Совершенствование технологии получения настоек из разного вида лекарственного растительного сырья тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Рогожникова Елена Петровна

• Рогожникова Елена Петровна
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Рогожникова Елена Петровна

Введение

ГЛАВА I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НАСТОЕК ИЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ (обзор литературы)

1.1. Настойки из лекарственного растительного сырья в фармации и медицине

1.2. Методы получения и анализа настоек из лекарственного растительного сырья

1.3. Современные аспекты исследования специфической активности и

безопасности настоек из лекарственного растительного сырья

Заключение к главе I

ГЛАВА II. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследований

2.2.1. Химические методы

2.2.2. Физические методы

2.2.3. Физико-химические методы

2.2.3. Биологические методы

2.2.4. Математические методы

Заключение к главе II

ГЛАВА III. ИССЛЕДОВАНИЯ ПО ОПТИМИЗАЦИИ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НАСТОЕК ИЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ57

3.1. Влияние экстрагента на показатели качества экстракционных препаратов, полученных разными методами

3.1.1. Сравнительное изучение настоек, полученных методом мацерации

3.1.2. Сравнительное изучение настоек, полученных методом перколяции

3.1.3. Сравнительное изучение настоек, полученных методом дробной мацерации

3.1.4. Получение настоев/отваров из лекарственного растительного сырья

3.2. Разработка метода модифицированной дробной мацерации

3.3. Сравнительная оценка влияния технологии получения на показатели качества настоек

3.4. Расчеты по снижению затрат на экстрагент при использовании метода модифицированной дробной мацерации

3.5. Обобщенная функция желательности Харрингтона как способ одновременной оптимизации множественных экспериментальных данных

Выводы к главе III

1145

ГЛАВА IV. ИССЛЕДОВАНИЕ ТОКСИЧНОСТИ, СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ И СТАБИЛЬНОСТИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ НАСТОЕК

4.1. Исследование in vitro бактериостатической активности и in vivo острой токсичности экспериментальных настоек

4.2. Исследование in vitro специфической и in vivo факрмакологической активности экспериментальных настоек

4.3. Исследование стабильности и определение сроков годности

экспериментальных настоек

Выводы к главе IV

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

РЕКОМЕНДАЦИИ

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

Список сокращений

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение № 1. ЛС-000538-060810 «Пустырника настойка»

Приложение № 2. РШ01887/01--040310 «Календулы настойка»

Приложение № 3. ЛСР-001753/09-100309 «Валерианы настойка»

Приложение № 4. ЛС-001659-290711 «Эхинацеи настойка»

Приложение № 5. Изучение антимикробной активности в опытах in vitro

Приложение № 6. Отчет о научно-исследовательской работе по сравнительному доклиническому изучению «острой» токсичности экспериментальных и

стандартных (фармакопейных) образцов настоек

Приложение № 7. Протокол изучения биологической активности образцов настоек с применением специфических ферментных биотест-систем в условиях

in vitro

Приложение № 8. Отчет о научно-исследовательской работе по сравнительному доклиническому фармакологическому изучению экспериментальных и

стандартных (фармакопейных) образцов настоек

Приложение № 9. Качественные и количественные показатели

экспериментальных настоек, полученных методом мацерации

Приложение № 10. Микробиологические показатели экспериментальных

настоек, полученных методом мацерации

Приложение № 11. Качественные и количественные показатели

экспериментальных настоек, полученных методом перколяции

Приложение № 12. Микробиологические показатели экспериментальных настоек, полученных методом перколяции

Приложение № 13. Качественные и количественные показатели

экспериментальных настоек, полученных методом дробной мацерации

Приложение № 14. Микробиологические показатели экспериментальных

настоек, полученных методом дробной мацерации

Приложение № 15 Качественные и количественные показатели образцов

водных извлечений

Приложение № 16. Расчет статистической значимости

Приложение № 17. Качественные и количественные показатели экспериментальных настоек, полученных методом модифицированной дробной

мацерации

Приложение № 18. Микробиологические показатели экспериментальных

настоек, полученных методом модифицированной дробной мацерации

Приложение № 19. Спецификация на лекарственный препарат «Боярышника

настойка»

Приложение № 20. Спецификация на лекарственный препарат «Пустырника

настойка»

Приложение № 21. Спецификация на лекарственный препарат «Календулы

настойка»

Приложение № 22. Спецификация на лекарственный препарат «Валерианы

настойка»

Приложение № 23. Спецификация на лекарственный препарат «Мяты перечной

настойка»

Приложение № 24. Спецификация на лекарственный препарат «Эхинацеи

настойка»

Приложение № 25. Акт внедрения результатов диссертационной работы в ГОУ

ВО МО ГГТУ г. Орехово-Зуево

Приложение № 26. Акт внедрения технологии получения ЛП «Боярышника

настойка»

Приложение № 27. Акт внедрения технологии получения ЛП «Пустырника

настойка»

Приложение № 28. Акт внедрения технологии получения ЛП «Календулы

настойка»

Приложение № 29. Акт внедрения технологии получения ЛП «Мяты перечной

настойка»

Приложение № 30. Акт внедрения технологии получения ЛП «Эхинацеи

настойка»

Приложение № 31. Акт внедрения проекта НД «Боярышника настойка»

Приложение № 32. Акт внедрения проекта НД «Пустырника настойка»

Приложение № 33. Акт внедрения проекта НД «Календулы настойка»

Приложение № 34. Акт внедрения проекта НД «Мяты перечной настойка»

Приложение № 35. Акт внедрения проекта НД «Эхинацеи настойка»

Приложение № 36. Опытно-промышленный регламент «Боярышника

настойка»

Приложение № 37. Опытно-промышленный регламент «Пустырника

настойка»

Приложение № 38. Опытно-промышленный регламент «Календулы

настойка»

Приложение № 39. Опытно-промышленный регламент «Мяты перечной

настойка»

Приложение № 40. Опытно-промышленный регламент «Эхинацеи настойка» 270 Приложение № 41. Отчет о проведении валидации технологии получения

настоек методом модифицированной дробной мацерации

Приложение № 42. Патент на изобретение «Настойка эхинацеи и способ

получения настойки эхинацеи»

Приложение № 43. Патент на изобретение «Настойка эхинацеи пурпурной и

способ ее получения»

Приложение № 44. Патент на изобретение «Мяты перечной настойка и способ

ее получения»

Приложение № 45. Патент на изобретение «Настойки из лекарственного растительного сырья и способ их получения»

6

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование технологии получения настоек из разного вида лекарственного растительного сырья»

Введение

Лекарственные препараты на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) вошли в лечебную практику, как препараты с мягким терапевтическим действием, с минимумом побочных эффектов и, связанной с этой возможностью, длительного применения. Одной из самых многочисленных групп таких препаратов являются настойки из ЛРС, что обусловлено их многокомпонентностью, обеспечивающей широту терапевтического спектра и возможностью, как внутреннего, так и наружного их применения. Они используются, как в лечебных, так и в профилактических целях (Гусев Н.Ф. с соавт., 2014 г.; Логвинова Е.Е. с соавт., 2015 г.; Куркин В.А. с соавт., 2016 г.; Бойко Н.Н. с соавт., 2017 г., 2018 г.; Токарева М.Г. с соавт., 2019 г.).

Однако из-за высокого содержания в настойках спирта этилового, ограничена категория пациентов для их использования внутрь (дети, беременные женщины, пациенты с заболеваниями печени, алкогольной зависимостью, лица с высокой концентрацией внимания на рабочем месте), что не отвечает требованиям к фармацевтической разработке, которая с учетом требований ICH Q8, должна быть пациент ориентированной. Кроме того, с 8 февраля 2017 года в Российской Федерации согласно приказу МЗ РФ №47н утвержден перечень лекарственных препаратов, в отношении которых установлены ограничения объема тары, допускающие фасовку настоек только в таре объемом не более 25 миллилитров, а в соответствии с Приказом МЗ РФ № 779н от 31 июля 2020 г. -при объемной доле спирта свыше 50% не более 25 миллилитров и не более 50 миллилитров при объемной доле спирта от 30% до 50%. Следовательно, оптимизация технологии получения водно-спиртовых извлечений из ЛРС за счет снижения содержания спирта позволила бы значительно расширить категорию пациентов для их применения, повысить приоритет настоек по отношению к другим лекарственным формам и снизить затраты на их производство. Поэтому совершенствование технологии получения настоек из лекарственного растительного сырья является актуальной задачей фармацевтической технологии.

Степень разработанности темы

Вопросам совершенствования технологии экстракционных препаратов из лекарственного растительного сырья посвящены работы ряда авторов (Давыдова В.Н., 2002 г.; Никифорова Е.Б., 2007 г.; Ковалева Л.Г., 2015 г.; Николашкин А.Н. с соавт., 2016 г., 2017 г.; Веремчук О. А. с соавт., 2018 г.; Муцаев Р. В. с соавт., 2018 г.; Савченко Л. Н. с соавт., 2016 г.; Базарнова Ю. Г. с соавт., 2016 г.; Романенко Е. А. с соавт., 2018 г.).

В тоже время, оптимизацией технологии не были охвачены водно-спиртовые извлечения валерианы, боярышника, календулы, пустырника, мяты перечной, эхинацеи, выпускаемые фармацевтической промышленностью. В современной литературе не уделялось должного внимания совершенствованию методов получения водно-спиртовых извлечений из ЛРС с целью снижения концентрации спирта и сокращения затрат на производство. Это и обусловило выбор темы, постановку цели и задач диссертационного исследования.

Цель исследования - совершенствование технологии получения настоек из боярышника кроваво-красного плодов, пустырника сердечного травы, календулы лекарственной цветков, валерианы лекарственной корневищ с корнями, мяты перечной листьев, эхинацеи пурпурной травы с использованием метода модифицированной дробной мацерации и индивидуализированным содержанием спирта в готовом продукте.

Для осуществления поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Обосновать выбор объектов исследования и необходимость совершенствования технологии получения настоек.

2. Определить влияние технологии получения и вида экстрагента на нормируемые показатели качества экспериментальных водно-спиртовых извлечений из ЛРС.

3. Обосновать индивидуализированную концентрацию экстрагента в экспериментальных настойках и рациональный способ их получения.

