Совершенствование клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантного типа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.05, кандидат сельскохозяйственных наук Райков, Игорь Александрович

• Райков, Игорь Александрович
• кандидат сельскохозяйственных наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат сельскохозяйственных наук Райков, Игорь Александрович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА

Место проведения и объекты исследования

Методы исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Введение в культуру in vitro смородины чёрной

3.1.1 Контаминация первичных эксплантов сопрафитной микрофлорой

3.2. Влияние ИМК и ГК на регенерационный потенциал первичных эксплантов растений смородины чёрной

3.3. Этап размножения растений смородины in vitro

3.4. Адаптация к среде размножения

3.5. Особенности клонального микроразмножения растений смородины чёрной в зависимости от генотипа и применяемого цитокинина

3.6. Влияние минерального состава питательных сред на рост и развитие растений малины в культуре in vitro

3.7. Влияние кислотности питательной среды на пролиферацию дополнительных побегов малины ремонтантной

3.8. Андроклиния малины ремонтантной

3.9. Особенности ризогенеза растений малины в песке

3.10. Совмещение процессов ризогенеза и адаптация растений к нестерильным условиям выращивания

ВЫВОДЫ

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И СЕЛЕКЦИИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

6-БАП - 6-бензиламинопурин ГК - гибберелловая кислота ИМК - индолилмасляная кислота ИУК - индолилуксусная кислота СРРи - N-(2 хлор-4-пиридил)-Ы-фенилмочевина - тидиазурон

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Совершенствование клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантного типа»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследований. Ягодные культуры - одни из основных источников поступления биологически активных веществ (витаминов, ферментов, минеральных солей и др.). В организме человека благодаря этим компонентам повышается иммунитет к различным заболеваниям, обеспечивается высокая работоспособность и долголетие людей. Особая роль принадлежит витаминам, которые регулируют обмен веществ в организме. Новейшие исследования в области молекулярной биологии свидетельствуют, что причина большинства человеческих болезней связана с нехваткой витаминов. Установлено, что 70% населения России страдает авитаминозом и нарушением многих физиологических процессов.

В условиях ухудшения климата, участившихся вспышек развития грибных болезней и вредителей, возросших требований к качеству продукции растениеводства возникает острая необходимость в проведении масштабной селекционной работы с целью создания сортов, отвечающих современным стандартам.

Создание ягодных растений очень длительный и сложный процесс. От начала селекционной работы до внедрения нового сорта в производство может пройти несколько десятилетий. Период селекционной работы у ягодных культур от гибридизации до передачи сорта в государственное сортоиспытание длится 10-15 и более лет. При этом не учитывается время на дальнейшее размножение этих сортов в питомнике, откуда они должны поступить к потребителю. Ещё более длительным оказывается путь создания сортов с использованием межвидовой гибридизации, нередко необходимой для радикального совершенствования исходного материала.

В реализации генетического потенциала ягодных растений важная роль отводится методам биотехнологии, которые существенно ускоряют селекционный процесс. Метод размножения растений с использованием техники культуры изолированных тканей позволяет полнее всего реализовать потенциал растительного организма к размножению.

Клональное микроразмножение в сочетании с термо- и хемотерапией нашло широкое применение в системе производства оздоровленного посадочного материла плодово-ягодных, культур. В настоящее время во многих селекционных программах этот метод рутинно используется для ускоренного размножения ценных генотипов (Hall, 2009). Особенно актуально этот способ использовать для растений, обладающих низким коэффициентом размножения традиционными способами, например, ремонтантных форм малины.

Важным условием клонального микроразмножения является использование объектов и методологических подходов, полностью сохраняющих генетическую стабильность размножаемых сортов на всех этапах процесса от эксплантата до растений в поле.

На Кокинском опорном пункте ВСТИСП и кафедре плодоовощеводст-ва Брянской госсельхозакадемии ведется активная работа по созданию новых высокопродуктивных сортов ягодных культур. Наши исследования являются составной частью этой работы.

Цель исследования. Провести оптимизацию методов клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантной в соответствии с их генотипическими особенностями. Решались следующие задачи:

1. Оценить действия цитокининов различной природы на пролиферацию микропобегов из первичных эксплантов смородины чёрной при введение в культуру in vitro.

2. Оптимизировать условия клонального микроразмножения применительно к генотипическим особенностям межвидовых сортов и элитных форм растений смородины чёрной

3. Изучить влияние минерального состава питательных сред на рост и развитие растений малины ремонтантной в культуре in vitro.

4. Оптимизировать процессы ризогенеза и адаптации пробирочных растений к нестерильным условиям выращивания.

Научная новизна и практическая значимость. Определены оптимальные концентрации регуляторов роста при клональном микроразмножении растений смородины чёрной, доказана эффективность производных ди-фенилмочевины при введении в культуру первичных эксплантов. Изучено влияние минерального состава и кислотности питательной среды на процессы пролиферации побегов малины ремонтантной. Оптимизированы условия культивирования и адаптации растений к нестерильным условиям выращивания.

Усовершенствованная методика клонального микроразмножения межвидовых форм смородины чёрной и малины ремонтантного типа позволяет быстро тиражировать их для использования в селекции и производстве. Положения выносимые на защиту.

• Оптимизированные концентрации регуляторов роста на этапе введения в культуру in vitro смородины чёрной.

• Минеральный состав питательных сред при введении в культуру in vitro растений ремонтантной малины.

• Ускорение процессов ризогенеза и адаптации растений к нестерильным условиям.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на заседаниях кафедры плодоовощеводства, технологии хранения и переработки продукции растениеводства Брянской госсельхозакадемии, а также на научных конференциях: Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Рязань, 2009); VI, VII, VIII Международных научных конференциях «Агроэкологические аспекты устойчивого развития АПК» (Брянск, 2009, 2010, 2011); Всероссийском инновационном форуме аграрной молодежи (Орел, 2010); Международной научной конференции «Биологизация земледелия в Нечерноземной зоне России» (Брянск, 2010); Международных научно-практических конференциях «Современная биотехнология: фундаментальные проблемы, инновационные проекты и био-нанотехнология» (Брянск, 2010); «Пути повышения устойчивости растение-

водства к негативным природным и техногенным воздействиям» (Орел, 2011); "Использование биотехнологических методов и регуляторов роста в садоводстве" (Москва, 2011), научных чтениях, посвященным выдающимся ученым академику Николаю Ивановичу Вавилову и селекционеру Константину Ивановичу Саввичеву (Брянск, 2011).

Результаты исследований были отмечены дипломами победителя Всероссийского конкурса научных работ студентов, аспирантов и молодых учёных аграрных вузов (Брянск, 2010, Краснодар, 2010, Курск, 2011, Орел, 2011), а также поддержаны грантами: «Участник молодежного научно-инновационного конкурса» («У.М.Н.И.К.») в 2009 г. и «Молодые новаторы аграрной России» по номинации «Агрономия» 2010 г.

Личное участие автора в получении научных результатов. Научные результаты, изложенные в диссертации, получены соискателем самостоятельно. Участвовал в разработке программы исследований, выбора методов ее выполнения, подборе исходного материала, обсуждении результатов исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликованы 12 печатных работ, в том числе две в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах компьютерного текста и состоит из введения, трех глав, выводов и рекомендаций для производства и селекции. Работа содержит 22 таблицы и 27 рисунков. Список использованной литературы включает 163 наименований, в том числе 52 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ПРИМЕНЕНИЕ МЕТОДОВ БИОТЕХНОЛОГИИ В СЕЛЕКЦИИ ПЛОДОВО-ЯГОДНЫХ РАСТЕНИЙ

(обзор литературы)

Важнейшим звеном комплексной системы производства ягодной продукции является сорт. Установлено, что вклад сорта в повышении величины и качества урожая может достигать 50-80%, и что роль селекционного улучшения растений будет непрерывно возрастать (Жученко, 2003).

Сортом у плодовых и ягодных культур принято называть вегетативное потомство от одного растения, которое характеризуется одинаковым генотипом. Этот генотип стабилен многие годы, а проявление спонтанных мутаций происходит редко. В отличие от растений, размножающихся семенами, сорта плодовых культур не могут быть самовоспроизводящейся системой, способной воспроизводить себя семенами. Природные и генетические различия сорта у этих двух групп растений приводит к различиям в технологии их выведения (Кичина, 2011).

Одной из основных предпосылок увеличения продуктивности ягодных насаждений является производство сертифицированного, чистосортного, свободного от комплекса наиболее опасных вредителей и болезней посадочного материала. Для быстрого и эффективного размножения плодовых и ягодных растений закладывают маточные насаждения, которые при использовании определенных приёмов должны обеспечить достаточно большое количество черенков или отводков (Еремин, 2004).

Значительно тормозит селекционный процесс и внедрение новых сортов в производство ограниченная способность растений к вегетативному размножению. Размножение единичного растение до необходимого для изучения и последующей передачи в государственное сортоиспытание количества может занимать несколько лет.

Существенно ускорить процесс селекции ягодных растений можно используя методы биотехнологии, которые Р. Г. Бутенко условно разделила на две группы:

> облегчающие и ускоряющие традиционный процесс, т.е. технологии, которые не подменяют селекционный процесс, а служат ему;

> создающие генетическое разнообразие и скрининг генотипов с ценными признаками - это самостоятельные от обычной селекции технологии.

К первой группе технологий относят: оплодотворение in vitro, эмбрио-культуру, регенерацию растений из тканей летальных гибридов, получение гаплоидных растений путем андрогенеза и гиногенеза, клональное микроразмножение растений, криосохранение генофонда. Во вторую группу входят следующие клеточные технологии: индукция сомаклональных вариантов, клеточная и тканевая селекция на устойчивость к стрессам, культура протопластов и соматическая гибридизация (Бутенко, 1964; Артамонов, 1989).

Наиболее ранними работами, в которых сделаны первые успехи по выращиванию изолированных от растения тканей, были исследования, проведенные немецкими учеными Н. Vochting, С. Rechinger, G. Haberlandt в период с 1892 по 1902 годы.

Н. Vochting делил растения на мелкие части и культивировал их в растворе сахарозы для изучения явления полярности. Он показал, что полярность - это свойство, присуще каждому фрагменту ткани независимо от его размера, в том числе и отдельным клеткам растений. С. Rechinger поставил опыты по определению «минимального предела» делимости растительных тканей. Помещая сегменты стеблей ясеня и тополя, корней свеклы и турнепса на поверхность влажного песка без соблюдений условий асептики он пришел к заключению, что ткани размером менее 20 мм иногда были способны продуцировать каллус и даже почки. С уменьшением толщины среза эта способность падала, а экспланты тоньше 1,5 мм не росли (Расторгуев, 2009).

Эксперименты в области культивирования соматических тканей привели к разработке принципиально новых методов размножения - клонального микроразмножения.

Метод клонального микроразмножения растений имеет ряд преимуществ перед общепринятыми методами размножения растений (Бутенко, 1979, Еремин, 2004, Шевелуха, 1998):

получение генетически однородного материала; сокращение продолжительности селекционного периода; ^ ускорение перехода от ювенильной к репродуктивной фазе развития; ^ высокий коэффициент размножения (сотни тысяч растений от одной

меристемы); ^ освобождение растений от вирусов;

^ размножение растений, трудно размножаемых традиционными способами;

^ возможность проведения работ в течение круглого года и экономия площадей, необходимых для выращивания посадочного материала; возможность автоматизации процесса выращивания Выделяют несколько типов клонального микроразмножения:

1) размножение пазушными побегами при различных способах снятия апикального доминирования - путем простого черенкования (удаления верхушки), применения повышенных концентраций цитокинина или ингибиторов транспорта ауксинов;

2) размножение путем образования адвентивных почек, побегов или эмбриондов непосредственно в тканях эксплантов. Вариантом этого типа размножения является также закладка микроклубней и микролуковичек;

3) регенерация растений из каллусной или суспензионной культур путем образования стеблевых почек или эмбриоидов.

Основой методов культуры изолированных клеток и тканей растений является тотипотентность растительных клеток. Под тотипотентностью подразумевается уникальная способность растительной клетки при определенных условиях вторично дифференцироватся и под влиянием внешних факторов выбирать путь морфогенеза (Бутенко, 1964; Бурдасов, 1998).

