Создание гипериммунного протективного антигена Bacillus anthracis для иммунопрофилактики сибирской язвы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.09, кандидат наук Щербинин, Дмитрий Николаевич

• Щербинин, Дмитрий Николаевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Щербинин, Дмитрий Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Факторы вирулентности Bacillus anthracis

1.2 Особенности иммунного ответа к Bacillus anthracis

1.3 Клеточный иммунный ответ к сибиреязвенным бациллам

1.4 Подходы к созданию вакцин от сибирской язвы

1.5 Используемые в настоящее время противосибиреязвенные вакцины

1.6 Рекомбинантный аденовирус человека пятого серотипа и его применение для генетической иммунизации

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Материалы

2.1.1 Вирусы и бактериальные штаммы

2.1.2 Клеточные линии

2.1.3 Плазмидные векторы

2.1.4 Ферменты и другие реактивы

2.1.5 Лабораторные животные

2.1.6 Лабораторное оборудование

2.2 Методы исследования

2.2.1 Бактериологические методы

2.2.2 Генно-инженерные методы

2.2.3 Вирусологические методы

2.2.4 Молекулярно-биологические методы

2.2.5 Серологические методы

2.2.6 Методы работы с животными

2.2.7 Статистическая обработка результатов исследований

2.2.8 Биоинформатические методы

2.3 Результаты исследований

2.3.1 Дизайн генетических конструкций сРА, бРА, РА-Бс

2.3.2 Получение челночных плазмид р8Ь-сРА, рБЬ -бРА, рЭЬ -РА-Бс

2.3.3 Получение рекомбинантных аденовирусов Ас1-сРА, Аё-вРА, Аё-РА-Бс

2.3.4 Изучение экспрессии генов сРА, 5РА, РА-Бс из состава рекомбинантных аденовирусов методом вестерн-блотта

2.3.5 Определение антиген-специфического лимфопролиферативного ответа к протективному антигену у мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Аё-РА-Бс, Аё-БРА и Ас1-сРА

2.3.6 Оценка индукции антител класса ^О к РА в сыворотках крови мышей, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами, методом ИФА

2.3.7 Оценка методом ИФА подклассов антител специфических к РА в сыворотках крови мышей

2.3.8 Изучение протективных свойств рекомбинантных аденовирусов Аё-сРА, Аё-зРА, Аё-РА-Бс против В. аШкгаЫз методом контрольного заражения лабораторных животных

2.3.9 Изучение длительности защитных свойств у лабораторных животных, интраназально иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Аё-сРА, Аё-эРА, Аё-РА-Бс

2.3.10 Оценка методом ИФА индукции антител класса к РА в сыворотках крови морских свинок, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами

2.3.11 Оценка защитных свойств гипериммунного протективного антигена на модели летальной сибиреязвенной инфекции на морских свинках

2.3.12 Оценка напряженности иммунного ответа при иммунизации гипериммунным протективным антигеном

ГЛАВА 3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

А549 - клетки карциномы легких человека Ad - аденовирус человека 5-го серотипа

Ad-PA-Fc - рекомбинантный аденовирус, содержащий РА слитый с Fc-

фрагментом иммуноглобулина IgG2a Ad-sPA - рекомбинантный аденовирус, содержащий секретируемую форму РА.

Ad-cPA - рекомбинантный аденовирус, содержащий несекретируемую форму РА

Amp - ген устойчивости к ампициллину

AVA (Anthrax Vaccine Adsorbed) - сибиреязвенная вакцина адсорбированная AVP (Anthrax Vaccine Precautions) - сибиреязвенная вакцина

преципитированная CDC (Centers for Disease Control and Prevention) - Центры по контролю и

профилактике заболеваний CIAP - щелочная фосфатаза кишечника теленка CMV - промотер цитомегаловируса человека

сРА - цитоплазматическая форма четвертого домена протективного антигена

DMEM - минимальная среда Игла в модификации Dulbecco

DTT - дитиотреитол

EF - отёчный фактор Bacillus anthracis

EGFP - зеленый флуоресцирующий белок

Fc-PA — четвертый домен протективного антигена N-концом слитый с

Fc-фрагментом IgG2a IFA- неполный адъювант Фрейнда

Km - ген устойчивости к канамицину

LD50 - средняя летальная доза

LF - летальный фактор Bacillus anthracis

МНС - главный комплекс тканевой совместимости

MOPS - 3-(1Ч-морфолино) пропансульфоновая кислота

ori - точка инициации репликации

р - плазмида

РА - протективный антиген Bacillus anthracis рА - сигнал полиаденилирования вируса SV40

PA-Fc - четвертый домен протективного антигена С-концом слитый с

Fc-фрагментом IgG2a PBS - фосфатный солевой буфер PEG — полиэтиленгликоль

RPMI-1640 - среда для культивирования клеток и тканей

SDS - додецилсульфат натрия

SEAP - секретируемая щелочная фосфотаза

sPA - секретируемая форма четвертого домена протективного антигена ТАЕ - трис-ацетатный буфер

tpa - сигнальный пептид Tissue-type plasminogen activator (UniProt: P00750)

Tris - гидрооксиметиламинометан

БОЕ - бляшкообразующая единица

ВОЗ - всемирная организация здравоохранения

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфат

КРС - крупный рогатый скот

ПЦР - полимеразная цепная реакция

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА — двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Создание гипериммунного протективного антигена Bacillus anthracis для иммунопрофилактики сибирской язвы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Сибирская язва - опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее людей и животных. Возбудителем является Bacillus anthracis - грамположительный, спорообразующий микроорганизм, способный длительное время сохраняться в почве и на различных предметах. Ежегодно в разных регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции [187]. Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных по сибирской язве территорий [12]. Развитию такой ситуации способствуют меняющиеся социально-экономические условия жизни населения, а также действие ряда факторов природного и антропогенного характера, требующие дальнейшего изучения. По уточненным данным кадастра, в 2008 году в России отмечено 28 986 стационарно неблагополучных по сибирской язве населенных пунктов, 13 855 скотомогильников, из них 4 961 - не отвечают требованиям ветеринарно-санитарных норм, что составляет 35,8 % [17]. Кроме этого на территории субъектов РФ имеется еще 15 664 места захоронения павших животных и 925 - сжигательных печей. В 14 субъектах Российской Федерации трупосжигательные печи отсутствуют. Более того, ежегодно регистрируются спорадические вспышки болезни среди людей, в том числе со смертельными исходами. По статистическим данным за период с 2001 по 2012 годы в РФ заболело 120 человек, из которых четверо умерло [22]. В других странах мира ситуация по сибирской язве также остается напряженной [21]. Таким образом, санитарно-эпидемиологическую обстановку по сибирской язве в России оценивают как неблагоприятную [1,4].

Постановлением Правительства Российской Федерации от 1 декабря 2004 г. №715 «Об утверждения перечня социально-значимых и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих» сибирская язва отнесена к группе заболеваний, представляющих опасность для окружающих, наряду с чумой и холерой.

Высокая патогенность В. anthracis в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов относящихся ко второй группе патогенности [20] и имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения [136,124]. Центр по контролю и профилактике заболеваний США (CDC) относит В. anthracis к высшему классу (категория А) биотеррористических агентов [184]. Потенциал В. anthracis в качестве биологического оружия был продемонстрирован несколькими громкими инцидентами, произошедшими в последних три десятилетия. В 1979 году аварийный случай распыления спор произошел на военном объекте в городе Свердловске, который привел к 96 случаям заражения сибирской язвы, в том числе 68 случаям со смертельным исходом [111,28]. С 1985 по 1991 год в Ираке разрабатывалось биологическое оружие на основе сибиреязвенных бактерий и могло быть использовано в любой момент в войне в Персидском заливе [181]. В 1993 году Аум Синрикё распылили споры сибирской язвы на вершине здания в Токио [145]. Этот инцидент можно считать первым документально зарегистрированным случаем использования сибиреязвенных бактерии в качестве аэрозольного оружия биотеррористами. Впоследствии было обнаружено, что используемый террористами штамм является вакцинным штаммом Sterne и был импортирован из США для использования в качестве вакцины для коров [87]. Осуществленная в 2001 году рассылка зараженной спорами В. anthracis корреспонденции, вызвала панику среди населения США и привела к гибели пяти человек из одиннадцати от легочной формы заболевания [83,47,40].

Существуют различные пути передачи возбудителя сибирской язвы: через кишечник (поедание зараженной пищи), кожу (контакты с зараженными животными или их тушами), или через дыхательные пути (вдыхание спор). Следует заметить, что самой распространенной является кожная форма заболевания, которая протекает гораздо легче, чем другие формы болезни но, тем не менее, несмотря на проведение антибиотекотерапии сопровождается 5,5% летальностью [17], тогда как без лечения летальность достигает 20% [56]. При проникновении возбудителя в организм человека через слизистые оболочки дыхательных путей или желудочно-кишечного тракта может развиваться септическая форма, которая часто приводит к смертельному исходу. Установлено, что при кишечной и легочной формах болезни летальность составляет приблизительно 50% и 90%, соответственно [111]. Все это свидетельствует о высокой вирулентности сибиреязвенных бацилл, а также о необходимости контроля над данным заболеванием.

