Создание иммунохимических реагентов для выявления CagA-антигена HELICOBACTER PYLORI и антител против него тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат биологических наук Климович, Александр Владимирович

• Климович, Александр Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Климович, Александр Владимирович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Эпидемиология инфекции Н. pylori.

1.2. Факторы патогенности Н. pylori.

1.3. Молекулярная структура белка CagA.

1.4. Биологические эффекты CagA.

1.5. Иммунный ответ на инфекцию Н pylori.

1.6. Диагностика инфекций Н. pylori.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Клонирование фрагментов гена cagA.

2.2. Создание штаммов-продуцентов рекомбинантных белков.

2.3. 11аработка и очистка рекомбинантных белков.

2.4. Молекулярно-генетическое типирование изолятов Н. pylori.

2.5. Иммунизация мышей и создание гибридом.

2.6. Иммунохимические методы исследования.

2.7. Статистическая обработка результатов.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1. In silico анализ последовательностей белков CagA.

3.2. Клонирование фрагментов гена cagA и их анализ.

3.3. Экспрессия и очистка рекомбинантных фрагментов CagA.

3.4. Использование rCagAfr. 1 -3 для выявления сывороточных антител.

3.5. Получение и характеристика МКАТ.

3.6. Молекулярно-генетическое типирование Н. pylori.

3.7. Разрабо гка двухцентрового ИФА.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

БЛАГОДАРНОСТИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание иммунохимических реагентов для выявления CagA-антигена HELICOBACTER PYLORI и антител против него»

Актуальность проблемы

Иммунохимические методы анализа приобретают всё большее значение в диагностике инфекционных заболеваний человека. Они позволяют выявлять антигены возбудителя, характеризовать его фенотип и патогенетический потенциал, а также оценивать иммунный ответ организма и исследовать его механизмы.

Инфекция бактерией Helicobacter pylori вызывает развитие в слизистой желудка воспалительного процесса, который в большинстве случаев протекает в форме хронического гастрита. В ряде случаев (до 20%) инфекция приводит к возникновению острого гастрита, язвенной болезни, аденокарциномы желудка и MALT-лимфомы (Жебрун, 2006; Kusters et а!. 2006). Наиболее выраженные патологические процессы, сопряженные с повышенной вероятностью опухолевой трансформации, вызывают штаммы Н. pylon, экспрессирующие цитотоксин CagA (Hatakeyama, Higashi, 2005). Этот белок признан одним из основных факторов патогенности Н. pylori и счи гается ответственным за нарушение целостности эпителия слизистой желудка, индукцию неконтролируемой пролиферации эпителиальных и лимфоидных клеток, секреции провоспалительных цитокинов и модуляцию презентации антигенов клетками эпителия (Brandt et al., 2005; Hatakeyama, 2008; Costa et al., 2009). Цитотоксин CagA является вариабельным белком, и в популяции носителей инфекции Н. pylori циркулируют штаммы бактерии, экспрессирующие CagA-белок «западного» или «восточноазиатского» типов, которые различаются по аминокислотной последовательности и биологической активности (Xia et al, 2009).

Инфекции CagA-позитивными штаммами Н. pylori сопряжены также с развитием ряда экстрагасгральныч заболеваний аутоиммунной природы. Антитела против CagA-белка вносят существенный вклад в патогенез иммунной громбоцигопении (Franceschi et al., 2004; Takahashi et al., 2004). Роль и молекулярные механизмы участия цитотоксина CagA и антител против него в патогенезе других аутоиммунных заболеваний (хроническая уртикария, аутоиммунный тироидит и др.) нуждаются в дальнейшем исследовании (Figura et al., 1999; Bakos, Hillander, 2003; Stasi, Provan, 2008).

До сих пор остаются неизученными свойства CagA-белка как антигена: не выяснена иммуногенность различных эпитопов молекулы, не исследован изотопический спектр антител, вырабатываемых против этого белка.

По заключению ряда экспертов, в том числе III Маастрихтской конференции, для диагностики инфекции Н. pylori рекомендуется использовать комплекс иммунологических и молекулярно-биологических методов (Malfertheiner et al., 2007; Mishra et al., 2008;

Guarner et al., 2010). Поскольку CagA-белок является маркером высокопатогенных штаммов Н. pylori, разработка методов иммунодетекции CagA-антигена и антител против него представляется актуальной проблемой клинической иммунологии (Hatakeyama, Higashi, 2005; Megraud, Lehours, 2007; Monteiro et al, 2009). Решение этой проблемы сдерживается отсутствием стандартизованных препаратов антигена CagA и моноклоналъных антител (МКАТ) против него. До сих пор не существует эффективной технологии выделения и очистки белка CagA из культур Н. pylori, что препятствует получению и агтестации МКАТ против этого антигена.

Цель и задачи работы

Цель работы состояла в создании иммунохимических реагентов - антигенов и моноклональных антител - для выявления CagA-белка Helicobacter pylori и антител против него.

В рамках поставленной цели были сформулированы следующие задачи:

1. С помощью методов биоинформатики выявить области молекулы CagA, различающиеся по степени консервагивности и иммуногенности, и определить участки аминокислотной последовательности для конструирования рекомбинантных фрагментов цитотоксина.

2. Создать штаммы бактерий Escherichia coli, экспрессирующие рекомбинантные фрагменты белка CagA Н. pylori.

