. Апробация использования молекулярного автомата с целью определения отдельной лимфоцитарной субпопуляции

3.2.7. Каскады последовательного замещения олигонуклеотидов протекают только при условии наличия на клеточной поверхности всех определяемых маркеров

3.2.8. Избыток конъюгатов олигонуклеотид-антитело, находящихся в растворе, не влияет на прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов

3.2.9. Прохождение каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов не зависит от определенного олигонуклеотида и определенного антитела, составляющих конъюгат

3.3. Создание молекулярного автомата для определения редких популяций клеток

3.4. Создание молекулярного автомата для одновременного определения трех маркеров

3.5. Апробация работы молекулярного автомата в цельной крови

3.6. Использование молекулярных автоматов для выделения индивидуальных клеточных популяций

3.6.1. Выделение СБ3 Т-лимфоцитов с помощью молекулярного автомата

3.6.2. Выделение наивных СБ3 Т-лимфоцитов с помощью молекулярных автоматов

3.6.3. Выделение наивных СБ4 Т-лимфоцитов с помощью молекулярных автоматов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

121

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВИЧ - Вирус Иммунодефицита Человека

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ДТТ - дитиотреитол

МКМ - микроканальная кремниевая матрица РНК - рибонуклеиновая кислота РНКазы - рибонуклеазы

РТПХ - реакция трансплантат-против-хозяина тРНК - транспортная РНК ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота 7-AAD - 7-актиноаминомицин D

alloSCT - аллогенные гемопоэтические стволовые клетки

BMH (Bismaleimidohexane) - бисмалеимидогексан

CD (Cluster of differentiation) - кластер дифференцировки

CDMi - кластер дифференцировки маркер

CDM2 - кластер дифференцировки маркер

c-Met - рецептор фактора роста гепатоцитов

Cy5TM - флуоресцентный краситель цианин

ЕрСАМ - молекулы адгезии эпителиальных клеток

6-FAMTM (Carboxyfluorescein) - флуоресцентный краситель флуоресцеин RNAMDB (RNA Modification Database) - база данных модификаций РНК SELEX (Systematic evolution of ligands by exponential enrichment) -систематическая эволюция лигандов экспоненциальным обогащением

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание молекулярных автоматов на основе олигонуклеотидов\nи их применение при выделении клеточных популяций\n»

ВВЕДЕНИЕ

Многоклеточные организмы состоят из различных типов клеток, которые в той или иной степени отличаются друг от друга по строению и функциям. Тем не менее, многие клетки, относящиеся к различным типам, могут быть морфологически неразличимы. В этом случае отличительными признаками могут являться маркеры клеточной мембраны. Мембранные маркеры — это, как правило, белковые молекулы, расположенные на клеточной мембране. Их уникальные сочетания (репертуары) часто свойственны лишь определенным популяциям или субпопуляциям клеток, а также могут характеризовать определенную стадию клеточной дифференцировки. Чужеродные и/или раковые клетки также часто отличаются от нормальных клеток организма специфическими маркерами, присутствующими на их поверхности.

Наличие уникальных для определенной популяции клеток наборов антигенов на клеточной поверхности стало основой для создания специальных методов идентификации клеточных популяций, а также для создания методов выделения клеток определенного типа. Однако несмотря на то, что такие методы выделения неплохо отработаны, при наличии в системе нескольких типов клеток, в том числе, раковых клеток процесс разделения существенно усложняется, и выделение определенных субпопуляций клеток может быть возможным только при помощи многоступенчатых процедур. Такие процедуры не только затратны и требуют значительного времени, но и часто приводят к тому, что большая часть клеток, прошедших многоступенчатый процесс очистки, оказывается поврежденной и не годится для дальнейших приложений.

В данной работе был сконструирован «молекулярный автомат», собирающийся на поверхности живых клеток, который может быть использован для идентификации и выделения уникальных популяций клеток.

Для построения «молекулярного автомата» были использованы свойства комплементарности ДНК. В работе предложены каскады последовательного замещения олигонуклеотидов, часть из которых была связана с клеточными поверхностными маркерами. В результате прохождения таких каскадов за счет более высокой энергии связывания одних олигонуклеотидов с другими происходит их последовательное вытеснение. Визуализация прохождения каскадов последовательного замещения олигонуклеотидов становится возможной при использовании флуорофоров, а также гасителей флуоресценции, которые, являясь сшитыми ковалентно с олигонуклеотидами, при замещении одних олигонуклеотидов другими оказываются либо сближенными, либо, наоборот, разделенными. В результате, можно регистрировать усиление или снижение флуоресцентного сигнала. Таким образом, результатом работы созданного «молекулярного автомата» является то, что при наличии определенного набора мембранных маркеров на клеточной поверхности становится возможным визуализировать такую клетку, а также выделить в один шаг популяцию клеток, содержащих определенный набор поверхностных маркеров.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Применение самособирающихся структур на основе нуклеиновых кислот

Нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) являются обязательными компонентами всех живых клеток. В соответствии с центральной догмой молекулярной биологии, основной функцией ДНК является хранение генетической информации, в то время как основной функцией РНК является ее реализация [1]. Являясь носителями генетической информации ДНК и/или РНК также входят в состав всех вирусов и мобильных генетических элементов.

Нуклеиновые кислоты состоят из мономеров, дезоксирибонуклеотидов или рибонуклеотидов, соединенных друг с другом фосфодиэфирными связями. Структурные различия дезоксирибонуклеотидов и рибонуклеотидов, соответственно, определяют различия в структурах и свойствах образуемых на их основе полимеров. Так, например, ДНК свойственна значительно более высокая температура плавления, чем РНК. Кроме того, ДНК является более химически стабильной молекулой. В то же время молекулы РНК способны образовывать большее разнообразие пространственных структур, чем ДНК [2, 3]. Открытие Ватсоном и Криком двойной спирали ДНК положило начало для дальнейших интенсивных исследований в области физико-химической биологии нуклеиновых кислот. Эти исследования выявили, в том числе, и то, что двуцепочечные РНК или хотя бы двуцепочечные участки в молекулах РНК можно наблюдать почти у всех живых организмов. Кроме того, двуцепочечная РНК может образовываться в клетке в качестве продукта синтеза вирусной РНК. Образование в клетке двуцепочечных участков РНК индуцирует процессы РНК-интерференции, которые являются одним из базовых защитных

механизмов клетки от мобильных генетических элементов, приводящих к деградации РНК-мишени. Такой принцип широко используется эукариотическими клетками не только для защиты от вирусных патогенов, но и для обеспечения регуляции экспрессии собственных генов с помощью механизмов посттранскрипционного умолкания генов [4, 5].

РНК у представителей всех царств живых организмов содержит относительно высокое количество неканонических оснований [6, 7]. В соответствии с информацией, содержащейся в базе данных модификаций РНК (RNA Modification Database; RNAMDB), к настоящему моменту известно более чем 100 модифицированных оснований, встречающихся в природных РНК [7]. Образование неканонических оснований в молекулах РНК в результате посттранскрипционных модификаций, обладающих уникальными физико-химическими свойствами, дополнительно расширяет структурно-функциональные свойства этих полимеров [6, 8, 9].

Исследования, посвященные структурно-функциональным свойствам обнаруженных в природе нуклеиновых кислот, в первую очередь, молекул РНК, включая и проявление ими энзиматической активности, привело к появлению гипотезы, названной «мир РНК», предполагающей этап возникновения жизни на Земле, в ходе которого конгломераты молекул рибонуклеиновых кислот выполняли как функцию хранения генетической информации, так и катализ химических реакций [10, 11].

Структурные особенности ДНК и РНК, в частности, способность нуклеотидов образовывать между собой водородные связи и формировать комплементарные комплексы, позволяют этим молекулам выполнять функции, отличные от хранения и реализации биологической информации. Особенно перспективным является использование нуклеиновых кислот в качестве наноматериалов и наноустройств в биотехнологии. Наноматериалы на основе нуклеиновых кислот представляют собой молекулы, способные собираться в высокомолекулярные комплексы, образуя устойчивые структуры. Первая часть данного литературного обзора посвящена

рассмотрению различных самособирающихся структур на основе нуклеиновых кислот, и их возможные практические применения.