Морфогенез является сложным процессом, который регулируется на клеточном, тканевом и организменном уровнях. В нем принимают участия взаимозависимые факторы, определяющие процессы деления, растяжения,

дифференциации, старения и гибели клеток. В ходе морфогенеза возникают сформированные заново ткани и органы (Бутенко, 1999).

Способ размножения растений пазушными побегами основан на снятии апикального доминирования. Этот метод широко используется при промышленном производстве посадочного материала некоторых культур и является наиболее надежным в отношении размножения плодовых и ягодных культур (Высоцкий, 1989).

Снятие апикального доминирования позволяет добиться активации роста пазушных меристем. Это может быть достигнуто двумя путями:

> удалением верхушки стебля и последующим микрочеренкованием побега in vitro;

> добавлением в питательную среду веществ цитокининового типа действия, индуцирующих развитие пазушных побегов: 6-бензиламинопурин (6-БАП), 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также 2-изопентиладенин (2ip) и зеатин (Бутенко, 1964).

Второй тип микроразмножения связан с образованием адвентивных почек и побегов. Регенерация придаточных побегов на изолированных органах может быть получена in vitro у многих растений.

Процесс образования адвентивных почек, как правило, происходит на питательных средах, содержащих один цитокинин или в сочетании с ауксином. Вид, количество и соотношение гормонов в среде для регенерации зависит от генотипа растения (Жуков, 1996).

Третий тип размножения связан с каллусной культурой. Быстро размножающиеся неорганизованные массы клеток, называемые каллусами, могут быть получены из эксплантов любой части растения и затем независимо культивироваться in vitro путем последовательных пересадок (Джонс, 1987).

Концентрации гормонов, наиболее благоприятные для образования каллуса, варьируют в зависимости от вида растения и используемого органа, однако в основном они выше, чем необходимые для образования побегов непосредственно на экспланте (Хасси, 1987).

В процессе культивирования каллусной ткани появляется возможность, вводя в питательную среду селективные агенты, быстро отобрать спонтанные или индуцированные мутации, и уже на стадии недифференцированных клеток вести отбор на интересующие признаки. Этот метод размножения целесообразно применять лишь к тем растениям, у которых регенеранты полученные из каллусной ткани обладают генетической стабильностью, вариабельность между которыми не превышает уровня естественной изменчивости (Высоцкий, 1983).

Снижением концентрации гормонов или изменением соотношения ауксина и цитокинина каллусы можно индуцировать к регенерации растений через образование придаточных побегов или соматических зародышей, обычно называемых эмбриоидами. Регенерировавшие побеги могут быть укоренены, а эмбриоиды выращены в полноценные растения на среде без регуляторов роста. Концентрация гормонов, необходимых для органогенеза, для каждого вида определяется эмпирически (Шевелуха, 1998).

Методика размножения растений пазушными побегами может быть пригодна для любого растения, продуцирующего нормальные пазушные побеги и реагирующего на экзогенный цитокинин. В настоящее время таким путем размножают многие сельскохозяйственные культуры, в т.ч. и плодово-ягодные такие, как земляника, яблоня, груша, вишня, слива, смородина, виноград, ирга, малина (Дорошенко, 1989; Высоцкий, 1995; Михальчик, 1995; Вовк, 1997; Колбанова, 2005).

Несмотря на то, что методика культивирования изолированных меристем разработана достаточно, применительно к большому числу видов растений, на практике, воспроизводимость результатов весьма низка, а размножение многих видов растений в условиях in vitro остается в лабораторной стадии. При размножении in vitro индивидуальная реакция генотипов проявляется значительно сильнее, чем при традиционных способах размножения. Поэтому приходится подбирать условия культивирования не только в зависимости от вида, но и сорта (Матушкина, 2001).

Доказано, что травянистые двудольные растения обладают большим морфогенетическим потенциалом. Они обладают более выраженной способность к образованию адвентивных почек, росту побегов, укоренению и, в конечном итоге, получению более высокого коэффициента размножения, чем ткани и органы однодольных травянистых и, тем более, древесных растений (Hussey, 1976).

Экспланты у растений разных сортов одного и того же вида часто проявляют неодинаковую реакцию на вводимые в питательную среду регуляторы роста. Возможно, это в какой-то мере зависит от содержания эндогенных ростовых веществ, содержание которых является генетически обусловленным признаком вида или сорта (Высоцкий, 1979; Туровская 1987; Попов, 1990).

При культивировании ягодных растений в условиях in vitro используют разные питательные среды. Наиболее распространенной является среда Му-расиге и Скуга (T.Murashige & F.Skoog, 1962). Меньшей популярностью пользуются среды Андерсона, Уайта, Ли-Фоссарда, Гамборга, Нича, Лойда-Маккауна. Reed при культивирование трудноразмножаемых генотипов малины удалось добиться лучшей пролиферации побегов на среде Андерсона (Reed, 1991).

Сравнивая питательные среды Мурасиге и Скуга, Ли-Фоссарда и Андерсона при культивировании растений смородины красной Колбанова отмечает низкий регенерационный потенциал на среде Ли-Фоссарда. Среда Андерсона не подходит для культивирования растений смородины красной, а оптимальный минеральный состав имеет питательная среда Мурасиге и Скуга (Колбанова, 2005).

При клональном микроразмножении важную роль в росте растений играют окружающие условия в пределах культурального сосуда. Обычно абиотическими факторами in vitro нельзя управлять прямо, вместо этого стабилизируют условия культивирования вне сосуда. В процессе культивирования окружающие условия в сосуде могут изменяться, поскольку растущее растения ока-

зывает на них воздействие. Показано, что у культивируемых растений была фотосинтетическая возможность, но окружающие условия ограничивали интенсивность фотосинтеза (Kubota, 2001).

Культуральный сосуд - это система для выращивания растений в асептических условиях. Обычно, сосуды для культивирования сделаны из стекла или прозрачного пластика, которые пропускают свет. В этом смысле сосуды культуры тканей можно рассмотреть как миниатюрные оранжереи. Различие между ними состоит в том, что оранжереи оборудованы системами для управления абиотическими факторами культивирования а, сосуды культуры тканей нет (Kozai, 2005).

Пробирочные растения, несмотря на культивирование в искусственных условиях реагируют на смену времени года. Летом и осенью растения ежевики и малины чёрной характеризовались наиболее низкой способностью к пролиферации побегов, тогда как зимой и особенно весной число новообразований возрастало. Период покоя у растений обуславливается генетически, однако при культивировании in vitro он часто отсутствует или слабо выражен (Упадышев, 1995).

В сосудах для культивирования ограничено движение воздуха, в связи, с чем могут возникнуть градиенты по влажности и/или концентрации углекислого газа в пределах сосуда. Кроме того в узких сосудах имеет место вертикальное распределение силы света. Выбор сосуда для культивирования также важен для управления контаминацией: чем больше сосуд, тем больше число растений, которые потеряны с каждым попавшим загрязнителем. Следовательно, использование более крупных сосудов обычно требует ультрачистых лабораторий (Хасси, 1987).

При обработке культивируемых растений лазером и электромагнитным полем сверхвысокой частоты в растительных тканях повышается активность обменных процессов в 2-6 раз. При этом в значительной степени улучшается их регенерационная способность. Лазерная стимуляция иммунных процессов может поддерживаться длительное время после прекращения действия низ-

коинтенсивного когерентного излучения. В работе по изучению сохранности плодов было показано, что величина относительного эффекта не только не уменьшалась с течением времени, но, наоборот, существенно возрастала на фоне снижения защитного потенциала необлучённых плодов (Будаговский, 1989; Дорошенко, 1998).

Получены обнадеживающие экспериментальные данные по дистанционной передаче морфогенетической информации в культуре растительных тканей посредством когеррентного излучения. Возможно, что проекция голограммы экспланта с более высоким морфогенетическим потенциалом на каллусную ткань с более низким потенциалом будет одним из универсальных методов индукции морфогенеза (Тюленев, 1996).

В экспериментах с плодовыми растениями был обнаружен эффект го-лографической индукции морфогенеза. Их каллусные ткани в культуре in vitro плохо регенерируют даже при содержании в питательной среде необходимых гормонов. Сам каллус, несмотря на тотипотентность редко переходит к процессам дифференцировки. В вариантах с лазерным облучение количество регенерантов более чем в 7 раз превосходило контрольные варианты (Будаговский, 2008).

Температурный фактор оказывает значительное влияние на рост и развитие изолированных тканей растений, способствуя активации метаболических процессов. Для большинства растительных тканей температурный оптимум составляет 23-25°С (Хасси, 1987). Однако существуют различия между растениями в отношении их требований к температуре. Так, растения средних широт лучше развиваются при 20°С, а для тропических культур температурный оптимум культивирования приближается к 30°С (Fonnesbech & Fonnesbech, 1980). Следовательно, для успешного роста и развития растений в культуре in vitro необходимо индивидуально подбирать условия каждому виду с учетом его естественного ареала произрастания.

Следует учесть, что используемые приёмы и методы культуры ткани, состав питательных сред, а так же условия культивирования не должны приводить к появлению сомаклональных вариаций (Кунах, 1997).

Проявление клоновой изменчивости имеет много причин. Их можно разделить на две категории:

• кратковременные изменения в развитии, так называемые эпигенетические эффекты;

• генетические изменения, возникающие в результате мутаций и хромосомных нарушений (Хасси, 1987).

Многочисленные исследования показали, что растения земляники после клонального микроразмножения обладают повышенной продуктивностью на 62-100% при использовании их для производства рассады в питомниках (Swartz, 1981; Долгих, 1988). В то же время в зависимости от условий культивирования они могут иметь более мелкую или более крупную ягоду по сравнению с исходным сортом. При наблюдении за ростом 4000 растений малины сорта Шенеманн, размноженных методом культуры тканей, обнаружено 24 растения с мелкими деформированными плодами (Feucht, 1985).

Основными факторами, влияющими на генетическую стабильность растений в культуре in vitro, являются:

S - метод, используемый при регенерации растений;

S - генетическая гетерогенность соматических клеток экспланта;

S - тип и концентрации используемых регуляторов роста;

•S - источник экспланта;

•S - количество проведенных субкультивирований;

S - генотип растения (Pierik, 1987; Кагр, 1995; Высоцкий, 1995).

У некоторых корнесобственных растений яблони, полученных методом микроразмножения, отмечено удлинение главного стебля, уменьшение числа ветвей и размера кроны (Nemeth, 1986).

Помимо эпигенетических изменений возможно появление более серьезных генетических. Спонтанные мутации происходят у всех культурных

растений. Проявление этих нарушений нежелательно для культурных растений и при обычном размножении легко выявляются экземпляры, в котором произошла мутация. Однако при размножении in vitro мутировавшие побеги могут остаться незамеченными; изменение таких признаков, как форма листьев, окраска цветка или качество плодов, могут быть выявлены только после того, как растение высажено в грунт. Чем раньше в процессе размножения произойдет мутация, тем выше будет содержание мутантных побегов (Хасси, 1987).

Фенотипическую и генетическую вариабельность получаемого растительного материала зачастую обусловливает число субкультивирований (Огольцова, 1988). Для нивелирования этого фактора некоторые исследователи считают необходимым ограничивать число субкультивирований и использовать по возможности большее количество исходного материала (Schimmelpfend, 1983; Swartz, 1986).

Фитогормоны могут стимулировать образование полиплоидных и генетических изменений. Антивирусные препараты, применяемые в культуре in vitro, так же могут способствовать появлению генетических нарушений, как это было показано на примере Arabidopsis thaliana (Schimmelpfend, 1983; Бе-лошапкина, 1987; Огольцова, 1988; Шевелуха, 1998).

Для снижения частоты появления в процессе клонального микроразмножения измененных форм плодово-ягодных культур и их своевременного выявления следует: использовать молодые ткани растений, применять модель размножения на основе пролиферации пазушных меристем; избегать применения сред, стимулирующих образование каллусной ткани; в процессе культивирования удалять все почки каллусного происхождения; вести размножение по отдельным мериклонам для облегчения контроля над происхождением растений; регулярно обновлять исходные культуры (Шамина, 1967; Высоцкий, 1995).