3. Изучить характер связывания рекомбинантных фрагментов CagA с сывороточными антителами и оценить возможность их использования для исследования антител против цитотоксина в сыворотке крови человека.

4. С помощью гибридомной технологии создать панель моноклональных антител против высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы CagA.

5. Изучить эпитопную специфичность и иммунохимические свойства полученных моноклональных антител с использованием рекомбинантных полипептидов в качестве антигенов.

6. Изучить взаимодействие моноклональных антител с нативным белком CagA из культур бактерий Н. pylori и определить методы их применения для выявления цито токсина.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Анализ аминокислотных последовательностей белков CagA с помощью методов биоинформатики оказался эффективным подходом к конструированию рекомбинантных полипептидов и созданию МКАТ.

2. Созданные рекомбинантные фрагменты CagA соответствуют изолированным участкам первичной структуры цитотоксина, обладающим разной иммуногенностыо, что позволяет получать МКАТ против высоко- и низкоиммуногенных детерминант молекулы CagA.

3. Рекомбинантные фрагменты CagA позволяют выявлять антитела против цитотоксина в сыворотках носителей инфекции Н. pylori, исследовать их изотопический состав и. специфичность в отношении различных участков молекулы белка CagA.

4. Рекомбинантные фрагменты могут служить основой для стандартизации мегодов количественного определения белка CagA в биологическом материале.

5. Созданные МКАТ способны взаимодействовать как с рскомбинантными фрагментами CagA, гак и с «природным» белком CagA в культурах Н pylori, и позволяют дискриминировать CagA-позитивные и CagA-негативные штаммы Н. pylori методами I иммуноблоттинга и иммуноферментного анализа. Новизна и научная значимость работы

В результате молекулярно-генетического типирования клинических изолятов Н. pylori впервые'осуществлен анализ особенностей молекулярной организации гена cagA штаммов Н. pylori, циркулирующих на территории России. В базе данных GenBank депонированы первые последовательности гена cagA российских изолятов бактерии.

Предсказана методами биоинформатики и подтверждена в экспериментах разная иммуногенность отдельных участков молекулы CagA.

Созданы штаммы Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантные фрагменты цитотоксина CagA, которые в совокупности воспроизводят всю аминокислотную последовательность этого белка.

Впервые создана панель МКАТ, распознающих антигенные детерминанты высоко- и низкоиммуногенных участков молекулы цитотоксина CagA.

Впервые предложена система двухцен грового иммуноферментного анализа (ИФА) для выявления CagA-антигена, основанная на использовании исключительно МКАТ.

Созданные реагенты открывают перспективы для решения ряда научно-исследовательских задач, таких как изучение закономерностей иммунного ответа на цитотоксин, анализ протективной эффективности антител против него, молекулярных механизмов развития язвенной болезни и опухолевой трансформации, роли CagA-белка в патогенезе экстрагастральных аутоиммунных заболеваний.

Практическая значимость работы

На основе полученных рекомбинантных фрагментов CagA белка разработан вариант ИФА для выявления специфических антител в сыворотках носителей высокопатогенных штаммов Н. pylori.

Рекомбинантные фрагменты CagA могут быть использованы в качестве контрольных и калибровочных реагентов для различных иммунометрических систем.

Созданные в работе МКАТ против CagA-белка представляют собой основу для разработки и производства диагностических тест-систем, позволяющих выявлять пациентов-носителей высокопатогенных CagA-позитивных штаммов Н. pylori, а также контролировать эффективность проводимой терапии.

Внедрение результатов исследования

Разработанные реагенты проходят апробацию в нескольких научных и диагностических лабораториях России, что подтверждается соответствующими документами. На базе Городской больницы №31 (г. Санкт-Петербург) у пациентов с идиопатической тромбоцитопенией и выявленным носительством Н. pylori проводится исследование антител, связывающих рекомбинантные фрагменты CagA. В лаборатории аллергодиагностики НИИ Вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (г. Москва) разработанные иммунохимические реагенты применяют для анализа взаимосвязи между инфекцией CagA-позитивными штаммами Н. pylori и аллергическим иммунным ответом у детей.

Результаты работы используются при проведении практического курса «Иммунологические методы исследования» на кафедре цитологии и гистологии биолого-почвенного факультета Санкт-Петербургского государственного университета.

Личный вклад автора в проведение исследования

Данные, представленные в работе, получены лично автором. Диссертантом выполнены все этапы создания штаммов-продуцентов рекомбинантных фрагментов CagA, иммунизации экспериментальных животных, получения гибридом, изучения свойств МКАТ, моделирования систем иммуноанализа на их основе. Приготовление меченых МКАТ и антигенов выполнено при участии сотрудников лаборатории гибридомной технологии ФГУ «РНЦ РХТ». Секвенирование образцов ДНК проведено специалистами компании «АТГ Сервис Ген» (Санкт-Петербург). Культивирование клинических изолятов Н. pylori выполнено сотрудниками НИЛ «Диагностика» (Санкт-Петербург).

Апробация работы

Материалы работы были представлены на IV международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), на Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии: Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 2008), на научной конференции «От лучей Рентгена - к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире решгенорадиологического института (Российского Научного Центра Радиологии и Хирургических Технологий)» (Санкт-Петербург, 2008), на XIX Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Хельсинки, 2009).

Публикации

Результаты работы отражены в 3 статьях и тезисах докладов 4 конференций.