1.1.1. Аптамеры

Одно из перспективных прикладных направлений исследований нуклеиновых кислот направлено на применение молекул РНК и ДНК в качестве аптамеров - молекул, способных специфично связываться с молекулой-мишенью, выполняя таким образом функции лигандов или рецепторов [12-14]. Термин аптамер происходит от латинского слова aptus, что означает «подходящий», и греческого слова ^spo<;, что означает «часть». Таким образом, аптамерами стали называть небольшие одноцепочечные молекулы ДНК или РНК, которые способны образовывать сложные трехмерные структуры. Такие пространственные структуры определяют основное свойство аптамеров - проявление высокоспецифичной избирательности при взаимодействии с молекулами-мишенями. Обычно перспективные кандидаты для аптамеров отбираются с помощью методики SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment), которая была предложена в 1990 году сразу двумя независимыми группами исследователей [15, 16]. Эта методика основана на экспоненциальном обогащении потенциальных лигандов из библиотеки случайных последовательностей синтетической РНК или ДНК. Для отбора оптимальной последовательности аптамера синтетическую смесь олигонуклеотидов (библиотеку) инкубируют совместно с интересуемой молекулярной мишенью. При этом олигонуклеотиды, не способные взаимодействовать с мишенью, отмываются, в то время как олигонуклеотиды, способные к специфичному взаимодействию - амплифицируются. Процедуру повторяют несколько раз, и, в результате, становится возможным получить смесь, содержащую небольшое количество олигонуклеотидов, обладающих высоким сродством к интересуемой мишени. После завершения обогащения библиотеки остается лишь определить нуклеотидные последовательности

отобранных олигонуклеотидов и синтезировать их в количествах необходимых для проведения функциональных тестов [17, 18].

В силу своей природы аптамеры, в первую очередь, нашли свое применение в исследованиях взаимодействий белков с нуклеиновыми кислотами [19]. Кроме того, к настоящему времени созданы аптамеры, способные специфично распознавать патогенные для человека бактерии и одноклеточные организмы (Salmonella enteritidis и Trypanosoma cruzi). Такие аптамеры могут быть использованы в качестве сенсоров, с помощью которых можно выявлять чрезвычайно низкие концентрации патогенных клеток [20, 21]. На основе ДНК создан аптамер, связывающий и ингибирующий тромбин, который, таким образом, является перспективным кандидатом для создания нового поколения лекарственных препаратов, обладающих фармакологической активностью антикоагулянтов прямого действия [22]. Были созданы аптамеры на основе ДНК, способные распознавать глюкозу [23]. Такие аптамеры могут найти широкое применение в диагностике и лечении сахарного диабета [24, 25]. Созданы аптамеры, которые способны специфично связываться с определенными белками на клеточной поверхности [26, 27]. Было показано, что так называемые би-специфичные аптамеры на основе ДНК, которые способны, с одной стороны, связываться с рецептором CD16a больших гранулярных цитотоксических лимфоцитов, а также обладающие сродством к c-Met, повышенная экспрессия гена которого часто выявляется во многих видах опухолевых клеток, способны стимулировать цитотоксический эффект [28].

В сравнении с иммуноглобулинами, аптамеры, как правило, являются более стабильными молекулами, а их небольшой размер обеспечивает лучшее проникновение в органы и ткани [29]. Обычно аптамеры обладают низкой токсичностью и иммуногенностью, что важно при создании новых лекарственных средств на основе аптамеров [29, 30]. Таким образом, аптамеры являются перспективной основой для создания новых диагностических систем, лекарственных препаратов и сенсоров.

1.1.2. Структуры и материалы

Методика БЕЬЕХ безусловно является мощным экспериментальным инструментом, позволяющим относительно быстро отобрать наиболее перспективные последовательности ДНК или РНК, обладающие необходимыми свойствами. В то же время, интенсивное развитие методов биоинформатики и молекулярного моделирования привело к тому, что в настоящий момент появились возможности направленного теоретического расчета для предсказания последовательностей ДНК или РНК, обладающих заданными структурными и функциональными свойствами [31]. Благодаря своим уникальным физико-химическим свойствам ДНК может применяться при создании достаточно сложных наноразмерных структур и даже наномашин. Используя способность ДНК к формированию двойных спиралей за счет комплементарных взаимодействий, можно на основании расчетов предсказывать способность определенной молекулы ДНК самособираться в сложные пространственные структуры [32, 33].

Одной из первых работ, посвященных построению трехмерных фигур на основе нуклеиновых кислот, стала работа под руководством Надриана Симана, в которой в 1991 году было описано конструирование куба, ребра которого были представлены двойной спиралью ДНК [32]. Такой куб стало возможным получить в процессе самосборки трех комплементарно взаимодействующих между собой дезоксирибоолигонуклеотидов, которые в начале собирались в пространственные структуры, образующие вершины куба, а также части трех граней (Рис. 1.1.А). При этом в таких структурах оставались свободными так называемые «липкие концы», которые на следующем этапе самосборки, взаимодействуя друг с другом, приводили к образованию куба (Рис. 1.1.Б). Для стабилизации куба на финальной стадии использовалась ДНК-лигаза с целью фиксации финальной структуры ковалентными связями. В дальнейшем на основе ДНК были созданы и другие геометрические фигуры, такие как треугольники, октаэдры и др. (Рис. 1.В) [34, 35].

Рис. 1.1. Создание пространственных структур на основе ДНК. А. Самосборка олигонуклеотидов в структуру, содержащую вершины и три части граней куба. Б. Схема куба, собранного из дезоксирибоолигонуклеотидов. В. Схема треугольника, собранного из дезоксирибоолигонуклеотидов. Г. Схематическое изображение различных плиточных элементов, собранных из дезоксирибоолигонуклеотидов. Д. Схема микротрубочки, собранной из молекул ДНК. Длинными широкими линиями обозначены нуклеотидные последовательности ДНК; короткими перпендикулярными линиями - водородные связи, соединяющие нуклеотиды в соответствии с принципом комплементарности.

В 2000 году Эрик Уинфри предложил использовать молекулы ДНК для создания плитки, которая могла бы быть использована при практическом применения плиточной теории Ванга [36, 37] с целью управления процессами кристаллизации. С помощью молекул ДНК были созданы плитки для сборки двумерных поверхностей, а также для сборки более сложных трехмерных структур (Рис. 1.1.Г). С помощью такой плитки появилась возможность конструировать более сложные пространственные структуры, например, структуры, схожие с микротрубочками (Рис. 1.1.Д) [38, 39].

Одной из недавно опубликованных работ, посвященных достижениям в области создания сложных пространственных наноструктур на основе ДНК, является работа Пола Ротемунда [40]. В этой работе был предложен термин ДНК-оригами по аналогии с оригами - древней японской традицией конструирования трехмерных фигурок из обыкновенных листов бумаги. В качестве основы для ДНК-оригами автор использовал одноцепочечную

13

кольцевую ДНК фага М13 (длинной 7249 нуклеотида) (Рис. 1.2). В раствор с этой молекулой добавлялись олигонуклеотиды, синтезированные таким образом, что части одного олигонуклеотида комплементарно взаимодействовали одновременно с двумя участками ДНК фага, в результате чего образовывались изгибы основной цепи ДНК фага, приводящие к самосборке сложной двумерной структуры (Рис. 1.2).