Иногда в культуре in vitro можно наблюдать эффект гипероводненно-сти (ветрификации) это физиологическое состояние в котором растительные ткани кажутся пропитанными водой. Такие ткани испытывают недостаток в хлорофилле и становятся хрупкими и прозрачными. Характерной особенно-

стью гипероводненных растений является быстрый и ненормальный рост, короткие междоузлия, потеря кутикулы, чрезмерный синтез этилена и быстрое старение и гибель. Появление гипероводненности зависит от типа и концентрации агар-агара и цитокинина в питательной среде. Жидкий агар и высокое содержание цитокинина стимулирует ветрификацию. Химически эту проблему связывают с недостатком лигнина (ТЬапШоп§, 1983).

Биологические исследования показывают, что в гипероводненных растениях увеличивается активность основных пероксидаз и уменьшается активность кислых, снижается активность фенилаланинаммиаклиазы, что приводит к уменьшению лигнификации. Разнообразие гипотез, связанное с разнообразием объектов, показывает, что пока мало ясности в понимании причин витрификации, а отсюда и способы борьбы с ней имеют сугубо эмпирический характер (Соловых, 1995).

Для устранения эффекта гипероводненности предложено несколько методов, однако, лучший подход - это предотвращение путем использования для индуцирования ростовых процессов минимального количества цитокинина и максимального количества агар-агара в зависимости от потребности растения для оптимального роста. Максимизация воздушного обмена, добавление в среду флороглюцина и холодовая обработка имели восстанавливающий эффект (Ра\¥1ю1а, 1994).

Кислотность питательной среды оказываю влияние на культивируемые растения, определяя доступность элементов питания, а так же влияет на химические реакции, которые проходят в клетках, особенно катализируемые ферментами. Кислые или щелочные среды лимитируют поступление некоторых элементов, например, железа и фосфора, делая их малорастворимыми и этим ограничивая рост растений. В то же время при высокой кислотности большое количество этих элементов переходит в растворенное состояние и оказывают токсичное действие на экспланты. При клональном микроразмножении ягодных растений рН питательной среды доводят до 5,5-5,8 (Ше-велуха, 1998; Муратова, 2008).

Процесс клонального микроразмножения состоит из четырёх последовательных стадий: 1 - введение в культуру in vitro; 2 - массовое размножение; 3 -индукция ризогенеза у образовавшихся растений; 4 - акклиматизация и адаптация к условиям ex vitro (Хасси, 1987; Муратова, 2008).

Введение растений в культуру in vitro. Исходный кусочек растения вводимый в культуру in vitro принято называть эксплантом. Для успешной регенерации первостепенное значение имеет выбор экспланта. При этом предпочтение следует отдавать сильным и здоровым растениям. Для успешной инициализации культуры необходима подготовка исходного материнского растений, которая включает в себя предобработку физическими или химическими факторами для снижение контаминации, что способствует лучшему развитию эксплантов in vitro (Колбанова, 2009). Некоторые авторы предлагают ввести нулевой этап в методику размножения растений in vitro, предусматривающий выращивание маточных форм в строго контролируемых условиях (Debergh &Маепе, 1981; Шевелуха, 1998).

К контаминирующим объектам прежде всего относят бактерии и грибы найденные в пределах экспланта или в лаборатории. К источникам загрязнения в лаборатории относят лабораторный воздух, твердые поверхности, людей и неправильно приготовленную питательную среду (Хасси, 1987).

При введении растений в культуру необходимо удалить микроорганизмы с поверхности эксплантов. Для освобождение эксплантов от конта-минирующих агентов используют различные стерилизующие вещества. Растворы 0,1% сулемы и 0,01% мертиолята применяют с экспозицией 3-4 минуты. Диацид в концентрации 0,1% применяют в течение 10 минут. Раствор гапохлорита применяют в концентрации 0,4% с экспозицией 15 минут, 33%-ную перекись водорода используют в течение 10-15 минут. После поверхностной стерилизации экспланты необходимо тщательно промыть в стерильной дистиллированной воде и перенести на стерильную питательную среду (Шевелуха, 1998).

Для снижения инфицированности эксплантов земляники проводят предстерилизационную обработку побегов горячей водой при температуре 48+0,5°С в течение 15-30 минут (Алексеенко, 1998).

Оценку контаминации культуры проводят визуально через 7-8 суток. Иногда для выявления микрофлоры среду обогащают органическими добавками, например, гидролизатом казеина, которые провоцируют развитие сапрофитных микроорганизмов (Lane, 1979; Алексеенко, 1998).

Иногда трудно получить исходную стерильную культуру экспланта. Контаминация первичных эксплантов сопрафитной микрофлорой может выявляться даже после нескольких пассажей. По-видимому, это связано с проникновением микроорганизмов в ткани растения. Для подавления сопрафитной микрофлоры рекомендуют вводить в состав питательной среды антибиотики (тетрациклин, бензилпеницилин и др.) в концентрации 100-200 мг/л. Наиболее актуально это у древесных растений, которые вследствие особенностей сосудистой системы склонны к накоплению внутренней инфекции. Эти антибиотйки разрушаются при высокой температуре, поэтому их стерилизуют фильтрованием и вводят в стерильную питательную среду (Franclet, 1979; Jones et al, 1979).

Основным показателем эффективности стерилизующего вещества является количество нормально развивающихся эксплантов. Волосевич отмечает, что на получение нормально развивающейся меристемы влияют сортовая принадлежность, вид стерилизатора, а так же оба фактора вместе. Наименьший процент инфицированных эксплантов был получен при использовании 0,1%-ной сулемы, однако она оказывает жесткое воздействие на растительные ткани. На эксплантах появляются некротические пятна (Волосевич, 2006).

Введение в культуру in vitro эксплантов большого размера резко сокращает длительность этапа инициализации культуры, а так же уменьшает затраты труда и времени на проведение манипуляций (Колбанова, 1999).

Рост и развития экспланта в культуре in vitro зависит от стадии развития материнского растения. Экспланты, взятые у растений в ювенильной фа-

зе развития обладают большей способностью к пролиферации и последующему ризогенезу побегов по сравнению с эксплантатами взрослых растений (Wareing, 1987).

При выборе срока изоляции эксплантов предпочтений отдается фазам выхода из покоя и активного роста. Наиболее успешная регенерация мери-стематических верхушек у малины наблюдается в период активного роста побегов (март-июнь). При введении в культуру эксплантатов вишни, подвоев яблони и сливы успешное введение эксплантатов было осуществлено, когда в качестве исходного материала использовали покоящиеся почки (Высоцкий, 1989; Туровская, 1990).

Установлено, что при изолировании экспланта в результате травмы активируются ферменты, окисляющие фенолы растений, в особенности поли-фенолоксидаза. В результате интенсивной деятельности этого фермента в тканях плодовых и ягодных культур накапливаются полифенолы в виде гид-ролизованного или конденсированного танина и продукты дальнейшего окисления полифенолов - хиноны. При этом продукты окисления фенолов вызывают потемнения ткани и культуральной среды, а так же ингибируют рост и развитие эксплантов (Атрощенко,1998).

Уменьшить отрицательное воздействие фенольных соединений можно добавлением в питательную среду антиоксидантов. Раздельное применение антиоксидантов не всегда дает желаемый эффект, в связи с тем, что каждый из этих препаратов действует на определенные ферменты, блокируя их и не реагируя на другие ферменты, которые окисляют фенолы растений. Смеси же антиоксидантов обладают большим спектром действия (Атрощенко, 1998).

В качестве антиоксидантов в питательную среду вводят флороглюцин, аскорбиновую кислоту, глютатион, диэтилдитиокарбомат, дитиотриэтол, которые снимают ингибирующее действие фенольных соединений при культивировании первичных эксплантов (Walkey, 1972).

Экспланты некоторых растений обладают высокими концентрациями ингибиторов роста, которые подавляют стимулирующее действие вводимых

в питательную среду экзогенных гормонов. Для снижения негативного действия ингибиторов в питательную среду добавляют активированный уголь, который их адсорбирует. К сожалению, активированный уголь связывает также и гормоны, поэтому такое отсутствие специфичности сужает область его применения при клональном микроразмножении на питательной среде (Негреев, 1990).

Этап размножения растений in vitro. На втором этапе клонального микроразмножения необходимо добиться получения максимального коэффициента размножения, что достигается использованием повышенных концентраций цитокинина в среде. Для большинства культур это 6-БАП в концентрации от 1 до 10 мг/л (Высоцкий, 1996; Шевелуха, 1998; Колбанова, 2005).

Для индукции и поддержания активной пролиферации дополнительных побегов важно правильно выбрать цитокинин и его концентрацию, поскольку цитокинетины при длительном культивировании могут ингибировать рост культуры, а так же препятствовать процессу ризогенеза (Геринг, 1991).

Цитокинины очень эффективно стимулируют прямую или косвенную пролиферацию побегов. Чтобы поддержать рост пазушных почек, и уменьшить доминирование верхушки при клональном микроразмножении в питательную среду на этапе размножения включают один или несколько цитоки-нинов (Расторгуев, 2009).

При клональном размножении некоторых форм косточковых культур совместно с цитокининами в питательную среду иногда вводят трийодбен-зойную кислоту (ТИБК), которая является ингибитором транспорта ауксина, что снижает концентрацию эндогенной ИУК в зоне пазушных почек (Высоцкий, 1985).

Тип и концентрация регуляторов роста воздействуют на возможность пролиферации растений in vitro, так как они играют главную роль в делении клетки, дифференцировании и формообразовании в культурах растительных клеток и тканей. Рост латеральных почек, который ингибируется апикальным доминированием верхушки, может быть увеличен в ответ на экзогенный цитокинин (Бутенко, 1993).

Было обнаружено, что цнтокинины являются эффективными акцепторами свободных радикалов. Формирование активных кислородных радикалов может воздействовать на морфогенез растительных клеток и тканей и замедлять процессы роста и развития растений в условиях in vitro. Обезвреживание активного кислорода играет важную роль в делении клетки. Растительные клетки обладают очень эффективными оборонными системами для устранения неблагоприятного эффекта оксидантного стресса (Marco, 1996).

Тип пуриновых цитокининов был наиболее широко изучен и, как находили, эффективно снимал апикальное доминирование в условиях in vitro распространенных растениях (Kapchina-Toteva et al., 2002; Хапова, 1997; Высоцкий, 1995; Упадышев, 1995).

В 1982 M.S. Мок обнаружил физиологическую активность цитокини-нового типа у TDZ. Первые отчеты описывали поддержание каллуса Phaseolus lunatus L. на питательной среде с содержанием TDZ (Мок, 1982).

Кроме того производные дифенилмочевины, обладающие цитокинино-вым действием демонстрировали явно выраженную высокую активность и проявляли положительное физиологическое воздействие во многих экспериментах по клональному микроразмножению(ТакаЬа81, 1978; Iwamura, 1980; Мок, 1982; Shudo, 1994).

При клональном микроразмножении растений малины ремонтантной рекомендуется в качестве источника цитокинина использовать TDZ в концентрациях 0,05-0,1 мг/л (Вовк, 2000).

На среде, содержащей 6-БАП и TDZ растения некоторых культурных сортов Vitis rotundifolia формировали больше дополнительных побегов, чем на среде, содержащей только один цитокинин. Растения, культивируемые на средах содержащих оба цитокинина, формировали более длинные побеги в сравнении с растениями, культивируемыми с добавлением только TDZ (Shudo, 1994; Лупышева, 2008; Сковородников, 2009).

Дополнение питательной среды для яблони и виноградной лозы тидиа-зуроном (TDZ) или CPPU вызывает улучшение роста пазушных почек

(Gribaudo, 1991). При регенерации в условиях in vitro Pellargonium CPPU и TDZ вызывают соматический эмбриогенез (Mithila, 2001).

Положительное влияние на процесс пролиферации побегов оказало добавление к 6-БАП аденин-сульфата в концентрации 50-100мг/л среды при культивировании клоновых подвоев яблони. Добавление аденин-сульфата ускорило процесс пролиферации в 1,5-2 раза (Туровская, 1994).