1. Климович А.В., Самойлович М.П., Суворов A.II. Создание и характеристика рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori // ЖМЭИ. 2010. В. 2. С. 74-79.

2. Климович А.В., Грязева И.В., Самойлович М.П., Терехина JI А., Крутецкая И.Ю., Климович В.Б. Создание и характеристика моноклональных антител против белка CagA Helicobacter pylori II ЖМЭИ. 2010. В. 3. С. 62-67.

3. Klimovich A.V., Samoylovich М.Р., Gryazeva I.V., Teiekhina L.A. Suvorov A.N., Klimovich V.B. Development of Immunoreagents for Diagnostics of CagA-Positive Helicobacter pylori Infections // Helicobacter. 2010. V. 15. P. 193-200.

4. Самойлович М.П., Климович A.B., Терехина Jl.A., Грязева И.В , Климович В.Б Создание моноклональных антител для выявления белка CagA Helicobacter pylori II Вестник Российской Военно-медицинской академии. 2008. В. 2(22). Материалы конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний», Санкт-Петербург. 2008. С. 192-193.

5. Климович А.В., Терехина JI.A., Грязева И.В., Самойлович М.П., Климович В.Б. Моноклональные антитела против рекомбинантных фрагментов белка CagA Helicobacter pylori II Материалы конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». Санкт-Петербург. 2008. С. 126.

6. Терехина JI.A., Грязева И.В., Климович А.В., Самойлович М.П., Климович В.Б. Моноклональные антитела для диагностики CagA-позитивных штаммов против

Helicobacter pylori // Материалы научной конференции «От лучей Рентгена - к инновациям XXI века: 90 лет со дня основания первого в мире рентгенорадиологического института». Санкт-Петербург. 2008. С. 318-319. 7. Klimovich А.У., Terekhina L.A., Gryazeva I.V., Samoylovich М.Р., Suvorov A.N., Klimovich V.B. Development of Recombinant Helicobacter pylori CagA protein fragments for antibody production and characterization // Clinical Microbiology and Infection. 2009. V. 15 (s4). PI 162. Abstracts of the European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (Helsinki, Finland, 2009).

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 129 страницах и включает: введение, обзор литературы, описание методов исследования, изложение полученных результатов и их обсуждение, а также выводы и список литературы. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 33 рисунками. Список цитированной литературы включает 167 литературных источников.

Заключение диссертации по теме «Клиническая иммунология, аллергология», Климович, Александр Владимирович

ВЫВОДЫ

1. На основании in silico анализа в молекуле цитотоксина CagA выделено три качественно различные области, из которых N-концевая высоко консервативна и низкоиммуногенна, центральная - консервативна и обладает высокой иммуногенностью, а С-концевая характеризуется высокой вариабельностью и низкой иммуногенностью.

2. Сконструированы четыре штамма Escherichia coli, продуцирующие рекомбинантные фрагменты белка CagA. Фрагменты воспроизводят структуру высоко- и низко-иммуногенных областей молекулы CagA и в совокупности представляют всю аминокислотную последовательность белка.

3. Рекомбинантные фрагменты CagA позволяют выявлять сывороточные антитела против цитотоксина, исследовать их изотопический соств и специфичность в отношении различных участков молекулы белка CagA.

4. Впервые созданы штаммы гибридом-продуцентов моноклональных антител против высоко- и против низкоиммуногенных участков молекулы CagA.

5. Моноклональные антитела распознают четыре изолированных линейных эпитопа и реагируют как с рекомбинантными полипептидами, так и с нативным белком CagA Н pylori.

6. Моноклональные антитела (1Н1, 1Н11 и ЗН7) позволяют дифференцировать CagA-позитивные и CagA-негативные штаммы Н. pylori методом иммуноблоттинга. Антитела 1Н11 и ЗН7 составляют комплементарную пару для определения белка CagA методом двухцептрового имму но ферментного анализа.

БЛАГОДАРНОСТИ

Хотелось бы выразить благодарность всем тем людям, кто сделал возможным выполнение этой работы. Я искренне признателен тем, кто был моими учителями в университете, и в особенности преподавателям кафедры цитологии и гистологии СПбГУ. Я благодарен Александру Николаевичу Суворову, который способствовал зарождению идеи работы и её развитию, а также открыл для меня новые подходы и сферы научной деятельности. Я выражаю благодарность всем сотрудникам лаборатории гибридомной технологии, которые создали прекрасную атмосферу для работы, и в особенности признателен за неоценимую помощь Ирине Владимировне Грязевой, Лидии Александровне Терехиной, Ирине Юрьевне Крутецкой и Марине Платоновне Самойлович. Наконец, я благодарен за поддержку своей семье и друзьям.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Климович, Александр Владимирович, 2010 год

1. Жебрун А.Б. Инфекция Helicobacter pylori. СПб.: Феникс. 2006. 380 с.

2. Лазебник Л.Б., Царегородцева Т.М., Серова Т.И., Соколова Г.Н., Юти шина М.В., Губина А.В. Антитела к Helicobacter pylori при болезнях желудка // Терапевтический Архив. 2006. Т. 78(2). С. 15-19.

3. Лазебник Л.Б., Чернутская С.П., Гервазиева В.Б., Сухарева Г.В. Н. pylori в развитии аллергических заболеваний у пациентов с гастродуоденальными заболеваниями // Терапевтический Архив. 2008. Т. 80(12). С. 63-66.