Рис. 1.2. ДНК-оригами Ротемунда, созданная на основе одноцепочечной кольцевой ДНК фага М13. Длинной широкой линией обозначена нуклеотидная последовательность ДНК фага М13, взятая в качестве основы для создания ДНК-оригами. Короткими стрелками обозначены олигонуклеотиды, взаимодействующие с участками ДНК фага, образующие ее изгибы. (5'->3')

Позднее группа исследователей из института Скриппса, используя метод Ротемунда, опубликовала методику сборки трехмерного ДНК-оригами [41]. Процесс сборки трехмерных структур из плоских поверхностей авторы проводили поэтапно. В соответствии с методом Ротемунда, одноцепочечная молекула ДНК, имеющая самокомплементарные участки, самособиралась в двумерную структуру, образующую развернутый октаэдр. На следующем этапе, добавлялись двуцепочечные олигонуклеотиды, которые взаимодействовали с образованными октаэдрами таким образом, что двумерные плоские структуры собиралась в объемные фигуры [42]. В

дальнейшем была разработана специальная программа caDNAno для конструирования трехмерных структур на основе ДНК [43]. Данная программа позволяет правильно расположить последовательности нуклеотидов для дальнейшего использования при самосборке, а также подобрать необходимые олигонуклеотиды для самосборки цепей ДНК в пространственные фигуры.

1.1.3. Подвижные молекулы

Уникальные свойства ДНК нашли свое применение при создании движущихся объектов, которые из-за своих сверхмалых размеров (менее 10 нм) правомерно назвать нанороботами. Такие роботы представляют из себя молекулу или группу молекул, способных передвигаться, а также взаимодействовать с другими наноразмерными объектами [44-46].

Роботы, сконструированные на основе дезоксирибонуклеиновых кислот, было предложено называть ДНК-нанороботами. Наноробот разработанный в лаборатории Нилса Пирса, был образован с помощью двух одноцепочечных ДНК, которые, частично взаимодействуя между собой, образовывали двухцепочечную структуру (тело робота), в то время оставшиеся не комплементарные друг-другу 5'-концевые участки оставались свободными, образуя «липкие концы» (ноги робота) [47]. Передвижения подобного робота, оказалось возможным по специальной поверхности, состоящей из одноцепочечной молекулы ДНК, с которой взаимодействовали частично комплементарные олигонуклеотиды, таким образом, что 3'-концевые участки этих олигонуклеотидов оставались свободными, создавая своеобразные «ступеньки» для передвижения ДНК-роботов (Рис. 1.3). «Ноги робота» комплементарно взаимодействовали с частью «ступенек» поверхности. Далее в раствор добавляли олигонуклеотид с более высокой энергией связывания к «ступенькам», что приводило к вытеснению «ноги робота», после чего она, высвободившись, получала возможность для образования комплементарных взаимодействий со следующей «ступенькой»,

обеспечивая таким образом дальнейшее продвижение робота [47].

15

Рис. 1.3. Схематическое изображение передвижения наноробота, созданного на основе молекул ДНК. Стрелками обозначены нуклеотидные последовательности ДНК и их направление (5->3). Широкая линия обозначает двуцепочечную структуру наноробота («тело робота») со свободными 5'-концевыми участками («ногами робота»). Пунктирная линия обозначает олигонуклеотид вытесняющий «ногу робота» и запускающий последовательность реакций, обеспечивающих продвижение наноробота.

1.1.4. Элементы компьютеров

Многие свойства ДНК, такие как автономия, способность к самосборке, а также возможность репарации могут применяться для решения математических задач. Таким образом, ДНК можно рассматривать не только в качестве носителя генетической информации или молекулы, обладающей уникальными структурно-функциональными свойствами, но и как структурный логический элемент, который может быть использован в вычислительных машинах [48, 49].

Еще в 1959 году Ричард Фейнман предложил использовать отдельные молекулы или атомы в качестве компонентов компьютера [50]. Вслед за ним Том Хэд предложил использовать молекулы ДНК для хранения информации, а также в качестве логических элементов вычислительных машин при решении вычислительных задач [51, 52]. А в 1994 году была опубликована работа Адлемана, в которой описывается возможность использования свойств молекул ДНК для решения непростой математической задачи о

поиске гамильтонова пути [53]. Адлеман на примере такой «задачи коммивояжера» впервые экспериментально показал возможность применения ДНК для решения математических задач, решив задачу «ориентированный граф», то есть набор из семи вершин с п ребрами, соединяющими их, где нужно найти кратчайший путь (если он существует) от точки входа к точке выхода, который проходит через каждую точку только один раз [53-55]. При решении задачи автор использовал ДНК-олигонуклеотиды, которые представляли вершины. Ребра между вершинами были представлены также олигонуклеотидами, которые были частично комплементарными к участкам последовательностей сразу 2-х олигонуклеотидов, представляющих вершины. После образования комплементарных взаимодействий полученный дуплекс ДНК стабилизировался с помощью ДНК-лигазы. Ответ о кратчайшем пути был получен при анализе продуктов амплификации [53-55].

Позднее Оуянг и соавторы, также используя ДНК, решили еще одну математическую задачу - «задачу о клике», где «кликой» называется граф в котором каждые две вершины соединены ребром [56, 57]. Методы расчетов с применением ДНК позволяют достаточно быстро получить ответ, что достигается относительной быстротой прохождения биохимических реакций. Кроме того, такие методы демонстрируют высокую эффективность и высокую скорость получения конечного результата в случае необходимости выполнения множества параллельных вычислений. С другой стороны, следует отметить, что при использовании ДНК для расчетов также имеются определенные ограничения. Например, чем больше вершин будет задано в «задаче коммивояжера», тем большее количество ДНК потребуется: если вершин будет 100, то общий вес молекул ДНК, необходимых для проведения вычислений и представляющих все возможные варианты, будет сопоставим с весом нашей планеты [58, 59]. Тем не менее, можно заключить, что работы с применением ДНК в вычислительных целях показывают то, что компьютеры на основе ДНК обладают высоким потенциалом и даже могут быть в

некоторых случаях быстрее и эффективнее, чем электронные вычислительные машины, разработанные к моменту постановки этих экспериментов.

1.1.5. Ферменты

Еще в 1967 году Крик, Везе и Оргель предположили, что молекулы РНК могут обладать каталитической активностью [60]. В начале 80-х годов открытие природных каталитических РНК, рибозимов, подтвердило эту гипотезу, опровергнув альтернативное мнение о том, что клеточными ферментами могут быть только белки или высокомолекулярные комплексы, содержащие в обязательном порядке белковый компонент [61, 62]. Первым идентифицированным рибозимом стал самосплайсирующийся интрон большой субъединицы рибосомальной РНК Tetrahymena thermophila [63, 64]. Другим примером рибозима является рибонуклеаза Р, участвующая в процессинге пре-тРНК у E. coli [65, 66]. К рибозимам можно отнести и рибосомы [67].

Открытие природных рибозимов, во-первых, продемонстрировало принципиальную возможность того, что нуклеиновые кислоты могут обладать ферментативной активностью, а, во-вторых, стало основой для целого ряда работ, продолжающихся до сих пор, целью которых стало создание искусственных нуклеиновых кислот, обладающих каталитической активностью. Результаты, полученные при проведении таких работ указывают на то, что рибозимы, как и ферменты белковой природы, способны осуществлять целый спектр энзиматических реакций. Получены рибозимы, обладающие полимеразной активностью, способные катализировать синтез собственной нуклеотидной последовательности [6872]. Были созданы рибозимы, обладающие активностью РНК-лигаз, способных катализировать процессы как внутримолекулярного, так и межмолекулярного лигирования РНК [73, 74], а также РНКаз [75, 63]. Примером первого синтетического рибозима является рибозим R18, который

является РНК-зависимой РНК-полимеразой, которая способна синтезировать комплементарную молекулу РНК длинной до 20 нуклеотидов [76].