Иммунизация современными ослабленными живыми вакцинами является научно-обоснованным и эффективным способом профилактики сибирской язвы. Однако выпускаемые живые вакцины необходимо водить двукратно, с последующей ежегодной ревакцинацией [168]. Считается, что существующие вакцины обладают слабой иммуногенностью [137] и длительность сохранения поствакцинального иммунитета не превышает 6-8 месяцев [15]. Отчасти это можно объяснить неспособностью стандартизировать скарификационный путь введения вакцины. Другим недостатком живых вакцин является их реактогенность [46], а также наличие противопоказаний к их применению [185]. Более того, некоторые авторы показали, что живые вакцины не создают напряженного иммунитета против некоторых полевых изолятов сибиреязвенных бацилл циркулирующих на территории Российской Федерации [30,99,162,7].

Применяемые в США и Великобритании химические вакцины также имеют недостатки: для создания защитного иммунитета их требуется вводить

шестикратно в течение 18 месяцев, что вызывает аллергизацию ревакцинируемого организма [148]. Используемые в этих странах субъединичные вакцины ввиду особенностей технологии получения их компонентов из аттенуированных культур В. апЖгаЫз, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов [149,34]. Именно с данными продуктами связывают развитие аллергических реакций, возникающих почти у 30 % вакцинированных в США людей [143,42] и возникновение побочных эффектов наблюдается у 11% вакцинированных англичан [57]. Как правило, побочные эффекты проявляются в виде покраснения кожи, уплотнения места иммунизации, болезненных ощущений, а также повышения температуры тела. Более того, у 1% вакцинированных людей наблюдаются серьезные побочные реакции [137], в том числе в виде некроза тканей [143].

С учётом вышесказанного задача совершенствования противосибиреязвенных вакцин является весьма актуальной, поэтому ведётся постоянный поиск новых средств для специфической профилактики сибирской язвы [43]. Основными критериями оценки качества вакцин являются: увеличение продолжительности иммунитета, повышение уровня продукции специфических антител к протективному антигену, индукция клеточного иммунного ответа, индукция как общего гуморального иммунного ответа, так и иммунного ответа на слизистых оболочках, а также снижение частоты возникновения побочных реакции по сравнению с существующими вакцинами [168].

Применяемые живые вакцины вводят в организм человека путем скарификации, в то время как субъединичные вакцины вводятся подкожно (внутримышечно), что приводит к формированию преимущественно общего иммунного ответа. Поскольку входными воротами возбудителя сибирской язвы являются как кожные покровы, так и слизистые оболочки легочного и кишечного трактов, то будущие вакцины должны формировать стойкий как общий иммунитет, так и местный (на слизистых оболочках) иммунитет.

Одним из наиболее эффективных на сегодняшний день подходов для решения вышеуказанных проблем является использование генетических вакцин, базирующихся на аденовирусных векторах [154]. При введении в организм таких вакцин происходит попадание генетического материала в клетки организма и экспрессия в них генов целевых белков патогена. В результате антигены распознаются иммунной системой хозяина, что приводит к индукции как гуморального, так и клеточного иммунного ответа [8,88]. На сегодняшний день одними из наиболее изученными и часто используемыми в генетической вакцинации являются рекомбинантные аденовирусные векторы [182]. Вакцины на основе рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа имеют ряд преимуществ перед другими генетическими вакцинами. Во-первых, рекомбинантные аденовирусы являются репликативно-дефектными и не способны вызывать заболевания. Безопасность аденовирусных векторов с удаленными Е1 и ЕЗ областями генома подтверждается целым рядом проведенных клинических испытаний различных вакцинных и терапевтических препаратов на их основе [157,94]. Во-вторых, использование рекомбинантных аденовирусов позволяет проводить интраназальную иммунизацию, и, как следствие, индуцировать образование иммунного ответа на слизистых оболочках. В-третьих, в настоящее время уже разработаны эффективные технологии получения рекомбинантных аденовирусов, позволяющие быстро реализовать масштабное производство различных вакцин на основе аденовирусных векторов на одной технологической линии, без ее переоборудования и изменения регламента [147]. Вышеперечисленные свойства делают рекомбинантные аденовирусы хорошей технологической платформой для создания широкого спектра вакцин против различных патогенов, в том числе и вакцин для биологической защиты [38].

В связи с вышесказанным, изучение возможности использования рекомбинантного аденовируса человека пятого серотипа для создания

препаратов для вакцинации против такого особо опасного патогена, как В. апМгаЫз, представляет самостоятельный научный интерес.

Цель исследования

Создание гипериммунного протективного антигена Bacillus Anthracis для иммунопрофилактики сибирской язвы.

В процессе выполнения работы предстояло решить следующие задачи:

1. Смоделировать и сконструировать последовательность, кодирующую химерный белок, в состав которых входит протективный антиген В. anthracis, а также иммуностимулирующая молекула, способная усилить гуморальный иммунный ответ к протективному антигену.

2. Определить in vivo основные параметры иммуногенности полученных генетических конструкций.

3. Исследовать защитные свойства рекомбинантного аденовируса, несущего гипериммунный протективный антиген, на лабораторной модели летальной экспериментальной сибиреязвенной инфекций с безкапсульным штаммом В. anthracis.

4. Исследовать защитные свойства рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего гипериммунный протективный антиген, против капсульного, вирулентного штамма 71/12 В. anthracis.

Научная новизна

С помощью эффективной технологии получения рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, основанной на гомологичной рекомбинации в Е. coli, было сконструировано и получено четыре рекомбинантных аденовируса человека пятого серотипа, содержащих ген протективного антигена Bacillus anthracis: Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc, Ad-Fc-PA.

Продемонстрирована способность полученных рекомбинантных аденовирусов вызывать антиген-специфическую пролиферацию Т-клеток лимфатических узлов.

Показана индукция гуморального иммунного ответа к В. anthracis у лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc.

Продемонстрировано защитное действие рекомбинантного аденовируса Ad-PA-Fc при интраназальной иммунизации мышей против В. anthracis штамма Sterne. Иммунизация Ad-PA-Fc способна полностью защищать мышей от заболевания сибирской язвой в течение трех месяцев после иммунизации.

Впервые показано, что генетическая иммунизация (генно-инженерная конструкция, которая после введения в клетку обеспечивает продуцирование белков патогенов) рекомбинантным аденовирусом (Ad-PA-Fc) индуцирует защитный иммунный ответ против капсульного штамма В. anthracis.

Впервые продемонстрировано, что иммунизация генетической конструкцией, кодирующей, кроме антигена, иммуностимулирующую молекулу, значительно увеличивает защиту лабораторных животных от бактериальной инфекции.

Впервые показана возможность увеличения иммуногенности антигенов при генетической иммунизации против бактериальных инфекций. Таким образом, подобные антигены, экспрессируемые из состава вирусных векторов, могут рассматриваться как компоненты будущих противобактериальных вакцины.

Теоретическая и практическая значимость работы

Работа представляет теоретический интерес в плане создания антигенов с увеличенными иммуногенными свойствами, за счет слияния антигенов с иммуностимулирующими молекулами. Более того, сконструированные генетические конструкции представляют также практическую значимость. Полученные в результате работы рекомбинантные аденовирусы могут выступать как компоненты будущих противосибиреязвенных вакцин.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертации, вошли в патент Российской Федерации № 2444570 «Способ получения рекомбинантной вакцины», в МР 1.2.2522-09 «Выявление наноматериалов, представляющих потенциальную опасность для здоровья человека», а также

в МР «Получение рекомбинантных аденовирусов человека пятого серотипа, экспрессирующих гены белков, обладающих токсичностью для эукариотических клеток».

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были доложены на девятой межнациональной аденовирусной конференции «Development of recombinant adenoviruses expressing M. tuberculosis antigens, and transfection of dendritic cells. 9th International Adenovirus Meeting 26-30 April 2009, Dobogöko, Hungary» и XIV Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Экспрессия гипериммуногенного антигена М. tuberculosis Ag85B в рекомбинантном аденовирусном векторе». Апробация диссертации состоялась на научной конференции отделов иммунологии, медицинской микробиологии и генетики и молекулярной биологии бактерий ФГБУ ФНИЦЭМ им. Гамалеи МЗ РФ 09.04.2015 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 22 научные работы, из них 8 статей в журналах рекомендованных ВАК, а также 1 патент, 2 методических указаний, 11 тезисов в научных конференциях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 100 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы и список используемой литературы (187 источника, из которых 27 отечественных, 154 иностранных и 6 интернет ссылок). Работа содержит 12 таблиц и 13 рисунков.

Основные положения, выносимые на защиту

Разработана технология получения гипериммунных антигенов, состоящих из иммуностимулирующей молекулы, слитой с протективным антигеном В. anthracis, которые в свою очередь экспрессируются из состава репликативно-дефектных аденовирусов человека пятого серотипа.

Продемонстрирована экспрессия рекомбинантных белков из состава полученных рекомбинантных аденовирусов in vitro.