4. Провести сравнительную оценку специфической фармакологической активности и безопасности экспериментальных и официнальных настоек.

5. Изучить стабильность полученных экспериментальных образцов настоек методом долгосрочных испытаний и определить срок их годности.

6. Разработать проекты нормативной документации для трансфера технологии на разработанные лекарственные препараты.

Дизайн исследования представлен на Рисунке 1.

Рисунок 1 - Дизайн диссертационного исследования

Научная новизна

Впервые дано теоретическое и экспериментальное обоснование рациональности получения методом модифицированной дробной мацерации настоек из боярышника плодов, пустырника травы, календулы цветков, валерианы корней и корневищ, мяты перечной листьев, эхинацеи травы с

индивидуализированным содержанием спирта, который обеспечивает профиль целевых БАВ, соответствующий официнальным настойкам, позволяет исключить стадию рекуперации спирта этилового из отработанного сырья и обеспечивает экономию ресурсов, трудо-и энергозатрат.

Доказано, что водно-спиртовые извлечения из ЛРС с индивидуализированным содержанием спирта обладают специфической фармакологической активностью, сопоставимой с официнальными настойками. Установлено, что настойка мяты перечной дополнительно проявляет адаптогенную, а настойка календулы - иммуномодулирущую активность.

Новизна разработок подтверждена патентами на изобретение: № 2552919 «Настойка эхинацеи пурпурной и способ ее получения» от 14.05.2015 г.; № 2567035 «Настойка эхинацеи и способ получения настойки эхинацеи» от 01.10.2015 г.; № 2712236 «Мяты перечной настойка и способ ее получения» от 06.12.2018 г.; № 2722067 «Настойка из лекарственного растительного сырья и способ ее получения» от 26.05.2020 г. (Приложения №№ 42-45).

Теоретическая и практическая значимость работы

Теоретическое и практическое значение результатов диссертационного исследования заключается в том, что они могут способствовать проведению аналогичных научных исследований по оптимизации технологии экстракционных лекарственных препаратов из разного вида лекарственного растительного сырья.

Проведенные расчеты свидетельствуют об экономической целесообразности использования предложенного метода модифицированной дробной мацерации при получении настоек из разного вида ЛРС с индивидуализированным содержанием спирта в препарате.

Материалы диссертации могут быть использованы в преподавании таких дисциплин, как «Фармацевтическая технология», «Фармацевтическая химия», «Фармакогнозия», «Фармакология».

Основные положения, выносимые на защиту:

- обоснование выбора объектов исследования и необходимости совершенствования технологии их получения;

- усовершенствованный метод модифицированной дробной мацерации для получения настоек из боярышника кроваво-красного плодов, пустырника сердечного травы, календулы лекарственной цветков, валерианы лекарственной корневищ с корнями, мяты перечной листьев, эхинацеи пурпурной травы;

- результаты сравнительных исследований показателей качества экспериментальных настоек;

- результаты исследований специфической активности и острой токсичности экспериментальных настоек;

- результаты исследования стабильности и определения сроков годности экспериментальных настоек, полученных методом модифицированной дробной мацерации с индивидуализированным содержанием спирта.

Методология и методы исследования

Методология исследования построена на анализе и обобщении литературных данных российских и иностранных ученых по изучению настоек из разных видов лекарственного растительного сырья и включала сравнительно-экспериментальный анализ полученных результатов. Для оценки качества экспериментальных образцов настоек использованы тесты, характеризующие наличие в них БАВ и их количественные показатели; специфическую активность in vitro и безопасность in vivo. Основные показатели качества лекарственных форм определяли в соответствии с ГФ РФ XIV изд. с помощью физических, химических, физико-химических (ГХ, ВЭЖХ, спектрофотомерия, ТСХ), биологических (в т.ч. микробиологических) методов.

Достоверность научных положений и выводов подтверждена многократной повторностью экспериментов по разработке оптимизированной технологии получения и контроля качества настоек из разных видов лекарственного растительного сырья с использованием спирта этилового

различной концентрации, а также статистической обработкой полученных результатов и их сопоставлением с данными литературы. В работе использовано поверенное сертифицированное аналитическое оборудование.

Апробация результатов исследования

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на Научно-практической конференции c международным участием «Перспективы внедрения инновационных технологий в фармации», г. Орехово-Зуево, МГОГИ, 2014 г.; на ХХП Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва, 2015 г.; на Научно-практической конференции c международным участием «Перспективы внедрения инновационных технологий в фармации», г. Орехово-Зуево, МГОГИ, 2016 г.; на Научной конференции «Современные аспекты лабораторной диагностики», г. Екатеринбург, 2018 г.; на V Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Перспективы внедрения инновационных технологий в медицине и фармации» г. Орехово-Зуево, ГОУ ВО МО ГГТУ, 2018 г.; на IV Научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Молодые ученые и фармация XXI века» г. Москва, Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений, 2018 г.; на XVI Международной научной конференции «Наука России: Цели и задачи», г. Екатеринбург, 2019 г.; на Седьмой научной конференции с международным участием «Современные тенденции развития технологий здоровьесбережения», г. Москва, 2019 г.; на VII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Перспективы внедрения инновационных технологий в медицине и фармации», г. Орехово-Зуево, 2020 г.; на III Международном симпозиуме «Innovations in Life Sciences», г. Белгород, 2021 г.

Работа заслушана и обсуждена на заседании Специализированной секции Ученого совета ФГБНУ ВИЛАР 18 марта 2021 г.

Личный вклад автора заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач и их реализации до статистической обработки, обобщения, анализа и обсуждения полученных результатов в научных публикациях и написания диссертационной работы, внедрения полученных результатов.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследований были внедрены в учебный процесс кафедры «Фармакологии и фармацевтических дисциплин» фармацевтического факультета ГОУ ВО МО ГГТУ г. Орехово-Зуево (Акт внедрения в учебный процесс от 19.12.2018 г., Приложение № 25) и в производство ЗАО «Ярославская фармацевтическая фабрика»: Акты внедрения технологии получения ЛП «Боярышника настойка», «Пустырника настойка», «Календулы настойка», «Мяты перечной настойка», «Эхинацеи настойка» от 02.07.2020 г., и НД от 15.07.2020 г (Приложения №№ 26-35).

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационное исследование проведено в соответствии с номенклатурой научной специальности 3.4.1. Промышленная фармация и технология получения лекарств (фармацевтические науки).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой научно -исследовательских работ Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» по направлению «Фундаментальные (в том числе биофармацевтические) исследования, направленные на создание инновационных лекарственных форм», шифр темы 0576 - 2016 - 0013.

Объем и структура работы

Диссертационная работа изложена на 287 стр. машинописного текста, содержит 37 таблиц, 80 рисунков и состоит из введения, обзора литературы (I глава), описания объектов и методов исследования (II глава), обсуждения результатов собственных экспериментальных исследований (главы III-IV), общих выводов, списка литературы, включающего 198 источников, из которых 68 источников на иностранных языках и 45 Приложений.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 20 научных работ, из них 4 - в изданиях, входящих в «Перечень российских рецензируемых научных журналов и изданий» ВАК Министерства науки и высшего образования Российской Федерации; из которых 2 работы - в изданиях, входящих в международную базу данных Scopus.

ГЛАВА I. СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ В ОБЛАСТИ ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ НАСТОЕК ИЗ ЛЕКАРСТВЕННОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ (обзор литературы)

1.1. Настойки из лекарственного растительного сырья в фармации и медицине

Одной из актуальных задач современной фармацевтической технологии является поиск рациональных путей использования лекарственных растений в соответствии с принципами доказательной медицины [52, 152, 153, 170, 185, 188].

Настойки из лекарственного растительного сырья на протяжении многих лет доказали свою эффективность, как в лечении, так и в профилактике различных заболеваний. Растения содержат комплексы БАВ, включающие протеины, эфирные масла, микроэлементы, витамины, витаминоиды и многие другие. Поэтому, несмотря на выраженный фармакологический эффект доминирующих биологически активных веществ растительных лекарственных средств, их общий терапевтический эффект является комплексным и складывается из суммы воздействий всех компонентов растения на органы и функциональные системы организма человека [102]. Поэтому способы получения лекарственных растительных препаратов традиционно ориентированы на сохранение всего комплекса БАВ растения.

Настойки - это лекарственные препараты, содержащие в своем составе не одну активную фармакологическую субстанцию, а множество БАВ. Благодаря этому у них более широкий спектр действия по сравнению не только с синтетическими препаратами, но и индивидуальными веществами, выделенными из растений [170]. Сочетание технологичности производства, доступности сырья и невысокой цены дают основание называть настойки социальным медицинским продуктом [85]. Поэтому особенно важно уделять внимание совершенствованию технологии производства и контролю качества от сырья до продукта, готового к реализации [75, 76, 79].

Препараты растительного происхождения содержат вещества, созданные живой клеткой и поэтому могут органично участвовать в обменных процессах человеческого организма [14].

Многокомпонентный состав настоек из растительного сырья, зачастую способствует пролонгированию лечебного эффекта, усиливает и ускоряет его наступление, снижает возможные побочные действия [64, 103].

В 2020 году объем рынка препаратов на растительной основе составил 44,3 млрд руб (цит. AlphaRM). В аптеках было реализовано около 388 млн упаковок. В денежном выражении в продаже лидируют растительные препараты в форме таблеток и капсул, в натуральном - настойки.

С 2014 г. по 2020 г. на аптечном рынке находилось в обращении около 332 брендов лекарств растительного происхождения, относительно 2014 года их количество незначительно увеличилось. В госсегменте же, напротив, сократилось: до 240 с 277 торговых марок (Рисунок 2).

332 □ 2014 □ 2020

277

240

Аптечный сегмент Госсектор

Количество наименований, шт.

Рисунок 2 - Динамика количества наименований препаратов растительного происхождения на фармрынке России в 2014 -2020 гг. (цит. по AlphaRM)

По сведениям DSM Group, в последнее время в аптечных сетях России вырос спрос на спиртосодержащие настойки (настойки боярышника, пустырника, валерианы и др.).