Некоторые рибозимы разрабатывались с целью создания на их основе терапевтических препаратов [77]. Например, на основе искусственных рибозимов были созданы противовирусные препараты направленного действия. Хорошим примером является искусственный рибозим способный специфично расщеплять РНК ВИЧ 1 в области гена gag. Использование такого рибозима в модельной бесклеточной системе приводило к снижению уровня вирусного антигена p24 на 98% [78, 79, 27]. Однако, несмотря на достигнутые успехи в области молекулярной инженерии рибозимов, все молекулы РНК имеют один принципиальный недостаток, ограничивающий возможности их применения. Молекулы РНК относительно легко гидролизуются в щелочных условиях, а, самое главное, молекулы РНК расщепляются РНКазами, которые всегда присутствуют как в любой биологической жидкости, так и в любом биологическом материале [80]. Из-за этого молекулы РНК очень нестабильны в биологических системах. Эта проблема на сегодняшний день по-прежнему актуальна и до конца не решена. Поэтому отдельным направлением исследований в настоящее время является поиск способов стабилизации молекул РНК, в том числе, рибозимов [81-84].

Ферментативной активностью может обладать не только РНК, но и ДНК. Однако в отличие от рибозимов, природные молекулы ДНК, обладающие ферментативной' активностью, до сих пор обнаружены не были. Первый дезоксирибозим, обладающий активностью РНКазы, был синтезирован в 1994 году Брикером [85]. В 1997 году Санторо и Джойс, используя метод селекции in vitro SELEX, получили олигодезоксирибонуклеотиды, способные катализировать расщепление РНК. К настоящему времени синтезированы молекулы ДНК, способные катализировать фосфорилирование ДНК и лигирование ДНК [86, 87]. Следует отметить, что спектр известных на сегодняшний день

энзиматических активностей дезоксирибозимов значительно уже, чем у рибозимов [88]. С другой стороны, как было сказано выше, дезоксирибозимы являются более устойчивыми молекулами и не подвержены расщеплению РНКазами, что может являться определяющим фактором при создании ферментов на основе ДНК для их использования в живых системах, в том числе, в качестве основ для создания терапевтических средств.

1.1.6. Молекулярные автоматы

Милан Стояновик и соавторы предложили использовать термин «молекулярные автоматы» для молекулярных комплексов, образование которых зависит от комплементарных взаимодействий между составляющими эти комплексы молекулами ДНК. В его лаборатории был сконструирован молекулярный автомат способный реализовать стратегии логической игры «крестики - нолики» [89, 90]. Молекулярный автомат, названный MAYA-III, представлял собой набор из четырех искусственно синтезированных дезоксирибозимов. Каждый дезоксирибозим имел в своем составе последовательности, с которыми могли комплементарно взаимодействовать олигонуклеотиды двух типов. Одни олигонуклеотиды инициировали энзиматическую активность дезоксирибозимов, в то время как другие, наоборот, ее подавляли. Для визуализации реакций авторы использовали совместно флуорофоры и гасители флуоресценции. Взаимодействие олигонуклеотидов и синтезированных дезоксирибозимов сближало флуорофор и гаситель, сигнал регистрировали спектрофотометрически.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рудченко Мария Николаевна, 2016 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Crick F.H. Central dogma of molecular biology. // Nature, 1970. V. 227. P. 561-563.

2. Watson J.D., Crick F.H. Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid. // Nature. 1953. V. 171. P. 737-738.

3. Fire A., Xu S., Montgomery M.K., Kostas S.A., Driver S.E., Mello C.C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. // Nature. 1998. V. 391. P. 806-811.

4. Siomi H., Siomi M.C. On the road to reading the RNA-interference code. // Nature. 2009 V. 457. P. 396-404.

5. Higgs P.G. RNA secondary structure: physical and computational aspects. // Q. Rev. Biophys. 2009 V. 33. P. 199-253.

6. Motorin Y., Helm M. RNA nucleotide methylation. // Wiley Interdiscip. Rev. RNA. 2011 V. 2. P. 611-631.

7. Limbach P.A., Crain P.F., McCloskey J.A. Summary: the modified nucleosides of RNA. // Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 2183-2196.

8. Wu G., Yu A.T., Kantartzis A., Yu Y.T. Functions and mechanisms of spliceosomal small nuclear RNA pseudouridylation. // Wiley Interdiscip Rev. RNA. 2011. V. 2. P. 571-581.

9. Богданов А. А., Зиновкин Р. А., Замятнин А. А. (мл.). Редактирование РНК: нарушая догму. // Биохимия. 2011. T. 76. C. 1061-1063.

10. Bernhardt H.S. The RNA world hypothesis: the worst theory of the early evolution of life (except for all the others). // Biol. Direct. 2012. V. 7. P. 23.

11. Gilbert W. Origin of life: The RNA world. // Nature. 1986. V. 319. P. 618.

12. Кульбачинский А.И. Методы отбора аптамеров к белковым мишеням. // Успехи биологической химии. 2006. T. 46. C. 193-224.

13. Shangguan D., Li Y., Tang Z., Cao Z.C., Chen H.W., Mallikaratchy P., Sefah K., Yang C.J., Tan W. Aptamers evolved from live cells as effective

molecular probes for cancer study. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 2006. V. 103. P. 11838-11843.

14. Sampson T. Aptamers and SELEX: the technology. // World Patent Information, №200325, P. 123-129.

15. Burke D.H., Gold L. RNA aptamers to the adenosine moiety of S-adenosyl methionine: structural inferences from variations on a theme and the reproducibility of SELEX. // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. P. 2020-2024.

16. Lauhon C.T., Szostak J.W. RNA aptamers that bind flavin and nicotinamide redox cofactors. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V. 117. P. 1246-1257.

17. Klug S.J., Famulok M. All you wanted to know about SELEX. // Mol. Biol. Rep. 1994. V. 20. P. 97-107.

18. Djordjevic M. SELEX experiments: new prospects, applications and dat analysis in inferring regulatory pathways. // Biomol. Eng. 2007. V. 24. P. 179-189.

19. Cox, J.C., Hayhurst, A., Hesselberth, J., Bayer, T.S., Georgiou, G., Ellington, A.D. Automated selection of aptamers against protein targets translated in vitro: from gene to aptamer. // Nucleic Acids Res. 2002. V. 30. P. 108.

20. Nagarkatti R., Bist V., Sun S., Fortes de Araujo F., Nakhasi H.L., Debrabant A. Development of an aptamer-based concentration method for the detection of Trypanosoma cruzi in blood. // Plos. One. 2012. V. 7. P. 43533.

21. Labib M., Zamay A.S., Kolovskaya O.S., Reshetneva I.T., Zamay G.S., Kibbee R.J., Sattar S.A., Zamay T.N., Berezovski M.V. Aptamer-based impedimetric sensor for bacterial typing. // Anal. Chem., 2012. V. 84. P. 8114-8117.

22. Решетников Р.В., Головин А.В., Копылов А.М. Cравнение моделей 15-звенного ДНК-аптамера к тромбину с помощью симуляции молекулярной динамики. // Биохимия. 2010. Т. 75. C. 1124-1132.

23. Barbu M., Stojanovic M.N. A fresh look at adenosine-binding DNA motifs. // Chembiochem. 2012. V. 13. P. 658-660.

24. Zhu J., Nguyen T., Pei R., Stojanovic M., Lin Q. Specific capture and temperature-mediated release of cells in an aptamer-based microfluidic device. // Lab. Chip. 2012. V. 12. P. 3504-3513

25. Zhu J., Shang J., Jia Y., Pei R., Stojanovic M., Lin Q. Spatially selective release of aptamer-captured cells by temperature mediation. // Nanobiotechnol. 2014. V. 8. P. 2-9.

26. Kim J., Hilton J.P., Yang K.A., Pei R., Stojanovic M., Lin Q. Nucleic Acid Isolation and Enrichment on a Microchip. // Sens. Actuators A. Phys. 2013. V. 195. P. 183-190.

27. Ramalingam D., Duclair S., Datta S.A., Ellington A., Rein A., Prasad V.R. RNA Aptamers Directed to Human Immunodeficiency Virus Type 1 Gag Polyprotein Bind to the Matrix and Nucleocapsid Domains and Inhibit Virus Production. // J. Virol. 2011. V. 85. P. 305-314.

28. Boltz A., Piater B., Toleikis L., Guenther R., Kolmar H., Hock B. Bi-specific aptamers mediating tumor cell lysis. // J. Biol. Chem. 2011. V. 286. P. 21896-21905.