Для успешного размножения некоторых растений в питательной среде необходимо присутствие цитокининов совместно с ауксинами. Положительное влияние на вытягивание побегов и стимуляцию ростовых процессов оказывает гибберелловоя кислота (Тюленев, 1990; В.А.Высоцкий, 1996).

Добавление кинетина в питательную среду, содержащую 6-бензиламинопурин приводит к увеличению выхода нормально развитых конгломератов почек и побегов смородины чёрной по сравнению с отдельным применением 6-БАП (Туровская, 1992).

Изменения в темпах роста и развития эксплантов рода Rubus в значительной степени зависит от числа и длительности субкультивирований, а также времени года. Зависимость коэффициента размножения и длинны побегов от числа субкультивирований носит криволинейный характер: первоначально эти показатели возрастают, а затем, после второго пассажа снижаются. Укореняемость побегов повышается с увеличением числа субкультивирований (Упадышев, 1995).

Скорость пролиферации дополнительных побегов при культивировании растений может значительно варьировать. Существенное влияние на коэффициент размножения оказывает питательная среда и генотип. Растения обладающие высоким пролиферационным потенциалом образовывают 5-10 дополнительных побегов в течение 4-8 недель (Высоцкий, 1984; Хасси, 1987).

На пролиферацию дополнительных побегов так же оказывает влияние ориентация побегов на питательной среде. Так, коэффициент размножения у подвоя яблони 62-396, отличающегося низкой побегообразовательной спо-

собностью в культуре in vitro при горизонтальной ориентации на среде образовал в 1,8 раза больше дополнительных побегов (Круглов, 1998).

Одним из лимитирующих факторов при клональном микроразмножение оказывает спектральный состав света и его интенсивность. В качестве источника света обычно используют люминисцентные лампы ЛД-40, ЛБ-40, ЛДЦ-40 излучение которых не велико, а спектральный состав близок к естественному (Высоцкий, 1983).

При культивировании клоновых подвоев яблони было установлено, что использование ламп с повышенным содержанием красного спектра в световом потоке позволяет повысить коэффициент размножения на этапе пролиферации побегов в сравнении с освещением лампами белого света (Бъядовский, 2011).

В опытах по клональному микроразмножению древесных плодовых культур, таких как яблоня, вишня, ирга и слива обнаружена зависимость между коэффициентом размножения и количеством проведенных субкультивирований. Было отмечено увеличение коэффициента размножения к пятому-седьмому пассажу (Howard, 1989; Коронацкий, 1991). Способность побегов индуцировать образование придаточных корней также увеличивалась после нескольких пересадок, причем для одних генотипов улучшение наступало после двух-пяти месяцев субкультивирования (Jones, 1982; Михальчик, 1990; Коронацкий, 1991).

Ризогенез растений в культуре in vitro. В качестве стимулятора ризо-генеза при клональном микроразмножении используют ИМК, ИУК, НУК а так же их комбинации, например НУК с ИМК. Иногда применяют феруло-вую или хлорогеновую кислоты, в некоторых случаях используют флорог-люцин (Бургутин, 1983; Поликарпова, 1984; Леонтьева-Орлова, 1991).

Основной природный представитель ауксинов - 3-индолилуксусная кислота (ИУК). Известно, что ауксин участвует в регуляции таких важных процессов в жизни растений, как деление клеток, рост растяжением клеток осе-

вых органов - стеблей и корней, дифференцирование корневой системы, гра-витропические реакции корня и стебля и многое другое (Полевой, 1989).

Ризогенез представляет собой серию различных биохимических, физиологических и гистологических событий, а место заложения корней влияет на жизнеспособность укорененных растений (Уайт, 1949; Хасси, 1987).

Индукцию корнеобразования проводят двумя основными способами: S выдерживание побегов в течение определенного времени (от нескольких секунд - до 24 часов) в стерильном концентрированном растворе ауксина (20-1000 мг/л) и последующее их культивирование на агари-зованной среде без гормонов (Трушечкин, 1992) или непосредственно в подходящем почвенном субстрате (Anderson, 1978; Lane, 1979); S непосредственное культивирование микропобегов в течение 3-4 недель на питательной среде, содержащей ауксин в невысоких концентрациях (Деменко, Трушечкин, 1983; Упадышев, 1991).

При любых способах индуцирования ризогенеза процесс адвентивного корнеобразования проходит 3 этапа: индукция, инициализация, появление корней за пределами стеблевой части черенка. Продолжительность первых двух этапов 10-15 дней, за этот период предкомпетентные клетки приобретают способность регенерировать меристематические участки, в которых синтезируются корнеспицефические белки (Кефели, 1970).

На процесс ризогинеза in vitro плодовых и ягодных культур оказывает лимитирующее воздействие множество факторов, которые можно подразделить на несколько групп: физические, химические и генотипические. Важное значение в процессах ризогенеза отводят свету, который считают ингибитором корнеобразования. Поэтому процесс индуцирования ризогенеза необходимо проводить в темноте, где происходит усиленное поглощение регулятора роста (Расторгуев, 2004).

Некоторые растения при укоренении на агаризованных средах не образуют корневых волосков, что приводит, в свою очередь, к нарушению погло-

щения воды и минеральных солей. Поэтому целесообразно такие укорененные пробирочные растения в течение недели культивировать на жидкой разбавленной питательной среде, содержащей НУК. В таких условиях корни образуют корневые волоски, которых они были лишены при развитии на твердой питательной среде, и восстанавливают свои функции (Gresshoff, 1977).

Приминение элиситоров эмистима, арахидоновой кислоты и экоста 1/3 обеспечивает высокий процент укоренения микрорастений на этапе ризоге-неза, а арахидоновая кислота способствует росту корней в длину при культивировании растений земляники (Белякова, 2011).

На этапе ризогенеза в питательную среду можно вводить паклобутра-зол, который оказывает положительное воздействие при адаптации растений. Это вещество замедляет рост растений и снимает стимулирующее действие цитокининов (Oliphant, 1995).

Адаптация растений к нестерильным условиям. Основной проблемой при клональном микроразмножении растений in vitro является их последующая адаптация к нестерильным условиям. У растений, выращенных in vitro, плохо развиты проводящие сосуды ксилемы, и устьичный аппарат, а приживаемость в первую очередь зависит от способности растения адаптироваться к низкой влажности. Пробирочные растения лишены эпикутикуляр-ного слоя воска и подвержены очень быстрому обезвоживанию при пересадке в условия ex vitro. Это может привести к гибели адаптируемых растений, в связи с этим выбор условий адаптации имеет первостепенное значение (Высоцкий, 1998).

Перегрузка продуктивностью, крупноплодностью, многоплодностью, слишком ранним вступлением в плодоношение, снижением числа листьев на плод и ряд других поддерживаемых человеком признаков плодового растения, приводит к наглядному снижению адаптации. Исходная устойчивость плодовых растений до повышения их продуктивности справлялась с нагрузкой урожаем на каком-то уровне, а повышение продуктивности почти всегда делает биологические механизмы устойчивости более напряженными в сравнении с исходным сортом (Кичина 2011).

Электронная микроскопия показала нетипичные особенности листьев растений, которые развиваются в культуре in vitro. Часто на листьях наблюдается аномально высокое количество устьиц на единицу площади поверхности (Ргеесе, 1991).

Если укоренение растений происходит в пробирках, адаптацию можно начинать до высадки. Для этого культуральные сосуды заранее открывают. Приживаемость гвоздик достигала 90%, когда емкости оставляли открытыми на протяжении 9 дней в комнате с 50% влажностью. Крышки лучше удалять постепенно в зависимости от влажности воздуха в помещении (Ziv, 1986).

Хорошие результаты были получены при высадке укорененных растений в стерильный ионитный субстрат или перлит на две недели (Катаева, 1984; Тулаева, 1990).

В опытах по культивированию растений малины сортов Аленушка и Метеор было установлено, что оптимальным субстратом для укоренения и адаптации являлся субстрат БИОНА-112, на котором была отмечена высокая приживаемость растений (78-97%), имели объём корневой системы и длину побегов значительно больше или на уровне контроля. Для растений малины сорта Бальзам лучшим являлся БИОНА - перлитный субстрат, на котором растения в 2,3 раза превышали контрольные по длине побегов (Волосевич, 2009).

Использование субстратов, содержащих нейтрализованный верховой торф и свежие стабилизированные обезвоженные осадки городских сточных вод на этапе адаптации пробирочных растений обеспечивают высокую приживаемость растений в нестерильных условиях. Растения, культивируемые на этих субстратах отличаются высокими темпами начального роста, большим приростом, значительной листовой поверхностью (Аладина, 2009).

Индийскими учеными предложен метод для предотвращения быстрого обезвоживания листьев у растений при пересадке в условия ex vitro. Метод заключается в том, что листья в течение всего акклиматизационного периода опрыскиваются 50% водным раствором глицерина или смесью парафина, или жира в диэтиловом эфире в соотношении 1:1 (Шевелуха, 1998).

О.С.Жуковым был предложен транспирационно - аэрационный способ, основанный на постепенном увеличении объема воздуха, используемого растением, что также ускоряет и облегчает адаптацию устьичного аппарата растений к влажности воздуха в культуральном помещении (Жуков, 1998).

Андроклиния. В селекционно-генетической работе с важнейшими сельскохозяйственными растениями, в том числе плодовыми и ягодными, все шире применяются современные биотехнологические методы, к которым относится в частности и андроклиния. В основе этого метода лежит уникальное свойство микроспор или клеток пыльцевого зерна при определенных условиях переключаться в своём развитии с характерного для них гаметофитного пути на принципиально иной - спорофитный путь развития с образованием гаплоидных растений (Maheshwari, 1982; Гапеенко, 1987; Круглова, 1995; Анапиляев, 2000).

Основной интерес к гаплоидам связан с возможностью их использования в качестве посредников для получения гомозиготных растений, образуемых удвоением числа хромосом. В пыльнике содержатся тысячи микроспор, каждая из которых может потенциально дать целое гаплоидное растение.

Гомозиготные растения и линии зерновых и овощных культур используются для получения их гетерозисных гибридов и повышения, тем самым, продуктивности этих культур (Бутенко, 1970).

Использование гаплоидов в экспериментальном мутагенезе эффективно, т.к. гены у них находятся в гемизиготном состоянии, а значит генотип гаплоидных растений - мутантов полностью соответствует их фенотипу, и все индуцированные мутации, таким образом, могут быть подвергнуты скринингу сразу же, в соответствии с наблюдаемым фенотипом.

Гемизиготное состояние гаплоидов способствует проявлению так же и летальных генов, которые у обычных диплоидных форм часто находятся в рецессиве. Такие гаплоидны, как правило, погибают на ранних стадиях развития, а те, которые выживают и растут, имеют, как считают исследователи,

хороший внутренний генный баланс, и поэтому представляют очень ценный материал для селекции (Савельев, 2009).

Многие виды при культивировании пыльников образуют каллусную ткань, в которой затем индуцируется органогенез, и формируются растения. Каллусная ткань может содержать наряду с гаплоидными клетки других уровней плоидности — анеуплоидные, диплоидные, полиплоидные, что может служить дополнительным источником генетической изменчивости в селекции.

В последние годы для целого ряда зерновых и овощных сельскохозяйственных культур (рис, пшеница, кукуруза, картофель, капуста, просо и др.) разработаны условия получения гаплоидов из изолированной пыльцы и пыльников и на их основе созданы новые высокоэффективные сорта этих культур.

У ягодных растений, таких как малина, смородина, земляника, представляющих очень трудный материал для селекционно-генетических исследований, в связи с тем, что они имеют сложную гетерозиготную природу и не могут репродуцироваться из семян, метод быстрого и эффективного получения генетически чистых линий на основе андроклинии пока не разработан. Работы по культуре пыльников плодовых растений проводятся в Германии, Франции, Китае и других странах, но достигнутые результаты весьма ограничены: только у отдельных генотипов получены с небольшой частотой анд-рогенные новообразования — каллусы, эмбриоиды различного уровня плоидности и побеги-регенеранты, среди которых обнаружены удвоенные гаплоиды. Установлено, что на индукцию каллуса и процессы регенерации влияет генотип исходного растения, фаза развития пыльцы и состав питательных сред. Для отдельных сортов разработаны условия получения с различной частотой каллусов и растений-регенерантов. Китайские исследователи среди каллусов, полученных из пыльников земляники, выделили наиболее ценный - эмбриогенный тип, в котором индуцировали эмбриоиды.