4. Самойлович М.П., Грязева И.В., Денисова Г.Н., Казакевич М.Ц., Сирота С., Пашкова С.Ф., Климович В.Б. Получение гибридом на средах с сывороткой крупного рогатого скота. В сб.: Труды ЦНИИВС им. И.И.Мечникова. М. 1985. С. 121-129.

5. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. 1985. 358 с.

6. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). В кн.: Методы культивирования клеток. Под ред.: Пинаев Г.П. Л.: Наука. 1988. С. 194205.

7. Хэй Р. Сохранение и оценка качества клеток. В кн.: Культура животных клеток: методы. Под ред.: Фрешни Р. М.: Мир. 1989. С. 108-165.

8. Adiloglu А.К., Isler М., Goren I., Candir О., Senol A., Onal S., Karahan N. Quantitative correlation of Helicobacter pylori stool antigen (HpSA) test with the severity of H. pylori-related gastritis // Tohoku J Exp Med. 2007. V. 212(2). P. 159-167.

9. Ahmed N., Sechi L. A. Helicobacter pylori and gastroduodenal pathology: new threats of the old friend // Ann Clin Microbiol Antimicrob. 2005. V. 4. P. 1.

10. Alberts В., Johnson A., Lewis J., Raff M., Roberts K., Walter P. Molecular biology of the cell, 4th ed. New York: Garland Science. 2002. 1616 P.

11. Algood H.M., Cover T.L. Helicobacter pylori persistence: an overview of interactions between H. pylori and host immune defenses // Clin Microbiol Rev. 2006. V. 19(4). P. 597613.

12. Altman D.G., Bland J.M. Diagnostic tests 2: Predictive values // BMJ. 1994a. V. 309(6947). P. 102.

13. Altman D.G., Bland J.M. Diagnostic tests. 1: Sensitivity and specificity // BMJ. 1994b. V. 308(6943). P. 1552.

14. Altschul S.F., Madden T.L., Schaffer A.A., Zhang J., Zhang Z., Miller W., Lipman D.J. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs // Nucleic Acids Res. 1997. V. 25(17). P. 3389-3402.

15. Amero S.A., James T.C., Elgin S.C.R. Production of antibodies using proteins in gel bands. In: Methods in Molecular Biology / Ed.: Walker J.M., Clifton N.J. N.J.: Humana Press. 1988. P. 355-362.

16. Amieva M.R, Vogelmann R., Covacci A., Tompkins L.S., Nelson W.J., Falkow S. Disruption of the epithelial apical-junctional complex by Helicobacter pylori CagA // Science. 2003. V. 300(5624). P. 1430-1434.

17. Andersen L.P., Wadstrom T. Basic bacteriology and culture. In: Helicobacter pylori: physiology and genetics / Ed.: Mobley II.L.T., Mendz G.L., Hazell S.L. Washington: ASM , Press. 2001. P. 27-38.

18. Ando T., Goto Y., Maeda O., Watanabe O., Ishiguro K., Goto H. Causal role of Helicobacter pylori infection in gastric cancer // World J Gastioenterol. 2006. V. 12(2). P. 181-186.

19. Argent RII., Thomas R.J, Letley D.P., Rittig M.G., Hardie K.R., Atherton J.C. Functional association between the Helicobacter pylori virulence factors VacA and CagA // J Med Microbiol. 2008b. V. 57(2). P. 145-150.

20. Asaka M., Kato M., Takahashi S., Fukuda Y., Sugiyama T., Ota H., Uemura N., Murakami K., Satoh K., Sugano K. Guidelines for the Management of Helicobacter pylori Infection in Japan: 2009 Revised Edition // Helicobacter. 2010. V. 15). P. 20.

21. Backert S., Selbach M. Role of type IV secretion in Helicobacter pylori pathogenesis // Cell Microbiol. 2008. V. 10(8). P. 1573-1581.

22. Bakos N., Hillander M. Comparison, of chronic autoimmune urticaria with chronic idiopathic urticaria // Int J Dermatol. 2003. V. 42(8). P. 613-615.

23. Bamford K.B., Fan X., Crowe S.E., Leary J.F., Gourley W.K., Luthra G.K., Biooks E.G., Graham D.Y., Reyes V.E., Ernst P.B. Lymphocytes in the human gastric mucosa during

24. Helicobacter pylori infection have a T helper cell 1 phenotype // Gastroenterology. 1998. V. 114(3). P. 482-492.

25. Basso D., Stefani A., Brigato L., NavagliaF., Greco E., Zambon C.F., Piva M.G., Toma A., Di Maiio F., Plebani M. Serum antibodies anti-//. pylori and anti-CagA: a comparison between four different assays // J Clin Lab Anal. 1999. V. 13(4). P. 194-198.

26. Basso D., Zambon C.F., Letley D.P., Stranges A., Marchet A., Rhead J.L.,' Schiavon S., Guariso G., Ceroti M., Nitti D., et al. Clinical relevance of Helicobacter pylori cagA and vacA gene polymorphisms // Gastroenterology. 2008. V. 135(1). P. 91-99.*

27. Berger B., Wilson D.B., Wolf E., Tonchev T., Milla Mi, Kim P.S. Predicting coiled coils by use of pairwise residue correlations // Proc Natl Acad Sci USA. 1995. V. 92(18). P. 82598263.

28. Beswick E.J., Suarez G., Reyes V.E. H. pylori and host interactions that influence pathogenesis // World J Gastroenterol. 2006. V>. 12(35). P. 5599-5605.