29. Debbage P. Targeted drugs and nanomedicine: present and future. // Curr. Pharm. Des. 2009. V. 15. P. 153-172.

30. Schrama D., Reisfeld R.A., Becker J.C. Antibody targeted drugs as cancer therapeutics. // Nat. Rev. Drug Discov. 2006. V. 5. P. 147-159.

31. Jagannathan V., Roulet E., Delorenzi M., Bucher. P. HTPSELEX--a database of high-throughput SELEX libraries for transcription factor binding sites. // Nucleic Acids Res. 2006. V. 34. P. 90-94.

32. Chen J.H., Seeman N.C. Synthesis from DNA of a molecule with the connectivity of a cube. // Nature 1991. V. 350. P. 631-633.

33. Winfree E., Liu F., Wenzler L.A., Seeman N.C. Design and self-assembly of two-dimensional DNA crystals. // Nature, 1998. V. 394. P. 539-544.

34. Seeman N.C. From Genes to Machines: DNA Nanomechanical Devices. // Trends Biochem. Sci. 2005. V. 30. P. 119-125.

35. Castro C.E., Kilchherr F., Kim D.N., Shiao E.L., Wauer T., Wortmann P., Bathe M., Dietz H. A primer to scaffolded DNA origami. // Nat. Methods. 2011. V. 8. P. 221-229.

36. Winfree E. Algorithmic Self-Assembly of DNA: Theoretical Motivations and 2D Assembly Experiments. // J. Biomol. Struct. Dyn. 2000. V. 17. P. 263-270.

37. Wang H. Games, logic and computers. // Scientific American. 1965. P. 98106.

38. Rothemund P.W., Ekani-Nkodo A., Papadakis N., Kumar A., Fygenson D.K., Winfree E. Design and characterization of programmable DNA nanotubes. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 16344-16352.

39. Douglas S.M., Dietz H., Liedl T., Högberg B., Graf F., Shih W.M. Self-assembly of DNA into nanoscale three-dimensional shapes. // Nature. 2009. V. 459. P. 414-418.

40. Rothemund P.W. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. // Nature. 2006. V. 440. P. 297-302.

41. Lund K., Manzo A.J., Dabby N., Michelotti N., Johnson-Buck A., Nangreave J., Taylor S., Pei R., Stojanovic M.N., Walter N.G., Winfree E., Yan H. Molecular robots guided by prescriptive landscapes. // Nature. 2010. V. 465. P. 206-210.

42. Andersen E.S., Dong M., Nielsen M.M., Jahn K., Subramani R., Mamdouh W., Golas M.M., Sander B., Stark H., Oliveira C.L., Pedersen J.S., Birkedal V., Besenbacher F., Gothelf K.V., Kjems J. Self-assembly of a nanoscale DNA box with a controllable lid. // Nature. 2009. V. 459. P. 73-76.

43. Douglas S.M., Marblestone A.H., Teerapittayanon S., Vazquez A., Church G.M., Shih W.M. Rapid prototyping of 3D DNA-origami shapes with caDNAno. // Nucleic Acids Res. 2009. V. 37. P. 5001-5006.

44. Macdonald J., Li Y., Sutovic M., Lederman H., Pendri K., Lu W., Andrews B.L., Stefanovic D., Stojanovic M.N. Medium scale integration of molecular logic gates in an automaton. // Nano Lett. 2006. V. 6. P. 2598-2603.

45. Pei R., Macdonald J., Stojanovic M.N. Development of trainable deoxyribozyme-based game playing automaton. // Methods Mol. Biol. 2012. V. 848. P. 419-437.

46. Douglas S.M., Bachelet I., Church G.M. A logic-gated nanorobot for targeted transport of molecular payloads. // Science. 2012. V. 335. P. 831834.

47. Shin J.S., Pierce N.A. A synthetic DNA walker for molecular transport. // J. Am. Chem. Soc. 2004. V. 126. P. 10834-10835.

48. Faulhammer D., Lipton R.J., Landweber L.F. Counting DNA: estimating the complexity of a test tube of DNA. // Biosystems. 1999. V. 52. P. 193-196.

49. Fu P. Biomolecular computing: is it ready to take off? // Biotechnol. J. 2007. V. 2. P. 91-101.

50. Hush N.S. An overview of the first half-century of molecular electronics. // Ann. NY Acad. Sci. 2003. V. 1006. P. 1-20.

51. Head T. Formal language theory and DNA: an analysis of the generative capacity of specific recombinant behaviors. // Bull. Math. Biol. 1987. V. 49. P. 737-759.

52. Head T. Splicing schemes and DNA, in Lindenmayer Systems: Impacts on Theoretical Computer Science and Developmental Biology. // SpringerVerlag. Berlin. 1992. P. 371-383.

53. Adleman L.M. Molecular computation of solutions to combinatorial problems. // Science. 1994. V. 266. P. 1021-1024.

54. Rubin F. A search procedure for Hamilton paths and circuits. // J. ACM., 1974. V. 21. P. 5404-5411.

55. Garey M., Johnson D. Computers and intractability: a guide to the theory of NP completeness. WH Freeman. New York. 1979.

56. Ouyang Q., Kaplan P.D., Liu S., Libchaber A. DNA solution of the maximal clique problem. // Science. 1997. V. 278. P. 446-449.

57. Braich R.S., Chelyapov N., Johnson C., Rothemund P.W., Adleman L. Solution of a 20-variable 3-SAT problem on a DNA computer. // Science. 2002. V. 296. P. 499-502.

58. Pool R. A boom in plans for DNA computing. // Science. 1995. V. 268. P. 498-499.

59. Lipton R.J. DNA solution of hard computational problems. // Science. 1995. V. 268. P. 542-545.

60. Woese C.R. The genetic code: the molecular basis for genetic expression. Harper and Row. New York. 1967

61. Rothstein M. Recent developments in the age-related alteration of enzymes: a review. // Mech. Ageing Dev. 1977. V. 6. P. 241-257.

62. North G. Nobel prizes: chemistry. RNA's catalytic role. // Nature. 1989. V. 341. P. 556.

63. Altman S. The road to RNase P. // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7: P. 827-828.

64. Schubert S., Kurreck J. Ribozyme- and deoxyribozyme-strategies for medical applications. // Curr. Drug Targets. 2004. V. 5. P. 667-681.

65. Flores R., Navarro J.A., de la Peña M., Navarro B., Ambrós S., Vera A. Viroids with hammerhead ribozymes: some unique structural and functional aspects with respect to other members of the group. // Biol. Chem. 1999. V. 380. P. 849-854.

66. Forster A.C., Symons R.H. Self-cleavage of plus and minus RNAs of a virusoid and a structural model for the active sites. // Cell. 1987. V. 49. P. 211-220.

67. Rodnina M.V. The ribosome as a versatile catalyst: reactions at the peptidyl transferase center. // Curr. Opin. Struct. Biol. 2013. V. 23. P. 595-602.

68. Wochner A., Attwater J., Coulson A., Holliger P. Ribozyme-catalyzed transcription of an active ribozyme. // Science. 2011. V. 332. P. 209-212.

69. Szostak J.W. The eightfold path to non-enzymatic RNA replication. // J. Syst. Chem. 2012. V. 3. P. 2.

70. Frommer J., Appel B., Müller S. Ribozymes that can be regulated by external stimuli. // Curr. Opin. Biotechnol. 2014. V. 18. P. 35-41.

71. Kore A.R., Vaish N.K., Kutzke U., Eckstein F. Sequence specificity of the hammerhead ribozyme revisited; the NHH rule. // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 4116-4120.

72. Ferre-D'Amare A.R. The hairpin ribozyme. // Biopolymers. 2004. V. 73. P. 71-78.

73. Robertson M.P., Ellington A.D. In vitro selection of an allosteric ribozyme that transduces analytes to amplicons. // Nat. Biotechnol. 1999. V. 17. P. 6266.

74. Fujita Y., Ishikawa J., Furuta H., Ikawa Y. Generation and development of RNA ligase ribozymes with modular architecture through "design and selection". // Molecules. 2010. V. 15. P. 5850-5865.