Сложность решения проблем получения гаплоидов у ягодных растений обусловлена тем, что у них морфогенетические процессы в культуре тканей

индуцируются с трудом и характеризуются нестабильностью и плохой воспроизводимостью. Условия получения растений-регенерантов, разработанные для одного вида или сорта, как правило, оказываются неэффективными для другого и требуют существенных модификаций (Савельев 2009).

На рост и развития микроспор in vitro влияют различные факторы среды. Блэксли и др. получили первое гаплоидное растение путем воздействия на мейоз низкой температурой. Мюнцинг успешно применил этот же метод на ржи. Под действием высоких температур получены гаплоиды кукурузы и ржи (Ницше, 1980).

Ионизирующее облучение дает лучшие результаты, чем экстремальные температуры. Так, Сваминатан и Синг добились соматической редукции у арбуза с помощью рентгеновских лучей. В большинстве случаев ионизирующее облучение применяли в ходе мейоза или перед оплодотворением. Первые гаплоидные растения кукурузы получены после опыления пыльцой, облученной рентгеновскими лучами. Лакадэн приводит итоги использования

т>32

этого метода, а также результаты, полученные с помощью радиоизотопов Р и S35 (Бутенко, 1964).

По данным ряда исследователей значение имеет фактор времени, так как она отмечала большую частоту появления гаплоидов при длительном хранении; очевидно, гаплоидные семена выживают дольше, чем обычные. Однако здесь необходимы дальнейшие исследования.

Можно считать, что действие физических факторов не зависит от вида растения, и, как правило, они дают низкую частоту образования гаплоидов.

Мутагенные вещества, как и физические факторы, можно использовать для индукции и гаплоидов. Наиболее важным среди этих веществ является колхицин, а также галогенизированные аминокислоты, особенно пара-флуорофенилаланин (ПФФА) и хлорамфеннкол. Все эти соединения вызывали редукцию соматических хромосом. На гаплоидном уровне нельзя ожидать проявления «полиплоидного оптимума». После обработки клетки в исходной

ткани могут стать не конкурентоспособными, а это отразится на их выживании и последующем формировании гаплоидных побегов и растений.

Опыление инактивированной пыльцой может индуцировать развитие партеногенетических гаплоидов. Инактивирующими агентами являются то-луидин синий, закись азота и формальдегид (Ницше, 1980).

Оздоровление растений в условиях in vitro. В настоящее время наиболее эффективным способом избавления растений от вирусов является метод клонального микроразмножения, где в качестве первичных эксплантов используются апексы инфицированных растений, а так же применение антивирусных препаратов и термотерапия. Сочетание этих методов - надежный и удобный способ избавления растений от контаминирующих агентов (Приходько, 2001).

Получение свободных от вирусов растений основывается на различных гипотезах. Согласно одной из них, концентрация вируса снижается в мери-стематических тканях вследствие слабого развития в них проводящей системы (Schuster, 1983).

Возможность оздоровления от вирусов в культуре in vitro зависит от комплекса факторов, из которых можно выделить размер первичных эксплантов, состав питательной среды для культивирования, а так же число пассажей. Поэтому процесс оздоровления растений от инфекции, имеющей различную вирусную природу, имеет ряд особенностей. Для борьбы с некоторыми вирусами достаточно провести несколько пассажей культивирование мериклонов пораженных растений in vitro (Barba, 1992).

Освобождения растений от вируса кольцевой пятнистости малины, который поражает смородину чёрную происходит при клональном микроразмножении материала в сочетании с применением фитогормонов и флюрог-лицина в различных концентрациях без применения антивирусных веществ. Другие вирусы являются трудноискореняемыми, и не устраняются даже при длительном культивировании in vitro (Lankes, 1995).

При клональном микроразмножении прослеживается зависимость между возможностью оздоровления от вирусов и размером выделяемых экс-плантов - чем меньше их размер, тем меньше вероятность их контаминации вирусами. В некоторых случаях процент оздоровления растений не зависит от размера выделяемых меристем (Томилин, 1993).

Ранее отмечалась возможность оздоровления растений малины от ВККМ при культивировании меристем и почек размером 0,5-1 мм, однако в настоящее время, используя высокочувствительные методы анализа, было доказано, что устранить этот вирус можно лишь при использовании апикальных меристем размером 0,1-0,2 мм. Но даже в этом случае процент свободных от ВККМ реге-нерантов невысок. Кроме того, выделение таких мелких эксплантов сильно сказывается на их приживаемости - из меристем малины размером 0,2 мм только около 4% успешно приживаются (Lances, 1995).

Малая эффективность оздоровления растений от вирусов in vitro проявляется в полевых условиях - при выращивании плохо оздоровленного посадочного материала уже через 4 года инфицированными являются до 50% посадок малины (Strik, 2003). Вообще, освобождение растений от многих вирусных болезней в культуре in vitro на среде, не содержащей антивирусных веществ, в большинстве случаев затруднительно, так как происходит оздоровление лишь единичных растений. Термотерапия и хемотерапия, особенно в сочетании с клональным микроразмножением, являются более эффективными методами.

Принцип действия термотерапии связан с нарушениями размножения вируса и его транспорта в результате изменения физиологического состояния растений при повышении температуры. Для оздоровления малины от ВККМ применяются различные вариации термотерапии, например культивирование верхушек побегов и черенков малины при температуре 33-42°С. Однако результаты такого лечения не очень эффективны - полное уничтожение инфекции происходит лишь через 20 недель. Основной недостаток этого метода в

том, что при повышении температуры возрастает количество повреждений растительных тканей и число погибших растений, поэтому результаты термотерапии не всегда положительные, а иногда ее проведение практически безуспешно (Mellor, 1976).

Для освобождения растений от термостабильных вирусов часто термотерапия применяется в сочетании с культивированием in vitro. Этот подход успешно применяется, например, для полного оздоровления малины от труд-ноискоренимого ВХЖМ. В этом случае корневые черенки малины, инфицированной ВХЖМ, культивируются при температуре 38-40°С в течение 1-3 месяцев. Из обработанных таким образом растений выделяются меристемы (0,5-0,7 мм), в течение 3-х месяцев осуществляется размножение in vitro и в течение 2-х месяцев укоренение (Приходько, 1995). Количество здоровых растений в этом случае гораздо выше, чем при термообработке, не сопровождающейся культивированием in vitro.

Хорошие результаты при оздоровлении посадочного материала даёт сочетание методов культуры ткани и хемотерапии. Применение хемотерапии основано на гипотезе, согласно которой оздоровление от вирусов может осуществляться путем ингибирования их репликации или нарушения структуры вирусных частиц при использовании веществ различной природы. Спектр действия веществ обладающих антивирусной активностью довольно широк. Противовирусным действием обладают, например, 2,4-диоксогексагидро-1,3,5-триазин, рибавирин (виразол), 2-тиоурацил, циано-гуанидин, ридостин, рифастин, биназа, интерферон, гипорамин, додецил-L-метилэфедринбромид и другие. Механизм их действия также разнообразен.

Особое место в клеточной инженерии занимает получение нового исходного селекционного материала методом эмбриокультуры. Культура изолированных зародышей - один из широко применяемых и доступных методов прикладной биотехнологии, направленных на облегчение и ускорение

селекционного процесса. С помощью этого метода можно существенно повысить эффективность генетически отдаленных скрещиваний (Belles, 1986).

Известно, что при отдаленной гибридизации часто проявляется явление несовместимости представителей разных таксонов и стерильность гибридов. Эмбриональные технологии используют в том случае, когда невозможно, в силу указанных причин, получить определенную комбинацию признаков в одном генотипе традиционными методами (Cadman, 1952).

Использование зародышей, изолированных на различных стадиях эмбриогенеза, позволяет избежать нежелательных явлений, которые связанны с несовместимостью зародыша и окружающих материнских тканей, обусловленной генетическими или физиологическими причинами, а также исключить период культивирования при пониженной температуре. Культивирование незрелых гибридных зародышей остается одним из надежных способов сохранения ценного генетического материала при отдаленной гибридизации для создания высокоадаптивных сортов плодовых растений (Высоцкий, 1988).

Эксперименты, проведенные рядом исследователей, свидетельствуют о возможности выращивания второго поколения отдаленных гибридов (смородина х крыжовник, яблоня х груша, груша х яблоня, вишня х черешня) с различной степенью стерильности путем культивирования недоразвитых зародышей на искусственных питательных средах (Кравцов, 1969;Спицын, 1988).

В исследованиях проведенных А.И. Здруйковской - Рихтер отмечено, что культивирование зародышей раносозревающих сортов плодовых культур в условиях пониженных температур в течение 5-6 месяцев во многих случаях является эффективным приемом получения жизнеспособных сеянцев (Здруй-ковская-Рихтер (1974).

Важными компонентами питательных сред для культивирования разновозрастных зародышей различных видов растений, в том числе плодовых и ягодных культур, являются физиологически активные вещества различной природы.

В экспериментах по культивированию зародышей черешни и груши отмечено положительное действие ГКЗ на формирование проростков из недоразвитых зародышей скороспелых сортов черешни и сорта груши Зеленая Магдалина. В отдельных вариантах опыта у зародышей развивались дополнительные побеги. Эффект индукторов в значительной степени зависел от их концентрации в питательной среде, возраста зародыша, его видовой принадлежности и условий культивирования (Здруйковская-Рихтер (1974).

Несмотря на достигнутые результаты исследований по культивированию растений in vitro, разработанные методы не всегда можно применять на других сортах той же культуры. В связи, с чем необходимо проводить постоянную оптимизацию и совершенствование используемых методик культивирования.

Заключение диссертации по теме «Селекция и семеноводство», Райков, Игорь Александрович

ВЫВОДЫ

1. При культивировании растений in vitro установлено, что реакция сор-тообразцов на действие регуляторов роста индивидуальна и определяется их генотипическими особенностями на всех этапах клонального микроразмножения.

2. Введение в культуру in vitro первичных эксплантов смородины чёрной с применением CPPU в концентрации 0,2 мг/л увеличивает выход жизнеспособных регенерантов.

3. Культивирование первичных эксплантов целесообразно проводить на питательной среде, содержащей помимо цитокинина ауксин и гибберелло-вую кислоту. Положительное влияние на развитие побегов наблюдается при добавлении ИМК в концентрации 0,05 мг/л. Для гиббереллина наиболее эффективна концентрация 0,5 мг/л.

4. Положительное влияние на пролиферацию дополнительных побегов оказывает витаминно-минеральный комплекс «Компливит» в концентрации 2 г/л.

5. Среда Мурасиге-Скуга увеличивала показатели приживаемости первичных эксплантов, коэффициент размножения и высоту растений малины в культуре in vitro в сравнении с питательными средами Ли-Фоссарда и Андерсона.

6. Применение импульсной обработки не укорененных растений в растворе ИМК с диапазоном концентраций от 5 до 7,5 мг/мл для индукции ризо-генеза позволило увеличить выход укорененных растений.

7. Культивирование растений малины целесообразно проводить на питательной среде с показателем кислотности 5,0-6,0.

8. Укоренение растений с одновременной адаптацией к нестерильным условиям культивирования целесообразно проводить в мини парниках на торфяном субстрате с добавлением песка в соотношении 1:3.

РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРОИЗВОДСТВА И СЕЛЕКЦИИ

1. При введении первичных эксплантов смородины черной использовать СРРи в концентрации 0,2 мг/л. Для увеличения выхода жизнеспособных эксплантов помимо СРРИ вводить в состав питательной среды ИМК в концентрации 0,05 мг/л.

2. Культивирование растений малины ремонтантной проводить на питательной среде М8. Показатель кислотности питательной среды может варьировать от 5 до 6.

3. Проводить укоренение пробирочных растений путем их обмакивания в растворе ИМК с концентрацией 5-7,5 мг/мл с последующей высадкой в питательный субстрат.