Таким образом, одними из востребованных настоек являются боярышника кроваво-красного плодов, пустырника сердечного травы, валерианы лекарственной корней и корневищ, календулы лекарственной цветков, мяты перечной листьев и эхинацеи пурпурной травы [15, 28, 41, 73, 74, 110]. Так, по статистике продаж в 2020 году в Топ-10 вошли настойки, представленные в Таблице 1

Таблица 1 - Топ-10 настоек по продажам в 2020 году (цит. DSM Group)

Наименование Упаковки (млн шт.) Оборот (млн руб.)

«Пустырника настойка» 14,3 327,5

«Валерианы настойка» 10,6 296,5

«Боярышника настойка»» 9,0 158,3

«Прополиса настойка»» 3,6 141,2

«Календулы настойка»» 5,4 133,5

«Пиона уклоняющегося настойка» 4,3 90,4

«Перца стручкового настойка» 2,3 80,6

«Герботон» 1,8 69,6

«Эхинацея» 0,5 67,0

«Сабельник Эвалар» 0,1 36,2

Перечисленные настойки выпускаются разными фармацевтическими предприятиями (ФП). На современном Российском рынке лекарственных препаратов присутствуют 11 ФП, выпускающих «Боярышника настойку», 13 ФП выпускающих «Пустырника настойку», 12 ФП выпускающих «Валерианы настойку», 11 ФП выпускающих «Календулы настойку» [34]. Значительно меньше производителей «Мяты перечной настойки» (6 зарегистрированных препаратов) и «Эхинацеи настойки» (2 зарегистрированных препарата) [34]. Многочисленность зарегистрированных настоек из лекарственного растительного сырья свидетельствует об их актуальности и востребованности в медицинской практике. Данные представлены в Таблице 2.

Таблица 2 - Зарегистрированные в России настойки боярышника, валерианы,

пустырника, мяты, календулы и эхинацеи

Состав Регистрационный номер Фармацевтические предприятия

Боярышника настойка

Состав Регистрационный номер Фармацевтические предприятия

ЛС-005500 ПАО "Брынцалов-А"

ЛС-002142 ЗАО "ЭКОлаб"

ЛС-002713 ОАО "Дальхимфарм"

Боярышника плоды - ЛП-000087 ОАО "Флора Кавказа"

100,0 г, ЛС-000411 ОАО Ивановская фарм. Фабрика

спирт этиловый 70 % до ЛСР-010521/09 ЗАО Ярославская фармфабрика

получения 1000 мл ЛСР-004134/09 ОАО Марбиофарм

настойки ЛСР-000020/09 ООО "Бэгриф"

ЛСР-009626/08 ЗАО Московская фарм. Фабрика

ЛСР-003636/08 ООО "Гиппократ"

Р N001521/01 ООО "Росбио"

Пустырника настойка

ЛП-006361 АО "Актива"

ЛП-005884 АО "ПФК Обновление"

ЛП-003497 ЗАО "Ярославская фарм. фабрика"

ЛС-002078 ОАО "Флора Кавказа"

Пустырника трава -200,0 г, спирт этиловый 70 % до получения 1000 мл настойки ЛП-000525 ЛС-000538 ЗАО "ЭКОлаб" ООО "БЭГРИФ"

ЛСР-000839/10 ЛСР-010408/09 ЛСР-008063/09 ООО "Тульская фарм. фабрика" ОАО "Ивановская фарм. фабрика" АО "Кемеровская фарм. фабрика"

ЛСР-007162/09 АО "Кировская фармацевтическая фабрика"

ЛСР-005228/09 ЗАО "Московская фарм. фабрика"

Р N002033/01 ООО "Гиппократ"

ЛСР-007007/08 ОАО "Марбиофарм"

Валерианы настойка

ЛП-003501 АО "ПФК Обновление"

ЛС-002561 ЗАО "Ярославская фарм. фабрика"

ЛСР-010391/09 ОАО "Ивановская фарм. фабрика"

ЛСР-010400/09 ООО "Тульская фарм. фабрика"

Валерианы корневища с ЛСР-007343/09 ОАО "Тверская фарм. фабрика"

корнями - 200,0 г, ЛСР-002591/09 ЗАО "Московская фарм. фабрика"

спирт этиловый 70% до ЛСР-001753/09 ЗАО "ЭКОлаб"

получения 1000 мл ЛСР-009776/08 АО "Кемеровская фарм. фабрика"

настойки Р N001741/01 ООО "РОСБИО"

ЛСР-008188/08 ООО "БЭГРИФ"

ЛСР-007066/08 АО "Кировская фармацевтическая фабрика"

Р N002035/01 ООО "Гиппократ"

Календулы настойка

Состав Регистрационный номер Фармацевтические предприятия

ЛП-005758 ЗАО ФП "Мелиген"

ЛП-005530 АО "ПФК Обновление"

ПN010617 ОАО "БЗМП"

ЛП-001293 ООО "БЭГРИФ"

Ноготков цветки - 100,0 г, этанол 70 % достаточное количество до получения 1 л настойки ЛП-000238 ЛСР-010529/09 ЛСР-010409/09 ЛСР-009539/09 ОАО "Флора Кавказа" ООО "Тульская фармацевтическая фабрика" ОАО "Ивановская фарм. фабрика" ЗАО "Московская фарм. фабрика"

ЛСР-004924/09 ОАО "Тверская фармацевтическая фабрика"

ЛСР-002739/09 АО "Кировская фарм. фабрика"

Р N001085/01 ООО "РОСБИО"

Мяты перечной настойка

Мяты перечной листья - ЛП-006692 ООО "БЭГРИФ"

50,0 г, ЛП-004027 ООО "Камелия Н1Ш"

мяты перечной масла - ЛП-001711 ОАО "Ивановская фарм. фабрика"

50,0 г, ЛП-000319 АО "Кировская фармацевтическая

этанола 90 % до фабрика"

получения 1000 мл Р N004249/01 ЗАО "Ярославская фарм. фабрика"

настойки Р N002470/01 ЗАО "ЭКОлаб"

Эхинацеи настойка

Эхинацеи пурпурной

трава - 200,0 г, спирта ЛС-001659 ЗАО "ЭКОлаб"

этилового 40 % - до Р N002574/01 ООО "РОСБИО"

получения 1 л настойки

По данным, представленным в Таблице 2, видно, что концентрация спирта этилового, в настойках боярышника, пустырника, календулы и валерианы составляет 70 %; в настойке мяты перечной - 90 %; в настойке эхинацеи 40 % и отсутствуют одноименные настойки с индивидуализированной концентрацией спирта этилового.

Сравнительная стоимость настоек, выпускаемых фармацевтическими предприятиями, представлена в Таблице 3.

Колебания цены связаны с используемым предприятиями этилового спирта (закупной или собственного производства). Наименьшая цена настоек у фармацевтических предприятий, использующих экстрагент собственного производства - (ОАО «Флора Кавказа», ООО «Гиппократ») [34, 107].

Таблица 3 - Сравнительная стоимость настоек в 2017-2018 годах [6]

Название препарата Стоимость 25 мл препа эата, руб.

ОАО «Флора Кавказа» ООО «Гиппократ» ЗАО «ЭКОлаб» ООО "Тульская фарм. фабрика" ЗАО "ПФК "Обновление"

Боярышника настойка 22,00 19,00 26,00 - -

Пустырника настойка 22,00 20,00 26,00 22,00 58,00

Валерианы настойка 22,00 21,00 26,00 24,00 58,00

Календулы настойка 23,00 22,00 27,00 25,00 -

Экстрагент, как известно, является значимым фактором для извлечения БАВ из ЛРС [12, 22, 70, 104]. В зависимости от концентрации спирта этилового, его водно-спиртовые растворы извлекают различные комплексы БАВ: алкалоиды, гликозиды, эфирные масла и другие вещества), которые в воде растворяются в незначительных количествах. Однако спирт этиловый высокой концентрации значительно труднее, чем вода проникает через стенки клеток, превращает белки и полисахариды в осадки, которые закупоривают стенки клетки, что приводит к ухудшению диффузии, следовательно, чем ниже концентрация спирта, тем легче он проникает внутрь клетки [128].

Поэтому вопрос о возможности изготовления настоек, где индивидуализирован подход к содержанию спирта этилового в готовом продукте без потери качества и фармакологических свойств препарата требует дальнейшего изучения [52].

Для интенсификации технологического процесса, сокращения расходов сырья, качественной очистки от сопутствующих веществ из настоек проведены исследования по оптимизации процессов экстрагирования флавоноидов [40, 70, 130]. Доминирующие группы БАВ в настойках позволяют разрабатывать качественные и количественные методы анализа лекарственных препаратов. В ГФ РФ для всех видов ЛРС предусмотрен раздел «Определение основных групп

биологически активных веществ», в который, включен метод ТСХ, а в ряде случаев дополнительно предусмотрено подтверждение подлинности БАВ с помощью качественных реакций. В ГФ РФ во все ФС на лекарственные препараты из ЛРС включены методики количественного определения основных групп БАВ [69]. Немаловажным является и содержание БАВ в составе лекарственного растительного сырья [15, 41, 46, 108, 167].

Так, к примеру, лечебное действие боярышника плодов обусловлено флавоноидами (ведущая группа БАВ) и тритерпеновыми сапонинами. В плодах содержатся флавоноловые гликозиды — гиперозид (кверцетин-3-галактозид), кверцитрин (кверцетин-3-рамнозид), пиннатифидин (8-глюкозид гербацетина); флавоновые гликозиды — витексин (С-глюкозид апигенина), ацетилвитексин; полимерные флаван-3-олы, фенольные соединения: кофейная и хлорогеновая кислоты, витамины, а также дубильные вещества, моносахара [9, 31, 62, 76, 101, 108, 128, 138, 184], микро- и макроэлементы [67].

Состав боярышника плодов, цветков и листьев постоянно изучается разными исследователями [38, 159, 160, 185, 195, 198].

БАВ надземных частей растения пустырник являются флавоноиды: О-гликозиды кверцетина (включая рутин, кверцитрин, изокверцитрин, гиперозид), кемпферола. Содержатся производные апигенина - генкванин и квинквелозид, иридоидные глюкозиды (леонурид, аюгол, галиридозид и гарпагид, ацетилгарпагид, аюгозид, обусловливающие седативный эффект и горькие свойства препаратов), дитерпеноиды (леокардин), циклолеонурипептиды (А, В, С и D), тритерпены (урсоловая кислота), горькие гликозиды, 4-рутинозид кофейной кислоты, танины, сапонины, аминокислоты [1, 95, 96, 162, 168, 191].