29. BhatN., Gaensbauer J., Peek R.M., Bloch K., Tham K.T., Blaser M.J., Perez-Perez G. Local and systemic immune and inflammatory responses to Helicobacter pylori strains // Clin Diagn Lab Immunol. 2005. V. 12(12). P. 1393-1400.

30. Blaser M.J. Atherton J.C. Helicobacter pylori persistence: biology and disease // J Clin Invest. 2004. V. 113(3). P. 321-333.

31. Blomstergren A., Lundin A., Nilsson C., Engstrand L., Lundeberg J. Comparative analysis of the complete cag pathogenicity island sequence in four Helicobacter pylori isolates // Gene. 2004. V. 328. P. 85-93.

32. Bolek B.K., Salih B.A., Sander E. Genotyping of Helicobacter pylori strains from gastric biopsies by multiplex polymerase chain reaction. How advantageous is it? // Diagn Microbiol Infect Dis. 2007. V. 58(1). P. 67-70.

33. Boscato L.M., Egan G.M., Stuart M.C. Specificity of two-site immunoassays // J Immunol Methods. 1989. V. 117(2). P. 221-229.

34. Botham C.M., Wandler A.M., Guillemin K. A transgenic Drosophila model 'demonstrates that the Helicobacter pylori CagA protein functions as a eukaryotic Gab adaptor // PLoS Pathog. 2008. V. 4(5). P. el000064.

35. Brandt S., Kwok T., Hartig R., Konig W., Backert S. NF-kappaB activation and potentiation of proinflammatory responses by the Helicobacter pylori CagA protein // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V. 102(26). P. 9300-5.

36. Bruce M.G., Maaroos H.I. Epidemiology of Helicobacter pylori infection // Helicobacter. 2008. V. 13(Suppl 1).P. 1-6.

37. Chen Y., Blaser M.J. Inverse associations of Helicobacter pylori with asthma and allergy // Arch Intern Med. 2007. V. 167(8). P. 821-827.

38. Coller H.A., Coller B.S. Poisson statistical analysis of repetitive subcloning by the limiting dilution technique as a way of assessing hybridoma monoclonality 11 Methods Enzymol. 1986. V. 121. P. 412-417.

39. Conacci-Sorrell M., Zhurinsky J., Ben-Zeev A. The cadherin-catenin adhesion system in signaling and cancer // J Clin Invest. 2002. V. 109(8). P. 987-991.

40. Cooper J.A., Hayman W., Reed C., Kagawa H., Good M.F., Saul A. Mapping of conformational B cell epitopes within alpha-helical coiled coil proteins // Mol Immunol. 1997. V. 34(6). P. 433-440.

41. Costa A.C., Figueiredo C., Touati E. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection // Helicobacter. 2009. V. 14(Suppl 1). P. 15-20.

42. Cover T.L., Glupczynski Y., Lage A.P., Burette A., Tummuru M.K., Perez-Perez G.I., Blaser M.J. Serologic detection of infection with cagA+ Helicobacter pylori strains // J Clin Microbiol. 1995. V. 33(6). P. 1496-1500.

43. Cover T.L., Krishna U.S., Israel D.A., Peek R.M., Jr. Induction* of gastric epithelial cell apoptosis by Helicobacter pylori vacuolating cytotoxic// Cancer Res. 2003. V. 63(5). P. 951-957.

44. D'Elios M.M., Andersen L.P. Inflammation, immunity, and vaccines for Helicobacter pylori II Helicobacter. 2009. V. 14(Suppl 1). P. 21-28.

45. Presse Med. 2008. V. 37(2). P. 525-534.

46. Dixon M.F., Genta R.M., Yardley J.H., Correa P. Classification and grading of gastritis. The updated Sydney System. International Workshop on the Histopathology of Gastritis, Houston 1994//Am J.Surg Pathol. 1996. V. 20(10). P. 1161-1181.

47. Dong Q.J., Wang Q., Xin Y.N., Li N., Xuan S.Y. Comparative genomics of Helicobacter pylori II World J Gastroenterol.' 2009. V. 15(32). P. 3984-3991.

48. Dubois A., Boren T. Helicobacter pylori is invasive and it may be a facultative intracellular i -organism // Cell Microbiol. 2007. V. 9(5). P. 1108-1116.

49. Dundon W.G., de Bernard M., Montecucco C. Virulence factors of Helicobacter pylori II Int J Med Microbiol. 2001. V. 290(8). P. 647-658.

50. Fan X.G., Yakoob J., Fan X.J., Keeling P.W. Enhanced T-helper 2 lymphocyte responses: immune mechanism of Helicobacter pylori infection // Ir J Med Sei. 1996. V. 165(1). P. 3739.

51. Feller S.M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles // Oncogene. 2001. V. 20(44). P. 6348-6371.

52. Figueiredo C., Machado J.C., Yamaoka Y. Pathogenesis of Helicobacter pylori Infection // Helicobacter. 2005. V. 10 (Suppl 1). P. 14-20. '

53. Fischer W., Hofreuter D., Haas R. Natural Transformation, Recombination, and Repair. In: ■i Helicobacter pylori: pKysiology and genetics / Ed.: Mobley H.L.T., Mendz G.L., Hazell S.L.

54. Washington: ASM Press. 2001. P. 249-258.

55. Fischer W., Prassl S., Haas R. Virulence mechanisms and persistence strategies of the* human gastric pathogen Helicobacter pylori II Curr Top Microbiol Immunol. 2009. V. 337. P. 129-171.