Список литературы диссертационного исследования кандидат сельскохозяйственных наук Райков, Игорь Александрович, 2011 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Аладина О.Н. Адаптация микрорастений малины (Rubus L.) и сирени (Syrinda L.) к нестерильным условиям / Аладина О.Н.; Акимова C.B.; Ковалева И.С.; Дубровская С.О.; Батрак Е.Р.; Аладин С.А. // Изв.Тимирязев.с.-х.акад., 2009; N 3. - С. 98-109.

2. Алексеенко JI.B. Особенности размножения нейтральнодневных и ремонтантных сортов земляники in vitro / Алексеенко JI.B. ; Автореф. дисс. ... канд. с.-х. наук. М., 1998. -20 с.

3. Анапиляев Б.Б. Влияние генотипа на частоту регенерации растений в культуре микроспор Triticum aestivum L. // Генетика. - 2000. T. 36,-№4.-С. 505-509.

4. Артамонов, В.И. Биотехнология - агропромышленному комплексу / В.И. Артамонов. - М.: Наука, 1989. - 157с.

5.Атрощенко Г.П. Применение антиоксидантов в биотехнологии плодовых и ягодных культур / Атрощенко Г.П., Самохин Г.М., Орлова С.Ю. // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем / Сб. докл. и сообщений XVIII Мичуринских чтений 27-29 октября 1997 г.- Мичуринск, 1998.- С. 25-28.

6. Атрощенко, Г.П. Научные основы ускоренного оздоровления и размножения смородины при производстве элиты: Автореф. дис. ... докт. с.-х. наук: 06.01.07 / Г.П. Атрощенко; Мичуринская гос-я с.-х. акад-я. - Мичуринск, 1995 - 57 с.

7. Белошапкина О.О. Влияние ингибиторов вирусов на частоту появления эмбриональных летадей у Arabidopsis thaliana / Белошапкина О.О., Высоцкий В.А., Хайбулина JI.M. // В сб.: Проблемы интенсификации плодоводства. М., 1987: 48-52.

8. Белякова JI.B Применение элистеров при клональном микроразмножении земляники / Белякова JI.B.; Высоцкий В.А.; Алексеенко JI.B. // Плодоводство и ягодоводство России / Всерос. селекц.-технол. ин-т садоводст-

ва и питомниководства, 2011; т.26. - С. 194-200.

9. Будаговский A.B. Лазерная биотехника, возможности и задачи // Проблемы интенсификации садоводства / Будаговский A.B. // Тез. докл. конф. (3-4-марта 1989 г.).- Мичуринск, 1989.- С. 180-182.

10. Будаговский A.B. Теория и практика лазерной обработки растений / Будаговский A.B. // Мичуринск-наукоград РФ: [б. и.], 2008. - 547 с.

11. Бургутин А.Б. Быстрое клональное размножение виноградного растения / Бургутин А.Б., Бутенко Р.Г., Катаева Н.В., Голодрига П.Я. // Сельскохозяйственная биология.- 1983.- N 5.- С. 48-50.

12. Бурдасов, В.М. О возможных путях биотехнологии в создании высокоадаптивных форм древесных растений / В.М. Бурдасов// Использование биотехнологических методов для решения генетико - селекционных проблем: Сб. докл. и сообщ. XVIII Мичуринских чтений. -Мичуринск, 1998. - С.23 - 25.

13.Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнология на их основе / Бутенко Р.Г. // Учеб. Пособие. - М: ФБК-ПРЕСС. 1999. 160 с.

14. Бутенко Р.Г. Использование культуры тканей растений в сельскохозяйственной науке и практике / Бутенко Р.Г. // Сельскохозяйственная биология. 1979. Т. 14. № 3. С. 306-315.

15. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений.- М., 1964.

16. Бутенко Р.Г. Экспериментальный морфогенез и дифференциация в культуре клеток растений / Бутенко Р.Г. - М., 1970. С. 48-65.

17. Бутенко, Р.Г. Морфогенез in vitro как важный этап клеточной и генной инженерии растений / Р.Г. Бутенко // Новые методы биотехнологии растений: Тез. докл. II Российского симпозиума. - Пущино, 1993. - С.118.

18. Бъядовский И.А. Влияние спектрального состава света на коэффициент размножения клоновых подвоев яблони в культуре in vitro / Бъядовский И.А. // Плодоводство и ягодоводство России / Всерос. се-лекц.-технол. ин-т садоводства и питомниководства, 2011; т.26. - С. 208-214.

19. Велчев, В. Клонално микроразмножаване на малине (Rubus Idaeus L.) / В. Велчев // Растениевъд. Науки. - 2004. - 41. - №1. - С.З - 8.

20. Вовк В.В. Клональное микроразмножение ремонтантных форм малины и подходы к разработке системы трансформации малины / Вовк В.В., Заякин В.В., Нам И.Я., Казаков И.В.// Материалы межвузовской научно-практической конференции - Брянск, 1997.- С. 94-96.

21. Вовк В.В. Оптимизация селекционного процесса и ускоренное размножение межвидовых ремонтантных форм малины методом in vitro / В.В. Вовк Дисс.... канд. с.-х. наук. Брянск., 2000. 20 с.

22. Волосевич H.H. Изучение методов стерилизации при введении в культуру in vitro малины красной /Волосевич H.H.// Плодоводство / Нац. акад. наук Беларуси, РУП "Ин-т плодоводства", 2006; т. 18 ч.2 - С. 169-173.

23. Волосевич H.H. Морфологические и экономические показатели ризогенеза и адаптации ex vitro сортов малины летнего срока созревания / Волосевич H.H. // Плодоводство / Нац. акад. наук Беларуси, РУП "Ин-т плодоводства", 2009; т.21. - С. 278-285.

24.Высоцкий В.А. Особенности клонального микроразмножения некоторых форм ремонтантной малины / Высоцкий В.А. // Плодоводство и ягодоводство России / Сб. научных трудов ВСТИСП. М., 1996. Т.З. С. 90-95.

25. Высоцкий В.А. Действие некоторых регуляторов роста на изолированные меристематические верхушкм черной смородины / Высоцкий В.А. // Плодоводство и ягодоводство нечерноземной полосы Сб.

научных трудов НИЗИСНП. М., 1979.- Т.9.- С. 101-107.

26.Высоцкий В.А. Клональное микроразмножение плодовых растений и декоративных кустарников / Высоцкий В.А. // Микроразмножение и оздоровление растений в промышленном плодоводстве и цветоводстве Сб. научных трудов НИИ им. И.В. Мичурина. Мичуринск. 1989. с. 3-8.

27. Высоцкий В.А. Клональное размножение роз / Высоцкий В.А., Алехно Г.Д. // Декоративное садоводство в России / Сб. научных трудов НИЗИСНП. М, 1986.- С. 59-67.

28. Высоцкий В.А. Культура изолированных тканей и органов плодовых растений: оздоровление и микроклональное размножение / Высоцкий В.А. // Сельскохозяйственная биология. 1983. №7. С. 42-47.

29. Высоцкий В.А. О генетической стабильности при клональном микроразмножении плодовых и ягодных культур / Высоцкий В.А. // Сельскохозяйственная биология. 1995. № 5. С. 57-63.

30. Высоцкий В.А. Особенности регенерации растений изолированными пыльниками и листовыми дисками ягодных культур in vitro / Высоцкий В.А., Упадышев М.Т., Соломонова Ф.Н. // Сельскохозяйственная биология. 1998. №3. С. 44-50.

31.Высоцкий В.А. Совершенствование питательной среды для микрокло-нального размножения вишни / Высоцкий В.А., Олешко Е.В. // Агротехника и сортоизучение плодовых культур / Сб. научных трудов НИЗИСНП.- М, 1985. С. 72-76.

32. Высоцкий В.А. Усовершенствование способов получения растений малины из изолированных меристематических верхушек / Высоцкий В.А. // Ягодоводство в Нечерноземье Сб. научных трудов ВСТИСП.- М., 1984.- С. 3-8.

33. Высоцкий, В.А. Методические указания по выращиванию сеянцев вишни из зародышей, изолированных на ранних стадиях развития / В.А. Высоцкий, Г.А. Плотникова // НИЗИСНП. - М., 1988. - 14с.

34. Гамбург К.З. Регуляторы роста растений /Гамбург К.З., О.Н. Ку-лаева, Г. С. Муромцев и др. // под ред. Г. С. Муромцева. - М.: Колос, 1979.-246 с.

35. Гапеенко А.К. Перспективы Использования культуры клеток растений в селекции // Успехи современной генетики. - М., 1987. - Т. 4. - С. 692705.

36. Геринг X. Преодоление витрификации и улучшение акклиматизации растений при клональном микроразмножении / Геринг X. // Биология культуры тканей в физиологии и биохимии растений. - М.: Наука, 1991.-С. 197-200.

37. Деменко В.И. Размножение вишни методом in vitro / Деменко В.И., Трушечкин В.Г. // Сельскохозяйственная биология. 1983. № 7. С. 51-53.

38. Дёрфлинг К. Гормоны растений. Системный подход: Пер. с англ. -М.: Мир, 1985.-304 с.

39. Джигадло E.H. Биотехнология в селекции / Джигадло E.H., Джигадло М.И., Тюленев В.М., Курсаков Г.А. и др. // Программа и методика селекции плодовых, ягодных и орехоплодных культур,- Орел, 1995.- С. 111-132.

40. Джигадло E.H. Методические рекомендации по использованию биотехнологических методов в работе с плодовыми, ягодными и декоративными культурами / под ред. E.H. Джигадло; Гос. науч. учреждение Всерос. науч.-исслед. ин-т селекции плодовых культур Рос. акад. с.-х. наук Орел: ГНУ ВНИИСПК, 2005. - 50 с.

41. Джонс О.П. Размножение хозяйственно важных древесных растений in vitro / Джонс О.П. // В кн.: Биотехнология сельскохозяйственных растений. М., 1987. С. 134-152.

42. Долгих В.А. Продуктивность земляники, выращенной из апексов / Долгих В.А. // Садоводство и виноградарство.- 1988.- N 7.- С. 24-25.

43. Дорошенко Н.П. Биотехнологические методы в селекции винограда/ До-

рошенко Н.П. // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем / Сб. докл. и сообщений XVIII Мичуринских чтений 27-29 октября 1997 г.- Мичуринск, 1998.- С. 42-46.

44. Дорошенко Н.П. Микроклональное размножение столового винограда сорта Агат Донской / Дорошенко Н.П., Кострикин И.А. // Садоводство и виноградарство. 1989. № 3. С. 40.

45. Доспехов Б.А. Методика полевого опыта.- М.: Колос, 1979. 416 с.

46. Евдокименко С.Н. Биологический потенциал ремонтантных форм малины и селекционные возможности его использования : автореф. дис. на соиск. ученю степ, д-ра с.-х. наук : специальность 06.01.05 Селекция и семеноводство> / Евдокименко Сергей Николаевич; [Брян. гос. с.-х. акад.] Брянск: [б. и.], 2009. - 51 с.

47. Егорова H.A. Микроразмножение лаванды in vitro / Егорова H.A. // BicH. Харьк. нац. аграр. ун-ту. Сер. "Биология". Харыав , 2002; N 9 (1). - С. 65-71.

48. Ерёмин, Г.В. Новые пути совершенствования косточковых плодовых растений России / Ерёмин Г.В. // История, современность и перспективы развития садоводства России. М., 2004. - С. 88-91.

49. Жуков О.С. Андрогенез и повышение генетической изменчивости и создания исходного материала для селекции плодовых растений / Жуков О.С., Олейникова О.Я., Савельев Н.И. // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии / Тез. докл. конференции.- М., 1996.- С. 27.

50. Жуков О.С. Перспективы использования гаметной и гомозиготной селекции плодовых растений / Жуков О.С., Савельев Н.И., Олейникова О.Я. // Использование биотехнологических методов для решения генетико-селекционных проблем / Сб. докл. и сообщений XVIII Мичуринских чтений 27-29 октября 1997 г.- Мичуринск, 1998.- С. 93-96.

51. Жученко A.A. Трансгеноз в современной селекции растений и его по-

следствия / Жученко А.А. // Arpo XXI, 2003; N 1-6. - С. 87-94.

52. Здруйковская - Рихтер, А.И. Культура изолированных зародышей и некоторые другие приемы выращивания растений in vitro / А.И. Здруйковская - Рихтер // Методические рекомендации. - М.: ВАСХНИЛ, 1974.-62с.