75. Kruger K., Grabowski P.J., Zaug A.J., Sands J., Gottschling D.E., Cech T.R. Self-splicing RNA: autoexcision and autocyclization of the ribosomal RNA intervening sequence of Tetrahymena. // Cell. 1982. V. 31. P. 147-157.

76. Cheng L.K., Unrau P.J. Closing the circle: replicating RNA with RNA. // Cold Spring Harb. Perspect Biol. 2010. V. 2.

77. Bagheri S., Kashani-Sabet M. Ribozymes in the age of molecular therapeutics. // Curr. Mol. Med. 2004. V. 4. P. 489-506.

78. Sarver N., Cantin E.M., Chang P.S., Zaia J.A., Ladne P.A., Stephens D.A., Rossi J.J. Ribozymes as potential anti-HIV-1 therapeutic agents. // Science. 1990. V. 247. P. 1222-1225.

79. Sarkar I., Hauber I., Hauber J., Buchholz F. HIV-1 proviral DNA excision using an evolved recombinase. // Science. 2007. V. 316. P. 1912-1915.

80. Wilson C., Szostak J.W. In vitro evolution of a self-alkylating ribozyme. // Nature. 1995. V. 374. P. 777-782.

81. Ding S.W. RNA-based antiviral immunity. // Nat. Rev. Immunol. 2010. V. 10. P. 632-644.

82. Zaher H.S., Unrau P.J. Selection of an improved RNA polymerase ribozyme with superior extension and fidelity. // RNA. 2007. V. 13. P. 1017-1026.

83. Motorin Y., Helm M. tRNA stabilization by modified nucleotides. // Biochemistry. 2010. V. 49. P. 4934-4944.

84. Motorin Y., Helm M. RNA nucleotide methylation. // Wiley Interdiscip. Rev. RNA. 2011. V. 2. P. 611-631.

85. Breaker R.R., Joyce G.F. A DNA enzyme that cleaves RNA. // Chem. Biol. 1994. V. 1. P. 223-229.

86. Breaker R.R. DNA enzymes. // Nat. Biotechnol. 1997. V. 15: P. 427-431.

87. Santoro S.W., Joyce G.F. A general purpose RNA-cleaving DNA enzyme. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. P. 4262-4266.

88. Li Y., Breaker R.R. Deoxyribozymes: new players in the ancient game of biocatalysis. // Curr. Opin. Struct. Biol. 1999. V. 9. P. 315-323.

89. Stojanovic M.N., Stefanovic D. A deoxyribozyme-based molecular automaton. // Nat. Biotechnol. 2003. V. 21. P. 1069-1074.

90. Macdonald. J., Li Y., Sutovic M., Lederman H., Pendri K., Lu W., Andrews B.L., Stefanovic D., Stojanovic M.N. Medium scale integration of molecular logic gates in an automaton. // Nano Lett. 2006. V. 6. P. 2598-603.

91. Pei R., Macdonald J., Stojanovic M.N. Development of trainable deoxyribozyme-based game playing automaton. // Methods Mol Biol. 2012. V. 848. P. 419-437.

92. Benenson Y., Paz-Elizur T., Adar R., Keinan E., Livneh Z., Shapiro E. () Programmable and autonomous computing machine made of biomolecules. // Nature. 2001. V. 414. P. 430-434.

93. Benenson Y., Gil B., Ben-Dor U., Adar R., Shapiro E. An autonomous molecular computer for logical control of gene expression. // Nature. 2004. V. 429. P. 423-429.

94. Soloveichik D., Winfree E. The computational power of Benenson automata. // Theor. Comput. Sci. 2005. V. 344. P. 279-297.

95. Alvarez-Lorenzo C., Concheiro A. Smart drug delivery systems: from fundamentals to the clinic. // Chem. Commun. 2014. V. 50. P. 7743-7765.

96. Klasa R.J., Gillum A.M., Klem R.E., Frankel S.R. Oblimersen Bcl-2 antisense: facilitating apoptosis in anticancer treatment. // Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 2002. V. 12. P. 193-213.

97. Kahan-Hanum M., Douek Y., Adar R., Shapiro E. A library of programmable DNAzymes that operate in a cellular environment. // Sci. Rep. 2013. V. 3. P. 1535.

98. Grassi G., Grassi M. First-in-human trial of Dz13 for nodular basal-cell carcinoma. // Lancet. 2013. V. 381. P. 1797-1798.

99. Seeman N.C. Nanotechnology and the double helix. // Sci. Am. 2004. V. 290. P. 64-69.

100. Wyatt Shields Iv, C., Reyes C.D., and Lopez G.P. Microfluidic cell sorting: a review of the advances in the separation of cells from debulking to rare cell isolation. // Lab Chip. 2015. V. 15(5). P. 1230-1249.

101. Plouffe B.D., Murthy S.K., and Lewis L.H. Fundamentals and application of magnetic particles in cell isolation and enrichment: a review. // Rep Prog Phys. 2015. V. 78(1). P. 016601.

102. Basu D. and Kulkarni R. Overview of blood components and their preparation. // Indian J Anaesth. 2014. V. 58(5). P. 529-537.

103. Namiot V.A., Kogan E.A., Filatov I.V., Polishchuk M.S., Tumanian V.G., and Esipova N.G. On efficient in vitro purification of cell suspensions containing malignant cells. // Biofizika. 2014. V. 59(6). P. 1121-1124.

104. Woroniecka R., Rymkiewicz G., Grygalewicz B., Blachnio K., Rygier J., Jarmuz-Szymczak M., Ratajczak B., and Pienkowska-Grela B. Cytogenetic and flow cytometry evaluation of Richter syndrome reveals MYC, CDKN2A, IGH alterations with loss of CD52, CD62L and increase of CD71 antigen expression as the most frequent recurrent abnormalities. // Am J Clin Pathol. 2015. V. 143(1). P. 25-35.

105. Han J.Y., Kim K.H., Park J.I., Kim I.H., and Je G.H. Detection of fetal erythroid cells from maternal blood using fluorescence in situ hybridization and liquid culture. // J Korean Med Sci. 2001. V. 16(2). P. 145-149.

106. Preira P., Grandne V., Forel J.M., Gabriele S., Camara M., and Theodoly O. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. // Lab Chip. 2013. V. 13(1). P. 161-170.

107. Davies R.T., Kim J., Jang S.C., Choi E.J., Gho Y.S., and Park J. Microfluidic filtration system to isolate extracellular vesicles from blood. // Lab Chip. 2012. V. 12(24). P. 5202-5210.

108. Hosokawa M., Hayata T., Fukuda Y., Arakaki A., Yoshino T., Tanaka T., and Matsunaga T. Size-selective microcavity array for rapid and efficient detection of circulating tumor cells. // Anal Chem. 2010. V. 82(15). P. 66296635.

109. Hur S.C., Henderson-MacLennan N.K., McCabe E.R., and Di Carlo D. Deformability-based cell classification and enrichment using inertial microfluidics. // Lab Chip. 2011. V. 11(5). P. 912-920.

110. Green J.V., Radisic M., and Murthy S.K. Deterministic lateral displacement as a means to enrich large cells for tissue engineering. // Anal Chem. 2009. V. 81(21). P. 9178-9182.

111. Davis J.A., Inglis D.W., Morton K.J., Lawrence D.A., Huang L.R., Chou S.Y., Sturm J.C., and Austin R.H. Deterministic hydrodynamics: taking blood apart. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2006. V. 103(40). P. 14779-14784.

112. Geislinger T.M. and Franke T. Hydrodynamic lift of vesicles and red blood cells in flow--from Fahraeus & Lindqvist to microfluidic cell sorting. // Adv Colloid Interface Sci. 2014. V. 208. P. 161-176.

113. Lee M.G., Shin J.H., Bae C.Y., Choi S., and Park J.K. Label-free cancer cell separation from human whole blood using inertial microfluidics at low shear stress. // Anal Chem. 2013. V. 85(13). P. 6213-6218.