Иммунизация рекомбинантными аденовирусами Ad-cPA, Ad-sPA, Ad-PA-Fc приводит к индукции гуморального иммунного ответа к В. anthracis у лабораторных животных.

При интраназальной иммунизации лабораторных животных против В. anthracis штамма Sterne, показано защитное действие рекомбинантного аденовируса - Ad-PA-Fc. Иммунизация Ad-PA-Fc способна полностью защищать мышей от заболевания сибирской язвой в течение трех месяцев после иммунизации.

Генетическая иммунизация рекомбинантным аденовирусом Ad-PA-Fc индуцирует защитный иммунный ответ против капсульного штамма В. anthracis в дозе равной 5 LD50.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Факторы вирулентности Bacillus anthracis

Сибирская язва - особо опасное заболевание человека и сельскохозяйственных животных, возбудителем которой является Bacillus anthracis. Воротами инфекции для сибиреязвенных бактерий обычно является повреждённая кожа. После попадания в организм бактериальных спор, они фагоцитируются макрофагами которые, в свою очередь, мигрируют в региональные лимфоузлы. В макрофагах происходит прорастание спор в вегетативные формы, что приводит к развитию инфекционного процесса. Вне зависимости от входных ворот инфекции первая стадия представляет собой локализованное поражение регионарных лимфатических узлов, вторая стадия - генерализацию процесса. Благодаря наличию факторов патогенности, сибирская язва характеризуется преимущественно острым течением и высокой летальностью.

Основными факторами вирулентности В. anthracis являются

бактериальные токсины и поверхностная капсула, которые кодируются

двумя плазмидами: рОХ1 и рОХ2 соответственно [32]. pXOl кодирует гены

двух экзотоксинов - летального (LF) и отёчного (EF) факторов, а также РА.

Эти факторы, гетерополимеризуются с протективным антигеном и

формируют летальный токсин и отечный токсин [35]. Протективный антиген

является компонентом каждого из двух токсинов и важен для их

функциональной активности. Связываясь с клеточными рецепторами ТЕМ8

[101] и CMG2 [123,130], протективный антиген обеспечивает перемещение

ферментативно активных летального и отечного факторов в цитоплазму

эукариотических клеток. LF является цинк-зависимой металлопротеиназой,

которая расщепляет митоген-активируемые протеиновые киназы (МАРК-

киназы) и таким образом, ингибирует внутриклеточную передачу сигналов,

17

необходимую для формирования иммунного ответа [35]. После фагоцититирования макрофагами В. anthracis секретирует летальный токсин, который вызывает апоптоз и некроз клеток, что в конечном итоге приводит к быстрому, в течение 2 часов, лизису макрофагов [96].

Другим вирулентным фактором является отечный токсин, который действует в основном через рецептор ТЕМ8, экспрессирующийся на эпителиальных клетках легких, кожи и кишечника, а также на эндотелиальных клетках [144]. EF является кальмодулин-зависимой аденилатциклазой, действие которой заключается в превращении аденозинтрифосфата (АТР) в циклический аденозинмонофосфат (цАМР). Накопление цАМФ приводит к изменению внутриклеточного водного баланса и, как следствие, к разрушению межклеточных контактов. Разобщённость эндотелиальных клеток приводит к нарушению барьера между кровью и тканями и, вследствие выхода плазмы крови в ткани, клинически выражается в массивном отеке тканей. Как LF, так и EF ингибируют приобретённый и врождённый иммунный ответ, позволяя бактерии беспрепятственно реплицироваться в хозяине [35].

рОХ2 плазмида кодирует гены, участвующие в синтезе иммунологически инертной капсулы, состоящей из полимера поли-у-D-глутаминовой кислоты [61]. Таким образом, в отличие от других бактерий, которые имеют полисахаридную капсулу, капсула сибиреязвенных бацилл уникально по своему составу. Основная функция D-глутаминовой капсулы заключается в защите бактерий от фагоцитоза [58]. Все вирулентные штаммы формируют капсулу, в то время как авирулентные и непатогенные штаммы являются безкапсульными (Таблица 1). Бактерии, которые не имеют плазмиды рОХ2 и, следовательно, не капсулируются, являются ослабленными и в настоящее время используются как живые аттенуированные вакцины для животных и людей.

Таблица 1.

Классификация штаммов В. anthracis [15]

Плазмидный ЬБ50 для Количество

Группа Вирулентность спектр белых штаммов,

рХ02 pXOl мышей %

1 Высоковирулентные + + 1-10 спор 53

2 Умеренновирулентные + - 11-100 спор 8

3 Авирулентные (вакцинные) - + >104спор 30

4 Непатогенные - - 109 спор 6

1.2 Особенности иммунного ответа к Bacillus anthracis

Как можно предположить, нейтрализация белков плазмид или удаление генов плазмид, как и самих плазмид, будет снижать вирулентность В. anthracis [10]. Действительно, второе поколение вакцин против сибирской язвы основывались на живых бактериях В. anthracis с удалённой плазмидой рХ02, вследствие культивирования бактерий при повышенной температуре.

В результате поиска иммуногенного начала, выделяемого В. anthracis in vivo, Max Sterne в 1937 году пришел к заключению [139,140,141], что иммунитет против сибирской язвы вырабатывается в ответ на бесклеточный антиген, не связанный с капсулой, и в одинаковой мере продуцируемый вирулентными и авирулентными штаммами В. anthracis. При изучении защитного действия отечной жидкости было установлено, что она содержала два фактора: воспалительный, который вызывает повышение проницаемости тканей, и активную иммунизирующую субстанцию. Выделенная из этой жидкости фракция, обладающая иммуногенной активностью, была названа защитным антигеном - PA (Protective Antigen) [37,53].

В дальнейших работах ряда исследователей было показано, что антитела к протективному антигену оказывают максимальное защитное действие:

In vitro данные

• поликлональные или моноклональные антитела против РА нейтрализуют токсический эффект LF и EF, ингибируют фагоцитоз и прорастание сибиреязвенных спор, и увеличивают уничтожение спор макрофагами [50,165,164,43]

In vivo данные

• активная иммунизация РА (белком или генетической конструкцией) обеспечивает значительную защиту на животных моделях [50,167]

• пассивная иммунизация животных путем введения поликлональных или моноклональных антител к РА является достаточной, чтобы обеспечить защиту против инфекции [117,116,90]

• защита коррелирует с уровнем антител в тестах ИФА или реакции токсин-нейтрализации [167,98,118,97]

In vivo данные на людях

• вакцины, содержащие РА как главный иммуноген, обеспечивают протекцию против инфекции, приобретенной естественным путем [42]

• терапевтическое введение антисыворотки, содержащей антитела к РА, уменьшает летальность у инфицированных людей [41]

Таким образом, особенность иммунного ответа к сибиреязвенным бактериям заключается в том, что основную роль в защите от патогена оказывает гуморальный иммунный ответ к антигенам, которые кодируются в плазмиде рОХ1. После перенесенной инфекции антитела к РА определяются в 68-93% случаях, тогда как у 42-55% и 26% пациентов детектируются антитела к LF и EF [41].

1.3 Клеточный иммунный ответ к сибиреязвенным бациллам.

Считается, что гуморального иммунного ответа достаточно для защиты от сибирской язвы, в то время как клеточному иммунитету не отводят большой роли и поэтому он практически не исследован. Однако с каждым годом накапливается все больше данных, что клеточный иммунный ответ

20

также оказывает защитные свойства. Например, у части морских свинок, которые выжили после заражения В. anthracis, выявляются низкие титры антител к РА и LF, что свидетельствует о том, что защита связана не обязательно с индукцией специфических антител [150]. У лиц работающих с шерстью, которые были экспонированы к сибиреязвенным спорам, были детектированы циркулирующие в крови Т-клетки, специфичные к РА и LF [163]. Также клеточный иммунный ответ был детектирован у людей которые в 2001 году в результате биотеррористической атаки могли заболеть сибирской язвой и с целью предотвращения заболевания принимали антибиотики в течение 60 дней [55]. Ряд других исследователей не отмечают корреляции между титром специфических антител к протективному антигену и уровнем защиты животных [152,81,80,99,150]. С другой стороны, давно известно, что вакцины на основе бактериальных штаммов более эффективны по сравнению с субъединичными вакцинами в исследованиях по протекции на животных моделях, что связывают с большей стимуляцией клеточного звена иммунного ответа [151,80,149].

Совсем недавно Glomski I .J. с коллегами в экспериментах по переносу CD4+ Т-клеток показал, что Т-клетки, секретирующие IFN-y, защищают мышей от нетоксиногенных капсулированных бактерий [64]. Эти результаты являются первым свидетельством защитных свойств клеточного иммунного ответа против капсулированных бактерий В. anthracis и предполагают, что будущие вакцины против сибирской язвы также должны индукцировать клеточное звено адаптивного иммунитета.

Сибиреязвенный микроб большую часть времени во время инфекции локализован вне клеток, и, следовательно, в результате иммунизации рационально индуцировать гуморальный иммунный ответ. Однако часть жизненного цикла этого патогена проходит внутри клеток, и клеточный иммунный ответ может быть направлен именно на эту стадию патогенеза [166]. Таким образом, акцент будущих вакцин должен быть сосредоточен на индукцию как гуморального, так и клеточного иммунного ответов.