53. Казаков И.В. Генетические ресурсы рода Ribes L. и использование их в селекции / Казаков И.В.; Сазонов Ф.Ф. // Сохранение биологического разнообразия России - основа устойчивого развития науки и наукоемких производств, 2011. - С. 21-26.

54. Катаева Н.В. Особенности клонального микроразмножения трудно-укореняемых сортов яблони / Катаева Н.В. // Сельскохозяйственная биология. 1984.- N 4.- С. 18-22.

55. Кефели В. И. Рост растений в свете современных представлений о внутриклеточной регуляции / Кефели В. И. // Успехи соврем, биологии. 1970. Т. 69, № 3. С. 446—459.

56. Кефели, В.И. Рост растений / В.И. Кефели. - М.: Колос, 1973. - 120с.

57. Кичина В.В. Принципы улучшения садовых растений / Кичина В.В. // М.: ГНУ ВСТИСП Россельхозакадемии, М., - 2011. - 528 е., с илл.

58. Колбанова Е.В. Влияние стерилизующих соединений и питательной среды на жизнеспособность и развитие меристематических верхушек сортов крыжовника в культуре in vitro / Колбанова Е.В. // Плодоводство / Нац. акад. наук Беларуси, РУП "Ин-т плодоводства", 2009; т.21. -С. 252-264.

59. Колбанова Е.В. Изучение регенерационной способности меристем сортов смородины красной / Колбанова Е.В. // Плодоводство / Нац. акад. наук Беларуси, РУП "Ин-т плодоводства", 2005; т.17 4.1. С. 199 -203.

60. Колбанова Е.В. Методика микроразмножения смородины чёрной in vitro / Колбанова Е.В.; Кухарчик Н.В. // Плодоводство / Нац. акад. наук Беларуси, РУП "Ин-т плодоводства", Материалы международной науч-

ной конференции "Методическое обеспечение устойчивого развития современного плодоводства". 2006; т. 18 ч.2 - С. 163-168.

61. Колбанова, Е.В. Особенности введения в культуру in vitro некоторых ягодных кустарников / Е.В. Колбанова, Н.В. Кухарчик // Итоги и перспективы ягодоводства: мат-лы межд-й науч.-практ. конф-ии - Минск, 1999.-С. 38-41.

62. Коронацкий С.А. Особенности клонального микроразмножения сливы в системе производства оздоровленного посадочного материала / Коронацкий С.А. // Автореф. дисс.... канд. с.-х. наук.- М., 1991.- 22 с.

63. Кравцов, П.В. Опыт применения культуры изолированных зародышей для преодоления стерильности отдаленных гибридов плодовых растений / П.В. Кравцов, В.Г. Касьянова // Тр. ЦГЛ им. И.В. Мичурина. -Мичуринск, 1969. - Т. 10. - С.236 - 244.

64. Круглова Н. Н. Эмбриоидогенез как путь морфогенеза в культуре изолированных пыльников злаков / Круглова H.H.; Горбунова В.Ю.; Батыги-на Т.Б. // Успехи соврем.биологии, 1995; Т.115,вып.6. - С. 692-705.

65. Кунах, В.А. Изменчивость растительного генома в процессе дедиффе-ренцировки и каллусообразования / В.А.Кунах // Физиология растений. - 1999. - Т.46. - №6. -С.919 - 929.

66. Леонтьева-Орлова, Л.А. Совершенствование метода клонального микроразмножения смородины и оценка развития растений в нестерильных условиях: Автореф. дис. ... канд. с.-х. наук: Л.А. Леонтьева-Орлова; Научно-исследовательский зональный институт садоводства нечерноземной полосы. - Москва, 1991. - 22 с.

67. Лупышева Ю.В. / Лупышева Ю.В.; Дунаева С.Е.; Пендинен Г.И.; Новикова Л.Ю.; Савельева Н.В.; Лутова Л.А.; Гавриленко т. ал Регенерация и трансформация сортов малины и ежевики в культуре in vitro Вестн.С.-Петербург.ун-та.Сер.З, 2008; N 2. - С. 28-35.

68. Матушкина О.В. Клональное микроразмножение плодовых и ягодных

культур и перспективы его использования / Матушкина О.В. // Основные итоги и перспективы науч.исслед.ВНИИС им.И.В.Мичурина( 1931-2001 гг.)/Всерос.НИИ садоводства, 2001; Т.2. - С. 103-115.

69. Матушкина О.В. Особенности размножения смородины in vitro / Матушкина О.В.; Пронина И.Н. // Современное состояние культур смородины и крыжовника / Всерос. науч.-исслед. ин-т садоводства. - Мичуринск, 2007. - С. 285-289.

70. Михальчик JI.C. Ускоренное выращивание посадочного материала яблони для интенсивных насаждений Нечерноземной зоны РСФСР / JI.C. Михальчик. Автореф. дисс. ... канд. с.-х. наук.- М., 1990.- 23 с.

71. Михальчик JI.C. Маркетинговые аспекты выращивания высококачественного посадочного материала рябины сладкой / Михальчик JI.C. // Плодоводство и ягодоводство России / Сб. трудов ВСТИСП.- М., 1995.-Т.2.- С. 133-141.

72. Муратова С.А. Биотехнологические методы размножения ягодных культур / Муратова С.А.; Шорников Д.Г.; Янковская М.Б. -Мичуринск-наукоград, 2008. - 69 с.

73. Негреев В.Н. Влияние активированного угля на образование каллусов из неоплодотворенных семяпочек яблони и вишнево-черемуховых гибридов / Негреев В.Н. // Достижения науки - в практику / Тез. докл. конф. (27-29 апреля).- М., 1990.- С. 121,122.

74. Ницше В. Гаплоиды в селекции растений / Ницше В., Венцель Г. // Пер. с англ. В.В. Попова; Предисл. Ю. П. Лаптева. - М., Колос, 1980 128 с.

75. Огольцова Т.П. Апробация сортов земляники при микроклональном размножении / Огольцова Т.П., Джигадло М.И. // Садоводство и виноградарство. 1988.- N 11.- С. 26-29.

76. Орлов П.Н. Роль перивискулярных волокон в образовании придаточных корней у зеленых черенков садовых растений /Орлов П.Н.

//Плодоводство ТСХА, 1985. Вып. 6. С. 102 - 115.

77. Панькова O.A. Оптимизация состава питательной среды для пролиферации черной смородины / Панькова O.A.; Несмелова Н.П. // Инновационное развитие АПК. Итоги и перспективы / Ижев. гос. с.-х. акад., 2007; Т.1.-С. 130-134.

78. Полевой В.В. Физиология растений: Учеб. для биол. спец. вузов. - М.: Высш. шк., 1989. - 464 с.

79. Поликарпова Ф.Я. Влияние предварительной подготовки маточных растений и физиологически активных веществ на зеленое черенкование клоновых подвоев яблони / Поликарпова Ф.Я., Яковлева В.А. // Плодоводство нечерноземной полосы / Сб. научных трудов НИЗИСНП. М., 1984.- С. 28-35.

80. Попов Г.Д. Влияние регуляторов роста и углеводов на каллусообразо-вание у яблони / Попов Г.Д. // Бюл. науч. информ. ЦГЛ им. И.В. Мичурина.- 1990.- Вып. 49.- С. 18-21.

81. Приходько Ю.Н. Антифитовирусное действие препарата гипорамин / Приходько Ю.Н., Цубера Л.В., Редин Д.В., Толкачев О.Н., Шейченко О.П. // Промышленное производство оздоровленного посадочного материала плодовых, ягодных и цветочно-декоративных культур: Материалы международной научно-практической конференции, 20-22 ноября 2001 г. Москва, 2001. С.85-87.

82. Приходько Ю.Н. Совершенствование технологии оздоровления малины от вирусов и микоплазм / Приходько Ю.Н. // Плодоводство и ягодоводст-во России (сборник научных трудов). Москва, 1995. т. II. С. 210-214.

83. Программа и методика сортоизучения плодовых, ягодных и орехоплодных культур / Всерос. НИИ селекции плодовых культур; Под общ. ред. Седова E.H. Орел, 1999. - 606 с.

84. Расторгуев С.Л. Культура изолированных тканей и органов в селекции плодовых растений / С. Л. Расторгуев // Мичуринск: Изд-во

МичГАУ, 2009. - 170 с.

85. Расторгуев С.Л. Технологии in vitro в селекции плодовых культур / Расторгуев С.Л.; Тюленев В.М. // Международная научно-практическая конференция "Мобилизация адаптационного потенциала садовых растений в динамичных условиях внешней среды": [материалы] / Всерос. селекц.-технол. ин-т садоводства и.... - М., 2004. - С. 110-113.

86. Савельев Н. И. Андрогенез in vitro малины и земляники. / Н.И. Савельев,О.Я. Олейникова, Н.С. Ильина // Вестник МичГАУ. -1. -2008. - С.12-15.

87. Савельев, Н.И. Использование метода андрогенеза in vitro в работе с плодовыми и ягодными культурами / Н.И. Савельев, О.Я. Олейникова. - Мичуринск, 2009. -52с.

88. Сковородников Д.Н. Некоторые аспекты использования цитокининов различной природы на этапе введения в культуру in vitro эксплантов чёрной смородины // Сковородников Д.Н., Райков И.А. // Плодоводство и ягодоводство России / Всерос. селекц.-технол. ин-т садоводства и пи-томниководства, 2009; т.22 ч.2. - С. 292-296.

89. Сковородников Д.Н. Особенности клонального микроразмножения in vitro и ускорение селекции новых ремонтантных форм малины : Авто-реф. дис...канд. с.-х. наук: 06.01.05, 03.00.12 / Сковородников Д.Н.; Брян. гос. с.-х. акад. : Брянск, 2004. - 20 с.

90. Сковородников Д.Н. Применение тидиазурона при адвентивном органогенезе ремонтантной малины /Сковородников Д.Н. // Международная научная конференция молодых ученых и специалистов "Вклад молодых ученых в развитие инноваций аграрной науки" / Рос. гос. аграр. ун-т - МСХА им. К. А. Тимиряева, 2009. - С. 135-138.

91. Соболев В.В. Об использовании цитокининов для оптимизации клонального микроразмножения ремонтантных форм малины / Соболев В.В.; Соболева А.Г.; Озеровский A.B.; Казаков И.В.; Евдокименко С.Н.

// С.-х.биология.Сер.Биология растений, 2007; N 1. - С. 91-95.

92. Соловых Н.В. Применение тканевых культур в селекции плодовых растений / Соловых Н.В., Расторгуев C.JI. // Молодые ученые - садоводству России/Тез. докл. совещ. 20-21 июня 1995 г. М., 1995. С. 9-12.

93. Спицын, И.П. Оценка гибридов вишни и черешни на основе цитоэм-бриологических исследований и культуры изолированных зародышей / И.П. Спицын // Наука - производству: Тез. докл. науч. конф. - М., 1988. С.58.

94. Суркова, О.Ю. Анализ распространения вредоносности, этиологии вирусных и вирусоподобных болезней красной и черной смородины и разработка мер борьбы с ними в средней полосе России: Автореф. дис. ... канд. с.-х. наук: 06.01.11 / О.Ю. Суркова; Всероссийский селекционно-технологический институт садоводства и питомниководства. - Москва, 1994.-20 с.

95. Томилин A.A. К вопросу об эффективности оздоровления растений малины красной от вируса мозаики резухи с использованием метода культуры меристем / Томилин A.A., Упадышев М.Т. // Ягодоводство в Нечерноземье: Сборник научных трудов. Москва, 1993. С. 25-28.

96.Трушечкин В.Г. Размножение клоновых подвоев яблони методом культуры тканей / Трушечкин В.Г., Высоцкий В.А., Леонтьев-Орлов O.A. // Сельскохозяйственная биология.- 1992.- N 4.- С. 455-457.

97. Трушечкин В.Г. Размножение клоновых подвоев яблони методом культуры тканей / Трушечкин В.Г., Высоцкий В.А., Леонтьев-Орлов O.A. // Сельскохозяйственная биология. 1992. №4. С. 455-457.