Основной группой БАВ считаются иридоиды, которые до настоящего времени недостаточно изучены. Иридоидные гликозиды гидрофильные соединения, поэтому в ряду вода - 96 % этанол оптимальным экстрагентом для извлечения является 40% этиловый спирт [1, 95, 191].

Основными БАВ растительного сырья календулы лекарственной цветки являются тритерпеновые сапонины (2-10 %), на основе олеаноловой кислоты

(календулозиды) и флавоноиды (3-О-гликозиды изорамнетина и кверцетина), а также астрагалин, гиперозид, изокверцитрин и рутин. К другим составляющим относятся эфирное масло, тритерпеновые сапонины, полисахариды, фенилпропаноиды (кофейная и хлорогеновая кислоты), каротиноиды, микроэлементы [7, 120, 119, 141, 152, 164, 165, 176, 179, 189, 190].

В корневищах с корнями валерианы лекарственной содержится более 200 индивидуальных химических веществ [194, 195]. Они содержат до 3,0-3,5 % эфирного масла, изовалериановую кислоту, борнилизовалерианат (валериано-борнеоловый эфир), борнеол, борнеоловые эфиры муравьиной, масляной и уксусной кислот, бициклические монотерпены, пинены, сесквитерпены, кетоны, кессиловый спирт - проазулен, а также ряд алкалоидов (актинидин, валерин, хатинин), гликозидные соединения (валерозиды), валепотриаты (сложные эфиры), дубильные вещества, смолы, гликозиды (валерид, валерозиды А, В и С) [87, 88, 116, 118, 132, 135, 169, 180, 194, 196], а также микроэлементы: Бе, Мв, Си, Бе, Лв, Аи и др. [51, 148].

БАВ листьев мяты перечной является эфирное масло (0,5-4,0 %), которое содержит ментола (30-55 %) и ментона (14-32 %), флавоноид флавоментин. К другим имеющимся монотерпенам относятся изоментон, 1,8-цинеол, Р-пинен, лимонен, неоментол и ментофуран [2, 3, 4, 5, 39, 69, 89, 115, 142, 151, 177, 183]. В листьях мяты перечной отмечено высокое содержание калия (не менее 2300 мг/кг)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рогожникова Елена Петровна, 2021 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Беленький МЛ. Элементы количественной оценки фармакологического эффекта. Л., 1963. 153 с.

2. Березовская И.В. Классификация химических вешеств по параметрам острой токсичности при парентеральных способах введения// Хим.-фарм. журн. - 2003.- т. 37. - № 3.- С.32-34.

3. Западнюк И.П. и др. - Лабораторные животные, Киев. 1983

4. Лакин Г.Ф. Биометрия. М. - 1990. - С.113-130.

5. Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной пракгики».

6. Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 199н от 01.04.2016 «Об утверждении 11равил лабораторной практики».

7. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Часть первая. - М.; Г риф и К, 2012. - С. 13-24.

8. Федеральный закон от 12.04.2010 г. .V» 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств».

Приложение № 7. Протокол изучения биологической активности образцов настоек с применением специфических ферментных биотест-систем в условиях in vitro

и эучетм биологическое активности образцов настоек с применением специфических ферменгных биотест-систем в условиях опыios т uno Многие годы в медицинских и фармацевтических кругах да и v населения в цепом сохраняется н с каждым годом возрастает интерес к применению лекарственных растений и лекарств, полученных на нх основе для лечения различные заболеваний Интерес обусловлен я значитсяwíой гтгпрни тем, чтоадаебим«» лекарственны«» растения и препараты из них при прдкпльноП дозировке практически нетоксичны безвредны относительно доступны эффективны и. в некоторых случая* не имеют конкурентов среди синтетических лекарств Несмотря на огромные успехи синтетической химии лекаре raen ных веществ н ci очи и к ом получения многих биологически активных соединений а том виде какими соллллп нх природа по прежнему являются лекарственные растения Многие растительные средства имеют преимущества перед синтетическими препаратами Оки редко вызывают аллергические реакции, к ним не развивается адаптация мокро- и миьрооргакитма, оии мало токсичны и хорошо л ерем от яте я лет ь ми

Для сокращения расходов на выявления биологически активных веществ (БДВ) различной фармакологической направленности целесообразно и актуально применение специфических ферментных ó и oí ест -систем т 11tro, разработанных в ФГБНУ BIL1AP, Среди разрабшанпых оригинальных специфических ферментных биотест-систем in wrrv имеются биотест системы на основе клю'гвых ферментов акт иокендавт nofl шшны — глутатнонредуктазы (ГР) и каталазы (КАТ), на основе лимнтнрмошего фермента респираторного взрыва - НАДФН окенддзы позволяющие выявлять ЕЛВ с адаптогенной. антиоксн лай гной антимикробной н иммуномодулируюшей активностью Использованные в данной работе ферментные биотест-системы входят в состав Биологической коллекции специфических ферментных он о тест систем invmo (ВК-СФБГС) ФГБНУ ВИ.ЧАР

В отдел экспериментальной н клинической фармакологии ФГБНУ ВИЛАР были представлены образцы настоек с пониженным содержанием этилового спирта н в качестве препаратов сравнения (ПС) - настойки с содержанием спирта по НД

1 ОI - ->х«напои настойка с содержанием спирта 1 "'•о

2 02 - »химацем настойка с содержанием спирта

Материалы и методы исследовании

В качестве объектов исследования были выбраны образцы стандартных (фармакопейных) настоек и иастоек с пониженным содержанием этилового спирта:

1. ОI экс п. - настойка эхннацеи пурпурной с содержанием спирта 17%;

2. 02станд. - настойка эхннацеи пурпурной с содержанием этанола 36% (НД ЗАО «ЭКОлаб» ЛС-001659);

3. 03 эксп, - настойка мяты перечной, содержание этанола - 52%;

4. 04 станд - настойка мяты перечной (НД ЗАО «ЭКОлаб» Р № 00247Q'01), содержание этанола - 82%;

5. 05 эксп. - настойка валерианы, содержание этанола - 36%;

6. Об станд - настойка валерианы (НД ЗАО «ЭКОлаб» ЛСР-001753/09) содержание этанола - 66,2%;

7. 07 эксп - настойка календулы лекарственной, содержание этанола - 35%;

8. 08 станд - настойка календулы лекарственной (НД ЗАО «ЭКОлаб» Р № 001887/01), содержание этанола - 67,6%;

9. 09 эксп. - настойка гтустьгрнттка. содержание эталола - 36%;

10. 010 станд - настойка пустырника (НД ЗАО «ЭКОлаб» ЛС-000538), содержание этанола - 67,7%;

11. 011 эксп.- насюйка боярышника, содержание этанола - 35%;

12. 012 станд - настойка боярышника (НД ЗАО «ЭКОлаб» ЛС-002142), содержание этанола - 66.9%.

В качестве биотест-систем использовали ферменты глутатнонредуктазу, кагталазу и индупибельную NO-синтезу (реактивы фирмы Merck. Германия). Активность выбранных ферментов определяли по методикам, авторов: Aebi H.. Королюк М.А. с соавт., Стрелковой

Л.Б. ссоавт. Г1 — 3J-

Скорость IT реакции определяли спектрофотомстричсски при 340 нм на спектрофотоме1ре Shimsdzu UV-1800 по снижению оптической плотности исследуемых растворов, за счет окисления НАДФН эквнмолярным количеством восстановленного глутатиона. Для определения скорости катал азной реакции использовали метод, основанный на способности перекиси водорода образовывать с солями молибдена стойкий окрашенный комплекс, то есть измерения вели по убыли перекиси водорода н процессе реакции Активность фермента ¡NOS в экспериментах оценивали по скорости реакции, катализируемой iNOS in vitro. Данные методы определения влияния БАВ на скорость

ферментных религий иг \то еттичаютех аыссчсм специфичностью а чувствительностью, хорошем э осарси тим ос тыс меньшем хрулоемхослю чем И5Лгстые мете .ним [4] Результаты к их обожает«г

На первом ?тапе работа алмн прсеелено срагннтельное изучение бисдогнчесхон апнвногти настое* ю выбранных валов лекарственного растительного сырья с применением комбинированной хлталашон (КАТ) в глутатноврезухт»мои (ГР) спенифкчесхой ферментной бнотест-системы Ш\trro

Результаты определения прямого мсти объектов исследования ял скорость ГР» и КАТ- реахзнн в условнее опытов ш гт/гс представлены в таблиле I Тлбдиал 1 - Рег.льтзгы изучения влияние обрзшов на скорость глуптнеяредухтазнон н итлшей реахдин т \ттз

Вариант одьггэ Схоростъ реахпии Мят

Катала зная Гтупгшонредухта шах

мхмодь мни на мг белы) • • MLMO.1t. МИН ЯЛ мг белхл» %

Ксюрооь 46.9=1.93 100 2.92=С'.122 100

Каасви )шиога 01 40.3sl.59* 861 Г 43=0.093* Ш

Ф 436x1 84* МЛ ¿4?

Настонха мяты перечное 03 21.0*0 819* 44.9 3.5<Ы).136* 120

04 16.5±0.632* ш 2.83г0.111 то

Настойхэ валерианы 05 45.1*173 96.1 3.71=0,147* 12"

Об 28.7=1.19* 612 4.82=0.226* 165

Нл стсшл хллекдулы 0" 53.0*117» Ш 4.14=0.167- 142

08 60.0±127* 128 3.59=0.149- 123

НастаАхл п> стыртад 09 6<.7±}7б* ОД 4 1^173* 142

010 58.622 48* "76.5 4 03г0167* 138

Нагтоижа 5охрышяиха 011 58 6г2 М* 125 4.3520 172- 149

012 53.9sl.75* 115 4 88*0186* 167

Примечание - Далее н везде * - статистически шачныость отлична от кштрсоя

прир 0,05

Определение схоростей ГР в КАТ реахгнн в прнелтетиш двух нг.чаемых обрашов )хикапеи нлетоех (Таблица I) похазадо что оба сбрадо в веямчигедьиой :телеки но достоверно скидали скорость ГР и КАТ реахдни в условиях т гтгге» проявляя слабые пропевоынкробные свойства Подученные результаты согласовываются с литературными

данными об антибактериальной активности препаратов из эхинацеи пурпурной в опытах in vitro в отношении £. coli, Р. mirahilis, Ps aeruginosa, St aureus, S. Typhimurium [5].