114. Geislinger T.M., Chan S., Moll K., Wixforth A., Wahlgren M., and Franke T. Label-free microfluidic enrichment of ring-stage Plasmodium falciparum-

infected red blood cells using non-inertial hydrodynamic lift. // Malar J. 2014. V. 13. P. 375.

115. Huang L.R., Cox E.C., Austin R.H., and Sturm J.C. Continuous particle separation through deterministic lateral displacement. // Science. 2004. V. 304(5673). P. 987-990.

116. Voldman J. Electrical forces for microscale cell manipulation. // Annu Rev Biomed Eng. 2006. V. 8. P. 425-454.

117. Ling S.H., Lam Y.C., and Chian K.S. Continuous cell separation using dielectrophoresis through asymmetric and periodic microelectrode array. // Anal Chem. 2012. V. 84(15). P. 6463-6470.

118. Tran N.P. and Marcos. The effect of dielectrophoretic force on swimming bacteria. // Electrophoresis. 2015.

119. Jones P.V. and Hayes M.A. Development of the resolution theory for gradient insulator-based Dielectrophoresis. // Electrophoresis. 2015. V.

120. Wu A.Y. and Morrow D.M. Clinical use of Dieletrophoresis separation for live Adipose derived stem cells. // J Transl Med. 2012. V. 10. P. 99.

121. Крылов В.Н., Густов А.В., Дерюгина А.В. Электрофоретическая подвижность эритроцитов и стресс. // Физиология человека. 1998. T. 24(6). C. 108-111.

122. Dufrene Y.F. Application of atomic force microscopy to microbial surfaces: from reconstituted cell surface layers to living cells. // Micron. 2001. V. 32(2). P. 153-165.

123. Stott, S.L., Hsu C.H., Tsukrov D.I., Yu M., Miyamoto D.T., Waltman B.A., Rothenberg S.M., Shah A.M., Smas M.E., Korir G.K., Floyd F.P., Jr., Gilman A.J., Lord J.B., Winokur D., Springer S., Irimia D., Nagrath S., Sequist L.V., Lee R.J., Isselbacher K.J., Maheswaran S., Haber D.A., and Toner M. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2010. V. 107(43). P. 1839218397.

124. Zhu J., Nguyen T., Pei R., Stojanovic M., and Lin Q. Specific capture and temperature-mediated release of cells in an aptamer-based microfluidic device. // Lab Chip. 2012. V. 12(18). P. 3504-3513.

125. Sequist L.V., Nagrath S., Toner M., Haber D.A., and Lynch T.J. The CTC-chip: an exciting new tool to detect circulating tumor cells in lung cancer patients. // J Thorac Oncol. 2009. V. 4(3). P. 281-283.

126. Nagrath S., Sequist L.V., Maheswaran S., Bell D.W., Irimia D., Ulkus L., Smith M.R., Kwak E.L., Digumarthy S., Muzikansky A., Ryan P., Balis U.J., Tompkins R.G., Haber D.A., and Toner M. Isolation of rare circulating tumour cells in cancer patients by microchip technology. // Nature. 2007. V. 450(7173). P. 1235-1239.

127. Gross P.G., Weiner L.P., Kartalov E.P., and Scherer A. Microfluidic techniques for studying the nervous system. // Crit Rev Neurobiol. 2005. V. 17(3-4). P. 119-144.

128. Бубликов А.В., Вандышева Н.В., Ломзов, А.А., Пышный, Д.В., Романов, С.И. Кремниевая микроканальная матрица для биочиповых технологий. // Нано- и микросистемная техника. 2007. T. 9.

129. Wang M.M., Schnabel C.A., Chachisvilis M., Yang R., Paliotti M.J., Simons L.A., McMullin L., Hagen N., Lykstad K., Tu E., Pestana L.M., Sur S., Zhang H., Butler W.F., Kariv I., and Marchand P.J. Optical forces for noninvasive cellular analysis. // Appl Opt. 2003. V. 42(28). P. 5765-5773.

130. Soo Hoo W., Wang M., Kohrumel J.R., and Hall J. A novel method for detection of virus-infected cells through moving optical gradient fields using adenovirus as a model system. // Cytometry A. 2004. V. 58(2). P. 140-146.

131. Евстрапов, А.А. Физические методы управления движением и разделением микрочастиц в жидких средах. Диэлектрофорез, фотофорез, оптофорез, оптический пинцет. // Научное приборостроение. 2005. Т. 15(1). C. 3-20.

132. Applegate R.W., Jr., Squier J., Vestad T., Oakey J., Marr D.W., Bado P., Dugan M.A., and Said A.A. Microfluidic sorting system based on optical

waveguide integration and diode laser bar trapping. // Lab Chip. 2006. V. 6(3). P. 422-426.

133. Wang M.M., Tu E., Raymond D.E., Yang J.M., Zhang H., Hagen N., Dees B., Mercer E.M., Forster A.H., Kariv I., Marchand P.J., and Butler W.F. Microfluidic sorting of mammalian cells by optical force switching. // Nat Biotechnol. 2005. V. 23(1). P. 83-87.

134. Zhang H., Tu E., Hagen N.D., Schnabel C.A., Paliotti M.J., Hoo W.S., Nguyen P.M., Kohrumel J.R., Butler W.F., Chachisvillis M., and Marchand P.J. Time-of-flight optophoresis analysis of live whole cells in microfluidic channels. // Biomed Microdevices. 2004. V. 6(1). P. 11-21.

135. Yim S.S., Bang H.B., Kim Y.H., Lee Y.J., Jeong G.M., and Jeong K.J. Rapid isolation of antibody from a synthetic human antibody library by repeated fluorescence-activated cell sorting (FACS). // PLoS One. 2014. V. 9(10). P. e108225.

136. Bendall S.C., Nolan G.P., Roederer M., and Chattopadhyay P.K. A deep profiler's guide to cytometry. // Trends Immunol. 2012. V. 33(7). P. 323332.

137. Formichi P., Radi E., Giorgi E., Gallus G.N., Brunetti J., Battisti C., Rufa A., Dotti M.T., Franceschini R., Bracci L., and Federico A. Analysis of opa1 isoforms expression and apoptosis regulation in autosomal dominant optic atrophy (ADOA) patients with mutations in the opa1 gene. // J Neurol Sci. 2015.

138. Marie D., Rigaut-Jalabert F., and Vaulot D. An improved protocol for flow cytometry analysis of phytoplankton cultures and natural samples. // Cytometry A. 2014. V. 85(11). P. 962-968.

139. Zhao L., Qu L., Zhou J., Sun Z., Zou H., Chen Y.Y., Marks J.D., and Zhou Y. High throughput identification of monoclonal antibodies to membrane bound and secreted proteins using yeast and phage display. // PLoS One. 2014. V. 9(10). P. e111339.

140. Gunzer M., Weishaupt C., Planelles L., and Grabbe S. Two-step negative enrichment of CD4+ and CD8+ T cells from murine spleen via nylon wool adherence and an optimized antibody cocktail. // J Immunol Methods. 2001. V. 258(1-2). P. 55-63.

141. Lojk J., Bregar V.B., Rajh M., Mis K., Kreft M.E., Pirkmajer S., Veranic P., and Pavlin M. Cell type-specific response to high intracellular loading of polyacrylic acid-coated magnetic nanoparticles. // Int J Nanomedicine. 2015. V. 10. P. 1449-1462.

142. Backer R.A., Helbig C., Gentek R., Kent A., Laidlaw B.J., Dominguez C.X., de Souza Y.S., van Trierum S.E., van Beek R., Rimmelzwaan G.F., ten Brinke A., Willemsen A.M., van Kampen A.H., Kaech S.M., Blander J.M., van Gisbergen K., and Amsen D. A central role for Notch in effector CD8(+) T cell differentiation. // Nat Immunol. 2014. V. 15(12). P. 11431151.