56. Fock K.M., Katelaris P., Sugano K., Ang T.L., Hunt R., Talley N.J., Lam S.K., Xiao S.D., Tan HJ., Wu C.Y., et al. Second Asia-Pacific Consensus Guidelines for Helicobacter pylori infection//J Gastroenterol Hepatol. 2009. V. 24(10). P. 1587-1600.

57. Franceschi F., Christodoulides N., Kroll M.H., Genta R.M. Helicobacter pylori and» idiopathic thrombocytopenic purpura // Ann Intern Med. 2004: V. l'40(9). P. 766-767.

58. Furuta T., Delchier J.C. Helicobacter pylori and non-malignant diseases // Helicobacter. 2009. V. 14(Suppl 1). P. 29-35.

59. GallofN., Basso D., Zambon C.F., Navaglia F., Dii Mario F., Rugge M., Plebani.M. Diagnosis of Helicobacter pylori infection: comparison of techniques // Recenti Prog Med. 2001. V. 92(5). P. 332-335.

60. Gasbarrini A., Franceschi F., Tartaglione R., Landolfi R., Pola P., Gasbarrini G. Regression of autoimmune thrombocytopenia after eradication of Helicobacter pylori II Lancet. 1998. V. 352(9131). P. 878.

61. Gebert B., Fischer W., Haas R. The Helicobacter pylori vacuolating cytotoxin: from cellular vacuolation to immunosuppressive activities // Rev Physiol Biochem Pharmacol. 2004. V. 152. P. 205-220.

62. Gisbert J.P., de la Morena F., Abraira V. Accuracy of monoclonal stool antigen test for the diagnosis of II. pylori infection: a systematic review and meta-analysis // Am J Gastroenterol. 2006. V. 101(8). P. 1921-1930.

63. Gisbert J.P., Pajares J.M. Review article: C-urea breath test in the diagnosis of Helicobacter pylori infection a critical review // Aliment Pharmacol Ther. 2004a. V. 20(10). P. 10011017.

64. Gisbert J.P., Pajares J.M. Stool antigen test for the diagnosis of Helicobacter pylori infection: a systematic review// Helicobacter. 2004b. V. 9(4). P. 347-368.

65. Go M.F. Review article: natural history and epidemiology of Helicobacter pylori infection // Aliment Pharmacol Ther. 2002. V. 16 (Suppl 1). P. 3-15.

66. Go M.F. Diagnosis and Treatment of Helicobacter pylori II Curr Treat Options Gastroenterol. 2005. V. 8(2). P. 163-174.

67. Guarner J., Kalach N., Elitsur Y., Koletzko S. Helicobacter pylori diagnostic tests in children: review of the literature from 1999 to 2009 // Eur J Pediatr. 2009. V. 169(1). P. 1525.

68. Hanly W.C., Artwohl J.E., Bennett B.T. Review of Polyclonal Antibody Production« Procedures in Mammals and Poultry // IL AR J. 1995. V. 37(3). P. 93-118.

69. Harlow E., Lane D. Antibodies: A Laboratory Manual. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory. 1988. 359 P.

70. Hatakeyama M. Helicobacter pylori CagA a potential' bacterial oncoprotein that functionally mimics the mammalian Gab family of adaptor proteins // Microbes Infect. 2003. V. 5(2). P. 143-150.

71. Hatakeyama M. SagA of CagA in Helicobacter pylori pathogenesis // Curr Opin Microbiol. 2008. V. 11(1). P. 30-37.

72. Hatakeyama M., Higashi H. Helicobacter pylori CagA: a new paradigm for bacterial carcinogenesis // Cancer Sei. 2005. V. 96(12). P. 835-843.

73. Huang X., Miller W. A time-efficient, linear-space local similarity algorithm // Adv in Appl Math. 1991. V. 12(3). P. 337-357.

74. IARC Schistosomes, liver flukes and Helicobacter pylori. IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Lyon, 7-14 June 1994 // IARC Monogr Eval Carcinog Risks Ilum. 19941 V. 61. P. 1-241.

75. Israel D.A., Salama N., Krishna U., Rieger U.M., Atherton J.C., Falkow S., Peek R.M , Jr. Helicobacter pylori genetic diversity within the gastric niche of a single human host // Proc Natl Acad Sci USA. 2001. V. 98(25). P. 14625-14630.

76. Jones D.M., Lessells A.M., Eldridge J. Campylobacter like organisms on the gastric mucosa: culture, histological, and serological studies // J Clin Pathol. 1984. V. 37(9). P. 1002-1006.

77. Jones K.R., Joo Y.M., Jang S„ Yoo Y.J., Lee H.S., Chung I.S., Olsen C.H., Whitmire J.M., Merrell D.S., Cha J.H. Polymorphism in the CagA EPIYA motif impacts development of gastric cancer//J Clin Microbiol. 2009. V. 47(4). P. 959-968.

78. Kimura M., Goto S., Wada A., Yahiro K., Niidome T., Hatakeyama T, Aoyagi H., Hiiayama T., Kondo T. Vacuolating cytotoxin purified from Helicobacter pylori causes mitochondrial damage in human gastric cells // Microb Pathog. 1999. V. 26(1). P. 45-52.