1.4 Подходы к созданию вакцин от сибирской язвы

Основоположником разработки живой сибиреязвенной вакцины является Луи Пастер, который ещё в 1881 году аттенуировал капсульный вирулентный штамм В. anthracis путем выращивания его культур при повышенной температуре (42,5-43°С) [153]. Вследствие тепловой нестабильности плазмиды рОХ1 [112] было предположено, что вакцина Пастера была аттенуированна путем потери плазмиды рОХ1. Однако это представляется маловероятным, так как рОХ1~ штаммы являются не протективными [79,155], а также известны некоторые штаммы Пастера, которые содержат обе плазмиды. Сейчас широко распространено мнение, что вакцина Пастера была смешанной культурой, которая содержала некоторое количество бактерий экспрессирующих токсин [79,62]. Смешанная культура, по-видимому, содержит очень небольшой процент полностью вирулентных бактерий, возможно увеличивающих защиту, хотя иногда и вызывающих болезнь. На самом деле она не была неожиданной, и в редких случаях животное могло умереть от вакцины но, тем не менее, вакцинация давала коллективный иммунитет.

Вакцина Пастера в значительной степени была вытеснена в 1930 годы вакциной Sterne, которая не имеет плазмиды рОХ2. Было показано, что Sterne тип вакцин (рОХ1+, рОХ2^) значительно лучше защищает животных, чем вакцины на основе штаммов рОХ1~, рОХ2+. Например в одном исследовании бактерии от двух штаммов рОХ2~ защищали морских свинок от штамма Vollum 1В, в то время, как ни один из трех штаммов рОХ1~ не оказывал протекции [79], таким образом, это доказывает, что рОХ1 достаточна для защиты, а рОХ2 нет.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Щербинин, Дмитрий Николаевич, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1- Адилов Д.А., Агзамов Б.М. Итоги применения антраксина в диагностике сибирской язвы в Узбекистане. // В кн.: Актуальные вопросы гигиены и эпидемиологии. Кишинев. 1972. С. 139-142.

2. Бургасов П.Н., Безденежных И.С. Научные основы организации профилактики инфекционных болезней. // Под. ред. Бургасова П.Н. М. Медицина. 1977. 348 с.

3. Вакцина против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ живая. // Технические условия. ГОСТ Р. 52616-2006.

4. Ведерников В., Бакулов И., Гаврилов В., Селиверстов В., Пылинин В. Сибирсая язва опасна по-прежнему. // Ветиренарная газета. 1995. № 20. (82). С.З.

5. Демидчик Л.Г. Корреляция вирулентности Bacillus anthracis с экспрессией признаков, кодируемых хромосомными генами. // Ветеренария. 2001. № 2. С. 336.

6. Инструкция и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей. // 1982. М. 61 с.

7. Ипатенко Н.Г., Гаврилов В.А., Маничев A.A., Бастаров С.И., Саленко Л.С., Яковлева Т.Н., Степанова В.В., Шморгун Б.И., Киселев Ю.Т., Сайиткулов Б.С. Опыт профилактики сибирской язвы сельскохозяйственных животных в России. // 1995. Ветеренария. № 5. Р.27-30

8. Карпов А.П., Тутыхина И.Л., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Шмаров М.М., Валихов А.Ф., Шулъпин М.И., Дрыгин В.В., Народицкий Б.С. Конструирование рекомбинантных аденовирусов птиц CELO, экспрессирующих гены гликопротеинов gB, gE, gl вируса болезни Марека.

// 2007. Биотехнология. № 5. с. 38-44.

9. Королева Е.А., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Зигангирова Н.А., Народицкий Б.С. Конструирование рекомбинантного аденовируса, несущего ген OmcB Chlamydia trachomatis, для разработки вакцинного препарата против урогенитального хламидиоза. // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. 2010. №. 10. С. 38-40.

Ю. Лобанова Т.П., Кихтенко Н.В. Сибирская язва. // 2003.

11- Лобзин Ю.В., Волжанин В.М., Захаренко С.М. Сибирская язва. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2002. Т. 4. № 2. С. 104-127.

12. Локтионова М.Н. Закономерности территориального распределения и проявления активности стационарно неблагополучных по сибирской язве пунктов российской федерации. // Автореферат кандидатской диссертации. Москва. 2011. С.24.

13. Маловастый К.С. Влияние антибиотиков на формирование иммунитета против сибирской язвы. // Вестник сельскохозяйственных наук. 1982. № 3. С. 86-91.

14. Маловастый К.С. Противосибиреязвенный иммуноморфогенез у животных в условиях применения антибиотиков. // Проблемы ветеренарной иммунологии. М. 1985. С. 87-90.

15. Маринин Л.И., Онищенко Г.Г., Кравченко Т.Б., Дятлов И.А., Тюрин Е.А., Степанов А.В., Никифоров В.В. Сибирская язва человека: эпидемиология, профилактика, диагностика, лечение. // Оболенск. 2008. 408 с.

16. Нафеев А.А., Меркулов А.В., Никишина Н.М. Вспышка сибирской язвы в Ульяновской области в 1997. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 1998. №3. С. 53.

17. О санитарно-эпидемиологической обстановке в Российской Федерации в 2008 году. // Государственный доклад. Москва. Федеральный центр

гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2009. С. 467.

18. Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей. // 2002. Методические указания.

19. Пономарев A.B., Милевский Е.И. Влияние пенициллина на иммуногенез при иммунизации сибиреязвенной вакциной СТИ. // Тез. док. на ленинградской научн. конф.по антибиотикам. Л. 1957. С. 38.

20. Постановление Главного государственного санитарного врача РФ от 28 января 2008 г. N 4. "Об утверждении санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08".

21. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Буравцева Н.П. и др. Обзор ситуации по сибирской язве в 2013 г., прогноз на 2014 г. // Проблемы особо опасных инфекций. 2014. В. 2. С. 27-28.

22. Рязанова А.Г., Еременко Е.И., Буравцева Н.П., Цыганкова О.И., Цыганкова Е.А., Аксенова Л.Ю., Головинская Т.М., Куличенко А.Н. Эпидемиологическая ситуация по сибирской язве в Российской Федерации: анализ заболеваемости в 2010 г., прогноз на 2011 г. // 2011. Проблемы особо опасных инфекций. В. 107. С. 42-45.

23. Садовой Н.В., Кравец И.Д., Селиваненко Г.М., Харечко Г.С., Садовая Е.А., Васильев П.Г., Литусов Н.В., Елагин Г.Д., Супотницкий М.В. Вакцина сибиреязвенная комбинированная. // Патент РФ. № 2115433.

24. Санитарно-эпидемиологические правила «Профилактика сибирской язвы» СП 3.1.7.2629-10. Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 2010.

25. Селянинов Ю.О., Соломаха О.И., Коваленко A.B., Кириллов Л.В., Лавченко Е.Г., Котляров В.И., Казановский Е.С., Фирсова Т.Е., Гнездилов И.Д. Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза животных. // Патент РФ. № 2286174.

26. Щербинин Д.Н., Есмагамбетов И.Б., Носков А.Н., Селянинов Ю.О.,

Тутыхина И.Л., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Индукция иммунного ответа к Bacillus anthracis при интраназальном введении рекомбинантного аденовируса, экспрессирующего протективный антиген, слитый с Fc-фрагментом антитела IgG2a. // Acta Nature. 2014. Т. 6. № 1(20). С.46-54.

27. Щербинин Д.Н., Шмаров М.М., Народицкий Б.С., Рубакова Э.И., Кондратьева Т.К. Исследование вакцинных противотуберкулезных препаратов на основе рекомбинантных аденовирусов в экспериментальной модели на мышах. // Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. Т. 87. № 10. С. 5053.

28. Abramova F.A., Grinberg L.M., Yampolskaya O.V., Walker D.H. Pathology of inhalational anthrax in 42 cases from the Sverdlovsk outbreak of 1979. // Proc Natl Acad Sci U S A. 1993. V. 90. № 6. P. 2291-4.

29. Andre S., Seed В., Eberle J., Schraut W., Bultmann A., Haas J. Increased immune response elicited by DNA vaccination with a synthetic gpl20 sequence with optimized codon usage. // J Virol. 1998. V. 72. № 2. P. 1497-503.

30. Auerbach S., Wright G.G. Studies on immunity in anthrax. VI. Immunizing activity of protective antigen against various strains of Bacillus anthracis. // J Immunol. 1955. V. 75. № 2. P. 129-33.

31. Baillie L. The development of new vaccines against Bacillus anthracis. // J Appl Microbiol. 2001. V. 91. № 4. P. 609-13.

32. Baillie L., Read T.D. Bacillus anthracis, a bug with attitude! // Curr Opin Microbiol. 2001. V. 4 № 1. P. 78-81.

33. Baillie L.W. Past, imminent and future human medical countermeasures for anthrax. // J Appl Microbiol. 2006. V. 101. № 3. P. 594-606.