Настойка мяты перечной с содержанием спирта 82% оказывала ингибирующее влияние на скорость КАТ-реакций, в то же время, не оказывая влияния на активность ГР-рсакцни, что соответствует наличию у стандартной настойки антимикробных свойств [2]. Настойка мяты перечной с содержанием спирта 52% проявляла адаптотенные свойства, снижая скорость КАТ-рсакппи. при этом увеличивая скорость ГР-рсакцни [1].

Экспериментальный образец календулы настойки и стандартной настойки проявляли антиоксидантные свойства, ускоряя и КАТ- и ГР-рсакцни [6].

Прн изучении влияния валерианы и пустырника настоск на активность ферментных реакций /л vitro, катализируемых ГР и KAI (Таблица 1), установлено активирующее влияние обоих образцов на активность ГР- и КАТ-реакций в условиях in vitro, что наблюдается при наличии у исследуемых объектов адалтогенного действия (7J.

Оба образца боярышника настоск проявляли антиоксидантные свойства, ускоряя КАТ- и ГР-реакции [б].

Известно, что настойки эхинацеи и календулы разрешены для медицинского применения в качестве иммуностимулирующих и противовоспалительных лекарственных средств [5, 8]. Поэтому нами проведены сравнительные исследования противовоспалительной активности в условиях in vitro настоек эхинацеи пурпурной и календулы лекарственной с применением ферментной бнотест-системы. разработанной на основе индуцибельной NO-синтазы (¡NOS), коюрая относится к лимитирующим ферментам, экспрессируемым при ннфскцнонно-воспалительных заболеваниях пол действием инфиштрующего фактора и цитокинов в клетках макрофагов, нейгрофиллах, гепатоцитах, мезангиальных. гладкомышечных клетках, хондроцитих и синовиоцнтах [3]. Индуцнбелъная NO- синтаза играет важную роль в защите организма от ннфнщфуюшсго агента, 1ак как продуцирует активный радикал оксида азота (NO*), который участвует в регуляции иммунитета, сосудистого тонуса, обеспечивает антимикробную н противоопухолевую защиту. Известно, что лекарственные препараты, обладающие иммуностимулирующими свойствами, активируют макрофаги и увеличивают синтез индуцибельной NO-синтазы, являющейся маркером развития воспалительного процесса в организме [3, 9J.

Эффективность противовоспалительного действия БАВ, содержащихся в исследуемых объектах оценивали по скорости ферментативной реакции, катализируемой индуцибельной NO-синтазой.

В таблице 2 представлены результаты изменения скорости ферментативной ¡NOS-реакции in vitro под влиянием ЬАВ, содержащихся а исследуемых образцах, Таблица 2 - Результаты изучения влияния настоек эхннацеи и календулы на скорость ферментативной реакции, катализируемую iNOS in vitro

Варианты опытов Скорость ферментативной реакции, катализируемая iNOSinvitro

нмоль НАДФН/ мг белка в мин (М ±т) %

Контроль 1,8 ± 0,028 100

01 2,7 ±0,13- 167

02 3,4 ± 0,16+ 212

07 3,5 ±0,016* 193

08 3,1 ± 0,011* 172

Примечание -* - статистическая значимость отличий от контроля при р<0,05

Из результатов, представленных в таблице 2, следует, что в экспериментах in vitro настойки эхинацен увеличивали скорость iNOS-реакпни. Так. препарат сравнения, стандартная настойка эхннацеи. увеличивала скорость iNOS-реикции на 52%, а образец № 2 (экспериментальный образец настойки эхннацеи с меньшим содержанием спирта) - па 92%, по сравнению с контролем, что свидетельствует о наличии иммуностимулирующей активности в данных образцах. Полученные результаты согласуются с литературными данными [5].

В условиях опытов in vitro оба образца настойки календулы увеличивали скорость rNOS-рсакшш. Экспериментальный образец на 92,7%, а стандартная настойка календулы -на 722%. Полученные результаты свидетельствуют об иммуностимулирующей активпости данных образцов, что подтверждается литературными данными [5].

Таким образом, при сравнительном изучении стандартных (фармакопейных) и экспериментальных образцов настоск из различного лекарственного растительного сырья, полученных с использованием экстрагеита с различной концентрацией, было установлено что для настоек эхннацеи, валерианы, календулы, пустырника и боярышника снижение концентрации спирта этилового практически не оказывает влияния на заявленную в ИД [10] биологическую активность изучаемых объектов в условиях опытов in vitro. В случае с настойкой мяты перечной снижение концентрации спирта приводит к сохранению антимикробных свойств и смешению активности препарата в сторону адаптогенного действия.

Выводы

1. При сравнительном изучении биологической икшаностн настоск, полученных из разных видов лекарственного растительного сырья целесообразно снижать концентрацию спирта этилового при их производстве.

2. Стандартная ностойка мяты перечной с содержанием спирта 82% обладала антимикробными свойствами, в то время как экспериментальный образец - мяты перечной настойка, с содержанием спирта 52%. проявляла адалтогенное действие.

3. Настойка эхииацеи пурпурной с пониженным содержанием спирта, также, как и стандартная настойки обладала выраженными иммуностимулирующими свойствами.

4. Оба образца настойки валерианы (стандартная и экспериментальная) обладали адаптогенными свойствами, различаясь лишь по выраженности эффектов на активность катализы и глутатнонредуктазы.

5. Стандартная настойка и экспериментальный образец настойки календулы обладали антнокенлантнммм и иммуностимулирующими свойствами.

6. Лдаптогенный эффект установлен для обоих образцов настоек пустырника.

7. Стандартная и экспериментальная настойки боярышника проявляли антиоксидантные свойства. *

Список используемой литературы

1. Aebi Н. Glutathione reductase // Methods in enzymatic analysis. H. V. Bcrgmcycr (red.). 1974. 2. 673-678.

2. Королкж M.A., Иванова М.И., Майорова И.Г., Токарев В.Е. Метод определения активности катал азы //Лоб. Дело. М. Медицина 1*>88. >61. С. 1-8.

3. Стрелкова Л.Б., Кондакова Н.В.. Дуби некая В.А. Индучибельная NO-синтаза как фермеш биотест-системы для выявления веществ с противовоспалительными свойствами in vitro // Вопр.биол.. мед и фарм. химии. 2013. -№11. С. 81-86.

4. Лупанова И.А. Исследование молекулярных механизмов действия БАВ на примере •гртгерпеновых и флавонондных гликочндов: диссертация ... кандидата биологических наук: 03.01.06. - Москва. 2013. - 131 с.

5. Лекарственные средства из растений (оиьгт ВИЛАР): научное издание / С.А. Вичконова. В.К. Колхпр. Т.А. Сокольская. И В. Воскобойникова. В.А. Быков. -М: АДРИС, 2009.-432 с.

6. Патент РФ № 2181892. Способ выявления веществ, обладающих ангнохеидантными свойствами, in vitro. Быков В.А.; Дубннская В.А.; Мннесва М.Ф.; Ребров Л.Б.; Колхир В.К.

Приложение № 8. Отчет о научно-исследовательской работе по сравнительному доклиническому фармакологическому изучению экспериментальных и стандартных (фармакопейных) образцов настоек

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ФГБНУ ВИЛАР)

УТВЕРЖДАЮ Директор ФГБНУ ВИЛАР а^адемрк РАН у/ У^г

< Сидельникон

« У//» ^¿гжЛ.^ 2021г.

■— г— ———————

ОТЧЕТ

О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ ПО СРАВНИТЕЛЬНОМУ ДОКЛИНИЧЕСКОМУ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОМУ ИЗУЧЕНИЮ ЭКСПЕРИМЕНТ АЛЬ ИЬГХ И СТАНДАРТНЫХ (ФАРМАКОПЕЙНЫХ) ОБРАЗЦОВ НАСТОЕК, ПОЛУЧЕННЫХ НА ЗАО «ЭКОлаб», РОССИЯ

Ру ко водитель исследования

руководитель Центра доклинических

исследований, капдидат

биологических наук

.г ^

С Дл^ъ) И.А. Лупанова

Москва - 2021

204

СПИСОК ИСПОЛНИТЕЛЕЙ

Руководителе 6 (ентра доклинических исследований, К&НД- б ПОЛ, наук

Заведующий отделом экспериментальной фармакологии, канд. мед. наук

Научный сотрудник отдела экспери мен галън ой фармакология

Старший научный сотрудник отдела ■экс 1 ¡сри мв1 палы эой фармакологии

____^^ ЮЛ Г ИА. Лупадова

4 подпись, дата

Е.В. Фе^бко

подпись, дета

(Т— с Г Е.Н, Курманова

подпись^ дата

р? / С % ... /НА. Маршнчик

подпись, дата

Соискатель

Е.П, Рогожниковя

подпись, дата

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Наименование доклинического исследования:

Сравнительное доклиническое фармакологическое изучение

экспериментальных и стандартных (фармакопейных) образцов настоек, полученных из лекарственного растительного сырья, производства ЗАО «ЭКОлаб», Россия.

1.2. Разработчик: ФГБНУ ВИЛАР и ЗАО «ЭКОлаб» 13. Исследовательское учреждение: ФГБНУ ВИЛАР

Федеральное Государственное бюджетное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений» (ФГБНУ ВИЛАР).

Адрес: 117216 Москва, ул. Грина, 7. Тел. [phone] Закрытое акционерное общество «ЭКОлаб».

Адрес: 142530 Московская область, г. Электрогорск, ул. Буденного, д. 1. Тел. [phone]

1.4. Сроки проведения доклинического исследования:

Исследование проводилось в период с 26.04.2021 по 21.05.2021.