79. Kuipers E.J. Review article: exploring the link between Helicobacter pylori and gastric cancer // Aliment Pharmacol Ther. 1999. V. 13(Suppl 1). P. 3-11.

80. Kusters J.G., van Vliet A.H., Kuipers E.J. Pathogenesis of Helicobacter pylori infection // Clin Microbiol Rev. 2006. V. 19(3). P. 449-490.

81. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. V. 227(5259). P. 680-685.

82. Larkin M.A., Blackshields G„ Brown N.P., Chenna R., McGettigan P.A., McWilliam H., Valentin F., Wallace I.M., Wilm A., Lopez R., et al. Clustal W and Clustal X version 2.0 // Bioinformatics. 2007. V. 23(21). P. 2947-2948.

83. Li Y., Ning Y.S., Hong-Y.H., Liu Y.C., Luo J., Long M., Dong W.Q., Li M. Preparation and identification of monoclonal», antibodies against Helicobacter pylori II Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 2006. V. 26(4). P. 425-427.

84. Lu H.S., Saito Y., Umeda M., Murata-Kamiya N. Zhang H.M., Higashi H:, Hatakeyama M. Structural and' functional; diversity in the PARlb/MARK2-binding region of Helicobacter pylori CagA // Cancer Sei. 2008. V. 99(10). P. 2004-2011.

85. Lu Z., Jiang G., Blume-Jensen P., Hunter T. Epidermal growth factor-induced tumor cellinvasion and metastasis*' initiated by dephosphorylation and downregulation of focal adhesion kinase//Mol Cell Biol. 2001. V. 21(12). P. 4016-4031.

86. Maeda S., YoshidaH., Ikenoue T., Ogura K., Kanai F., Kato N., Shiratori Y., Omata M. Structure of cag pathogenicity island" in Japanese Helicobacter pylori isolates // Gut. 1999. V. 44(3). P. 336-341.

87. Maniatis T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory. 1982. 545 P.

88. Mattsson A., Quiding-Jarbrink M., Lonroth H., Hamlet A., Ahlstedt I., Svennerholm A. Antibody-secreting cells in the stomachs of symptomatic and asymptomatic Helicobacter /n /or/-infected subjects // Infect Immun. 1998. V. 66(6). P. 2705-2712.

89. McDaniel L.S., Ralph B.A., McDaniel D.O., Briles D.E. Localization of protection-eliciting epitopes on PspA of Streptococcus pneumoniae between amino acid residues 192 and 260 // Microb Pathog. 1994. V. 17(5). P. 323-337.

90. Megraud F., Lehours P. Helicobacter pylori detection and antimicrobial susceptibility testing // Clin Microbiol Rev. 2007. V. 20(2). P. 280-322.

91. Mimuro H., Berg D.E., Sasakawa C. Control of epithelial cell structure and developmental fate: lessons from Helicobacter pylori II Bioessays. 2008. V. 30(6). P. 515-520.

92. Mitchell H.M., Ally R., Wadee A., Wiseman M., Segal I. Major differences in the IgG subclass response to. Helicobacter pylori in the first and third worlds // Scand J Gastroenterol. 2002. V. 37(5). P. 517-522.

93. Mobley H.L.T. Urease. In: Helicobacter pylori: physiology and genetics. / Ed.: Mobley H.L.T., Mendz G.L., Hazell S.L. Washington, DC: ASM Press. 2001. P. 179-193.

94. Monteiro L., Oleastro M., Lehours P., Megraud F. Diagnosis of Helicobacter pylori infection//Helicobacter. 2009. V. 14(Suppl 1). P. 8^14.

95. Nguyen L.T., Uchida T., Murakami K., Fujioka T., Moriyama M. Helicobacter pylori virulence and the diversity of gastric cancer in Asia // J Med Microbiol. 2008. V. 57(Pt 12). P: 1445-1453.

96. Park C.Y., Cho Y.K., Kodama T., El-Zimaity H.M., Osato M.S., Graham D.Y., Yamaoka Y. New serological assay for detection of putative Helicobacter pylori virulence factors // J Clin Microbiol. 2002. V. 40(12). P. 4753-4756.

97. Parsonnet J., Friedman G.D., Orentreich N., Vogelman H. Risk for gastric cancer in people with CagA positive or CagA negative Helicobacter pylori infection // Gut. 1997. V. 40(3). P. 297-301.

98. Peek R.M., Jr., Blaser M.J., Mays-D.J., Forsyth M.H., Cover T.L., Song S.Y., Krishna U., Pietenpol J.A. Helicobacter pylori strain-specific genotypes and modulation of the gastric epithelial cell cycle // Cancer Res. 1999. V. 59(24). P. 6124-6131.

99. Pellicano R., .Franceschi F., Saracco G., Fagoonee S., Roccarina D., Gasbarrini A. Helicobacters and extragastric diseases // Helicobacter. 2009. V. 14(Suppl 1). P. 58-68.

100. Perez-Perez G.I., Rothenbacher D., Brenner H. Epidemiology of Helicobacter pylori infection // Helicobacter. 2004. V. 9(Suppl 1). P. 1-6.

101. Piechaczyk M., Chardes T., Cot M.C., Pau Bl, Bastide J.M. Production and characterization of monoclonal antibodies against human thyroglobulin // Hybridoma. 1985. V. 4(4). P. 361367.

102. Prinz C., Schwendy S., Voland P. H. pylori and gastric cancer: shifting the global^burden // World J Gastroenterol. 2006. V. 12(34). P. 5458-5464.