34. Baillie L.W., Fowler K., Turnbull P.C. Human immune responses to the UK human anthrax vaccine. // J Appl Microbiol. 1999. V. 87. № 2. P. 306-8.

35. Baldari C.T., Tonello F., Paccani S.R., Montecucco C. Anthrax toxins: A

paradigm of bacterial immune suppression. // Trends Immunol. 2006. V. 27 № 9. P. 434-40.

36. Bergtold A., Desai D.D., Gavhane A., Clynes R. Cell surface recycling of internalized antigen permits dendritic cell priming of B cells. // Immunity. 2005. V. 23. №5. P. 503-14.

37. Bloom W.L., Watson D.W., et al. Studies on infection with Bacillus anthracis; preparation and characterization of an anthracidal substance from various animal tissues. //J. Infect. Dis. 1947. V. 80. № 1. P. 41-52.

38. Boyer J.L., Kobinger G., Wilson J.M., Crystal R.G. Adenovirus-based genetic vaccines for biodefense. // Hum Gene Ther. 2005. V. 16. № 2. P. 157-68.

39. Boyle J.S., Koniaras C., Lew A.M. Influence of cellular location of expressed antigen on the efficacy of DNA vaccination: cytotoxic T lymphocyte and antibody responses are suboptimal when antigen is cytoplasmic after intramuscular DNA immunization. // Int. Immunol. 1997. V. 9. № 12. P. 1897906.

40. Brachman P.S. Bioterrorism: an update with a focus on anthrax. // Am J Epidemiol. 2002. V. 155 № 11 P. 981-7.

41. Brachman P.S., Friedlander A.M., Grabenstein J.D. Anthrax Vaccine. // Vaccines for Special Circumstances. 2003. ch. 31 P. 887-903.

42. Brachman P.S., Gold H., Plotkin S.A., Fekety F.R., Werrin M., Ingraham N.R. Field Evaluation of a Human Anthrax Vaccine. // Am J Public Health Nations Health. 1962. V. 52. № 4. P. 632-45.

43. Brey R.N. Molecular basis for improved anthrax vaccines. // Adv Drug Deliv Rev. 2005. V. 57. № 9. P. 1266-92.

44. Brown L.J., Rosatte R.C., Fehlner-Gardiner C., Bachmann P., Ellison J.A., Jackson F.R., Taylor J.S., Davies C., Donovan D. Oral vaccination and protection of red foxes (Vulpes vulpes) against rabies using ONRAB, an adenovirus-rabies recombinant vaccine. // Vaccine. 2014. V. 32. № 8. P. 984-9.

45. Brown T.H., David J., Acosta-Ramirez E., Moore J.M., Lee S., Zhong G., Hancock R.E., Xing Z., Halperin S.A., Wang J. Comparison of immune responses and protective efficacy of intranasal prime-boost immunization regimens using adenovirus-based and CpG/HH2. adjuvanted-subunit vaccines against genital Chlamydia muridarum infection. // Vaccine. 2012. V. 30. № 2. P. 350-60.

46. Burgasov P.N., Cherkasskii B.L., Knop A.G., Utegenov K.U. Epidemiologic effectiveness of anthrax vaccine STI. // Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol. 1976. V. 9. P. 27-35.

47. Bush L.M., Abrams B.H., Beall A., Johnson C.C. Index case of fatal inhalational anthrax due to bioterrorism in the United States. // N Engl J Med. 2001. V. 345 №22 P. 1607-10.

48. Carrasco Y.R., Batista F.D. B cell recognition of membrane-bound antigen: an exquisite way of sensing ligands. // Curr. Opin. Immunol. 2006. V. 18. № 3. P. 286-91.

49. Cataldi A., Mock M., Bentancor L. Characterization of Bacillus anthracis strains used for vaccination. // J Appl Microbiol. 2000. V. 88. № 4. P. 648-54.

50. Chen Z., Moayeri M., Zhou Y.H., Leppla S., Emerson S., Sebrell A., Yu F, Svitel J., Schuck P., St Claire M., Purcell R. Efficient neutralization of anthrax toxin by chimpanzee monoclonal antibodies against protective antigen. // 2006. J Infect Dis. V. 193 № 5. P. 625-33.

51. Choi J.H., Schafer S.C., Zhang L., Kobinger G.P., Juelich T., Freiberg A.N., Croyle M.A. A single sublingual dose of an adenovirus-based vaccine protects against lethal Ebola challenge in mice and guinea pigs. // Mol Pharm. 2012. V. 9 № l.P 156-67.

52. Cid-Arregui A., Juarez V., zur Hausen H. A synthetic E7 gene of human papillomavirus type 16 that yields enhanced expression of the protein in mammalian cells and is useful for DNA immunization studies. // J Virol. 2003. V. 77. № 8. P. 4928-37.

53. Cromartie W.J., Watson D.W., et al. Studies on infection with Bacillus anthracis; the immunological and tissue damaging properties of extracts prepared from lesions of B. anthracis infections. // J. Infect. Dis. 1947. V. 80. № 1. P. 14-27.

54. Dempsey P.W., Allison M.E., Akkaraju S., Goodnow C.C., Fearon D.T. C3d of complement as a molecular adjuvant: bridging innate and acquired immunity. // Science. 1996. V. 271. № 5247. P. 348-50.

55. Doolan D.L., Freilich D.A., Brice G.T. et al. The US capitol bioterrorism anthrax exposures: clinical epidemiological and immunological characteristics. // J Infect Dis. 2007. V. 195. № 2. P. 174-84.

56. Ebensen T., Link C., Guzman C. Classical Bacterial Vaccines. // Novel Vaccination Strategies. 2004. Chapter 11. P. 219-242.

57. Enstone J.E., Wale M.C., Nguyen-Van-Tam J.S., Pearson J.C. Adverse medical events in British service personnel following anthrax vaccination. // Vaccine. 2003. V. 21. № 13-14. P. 1348-54.

58. Ezzell J.W., Welkos S.L. The capsule of bacillus anthracis, a review. // J Appl Microbiol. 1999. V. 87. № 2. P. 250.

59. Fasanella A., Losito S., Trotta T., Adone R., Massa S., Ciuchini F., Chiocco D. Detection of anthrax vaccine virulence factors by polymerase chain reaction. // Vaccine. 2001. V. 19. № 30. P. 4214-8.

60. Forbes E.K., de Cassan S.C., Llewellyn D., et al. T cell responses induced by adenoviral vectored vaccines can be adjuvanted by fusion of antigen to the oligomerization domain of C4b-binding protein. // PLoS One. 2012. V. 7. № 9. P.e44943.

61. Fouet A. The surface of Bacillus anthracis. // Mol Aspects Med. 2009. V. 30. № 6. P. 374-85.

62. Friedlander A.M., Welkos S.L., Ivins B.E. Anthrax vaccines. // Curr Top Microbiol Immunol. 2002. V. 271. P. 33-60.

63. Friedlander A.M., Welkos S.L., Pitt M.L. et al. Postexposure prophylaxis against

experimental inhalation anthrax. // J. Infect. Dis. 1993. V. 167. № 5. P. 1239-43..

64. Glomski I.J., Corre J.P., Mock M., Goossens P.L. Cutting Edge: IFN-gamma-producing CD4 T lymphocytes mediate spore-induced immunity to capsulated Bacillus anthracis. // J Immunol. 2007. V. 178. № 5. P. 2646-50.

65. Gonzalez S.F., Degn S.E., Pitcher L.A., Woodruff M., Heesters B.A., Carroll M.C. Trafficking of B cell antigen in lymph nodes. // Annu. Rev. Immunol. 2011. V. 29. P. 215-33.

66. Gonzalez S.F., Pitcher L.A., Mempel T., Schuerpf F., Carroll M.C. B cell acquisition of antigen in vivo. // Curr. Opin. Immunol. 2009. V. 21. № 3. P. 2517.

67. Graham D.B., Akilesh H.M., Gmyrek G.B., Piccio L., et al. ITAM signaling in dendritic cells controls T helper cell priming by regulating MHC class II recycling. // Blood. 2010. V. 116. № 17. P. 3208-18.

68. Graham F.L. and Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. // Methods in Mol.Biol. 1994. V. 7. P. 109-127.

69. Green K.Y., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay. // Methods Enzymology. 1980. V. 80. P. 425-431.

70. Haas J., Park E.C., Seed B. Codon usage limitation in the expression of HIV-1 envelope glycoprotein. // Curr Biol. 1996. V. 6. № 3. P. 315-24.

71. Hanahan D. Studies of transformation of Escherichia coli with plasmids. // J. Mol. Biol. 1983. V. 166. P. 557-580.

72. Harwood N.E., Batista F.D. Early events in B cell activation. // Annu. Rev. Immunol. 2010. V. 28. P. 185-210.

73. Hashimoto M., Boyer J.L., Hackett N.R., Wilson J.M., Crystal R.G. Induction of protective immunity to anthrax lethal toxin with a nonhuman primate adenovirus-based vaccine in the presence of preexisting anti-human adenovirus immunity. // Infect. Immun. 2005. V. 73. № 10. P. 6885-91.