1.5. Цель и задачи доклинического исследован ни: -

Провести сравнительное фармакологическое изучение экспериментальных и стандартных (фармакопейных) образцов настоек, полученных из лекарственного растительного сырья, производства ЗАО «ЭКОлаб», Россия.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Описание исследуемых лекарственных средств

2.1.1. Название

Название тестируемых объектов - экспериментальных настоек, полученных методом модифицированной дробной мацерации:

- эхинацеи настойка, образец 06/15 МДМЭ;

- валерианы настойка, образец 06/35 МДМВ;

- календулы настойка, образец 06/35 МДМК;

- пустырника настойка, образец 11/35 МДМП;

- боярышника настойка, образец 06/35 МДМ Б. Название референтных объектов:

- эхинацеи настойка, образец 40 ДМЭ, серия 020420;

- валерианы настойка, образец 70 ДМВ, серия 071218;

- календулы настойка образец 70 ДМК, серия 021118;

- пустырника настойка, образец 70 ДМП, серия 010119;

- боярышника плоды настойка образец 70 ДМБ, серия 021018.

2.1.2. Физико-химические характеристики образцов, состав и описание

Иинацеи настойка тестируемый образец 06/15 МДМЭ - прозрачная жидкость жблто-коричневого цвета. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 17%. Сухой остаток - 2,58%. Количественное определение содержания оксикоричных кислот в пересчете на цикорневую кислоту 0,23%. Соответствует требованиям ЛС - 001659-270911, изм. 1, кроме п. 4, содержание спирта.

Эхннацен настойки (фармакопейная), образец 40 ДМЭ, образец 01/40

ДМЭ — прозрачная жидкость жёлто- кор и ч не во го цвета. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляет 36%. Сухой остаток - 2,18%. Количественное определение содержания оксикоричных кислот в пересчете на цикорневую кислоту 0,22%. Соответствует проекту требованиям ЛС - 001659270911, изм. 1.

Валерианы настойка, образец 06/35 МДМВ — прозрачная жидкость красно-бурого цвета, характерного ароматного запаха и сладковато-горького вкуса. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 36%. Сухой остаток - 4,2%. Количественное определение содержания сложных эфиров в пересчете на этиловый эфир кислоты, валереновой 0,41%. Соответствует требованиям ЛСР- 001753/09-100309, изм. 1-3, кроме п. 5, содержание спирта.

Валерианы настойка, образец 70 ДМВ, серия 071218 - прозрачная жидкость коричневого цвета, характерного ароматного. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 66%. Сухой остаток - 3,650%. Количественное определение содержания сложных эфиров карбоновых кислот в пересчете на этиловый эфир кислоты валереновой 0,31%. Соответствует требованиям ЛСР- 001753/09-100309, изм. 1-3, ГФ XIII.

Календулы настойка, образен 06/35 МДМК - прозрачная жидкость желтого цвета с буроватым оттенком, со специфическим запахом. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 35%. Сухой остаток - 3,51%. Количественное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин 0,0912%, Соответствует требованиям Р № 001887/01040310, изм. 1-3, кроме п.4, содержание спирта.

Календулы настойка, образец 70 ДМК, серии 021118 - прозрачная жидкость желтовато-коричневого цвета со специфическим запахом. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 67,6%. Сухой остаток - 2,18%. Количественное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин 0,09%. Соответствует требованиям Р № 001887/01 -040310, изм. 1-3, кроме п.4, ГФ XIII.

Пустырника настойка, образец 11/35 МДМП - прозрачная жидкость коричневого цвета со слабым ароматным запахом. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 36%. Сухой остаток - 1,92%. Количественное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин 0,027%. Соответствует требованиям ЛС - 000538-060810, изм. 1-5, кроме показателя по п.4, содержание спирта.

Пустырника настойка, обрагеи 70 ДМП, серим 010119 - прозрачная жидкость зеленовато-коричневого цвета со слабым ароматным запахом. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 67,7%. Сухой остаток - 1,94%. Количественное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин 0,021%. Соответствует требованиям ЛС - 000538-060810, изм. 1-5, ГФ XIII.

Боярышника настойка, образец 06/35 МДМБ - прозрачная жидкость красно-коричневого цвета. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 35%. Сухой остаток - 1,82%. Количественное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин 0,007%. Соответствует требованиям ЛС — 002142 от 271011, изм. 1,2, кроме показателя по п.4, содержание спирта. ,

Боярышника настойка, образец 70 ДМБ, серия 021018 МДМБ -

прозрачная жидкость красно-коричневого цвета. Концентрация спирта этилового в готовой настойке составляла 66,9%. Сухой остаток - 1,89%. Количественное определение содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин 0,013%. Соответствует требованиям ЛС - 002142 - 271011, изм. 1,2, ГФ XIII.

2.2. Обоснование исследования

2.2.1. Выбор животных

Мыши являются стандартным объектом для доклинических испытаний лекарственных средств. Мыши рекомендуются нормативными документами в качестве одной из тест-систем для исследования фармакологической активности потенциальных фармацевтических препаратов.

2.2.2. Количество животных

Количество животных, используемое в исследовании, достаточно для полной регистрации изучаемых эффектов.

2.3. Регулирующие стандарты

2.3.1. Нормативные ссылки

Доклинические исследования лекарственных препаратов выполняются согласно Решению Совета ЕЭК от 03.11.2016 Х«81 «Об утверждении Правил надлежащей лабораторной практики ЕАЭС», Национальному стандарту

Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.) и в соответствии с Федеральными законами от 12.04.2010 г. № 61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» и от 22,12.2014 г. № 429-Ф'З «О внесении изменений в Федеральный закон «Об обращении лекарственных средств».

Эксперименты на животных проводятся в соответствии с правилами, принятыми Европейской Конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (European Convention for the Protection of Vertebrate Animais Used for Expérimental and other Scientific Purposes (ETS 123), Strasbourg, 1986).

Исследования выполняются no согласованному письменному плану и в соответствии со Стандартными операционными процедурами исследователя (СОП); в соответствии с санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).

2.3.2. Комиссия по биоэтике

Конкретные процедуры с использованием животных до их начала были рассмотрены и утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными ФГБНУ BHJ1AP (Протоколы № 48 от 26.04.21 и № 49 от 11.05.21 ).

2.3.3. Принципы и руководства, лежащие в основе дизайна исследования

В основе дизайна исследования лежало «Руководство по проведению

доклинических исследовании лекарственных средств» (2012 г.).

Дизайн и организация исследования направлены на решение поставленной цели и базируются на общих принципах организации исследований по фармакологическому изучению веществ на животных.

2.4. Дизайн исследования

2.4.¡.Описание исследования

Экспериментальное исследование фармакологической активности тестируемых и референтных настоек эхинацеи и календулы

Цель: изучить противовоспалительную активность настоек в условиях модели формалинового отёка лап мышей.

Фармакологические свойства образцов изучали при внутрижелудочном введении. Животным в апоневроз вводили 0,05 мл 1 % формалина. Исследование противовоспалительной активности настоек проводили внутрижелудочно в течение четырёх дней до введения формалина и через I час после. Животных делили на 5 ipynii по 10 особей. Первая - контрольная ipynna, вторая получала эхинацеи настойку, образец 01/40 ДМЭ, третья - эхинацеи настойку, образец 06/15 МДМЭ, четвёртая - календулы настойку, образец 70

ДМК серия 021118 и пятая - календулы настойку образец 06/35 МДМК. Контрольным животным вводили в эквивалентном объеме воду очищенную. Через зри часа на пике воспаления животных подвергли эвтаназии с помощью углекислого газа и регистрировали массу ампутированных конечностей мышей с развитием отёка и здоровых н рассчитали прирост объема экссудата (мг). О развитии отека судили по разнице в массе у контрольных и опытных животных и рассчитают противоэкссудативный эффект по формуле:

% угнетения отёка = Рк - Ро/Рк х 100,

где Рк - разность масс лапок с отёком и без отёка у животных контрольной группы; Ро - разность масс лапок с отёком и без отёка у животных опытной группы.

Экспериментальное исследование фармакологической активное! н тестируемых н референтных настоек валерианы и пустырника

Цель: изучить седативную активность настоек в условиях модели хлорапгидратного сна.

Опытные животные были разделены на пять 1-рупп по 10 особей: первая

- контрольные животные. Животные, которые получали Валерианы настойку, образец 70 ДМВ, серня 071218 - вторая группа, третья группа получала Валерианы настойку образец 06/35 МДМВ. четвертая фушха получала Пустырника настойку, образец 70 ДМП, серия 010119, пятая - Пустырника настойку. 11/35 МДМП. На 4 день эксперимента через 30 минут после введения препаратов изучено их влияние на нервную деятельность на модели хлоралгидратного сна. Хлоралгидрат в дозе 350 мг/кг вводили мышам после внутрнжелудочного введения исследуемых препаратов. Время засыпания отмечено по боковому положению животных. Время пробуждения отмечено но принятию животными обычной позы при открытых глазах и груминге. Период наблюдения продолжительности сна - 4 часа.

Экспериментальное исследование фармакологической активности тестируемой и референтной настоек боярышника

Цель: изучить седативную активность настоек в условиях модели хлоралгидратного сна.

Опытные животные были разделены на три группы по 10 особей: первая

— контрольные животные. Животные, которые получапи Боярышника настойку, образец 70 ДМБ, серия 021018 - вторая группа третья группа получала Боярышника настойку образец 06/35 МДМБ. На 4 день эксперимента через 30 минут после введения препаратов изучено их влияние на нервную деятельность на модели хлоралгидратного сна. Хлоралгидрат в дозе 350 мг/кг вводили мышам после внутрнжелудочного введения исследуемых препаратов. Время засыпания отмечено по боковому положению животных. Время пробуждения

отмечено по принятию животными обычной позы при открытых глазах и груминге. Период наблюдения продолжительности сна - 4 часа.

2.4.2. Дозы

Лабораторным животным настойки вводили в дозе, соответствующей терапевтической дозе, указанной в «Инструкции по медицинскому применению», (согласно коэффициенту пересчёта доз для лабораторных мышей) объемом до 0,5 мл, что соответствует физиологически допустимым для введения в желудок мышам.