143. Schumm M., Lang P., Bethge W., Faul C., Feuchtinger T., Pfeiffer M., Vogel W., Huppert V., and Handgretinger R. Depletion of T-cell receptor alpha/beta and CD19 positive cells from apheresis products with the CliniMACS device. // Cytotherapy. 2013. V. 15(10). P. 1253-1258.

144. He J., Huang M., Wang D., Zhang Z., and Li G. Magnetic separation techniques in sample preparation for biological analysis: a review. // J Pharm Biomed Anal. 2014. V. 101. P. 84-101.

145. Boyum A. Separation of white blood cells. // Nature. 1964. V. 204. P. 793794.

146. Zola H., Swart B., Banham A., Barry S., Beare A., Bensussan A., Boumsell L., C D.B., Buhring H.J., Clark G., Engel P., Fox D., Jin B.Q., Macardle P.J., Malavasi F., Mason D., Stockinger H., and Yang X. CD molecules 2006--human cell differentiation molecules. // J Immunol Methods. 2007. V. 319(1-2). P. 1-5.

147. Bendall S.C., Simonds E.F., Qiu P., Amir el A.D., Krutzik P.O., Finck R., Bruggner R.V., Melamed R., Trejo A., Ornatsky O.I., Balderas R.S.,

Plevritis S.K., Sachs K., Pe'er D., Tanner S.D., and Nolan G.P. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. // Science. 2011. V. 332(6030). P. 687-696.

148. Ma L., Pan Q., Sun F., Yu Y., and Wang J. Cluster of differentiation 166 (CD166) regulates cluster of differentiation (CD44) via NF-kappaB in liver cancer cell line Bel-7402. // Biochem Biophys Res Commun. 2014. V. 451(2). P. 334-338.

149. Douds J.J., Long D.J., Kim A.S., and Li S. Diagnostic and prognostic significance of CD200 expression and its stability in plasma cell myeloma. // J Clin Pathol. 2014. V. 67(9). P. 792-796.

150. Yu H.K., Lee H.J., Choi H.N., Ahn J.H., Choi J.Y., Song H.S., Lee K.H., Yoon Y., Yi L.S., Kim J.S., Kim S.J., and Kim T.J. Characterization of CD45-/CD31+/CD105+ circulating cells in the peripheral blood of patients with gynecologic malignancies. // Clin Cancer Res. 2013. V. 19(19). P. 5340-5350.

151. Gaedicke S., Braun F., Prasad S., Machein M., Firat E., Hettich M., Gudihal R., Zhu X., Klingner K., Schuler J., Herold-Mende C.C., Grosu A.L., Behe M., Weber W., Macke H., and Niedermann G. Noninvasive positron emission tomography and fluorescence imaging of CD133+ tumor stem cells. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2014. V. 111(6). P. E692-701.

152. Nguyen R., Perfetto S., Mahnke Y.D., Chattopadhyay P., and Roederer M. Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design. // Cytometry A. 2013. V. 83(3). P. 306315.

153. Roederer M. and Tarnok A. OMIPs--Orchestrating multiplexity in polychromatic science. // Cytometry A. 2010. V. 77(9). P. 811-812.

154. Geem D., Harusato A., Flannigan K., and Denning T.L. Harnessing Regulatory T Cells for the Treatment of Inflammatory Bowel Disease. // Inflamm Bowel Dis. 2015.

155. Roberto A., Castagna L., Zanon V., Bramanti S., Crocchiolo R., McLaren J.E., Gandolfi S., Tentorio P., Sarina B., Timofeeva I., Santoro A., CarloStella C., Bruno B., Carniti C., Corradini P., Gostick E., Ladell K., Price D.A., Roederer M., Mavilio D., and Lugli E. Role of naive-derived T memory stem cells in T cell reconstitution following allogeneic transplantation. // Blood. 2015.

156. Adar R., Benenson Y., Linshiz G., Rosner A., Tishby N., and Shapiro E. Stochastic computing with biomolecular automata. // Proc Natl Acad Sci U S A. 2004. V. 101(27). P. 9960-9965.

157. Pei R., Matamoros E., Liu M., Stefanovic D., and Stojanovic M.N. Training a molecular automaton to play a game. // Nat Nanotechnol. 2010. V. 5(11). P. 773-777.

158. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия 3. 1985. C. 534

159. Шабарова З.А., Богданов А.А. Химия нуклеиновых кислот и их компонентов. 1978. C. 583

160. Ярилин А.А. Иммунология. 2010. C. 752.

161. Schwarz B.A. and Bhandoola A. Trafficking from the bone marrow to the thymus: a prerequisite for thymopoiesis. // Immunol Rev. 2006. V. 209. P. 47-57.

162. Joachims, M.L., Chain J.L., Hooker S.W., Knott-Craig C.J., and Thompson L.F. Human alpha beta and gamma delta thymocyte development: TCR gene rearrangements, intracellular TCR beta expression, and gamma delta developmental potential—differences between men and mice. // J Immunol. 2006. V. 176(3). P. 1543-1552.

163. Finney H.M., Akbar A.N., and Lawson A.D. Activation of resting human primary T cells with chimeric receptors: costimulation from CD28, inducible costimulator, CD134, and CD137 in series with signals from the TCR zeta chain. // J Immunol. 2004. V. 172(1). P. 104-113.

164. Faure S., Salazar-Fontana L.I., Semichon M., Tybulewicz V.L., Bismuth G., Trautmann A., Germain R.N., and Delon J. ERM proteins regulate

cytoskeleton relaxation promoting T cell-APC conjugation. // Nat Immunol. 2004. V. 5(3). P. 272-279.

165. Jankovic D. and Feng C.G. CD4(+) T Cell Differentiation in Infection: Amendments to the Th1/Th2 Axiom. // Front Immunol. 2015. V. 6. P. 198.

166. Lyadova I.V., Oberdorf S., Kapina M.A., Apt A.S., Swain S.L., and Sayles P.C. CD4 T cells producing IFN-gamma in the lungs of mice challenged with mycobacteria express a CD27-negative phenotype. // Clin Exp Immunol. 2004. V. 138(1). P. 21-29.

167. Lyadova I.V., Tsiganov E.N., Kapina M.A., Shepelkova G.S., Sosunov V.V., Radaeva T.V., Majorov K.B., Shmitova N.S., van den Ham H.J., Ganusov V.V., De Boer R.J., Racine R., and Winslow G.M. In mice, tuberculosis progression is associated with intensive inflammatory response and the accumulation of Gr-1 cells in the lungs. // PLoS One. 2010. V. 5(5). P. e10469.

168. Overgaard N.H., Jung J.W., Steptoe R.J., and Wells J.W. CD4+/CD8+ double-positive T cells: more than just a developmental stage? // J Leukoc Biol. 2015. V. 97(1). P. 31-38.

169. Deeg H.J. Hematopoietic cell transplantation for myelodysplastic syndrome. // Am Soc Clin Oncol Educ Book. 2015. V. 35. P. 375-380.

170. Li N., Matte-Martone C., Zheng H., Cui W., Venkatesan S., Tan H.S., McNiff J., Demetris A.J., Roopenian D., Kaech S., and Shlomchik W.D. Memory T cells from minor histocompatibility antigen-vaccinated and virusimmune donors improve GVL and immune reconstitution. // Blood. 2011. V. 118(22). P. 5965-5976.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я глубоко признательна моему научному руководителю Андрею Александровичу Замятнину за всестороннюю поддержку и помощь в написании работы. Выражаю благодарность Татьяне Андреевне Белозерской (Институт биохимии им. А.Н.Баха) за ценные рекомендации и Ирине Лебедевой (Колумбийский Университет, Нью-Йорк) за полезные советы и критические замечания при прочтении работы. Искренне благодарю сотрудников лаборатории аутоиммунных и воспалительных заболеваний Госпиталя специальной хирургии (Нью-Йорк) и лаборатории экспериментальной терапии Колумбийского Университета (Нью-Йорк) за помощь в планировании экспериментов, в особенности Стивена Тэйлора за помощь в конъюгировании антител с олигонуклеотидами.