74. Henning P., Gustafsson T., Flach C.F., Hua Y.J., Strombeck A., Holmgren J.,

Lindholm L., Yrlid U. The subcellular location of antigen expressed by adenoviral vectors modifies adaptive immunity but not dependency on cross-presenting dendritic cells. // Eur. J. Immunol. 2011. V. 41. № 8. P. 2185-96.

75. Henry L. Inhalational anthrax: threat, clinical presentation, and treatment. // J. Am. Acad. Nurse Pract. 2001. V. 13. № 4. P. 164-8.

76. Holmes D., Quigley M. A rapid boiling method for the preparation of bacterial plasmids. // Anal. Biochem. 1981. V. 114. P. 193.

77. Huleatt J.W., Jacobs A.R., Tang J., et al. Vaccination with recombinant fusion proteins incorporating Toll-like receptor ligands induces rapid cellular and humoral immunity. // Vaccine. 2007. V. 25. № 4. P. 763-75.

78. Huleatt J.W., Nakaar V., Desai P., et al. Potent immunogenicity and efficacy of a universal influenza vaccine candidate comprising a recombinant fusion protein linking influenza M2e to the TLR5 ligand flagellin. // Vaccine. 2008. V. 26. № 2. P. 201-14.

79. Ivins B.E., Ezzell J.W., Jemski J., Hedlund K.W., Ristroph J.D., Leppla S.H. Immunization studies with attenuated strains of Bacillus anthracis. // Infect Immun. 1986. V. 52. № 2. P. 454-8.

80. Ivins B.E., Welkos S.L. Recent advances in the development of an improved, human anthrax vaccine. // Eur J Epidemiol. 1988. V. 4. № 1. P. 12-9.

81. Ivins B.E., Welkos S.L., Little S.F., Crumrine M.H., Nelson G.O. Immunization against anthrax with Bacillus anthracis protective antigen combined with adjuvants. // Infect Immun. 1992. V. 60. № 2. P. 662-8.

82. Janeway C.A. Jr. Approaching the asymptote? Evolution and revolution in immunology. // Cold. Spring. Harb. Symp. Quant. Biol. 1989. V. 54. Pt. l.P. 113.

83. Jernigan J.A., Stephens D.S., Ashford D.A., et al. Bioterrorism-related inhalational anthrax: the first 10 cases reported in the United States. // Emerg Infect Dis. 2001. V. 7 № 6 P. 933-44.

84. Jiang Y., Yu K., Zhang H., Zhang P., Li C., Tian G., Li Y., Wang X., Ge J., Bu Z., Chen H. Enhanced protective efficacy of H5 subtype avian influenza DNA vaccine with codon optimized HA gene in a pCAGGS plasmid vector. // 2007. Antiviral Res. V. 75. № 3. P. 234-41.

85. Kasuya K., Boyer J.L., Tan Y., Alipui D.O., Hackett N.R., Crystal R.G. Passive immunotherapy for anthrax toxin mediated by an adenovirus expressing an anti-protective antigen single-chain antibody. // Mol. Ther. 2005. V. 11. № 2. P. 23744.

86. Kaur R., Chen S., Arevalo M.T., Xu Q., Chen Y., Zeng M. Protective immunity against tularemia provided by an adenovirus-vectored vaccine expressing Tul4 of Francisella tularensis. // Clin Vaccine Immunol. 2012. V. 19. № 3. P. 359-64.

87. Keim P., Smith K.L., Keys C., Takahashi H., Kurata T., Kaufmann A. Molecular investigation of the Aum Shinrikyo anthrax release in Kameido, Japan. // J Clin Microbiol. 2001. V. 39. № 12. P. 4566-7.

88. Knoblich H.V., Sommer S.E., Jackwood D.J. Antibody titers to infectious bursal disease virus in broiler chicks after vaccination at one day of age with infectious bursal disease virus and Marek's disease virus. // Avian Dis. 2000. V. 44 № 4. P. 874-84.

89. Ko H.J., Ko S.Y., Kim Y.J., Lee E.G., Cho S.N., Kang C.Y. Optimization of codon usage enhances the immunogenicity of a DNA vaccine encoding mycobacterial antigen Ag85B. // Infect Immun. 2005. V. 73. № 9. P. 5666-74.

90. Kobiler D., Gozes Y., Rosenberg H., Marcus D., Reuveny S., Altboum Z. Efficiency of protection of guinea pigs against infection with Bacillus anthracis spores by passive immunization. // Infect Immun. 2002. V. 70. № 2. P. 544-60.

91. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.// Nature. 1970. V. 227. № 5259. P. 680-5.

92. Legerski R., Robberson D. Analysis and optimization of recombinant DNA joining reactions.//J of Mol Biol. 1985. V. 181. P. 297-312.

93. Leppla S.H., Robbins J.B., Schneerson R., Shiloach J. Development of an improved vaccine for anthrax. // J Clin Invest. 2002. V. 110. № 2. P. 141-4.

94. Li X., Xiao S., Li Y, Zhang S. Clinical antiangiogenic effect of recombinant adenovirus-p53 combined with hyperthermia for advanced cancer. // Chin J Cancer Res. 2013 V. 25 № 6 P. 749-55.

95. Liang P.H., Zhang K.Q., Xu G.L., et al. Construction of a DNA vaccine encoding Flk-1 extracellular domain and C3d fusion gene and investigation of its suppressing effect on tumor growth. // Cancer Immunol. Immunother. 2010. V. 59. №. l.P. 93-101.

96. Lin C.G., Kao Y.T., Liu W.T., Huang H.H., Chen K.C., Wang T.M., Lin H.C. Cytotoxic effects of anthrax lethal toxin on macrophage-like cell line J774A.1. // Curr. Microbiol. 1996. V. 33. № 4. P. 224-7.

97. Little S.F., Ivins B.E., Fellows P.F., Pitt M.L., Norris S.L., Andrews G.P. Defining a serological correlate of protection in rabbits for a recombinant anthrax vaccine. // Vaccine. 2004. V. 22. № 3-4. P. 422-30.

98. Little S.F., Ivins B.E., Webster W.M., Fellows P.F., Pitt M.L., Norris S.L., Andrews G.P. Duration of protection of rabbits after vaccination with Bacillus anthracis recombinant protective antigen vaccine. // Vaccine. 2006. V. 24. № 14. P. 2530-6.

99. Little S.F., Knudson G.B. Comparative efficacy of Bacillus anthracis live spore vaccine and protective antigen vaccine against anthrax in the guinea pig. // Infect Immun. 1986. V. 52 № 2 P. 509-12.

100. Liu G.X., Lan J.M., Chuai X., et al. Immune effects of four coxsackievirus B3 VP1 DNA fusion vaccines in mice. // Xi Bao Yu Fen Zi Mian Yi Xue Za Zhi. 2010. V. 26. №2. P. 103-6.

101. Liu S., Leppla S.H. Cell surface tumor endothelium marker 8 cytoplasmic tail-independent anthrax toxin binding, proteolytic processing, oligomer formation, and internalization. // J Biol Chem. 2003. V. 278. № 7. P. 5227-34.

102. Lu J., Marjon K.D., Mold C., Du Clos T.W., Sun P.D. Pentraxins and Fc receptors. // Immunol Rev. 2012. V. 250. № 1. P. 230-8.

103. Makino S., Watarai M., Cheun H.I., Shirahata T., Uchida I. Effect of the lower molecular capsule released from the cell surface of Bacillus anthracis on the pathogenesis of anthrax. // J Infect Dis. 2002. V. 186. № 2. P. 227-33.

104. Maniatis T., Sambrook J., Fritsch E.F. Molecular Cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Pr. 1989. 2nd edition.

105. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals (mammals, birds and bees). // World organisation for animal health. Sixth Edition. Volume 1. 2008.

106. McBride B.W., Newell D.G. Production and characterization of monoclonal antibodies directed against guinea pig IgG subclasses. // J. Immunol. Methods. 1989. V. 118. №2. P. 193-8.

107. McConnell M.J., Hanna P.C., Imperiale M.J. Adenovirus-based prime-boost immunization for rapid vaccination against anthrax. // Mol. Ther. 2007. V. 15. № l.P. 203-10.

108. McConnell M.J., Hanna P.C., Imperiale M.J. Cytokine response and survival of mice immunized with an adenovirus expressing Bacillus anthracis protective antigen domain 4. // Infect. Immun. 2006. V. 74. № 2. P. 1009-15.

109. McDonald W.F., Huleatt J.W., Foellmer H.G., et al. A West Nile virus recombinant protein vaccine that coactivates innate and adaptive immunity. // J. Infect. Dis. 2007. V. 195. № 11. P. 1607-17.

110. McEwan W.A., Tam J.C., Watkinson R.E., Bidgood S.R., Mallery D.L., James L.C. Intracellular antibody-bound pathogens stimulate immune signaling via the Fc receptor TRIM21. //Nat. Immunol. 2013. V. 14. № 4. P. 327-36.

Ill- Meselson M., Guillemin J., Hugh-Jones M., Langmuir A., Popova I., Shelokov A., Yampolskaya O. The Sverdlovsk anthrax outbreak of 1979. // Science. 1994. V. 266. №5188. P. 1202-8.