103. Qiagen. The QIAexpressionist, 5th ed.: QIAGEN Inc. 2003. 128 P.

104. Radosz-Komoniewska H., Bek T., Jozwiak J., Martirosian G. Pathogenicity of Helicobacter pylori infection // Clin Microbiol Infect. 2005. V. 11(8). P. 602-610.

105. Rohde M., Puis J., Buhrdorf R., Fischer W., Haas R. A novel sheathed surface organelle of the Helicobacter pylori cag type IV secretion system // Mol Microbiol. 2003. V. 49(1). P. 219-234.

106. Rozen S., Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers // Methods Mol Biol. 2000. V. 132. P. 365-386.

107. Rubio C.A. My approach to reporting a gastric biopsy // J Clin Pathol. 2007. V. 60(2). P. 160-166.

108. Salama N., Guillemin K., McDaniel T.K., Sherlock G., Tompkins L., Falkow S. A whole-genome microarray reveals genetic diversity among Helicobacter pylori strains // Proc Natl Acad Sci USA. 2000. V. 97(26). P. 14668-14673.

109. Samoilovich M.P., Klimovich V.B., Gervazieva V.B., Ovsjannikova I.G., Pashkova S.F., Polyschuk T.B. A new family of monoclonal antibodies against human IgE // Allergy and Clinical Immunology News. 1992. V. 4. P. 21-25.

110. Schmausser B., Eck M., Greiner A., Kraus M., Muller-Hermelink H.K. Mucosal humoral immune response to CagA shows a high prevalence in patients with gastric MALT-type lymphoma // Virchows Arch. 2000. V. 436(2). P. 115-118.

111. Segal E.D., Cha J., Lo J., Falkow S., Tompkins L.S. Altered states: involvement of phosphorylated CagA in the induction of host cellular growth changes by Helicobacter pylon // Proc Natl Acad Sci USA. 1999. V. 96(25). P. 14559-14564.

112. Selgrad M., Kandulski A., Malfertheiner P. Helicobacter pylori: diagnosis and treatment //

113. Sommer F., Faller G., Konturek P., Kirchner T., Hahn E.G., Zeus Ji, Rollinghoff M., Lohoffi

114. Trautmann K., Stolte M., Miehlke S. Eradication of H pylori for the prevention of gastric cancer// World J Gastroenterol. 2006. V. 12(32). P.15101-5107.

115. Tsutsumi R., Takahashi A., Azuma T., Higashi H., Hatakeyama M. Focal adhesion kinase is a substrate and downstream effector of SHP-2 complexed with Helicobacter pylori CagA // Mol Cell Biol. 2006. V. 26(1). P. 261-276.

116. Tummuru M.K., Cover T.L., Blaser M.J. Cloning and expression of a high-molecular-mass major antigen of Helicobacter pylori: evidence of linkage to cytotoxin production // Infect Iramun. 1993. V. 61(5). P. 1799-1809.

117. Vaira D., Gatta L., Ricci C., Miglioli M. Review article, diagnosis of Helicobacter pylori infection // Aliment Pharmacol Ther. 2002. V. 16 (Suppl 1). P. 16-23.

118. Vorobjova T., Maaioos H.I., Uibo R. Immune response to Helicobacter pylori and its association with the dynamics of chronic gastritis in the antrum and coipus // Apmis. 2008. V. 116(6). P. 465-476.

119. Weintraub M., Raymond S. Antiserums prepared with acrylamide used as an adjuvant // Science. 1963. V. 142 P. 1677-1678.

120. Westblom T.U., Madan E., Midkiff B.R. Egg yolk emulsion agar, a new medium for the cultivation of Helicobacter pylori //J Clin Microbiol. 1991. V. 29(4). P. 819-821.

121. Xia Y., Yamaoka Y., Zhu Q., Matha I., Gao X. A comprehensive sequence and disease correlation analyses for the C-terminal region of CagA protein of Helicobacter pylori II PLoS One. 2009. V. 4(11). P. e7736.

122. Yamaoka Y., Kato M., Asaka M. Geographic differences in gastric cancer incidence can be explained by differences between Helicobacter pylori strains // Intern Med. 2008. V. 47(12). P 1077-1083.

123. Yamaoka Y., Kodama T., Kashima K., Graham D.Y., Sepulveda A.R. Variants of the 3' region of the cagA gene in Helicobacter pylori isolates from patients with different H. pylori-associated diseases Ii J Clin Microbiol. 1998. V. 36(8). P. 2258-2263.

124. Yamazaki S., Yamakawa A., Ito Y., Ohtani M., Higashi H., Hatakeyama M., Azuma T. The CagA protein of Helicobacter pylori is translocated into epithelial cells and binds to SHP-2 in human gastric mucosa // J Infect Dis. 2003. V. 187(2). P. 334-337.

125. Yasuda A., Uchida T., Nguyen L.T., Kawazato H., Tanigawa M., Murakami K., Kishida T., Fujioka T., Moriyama M. A novel diagnostic monoclonal antibody specific for Helicobacter pylori CagA of East Asian type // Apmis. 2009. V. 117(12). P. 893-899.

126. Zhong Q., Shao S.H., Cui L.L., Mu R.H., Ju X.L., Dong S.R. Type IV secretion system in Helicobacter pylori: a new insight into pathogenicity // Chin Med J (Engl). 2007. V. 120(23). P. 2138-2142.