Мышам вводили исследуемые настойки в желудок,

2.5. Подготовка препаратов для введения

Настойки эхинацеи в объёме 5,25 мл растворяли в 150 мл воды очищенной. Данные растворы вводили мышам в расчёте 0,4 мл на 20,0 г массы тела животного.

Настойки календулы в объёме 3 мл растворяли в 150 мл воды очищенной. Данные растворы вводили мышам в расчёте 0,44 мл на 20 г массы тела животного.

Настойки валерианы в объёме 4,5 мл растворяли в 150 мл воды очищенной. Данные растворы вводили мышам в расчёте 0,44 мл на 20,0 г массы тела животного.

Настойки пустырника в объёме 7,5 мл растворяли в 150 мл воды очищенной. Данные растворы вводили мышам в расчёте 0,45 мл на 20,0 г массы тела животного.

Настойки боярышника в объёме 4,5 мл растворяли в 150 мл воды очищенной. Данные растворы вводили мышам в расчете 0,44 мл на 20,0 г массы тела животного.

2.6. Способ н процедура введения

В условиях эксперимента приготовленные растворы препаратов вводили внутрижелудочно при помощи металлического зонда, однократно в течение 4 дней.

Введение лекарственных средств осуществляли с 09.00 час.

2.7.Тест-система (животные и уход за ними)

2.7.1. Вид, линия, количество животных

В эксперименте использовали конвенциональных животных. Общее количество животных, используемое в данных исследованиях, составило: 130 нелинейных мышей (самцы).

2.7.2. Источник животных

Производители животных: питомник ФГБНУ ВИЛАР. Животные разведены специально и ранее не участвовали в исследованиях. Имеется заключение ветеринарного врача.

2.7.3. Начальные возраст и масса тела. Распределение по группам.

В исследовании использовали животных одного возраста и по возможности одинаковой массы тела. Возраст мышей составлял 2,5 - 3 месяца, масса тела, соответственно 19,0 - 21,0 г.

2.7.4. Клетки, подстил

Мышей содержали в поликарбонатных клетках по 10 штук. В качестве подстила использовали стерилизованные древесные опилки.

2.7.5. Корм

Стандартный полнорационный экстру диро ванный комбикорм для лабораторных животных (мыши), удостоверение качества и безопасности комбикорма рецепт ПК-120 ТУ 10.92.10-006-00933051-2018 (ООО «Лабораторкорм», Россия) от 18.02.2019 г., партия №116, давали ad libitum в кормовое углубление.

2.7.6. Вода

Водопроводную воду давали ad libitum в стандартных поилках. Протоколы лабораторных испытаний .Ys 39-13-18285 от 30.04.2019 г. и

№ 39-11-423 от 06.05.2019 г о соответствии СанПин 2.1.4.1074-01 «Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль качества».

2.7.7. Параметры окружающей среды

Животных содержали в контролируемых условиях окружающей среды: температура воздуха 20-22°С и относительная влажность 40-60%. Температуру и влажность контролировали в экспериментальной комнате ежедневно и документировали вручную. Освещение - естественно-искусственное. Имеется протокол лабораторных испытаний (измерений освещенности) X» 39-06-65 Пр/о от 06.05.2019 о соответствии СанПиН 2.2.1/2.1.1.1278-03 «Гигиенические требования к естественному, искусственному и совмещенному освещению жилых и общественных зданий». Протокол № 39-11-35-3 (97-105) исследования воздуха рабочей зоны от 30.04.2019 г. о соответствии ГН 2.2.5.3532-18 «Предельно-допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Протокол лабораторных испытаний (измерений микроклимата) № 39-06-72 к/м от 06.05.2019 г. о соответствии требованиям СанПин 2.2.4.54896 «Гигиенические требования к микроклимату производственных помещений».

2.7.8. Карантин

Животных содержали в карантине 14 дней в клетках.

Во время карантинного периода у них контролировали клинические признаки здоровья.

2.7.9. Идентификация животных

Каждому животному был присвоен индивидуальный номер, каждой группе животных был присвоен номер, фиксируемый на карточке клетки.

2.8. Статистический анализ

Статистическую обработку результатов провели с помощью пакета программ статистического анализа Statistica 10,0 (StatSoft, США). Для оценки значимости отличий между выборками с распределением, приближающимся к нормальному, использован t-критерий Стьюдснта. Критический уровень значимости Р при проверке статистических гипотез принимали равным 0,05.

2.9. Документация и архивирование

Все первичные данные, полученные в эксперименте, заключительный отчет и документация, относящаяся к исследованию, сложены в папку по исследованию препарата и будут храниться в архиве в течение 5 лет.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 3.1. Результаты сравнительного фармакологического изучения настоек эхинацеи н календулы

Результаты изучения влияния настоек эхинацеи и календулы на течение экссудативной фазы острого воспаления на модели формалинового отёка лап мышей представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты изучения противовоспалительной активности

настоек эхинацеи и календулы на модели < юрмалинового отёка

Группы животных п=10 Прирост объема экссудата на пике воспаления, мг Противовоспалительный эффект %

Контроль, вода очищенная 86,4±5,98 -

Эхинацеи настойка образец 01/40 ДМЭ 68,7±2,86* 20

Эхинацеи настойка образец 06/15 МДМЭ 71,0±2,47* 18

Календулы настойка образец 70 ДМК, серия 021118 69,3±1,10* 20

Календулы настойка образец 06/35 МДМК 57,1±1,90* 34

Примечание: различия статистически достоверны но сравнению с контролем при р<0,05.

Как видно из таблицы 1, тестируемая и референтная настойки эхинацеи при четырёхдневном введении обладали достоверным противовоспалительным эффектом, уменьшая формалиновый отёк на 20 и 18 % соответственно.

Референтная настойка календулы уменьшала формалиновый отёк на 20 %, а тестируемая - на 34 %, проявляя таким образом более высокую противовоспалительную активность.

3.2. Результаты сравнительного фармакологического изучения настоек валерианы н пустырника

Результаты изучения нейротропной активности референтных и тестируемых настоек валерианы и пустырника на модели «хлоралгидратный сон» представлены в таблице 2.

Группы животных п=Ю Время латентного периода (секунды) Время сна (минуты)

Контроль, вода очищенная 126,5^7,08 183,4^2,49

Валерианы настойка образец 70 ДМВ, серия 071218 63,0±1,60* 207,8±3,65*

Валерианы настойка образец 06/35 МДМВ 58,0± 1,00* 207,3±3,13*

Пустырника настойка образен 70 ДМП, серия 010119 56,5±2,50* 233,6±5,08*

Пустырника настойка образец 11/35 МДМП 55,5± 1,50* 233,7±2,68*

Примечание: * - отличия от контроля достоверны при p<0t05

По результатам проведенного эксперимента установлено, что референтная настойка валерианы вызывала уменьшение латентного периода сна на 50 % и увеличивала продолжительность сна йа 12 %, а тестируемая настойка уменьшала латентный период сна на 54 %, также увеличивая продолжительность сна на 12 %. Таким образом, было установлено седативное действие для обоих образцов настоек валерианы.

Референтная настойка пустырника вызывала уменьшение латентного периода сна на 55 %, а тестируемая - на 56 %. Оба образца настоек увеличивали продолжительность сна на 27 %, проявляя, таким образом, седативное действие. 3.3. Результаты сравнительного фармакологического изучения настоек боярышника

Результаты изучения нейротропиой активности референтной и тестируемой настоек боярышника на модели «хлоралгидратный сон» представлены в таблице 3.

Таблица 3 - результаты изучения влия»шя настоек боярышника на параметры

сна, вызванного хлоралгидратом

Группы животных п-10 Время латентного периода (секунды) Время сна (минуты)

Контроль, вода очищенная 121,0±4,35 186,6±3,20

Боярышника настойка образец 70 ДМБ, серия 021018 79,0±1,89* 184,8±3,45ф

Боярышника настойка образец 06/35 МДМБ 73,0±3,56* 182,5±335*

По результатам проведенного эксперимента установлено, что референтная настойка боярышника вызывала уменьшение латентного периода сна на 35 %, а тестируемая - на 39 %. На продолжительность сна оба образца настоек влияния не оказывали. Таким образом, тестируемая и референтная настойки боярышника улучшали засыпание опытных животных, оказывая таким образом седативное действие.

4. ОТКЛОНЕНИЯ ОТ ПРОТОКОЛА

В ходе проведения доклинического исследования не было отклонений от протокола, которые могли бы повлиять на качество получаемых результатов.

5. ХРАНЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ДОКЛИНИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Все первичные данные, полученные в эксперименте, заключительный отчет и документация, относящаяся к исследованию, складываются в папку по исследованию и хранятся в архиве лаборатории в течение 5 лет.

6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено сравнительное доклиническое фармакологическое изучение экспериментальных и стандартных (фармакопейных) образцов настоек, полученных из лекарственного растительного сырья, производства ЗАО «ЭКОлаб», Россия.

Показано, что при четырехдневном внутрижелудочном введении стандартных (фармакопейных) и экспериментальных образцов настоек эхинацеи, валерианы, пустырника и боярышника лабораторным животным (мыши-самцы) не установлено различий в их фармакологической активности.

Было показано, что тестируемая настойка календулы обладала более выраженной фармакологической (противовоспалительной) активностью по сравнению с референтной настойкой.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют, что снижение концентрации спирта этилового при производстве экспериментальных настоек эхинацеи, валерианы, пустырника и боярышника не приводит к снижению фармакологической активности, а в случае с настойкой календулы фармакологическая (противовоспалительная) активность увеличивается.