112. Mikesell P., Ivins B.E., Ristroph J.D., Dreier T.M. Evidence for plasmid-mediated toxin production in Bacillus anthracis. // Infect Immun. 1983. V. 39. № l.P. 371-6.

113. Morel P.A., Falkner D., Plowey J., Larregina A.T., Falo L.D. DNA immunisation: altering the cellular localisation of expressed protein and the immunisation route allows manipulation of the immune response. // Vaccine. 2004. V. 2. № 3-4. P. 447-56.

114. Nakamura Y., Gojobori T., Ikemura T. Codon usage tabulated from international DNA sequence databases: status for the year 2000. // Nucleic Acids Res. 2000. V. 28. № l.P. 292.

115. O'Brien L.M., Stokes M.G., Lonsdale S.G., Maslowski D.R., Smither S.J., Lever M.S., Laws T.R., Perkins S.D. Vaccination with recombinant adenoviruses expressing Ebola virus glycoprotein elicits protection in the interferon alpha/beta receptor, knock-out mouse. // Virology. 2014 V. 452. In press.

116. Peterson J.W., Comer J.E., Baze W.B. et. al. Human monoclonal antibody AVP-21D9 to protective antigen reduces dissemination of the Bacillus anthracis Ames strain from the lungs in a rabbit model. // Infect Immun. 2007. V. 75 № 7. P. 3414-24.

117. Peterson J.W., Comer J.E., Noffsinger D.M., et. al. Human monoclonal anti-protective antigen antibody completely protects rabbits and is synergistic with ciprofloxacin in protecting mice and guinea pigs against inhalation anthrax. // 2006. Infect Immun. V. 74 № 2 P. 1016-24.

118. Pitt M.L., Little S.F., Ivins B.E., Fellows P., Barth J., Hewetson J., Gibbs P., Dertzbaugh M., Friedlander A.M. In vitro correlate of immunity in a rabbit model of inhalational anthrax. // Vaccine. 2001. V. 19 № 32 P. 4768-73.

119. Platzer B., Stout M., Fiebiger E. Antigen cross-presentation of immune complexes. // Front Immunol. 2014. Pr V. 5. P. 140.

120. Pridgen E.M., Alexis F., Kuo T.T., Levy-Nissenbaum E., Karnik R., Blumberg R.S., Langer R., Farokhzad O.C. Transepithelial transport of Fc-targeted

nanoparticles by the neonatal fc receptor for oral delivery. // 2013. Sci Transl Med. V. 5. № 213. P. 213ral67.

121. Radjainia M., Hyun J.K., Leysath C.E., Leppla S.H., Mitra A.K. Anthrax toxin-neutralizing antibody reconfigures the protective antigen heptamer into a supercomplex. // Proc Natl Acad Sci USA. 2010. V. 107. № 32. P. 14070-4.

122. Radosevic K., Wieland C.W., Rodriguez A., Weverling G.J., Mintardjo R., Gillissen G., Vogels R., Skeiky Y.A., Hone D.M, Sadoff J.C., van der Poll T., Havenga M., Goudsmit J. Protective immune responses to a recombinant adenovirus type 35 tuberculosis, vaccine in two mouse strains: CD4 and CD8 T-cell epitope mapping and role of gamma interferon. // Infect. Immun. 2007. V. 75. №8. P. 4105-15.

123. Rainey G.J., Wigelsworth D.J., Ryan P.L., Scobie H.M., Collier R.J., Young J.A. Receptor-specific requirements for anthrax toxin delivery into cells. // Proc Natl Acad Sci USA. 2005. V. 102. № 37. P. 13278-83.

124. Redmond C, Pearce M.J., Manchee R.J., Berdal B.P. Deadly relic of the Great War. // Nature. 1998 V. 393. № 6687. P. 747-8.

125. Ross T.M., Xu Y., Bright R.A., Robinson H.L. C3d enhancement of antibodies to hemagglutinin accelerates protection against influenza virus challenge. // Nat. Immunol. 2000. V. 1. № 2. P. 127-31.

126. Sanger F., Nicklen S., Coulson A. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. // Proc Natl Acad Sci USA. 1977. V. 74. P. 5463-5467.

127. Santelli E., Bankston L.A., Leppla S.H., Liddington R.C. Crystal structure of a complex between anthrax toxin and its host cell receptor. // Nature. 2004. V. 430. № 7002. P. 905-8.

128. Santosuosso M., McCormick S., Zhang X., Zganiacz A., Xing Z. Intranasal boosting with an adenovirus-vectored vaccine markedly enhances protection by parenteral Mycobacterium bovis BCG immunization against pulmonary tuberculosis. // Infect. Immun. 2006. V. 74. № 8. P. 4634-43.

129. Santosuosso M., Zhang X., McCormick S., Wang J., Hitt M., Xing Z. Mechanisms of mucosal and parenteral tuberculosis vaccinations: adenoviral -based mucosal immunization preferentially elicits sustained accumulation of immune protective CD4 and CD8 T cells, within the airway lumen. // J. Immunol. 2005. V. 174. № 12. P. 7986-94.

130. Scobie H.M., Rainey G.J., Bradley K.A., Young J.A. Human capillary morphogenesis protein 2 functions as an anthrax toxin receptor. // Proc Natl Acad Sei USA. 2003. V. 100. № 9. P. 5170-4.

131. Sedova E.S., Shcherbinin D.N., Migunov A.I., Smirnov Iu.A., Logunov D.Iu., Shmarov M.M., Tsybalova L.M., Naroditskii B.S., Kiselev O.I., Gintsburg A.L. Recombinant influenza vaccines. // Acta Naturae. 2012. V. 4. № 4. P. 17-27.

132. Seok Y.J., Kim K.I., Yoo K.H., et al. Expression and immunogenicity of a recombinant chimeric protein of human colorectal cancer antigen GA733-2 and an Fc antibody fragment in stably transformed Drosophila melanogaster S2 cells. //. Appl. Biochem. Biotechnol. 2010. V. 162. № 5. P. 1435-45.

133. Shlyakhov E.N., Rubinstein E. Human live anthrax vaccine in the former USSR. // Vaccine. 1994. V. 12. № 8. P. 727-30.

134. Shmarov M.M., Sedova E.S., Verkhovskaya L.V., Rudneva I.A., Bogacheva E.A., Barykova Y.A., Shcherbinin D.N., Lysenko A.A., Tutykhina I.L., Logunov D.Y., Smirnov Y.A., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Induction of a Protective Heterosubtypic Immune Response. Against the Influenza Virus by using Recombinant Adenoviral Vectors Expressing Hemagglutinin of the Influenza H5 Virus. //Acta Naturae. 2010. V. 2. № 1. P. 111-8.

135. Sigalov A.B. Signaling chain homooligomerization (SCHOOL) model. // Adv Exp Med Biol. 2008. V. 640. P. 121-63.

136. Spencer R.C., Lightfoot N.F. Preparedness and response to bioterrorism. // J Infect. 2001. V. 43 № 2 P. 104-10.

137. Splino M., Patocka J., Prymula R., Chlibek R. Anthrax vaccines. // Ann Saudi Med. 2005. V. 25. № 2. P. 143-9.

138. Stepanov A.V., Marinin L.I., Pomerantsev A.P., Staritsin N.A. Development of novel vaccines against anthrax in man. // J Biotechnol. 1996. V. 44. № 1-3. P. 155-60.

139. Sterne M. Avirulent anthrax vaccine. // Onderstepoort. J. Vet. Sci. Anim. Ind. 1946. V. 21. P. 41-3.

140. Sterne M. The use of anthrax vaccines prepared from avirulent (uncapsulated) variants of Bacillus anthracis. // Ondestepoort J. Vet. Sci. Anim. 1939. Ind. 13 P. 313-317.

141. Sterne M. Variation in Bacillus anthracis. // Onderstepoort Journal of Veterinary Science and Animal Industry. 1937. V. 8. P. 271-349.

142. Stratford R., Douce G., Zhang-Barber L., Fairweather N., Eskola J., Dougan G. Influence of codon usage on the immunogenicity of a DNA vaccine against tetanus. // Vaccine. 2000. V. 19. № 7-8. P. 810-5.

143. Swanson-Biearman B., Krenzelok E.P. Delayed life-threatening reaction to anthrax vaccine. // J Toxicol Clin Toxicol. 2001. V. 39. № 1. P. 81-4.

144. Taft S.C., Weiss A.A. Toxicity of anthrax toxin is influenced by receptor expression. // Clin Vaccine Immunol. 2008. V. 15. № 9. P. 1330-6.

145. Takahashi H., Keim P, Kaufmann A.F., Keys C., Smith K.L., Taniguchi K., Inouye S., Kurata T. Bacillus anthracis incident, Kameido, Tokyo, 1993. // Emerg Infect Dis. 2004. V. 10. № 1. P. 117-20.