Приложение № 9. Качественные и количественные показатели экспериментальных настоек, полученных

методом мацерации

Номер образца Описание Сухой остаток, % Содержан ие спирта, % Подлинность (химический метод) Подлинность (ТСХ) Содержание целевых БАВ, % Микробиолог ическая чистота

01/70 МБ Прозрачная жидкость красно-коричневого цвета с характерным запахом 1,14 65 Подтверждено наличие флавоноидов Обнаружены зоны на уровне гиперозида, кверцетина и рутина 0,0038 категория 3Б

02/70 МБ 1,10 66 0,0043 категория 3Б

03/70 МБ 1,01 67 0,0042 категория 3Б

04/70 МБ 1,10 67 0,0040 категория 3Б

05/70 МБ 0,98 67 0,0044 категория 3Б

Средние значения 1,07±0,08 66,4±1,0 0,0042±0,0003

01/40 МБ Прозрачная жидкость красно-коричневого цвета с характерным запахом 1,50 36 Подтверждено наличие флавоноидов Обнаружены зоны на уровне гиперозида, кверцетина и рутина 0,0045 категория 3Б

02/40 МБ 1,36 37 0,0039 категория 3Б

03/40 МБ 1,22 37 0,0042 категория 3Б

04/40 МБ 1,26 38 0,0036 категория 3Б

05/40 МБ 1,24 37 0,0034 категория 3Б

Средние значения 1,32±0,13 37,0±0,8 0,0039±0,0005

01/20 МБ Прозрачная жидкость красно-коричневого цвета с характерным запахом 1,18 18 Подтверждено наличие флавоноидов Обнаружены зоны на уровне гиперозида, кверцетина и рутина 0,0054 Не соотв. категории 3Б

02/20 МБ 1,08 18 0,0044

03/20 МБ 1,04 17 0,0055

04/20 МБ 1,14 17 0,0051

05/20 МБ 1,14 17 0,0053

Средние значения 1,12±0,06 17,4±0,6 0,0051±0,0005

01/70 МП прозрачная жидкость зеленовато-коричневого цвета со слабым характерным запахом 1,68 66 Подтверждено наличие флавоноидов и фенольных соединений Обнаружены зоны с Rf около 0,2 и 0,9 0,024 категория 3Б

02/70 МП 1,50 66 0,021 категория 3Б

03/70 МП 1,44 66 0,023 категория 3Б

04/70 МП 1,42 66 0,022 категория 3Б

05/70 МП 1,54 65 0,021 категория 3Б

Средние значения 1,52±0,11 65,8±0,5 0,0222±0,0011

01/40 МП прозрачная жидкость темно-коричневого с зеленоватым оттенком цвета со слабым характерным запахом 1,55 36 Подтверждено наличие флавоноидов и фенольных соединений Обнаружены зоны с Rf около 0,2 и 0,9 0,021 категория 3Б

02/40 МП 1,49 36 0,024 категория 3Б

03/40 МП 1,46 37 0,021 категория 3Б

04/40 МП 1,56 36 0,020 категория 3Б

05/40 МП 1,14 37 0,015 категория 3Б

Средние значения 1,44±0,19 36,4±0,6 0,0202±0,0041

01/20 МП прозрачная жидкость 1,54 17 Подтверждено Обнаружены зоны с 0,019 Не соотв.

Номер образца Описание Сухой остаток, % Содержан ие спирта, % Подлинность (химический метод) Подлинность (ТСХ) Содержание целевых БАВ, % Микробиолог ическая чистота

02/20 МП темно-коричневого с зеленоватым оттенком цвета со слабым характерным запахом 1,55 16 наличие флавоноидов и фенольных соединений Rf около 0,2 и 0,9 0,021 категории 3Б

03/20 МП 1,54 16 0,025

04/20 МП 1,49 17 0,022

05/20 МП 1,48 17 0,023

Средние значения 1,52±0,04 16,6±0,6 0,0220±0,0025

01/70 МК прозрачная жидкость желтовато-коричневого цвета со специфическим запахом 2,47 67 Подтверждено наличие флавоноидов и фенольных соединений Обнаружены зоны на уровне кафтаровой и хлорогеновой кислот, рутина 0,069 категория 2

02/70 МК 2,31 66 0,065 категория 2

03/70 МК 2,44 67 0,063 категория 2

04/70 МК 2,31 67 0,066 категория 2

05/70 МК 2,22 65 0,061 категория 2

Средние значения 2,35±0,11 66,4±1,0 0,0648±0,0034

01/40 МК прозрачная жидкость желтовато-коричневого цвета со специфическим запахом 2,11 36 Подтверждено наличие флавоноидов и фенольных соединений Обнаружены зоны на уровне кафтаровой и хлорогеновой кислот, рутина 0,051 категория 2

02/40 МК 2,31 37 0,049 категория 2

03/40 МК 2,26 37 0,052 категория 2

04/40 МК 2,27 38 0,052 категория 2

05/40 МК 2,29 37 0,050 категория 2

Средние значения 2,25±0,09 37,0±0,8 0,0508±0,0014

01/20 МК прозрачная жидкость желтовато-коричневого цвета со специфическим запахом 2,22 18 Подтверждено наличие флавоноидов и фенольных соединений Обнаружены зоны на уровне кафтаровой и хлорогеновой кислот, рутина 0,050 Не соотв. категории 2

02/20 МК 2,24 18 0,051

03/20 МК 2,11 17 0,049

04/20 МК 2,23 17 0,048

05/20 МК 2,22 17 0,049

Средние значения 2,20±0,06 17,4±0,6 0,0494±0,0013

01/70 МВ прозрачная жидкость красно-коричневого цвета характерного ароматного запаха 3,82 68 Подтверждено наличие сложных эфиров карбоновых кислот Обнаружены зоны с ЯГ 0,44-0,54 и 0,640,9 0,51 категория 3Б

02/70 МВ 3,38 68 0,52 категория 3Б

03/70 МВ 3,30 67 0,42 категория 3Б

04/70 МВ 3,20 69 0,43 категория 3Б

05/70 МВ 3,00 68 0,51 категория 3Б

Средние значения 3,34±0,34 68,0±0,8 0,478±0,054

01/40 МВ прозрачная жидкость красно-коричневого цвета характерного ароматного запаха 4,70 38 Подтверждено наличие сложных эфиров карбоновых кислот Обнаружены зоны с ЯГ 0,44-0,54 и 0,640,9 0,42 категория 3Б

02/40 МВ 4,32 38 0,28 категория 3Б

03/40 МВ 4,28 38 0,31 категория 3Б

04/40 МВ 4,12 37 0,34 категория 3Б

05/40 МВ 4,40 38 0,32 категория 3Б

Номер образца Описание Сухой остаток, % Содержан ие спирта, % Подлинность (химический метод) Подлинность (ТСХ) Содержание целевых БАВ, % Микробиолог ическая чистота

Средние значения 4,36±0,24 37,8±0,5 0,334±0,059

01/20 МВ прозрачная жидкость красно-коричневого цвета характерного ароматного запаха 4,52 19 Подтверждено наличие сложных эфиров карбоновых кислот Обнаружены зоны с ЯГ 0,44-0,54 и 0,640,9 0,27 Не соотв. категории 3Б

02/20 МВ 4,62 18 0,21

03/20 МВ 4,67 17 0,25

04/20 МВ 4,47 17 0,23

05/20 МВ 4,21 17 0,21

Средние значения 4,50±0,20 17,6±1,0 0,234±0,029

01/90 ММ прозрачная жидкость светло-зеленого цвета с характерным запахом 0,47 83 Обнаружена зона на уровне ментола 3,04 категория 3Б

02/90 ММ 0,51 84 2,92 категория 3Б

03/90 ММ 0,53 83 3,01 категория 3Б

04/90 ММ 0,51 83 3,00 категория 3Б

05/90 ММ 0,49 84 3,03 категория 3Б

Средние значения 0,50±0,03 83,4±0,6 3,000±0,053

01/60 ММ прозрачная жидкость темно-зеленого цвета с характерным запахом 0,81 52 Обнаружена зона на уровне ментола 3,03 категория 3Б

02/60 ММ 0,83 53 2,99 категория 3Б

03/60 ММ 0,77 51 2,97 категория 3Б

04/60 ММ 0,82 53 2,99 категория 3Б

05/60 ММ 0,78 53 2,95 категория 3Б

Средние значения 0,80±0,03 52,4±1,0 2,986±0,033

01/40 МЭ Прозрачная жидкость желтовато-коричневого цвета 2,36 36 Подтверждено наличие фенольных соединений Обнаружены зоны с Rf около 0,09, 0,15, 0,45 и 0,75 0,24 категория 3Б

02/40 МЭ 2,47 36 0,22 категория 3Б

03/40 МЭ 2,55 37 0,23 категория 3Б

04/40 МЭ 2,39 36 0,24 категория 3Б

05/40 МЭ 2,45 36 0,22 категория 3Б

Средние значения 2,44±0,08 36,2±0,5 0,222±0,009

01/20 МЭ Прозрачная жидкость желтовато-коричневого цвета 2,50 16 Подтверждено наличие фенольных соединений Обнаружены зоны с Rf около 0,09, 0,15, 0,45 и 0,75 0,22 Не соотв. категории 3Б

02/20 МЭ 2,52 16 0,21

03/20 МЭ 2,55 15 0,23

04/20 МЭ 2,57 16 0,24

05/20 МЭ 2,54 16 0,22

Средние значения 2,54±0,03 15,8±0,5 0,220±0,006

Приложение № 10. Микробиологические показатели экспериментальных настоек, полученных методом мацерации

Номер образца Общее число аэробных бактерий < 104 в 1 мл. Общее число грибов < 102 в 1 мл. Энтеробактерий и некоторых других грамотрицательных бактерий < 102 в 1 мл Отсутствие Escherichia coli в 1 мл Отсутствие Salmonella в 10 мл Отсутствие Stafylococcus aureus в 1 мл

01/70 МБ 1100 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

02/70 МБ 1100 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

03/70 МБ 1300 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

04/70 МБ 1200 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

05/70 МБ 1300 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

01/40 МБ 7000 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

02/40 МБ 5800 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

03/40 МБ 8000 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

04/40 МБ 7500 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

05/40 МБ 8100 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

01/20 МБ 14000 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

02/20 МБ 12000 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

03/20 МБ 11800 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

04/20 МБ 13100 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

05/20 МБ 12700 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

01/70 МП 1700 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

02/70 МП 1800 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

03/70 МП 1700 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

04/70 МП 1900 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

05/70 МП 1800 До 10 До 10 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

01/40 МП 5300 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

02/40 МП 6200 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

03/40 МП 6800 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

04/40 МП 5700 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют

05/40 МП 5900 До 10 До 100 отсутствуют отсутствуют отсутствуют