146. Tan Y., Hackett N.R., Boyer J.L., Crystal R.G. Protective immunity evoked against anthrax lethal toxin after a single intramuscular administration of an adenovirus-based vaccine encoding humanized protective antigen. // Hum. Gene. Ther. 2003. V. 2014 № 17. P. 1673-82

147. Tang D.C., Zhang J., Toro H., Shi Z., Van Kampen K.R. Adenovirus as a carrier for the development of influenza virus-free avian influenza vaccines. // Expert Rev Vaccines. 2009. V. 8. № 4. P. 469-81.

148. Turnbull P.C. Current status of immunization against anthrax: old vaccines may

be here to stay for a while. // Curr Opin Infect Dis. 2000 V. 13. № 2. P. 113-120.

149. Turnbull P.C., Bell R.H., Saigawa K., Munyenyembe F.E., Mulenga C.K., Makala L.H. Anthrax in wildlife in the Luangwa Valley, Zambia. // Vet Rec. 1991. V. 128. № 17. P. 399-403.

150. Turnbull P.C., Broster M.G., Carman J.A., Manchee R.J., Melling J. Development of antibodies to protective antigen and lethal factor components of anthrax toxin in humans and guinea pigs and their relevance to protective immunity. // Infect Immun. 1986. V. 52. № 2. P. 356-63.

151. Turnbull P.C., Leppla S.H., Broster M.G., Quinn C.P., Melling J. Antibodies to anthrax toxin in humans and guinea pigs and their relevance to protective immunity. // Med Microbiol Immunol. 1988. V. 177. № 5. P. 293-303.

152. Turnbull P.C.B., Quinn C.P., Hewson R., Stockbridge M.C., Melling, J. Protection conferred by microbially-supplemented UK and purified PA vaccines. // Proceedings of the International Workshop on Anthrax. Salisbury Medical Bulletin. 1990. Supplement 68. P. 89-91.

153. Turnbull PCB. Anthrax. // Vaccines: A Biography. 2010. Chapter 4. P. 57-71.

154. Tutykhina I.L., Logunov D.Y., Shcherbinin D.N., Shmarov M.M., Tukhvatulin A.I., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Development of adenoviral vector-based mucosal vaccine against influenza. // J. Mol. Med. 2011. V. 89. № 4 P. 331-41.

155. Uchida I., Hashimoto K., Terakado N. Virulence and immunogenicity in experimental animals of Bacillus anthracis strains harbouring or lacking 110 MDa and 60 MDa plasmids. // J Gen Microbiol. 1986. V. 132. № 2. P. 557-9.

156. Van der Eb A.J., van Kesteren J., van Bruggen E.F. Structural properties of adenovirus DNAs. // Biochem Biophys Acta. 1969. V. 182. P. 530-541.

157. Van Kampen K.R., Shi Z., Gao P., Zhang J., Foster K.W., Chen D.T., Marks D., Elmets C.A., Tang D.C. Safety and immunogenicity of adenovirus-vectored nasal and epicutaneous influenza vaccines in humans. // Vaccine. 2005. V. 23 № 8. P. 1029-36.

158. Vietri N.J., Purcell B.K., Lawler J.V. et al. Short-course postexposure antibiotic prophylaxis combined with vaccination protects against experimental inhalational anthrax. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V. 103. № 20. P. 78136.

159. Walport M.J. Complement. First of two parts. // N. Engl. J. Med. 2001. V. 344. № 14. P. 1058-66.

160. Wang L., Sunyer J.O., Bello L.J. Fusion to C3d enhances the immunogenicity of the E2 glycoprotein of type 2 bovine viral diarrhea virus. // J. Virol. 2004. V. 78. №4. P. 1616-22.

161. Wang M., Xie Z., Shi M., et al. A new strategy to induce effective antitumour response in vitro and in vivo. // Scand. J. Immunol. 2008. V. 68. № 3. P. 287-96.

162. Ward M.K., Mcgann V.G., Hogge A.L. Jr, Huff M.L., Kanode R.G. Jr., Roberts E.O. Studies on anthrax infections in immunized guinea pigs. // J Infect Dis. 1965. V. 115 P. 59-67.

163. Wattiau P., Govaerts M., Frangoulidis D. et al. Immunologic response of unvaccinated workers exposed to anthrax, Belgium. // Emerg Infect Dis. 2009. V. 15. № 10. P. 1637-40.

164. Welkos S., Friedlander A., Weeks S., Little S., Mendelson I. In-vitro characterisation of the phagocytosis and fate of anthrax spores in macrophages and the effects of anti-PA antibody. // J Med Microbiol. 2002. V. 51 № 10. P. 821-31.

165. Welkos S., Little S., Friedlander A., Fritz D., Fellows P. The role of antibodies to Bacillus anthracis and anthrax toxin components in inhibiting the early stages of infection by anthrax spores. // Microbiology. 2001. V. 147 № 6. P. 1677-85.

166. Welkos S.L., Bozue J.A., Cote C.K. The Interactions between Bacillus anthracis and Macrophages. // Books. Chapter 10. Bacillus anthracis and Anthrax. Bergman N.H. 2011. P. 179-208.

167. Williamson E.D., Hodgson I., Walker N.J., Topping A.W., Duchars M.G., Mott

J.M., Estep J., Lebutt C., Flick-Smith H.C., Jones H.E., Li H., Quinn C.P. Immunogenicity of recombinant protective antigen and efficacy against aerosol challenge with anthrax. // Infect Immun. 2005. V. 73 № 9. P. 5978-87.

168. World Health Organization. Anthrax in humans and animals. Fourth edition. // 2008. P.162.

169. Wright G.G., Green T.W., Kanode R.G. Studies on immunity in anthrax. V. Immunizing activity of alum-precipitated protective antigen. // J Immunol. 1954. V.73№6P. 387-91.

170. Wright J.G., Quinn C.P., Shadomy S., Messonnier N.; Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Use of Anthrax Vaccine in the United States. Recommendations of the Advisory Committee on Immunization Practices (ACIP).. // MMWR Recomm. Rep. 2010 V. 59/RR-6. P.21.

171. Wu S., Zhang Z., Yu R., Zhang J. et. al. Intramuscular delivery of adenovirus serotype 5 vector expressing humanized protective antigen induces rapid protection against anthrax that may bypass intranasally originated preexisting adenovirus immunity. // Clin Vaccine Immunol. 2014. V. 21. № 2. P. 156-64.

172. Xiang Z.Q., Greenberg L., Ertl H.C, Rupprecht C.E. Protection of non-human primates against rabies with an adenovirus recombinant vaccine. // Virology. 2014. V. 450-451. P. 243-9.

173. Xu G.L., Zhang K.Q., Guo B., et al. Induction of protective and therapeutic antitumor immunity by a DNA vaccine with C3d as a molecular adjuvant. // Vaccine. 2010. V. 28. № 44. P. 7221-7.

174. Yang S., Wang C., Fang X., et al. Fusion of C3d molecule with neutralization epitope(s) of hepatitis E virus enhances antibody avidity maturation and neutralizing activity following DNA immunization. // Virus Res. 2010. V. 151. №2. P. 162-9.

175. Ye L., Zeng R., Bai Y., Roopenian D.C., Zhu X. Efficient mucosal vaccination mediated by the neonatal Fc receptor. // Nat Biotechnol. 2011. V. 29. № 2. P. 158-63.

176. Yu Y.Z., Li N., Wang W.B., Wang S., Ma Y., Yu W.Y., Sun Z.W. Distinct immune responses of recombinant plasmid DNA replicon vaccines expressing two types of antigens with or without signal sequences. // Vaccine. 2010. V. 28. № 47. P. 7529-35.

177. Zhang D., Xia Q., Wu J., Liu D., Wang X., Niu Z. Construction and immunogenicity of DNA vaccines encoding fusion protein of murine complement C3d-p28 and GP5 gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. // Vaccine. 2011. V. 29. № 4. P. 629-35.

178. Zhang J., Jex E., Feng T., Sivko G.S., Baillie L.W., Goldman S., Van Kampen K.R., Tang D.C. An adenovirus-vectored nasal vaccine confers rapid and sustained protection against anthrax in a single-dose regimen. // Clin Vaccine Immunol. 2013. V. 20. № 1. P. 1-8.

179. Zhang Z., Li Y., Xu S., Chen F., Zhang L., Jiang B., Chen X. Fusion to chicken C3d enhances the immunogenicity of the M2 protein of avian influenza virus. // Virol. J. 2010. V. 7. P. 89.

180. Zhou J., Qiu C., Cao X.A., Lin G. Construction and immunogenicity of recombinant adenovirus expressing the major outer membrane protein (MOMP) of Chlamydophila psittaci in chicks. // Vaccine. 2007. V. 25. № 34. P. 6367-72.

181. Zilinskas R.A. Iraq's biological weapons. The past as future? // JAMA. 1997. V. 278. №5. P. 418-24.

182. ahttp://www.abedia.com/wiley/genes.php.

183. ahttp://www.abedia.com/wiley/vectors.php.

184. ahttp://www.bt.cdc.gov/agent/agentlist-category.asp.

185. ahttp://www.epidemiolog.ru/catalog_vac/369.html.

186. ahttp://www.health-ua.org/archives/health/l639.html.

187. ahttp://www.rospotrebnadzor.ru/about/info/news_region/news_details_region.ph p?ELEMENT_ID= 1458.