98.Тулаева Н.И. Микроклональное размножение винограда на ионитных субстратах / Тулаева Н.И., Стыцко С.А., Белякова З.Н., Хорошко Р.Н. и др. // Садоводство и виноградарство.- 1990.- N 2.- С. 14-16.

99. Туровская Н.И. Микроклональное размножение яблони и груши in vitro / Туровская Н.И. // Садоводство и виноградарство.- 1994.- N 1.- С. 10-12.

100. Туровская Н.И. Микроклональное размножение груши / Туровская Н.И. // Садоводство и виноградарство.- 1987.- N 6.- С. 22-24.

101. Туровская Н.И. Микроклональное размножение малины / Туровская Н.И., Стрыгина О.В. // Садоводство и виноградарство. 1990. № 8. С. 26-29.

102.Туровская Н.И. Формирование адвентивных почек на эксплантах малины / Туровская Н.И., Стрыгина О.В. // Сортоизучение и селекция плодовых и ягодных культур. / В сб. научных трудов НИИ им. И.В. Мичурина. Мичуринск. 1992. с. 82-84.

ЮЗ.Тюленев В.М. Перспективы применения тканевых культур в селекции плодовых и ягодных растений / Тюленев В.М., Будаговский A.B., Евсеева Р.П., Соловых Р.П. // Актуальные проблемы биотехнологии в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии / Тез. докл. науч. конф. М., 1996.- С. 82.

Ю4.Тюленев В.М. Способ укоренения побегов яблони in vitro / Тюленев

B.М., Нафталиев П.М., Осипова П.В., Расторгуев C.JI. // Бюл. науч. ин-форм. ЦГЛ им. И.В. Мичурина. 1990. Вып. 48. С. 34-36.

105.Уайт, Ф.Р. Культура растительных тканей /Ф.Р. Уайт. - М.: Иностранная литература, 1949. - 159с.

106. Упадышев М.Т. Клональное микроразмножение нетрадиционных плодовых и ягодных культур / Упадышев М.Т. // Молодые ученые - садоводству России /Тез. докл. совещ. 20-21 июня 1995 г. М., 1995. С. 165-167.

Ю7.Хапова С.А. Условия культивирования in vitro и последующая продуктивность растений земляники / С. А. Хапова; Автореф. дисс... канд. с.-х. наук. М., 1997. 23 с.

Ю8.Хасси Г. Размножение сельскохозяйственных культур in vitro / Хасси Г. // В кн.: Биотехнология сельскохозяйственных растений. М., 1987.

C. 105-133.

109.Шамина З.Б. Генетическая изменчивость растительных клеток in vitro / Шамина З.Б. // Докл. II Всеросийской конференции "Культура клеток

растений", М., 1967.- С. 80-93. ПО.Шевелуха B.C. Сельскохозяйственная биотехнология / Шевелуха B.C.,

Калашникова Е.А., Дягтерев С.В. // М.: Высшая школа, 1998. С. 416. 111 .Шорников Д.Г. Размножение in vitro лимонника и актинидии / Шорников Д.Г.// Современные проблемы технологии производства, хранения, переработки и экспертизы качества с.-х. продукции / Мичур. гос. аграр. ун-т. - Мичуринск, 2007; Т. 1. - С. 337-341.

112.Anderson Н. М. Roting of tissue cultured rhododendrous / Anderson H. M. // The Inter. Plant. Prop. Soc.- 1978.- V 28.- P. 135-139.

113.Anderson W.C. Tissue culture propagation of red and black raspberry, Ru-bus idaeus and Rubus occidentalism Anderson W.C. // Acta Horticulture.

1980. V.112. P. 13-20.

114.Barba M. Comparison of different methods to produce virus free stone fruits / Barba M., Martino L., Lauretti F. // Acta Hortic. 1992. Vol. 309. P.385-392.

115.Belles J.M. Antiviroid effects of ribavirin on citrus exocortis viroid infection in Gynura aurantiaca DC. / Belles J.M., Hansen A.J., Granell A., ConejeroV. //Physiol. Mol. PI. Path. 1986. Vol. 28. P.61-65.

116.Cadman C.H. Studies in Rubus virus diseases. Three types of vein chlorosis of Raspberries / Cadman C.H. // Ann.appl.Biol. 1952. Vol.39. P.61-68.

117.Debergh P. C. A scheme for commercial propagation of ornamental plants by tissue culture / Debergh P. C. & Maene L.J.// Scientia Horticulturae.-

1981,-V.14.-P/335-45.

118.Feucht W. Large-scale trial of raspberries propagated in vitro: 0,68 % of off types and enzyme pattern of atypical fruits / Feucht W., Schmid P.P.S., Schimmelpteng H.// Erwerbsobstbau.- 1985.-V. 27.-P. 167-169.

119.Fonnesbech A. In vitro propagation of Monstera deliciosa / Fonnesbech A. & Fonnesbech M. // Hort. Science.- 1980.- 15.- P. 740-1.

120.Franclet A. Rejeunissement des arbres adultes en vue de leur propagation vegetative / Franclet A. // In Annales de Recherches Syluicoles, AFOCEL.

Etudes et Recherches., Micropropagation d'Arbres Forestiers.- 1979.- V.6, N. 12.-P. 3-18.

121.Gonzalez, M.V., M. Lopez, A.E. Valdes, and R.J. Ordas. Micropropagation of three berry fruit species using nodal segments from field-grown plants. Ann. Appl. Biol. 2000 - C. 73-78.

122.Gresshoff P. Syndicate. Methods employed in planting out tissue culture. The horizons of tissue culture propagation / Gresshoff P. // A seminar directed by Dr. R. A. de Fossard for the N.S.W. Association of Nurserymen Ltd. at the University of Sydney, 3-4 December 1977. P. 106-108.

123.Gribaudo, I. Effects of thidiazuron on grape vane axillary buds cultured in vitro / Gribaudo, I, Fronda, A. // Hort. Sci.1991. - 26: 1083-1086.

124.Hall H. Plant breeding reviews. / H. Hall, K. E. Hummer // Raspberry breeding and genetics. New Jersey. Willey Blackwell, 2009. - 382 p.

125.Ho ward B.H. Long-term improvement in the rooting of plum cutting following apparent rejuvenation / Howard B.H., Jones O.P., Vasec J. // Hort. Sci.- 1989.-V 64, N 2.-P. 147-154.

126.Hussey G. Plantlet regeneration from callus and parent tissue in Omithoga-lum thyrsoides / Hussey G. // Journal of Experimental Botany. 1976. V. 27. P. 375-382.

127.1wamura, H. Quantitative structure-activity relationship of cytokinin-active adenine and urea derivatives. /Iwamura, H., Fujita, T., Koyama, S., Koshi-mizu, K., Kumazawa, Z. //. Phytochemistry 1980. -19: 1309-1311.

128.Jones O.P. Propagation in vitro / Jones O.P., Marks T.R. & Waller B.J. // Report of East Mailing Research Station for 1981.- 1982.- 159 p.

129.Jones, O. P. The successful propagation in vitro of two rootstocks of Prunus: the plum rootstock Pixy (P. insititia) and the cherry rootstock F 12/1 (P. avium)./ Jones, O. P. & Hopgood, M. E. // Journal of Horticultural Science.-1979.-V.54, Nl.-P. 63-66.

130.Kapchina-Toteva V. Anticytokinin effect on apical dominance release in in

vitro cultured Rosa hybrida L / Kapchina-Toteva V.; Somleva M.// Biol.Plantaram, 2002; Vol.45,N 2. - P. 183-188.

131.Karp A. Somaclonal variation as a tool for crop improvement / Karp A. // Euphytica. 1995. V.85. P. 295-302.

132.Kozai T. Photoautotrophic (sugar-free medium) Micropropagation as a New Micropropagation and Transplant Production System / T. Kozai, F. Afreen and S.M.A. Zobayed // Published by Springer, 2005 - 316 C.

133.Kubota N. Effects of daylength, its extension or light interruption (night break) at different times on shoot growth and flower bud differentiation of potted "Pione" grapes / Kubota N.; Ohno M.; Fukuda F. // J.Japan.Soc.Hortic.Sc, 2001; Vol.70,N 1. - P. 89-94.

134.Lane D.W. Regeneration of pear plants from shoot meristem-tips / Lane

D.W. // Plant Science Letters.-1979.- V.16.-P. 337-342.

135.Lankes C. Elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus / Lankes C. // Acta Horticulturae: VII International Symposium on Small Fruit Vims Diseases. 1995. Vol. 385. P. 70-75.

136.Lee E.C.M. Regeneration of strawberry plants from tissue cultures / Lee

E.C.M., Fossard R.A. // Comb. Proc. (Intern. Plant Propagators Soc. Mil-town, N.-Y.) 1975.-V. 25.- P. 277-285.

137.Leifert C. Effect of medium acidification on filamentous fungi,yeasts and bacterial contaminats in Delphinium tissue cultures / Leifert C.; Waites B.; Keetley J.W.; Wright S.M.; Nicholas J.R.; Waites W.M. // Plant Cell Tissue Organ Cult, 1994; Vol.36,N 2. - P. 149-155.

138.Maheshwari S. C. Haploid from pollen grains - retrospect and prospect / Maheshwari S. C., Rashid A., Gyagi // Amer. J. Bot. - 1982. V. 69, № 5. -P. 865-879.

139.Marco J.B. In vitro culture of albedo tissue from fruits of Citrus sinensis cv.Washington Navekeffect of fruit age and orange juice / Marco J.B.; Picazo I. // J.hortic.Sc, 1994; Vol.69,N 5. - P. 929-935.

140.Mellor F.C., Stace-Smith R. Influence of heat therapy on rooting of, and elimination of Raspberry Bushy Dwarf Virus from shoot cuttings of red raspberry / Mellor F.C. // Acta Hort. 1976. Vol. 66. P.63-70.

141.Mithila, J. Recent advances in Pelargonium in vitro regeneration systems / Mithila, J., Murch, S. J., Raj, S.-N., Saxena, P. K. // Plant Cell Tissue and Organ Culture, 2001. - 67: 1-9.

142.Mok, M. C. Cytokinin activity of N-phenyl-NO-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea (thidiazuron) / Mok, M. C.; Mok, D. W. S.; Armstrong, D. J.; Shudo, K.; Isogai, Y.; Okamoto, T.// Phytochemistry. 21:1509-1511; 1982.

143.Murashige T. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures / Murashige T. & Skoog F. // Physiologia Plantarum. 1962. V.15. №.13. P. 473-497.

144.Nemeth G. Induction of Rooting. In: Biotechnology in Agriculture and Forestry 1/ Nemeth G.// Springer-Verlag Berlin. Heidelberg, New-York, Tokyo, 1986:.-P .49-64.

145.01iphant J.L. Micropropagation of Luculia species / Oliphant J.L. // Comb.Proc./Intern.Plant Propagators' Soc.. - S.I., 1995; Vol.44. - P. 430-431

146.Pawlicki N. Adventitious shoot regeneration from leaf segments of in vitro cultured shoots of the apple rootstock Jork 9/ Pawlicki N, Welander M//. 1994 J Hortic Sci 69:687-696.

147.Pierik R.L.M. In vitro culture of higher plants / Pierik R.L.M. // Dordrecht etc.; Nijhoff., 1987.V.5. 344 p.

148.Preece J.E. Plant regeneration from leaf explants of Phododenron 'P.J.M. Hybrids' / Preece J.E. & Imel M.R. // Scientia Hort. 1991. V.48. P. 159-170.

149. Reed B.M. Application of gas-permeable bags for in vitro cold storage of strawberry germ-plasm/Reed B.M. //Plant Cell Rpt. 1991. V.10. P. 431434.

150.Reed B.M. Multiplication of Rubus germplasm In vitro: a screen of 256 accessions. //Fruit Vaueties Journal. 1990. V.44. №3. p. 141-148.

151.Ruzic D., Micropropagation as means of rapid multiplication of newly de-

veloped blackberry and black currant cultivars / D. Ruzic, T. Lazic // Agri-culturae conspectus scientificus. Vol. 71. - № 4. - 2006. - P. 149-153.

152.Schimmelpfend H. Himbeerpflanzer aus Gewebekulturen - Erfahzungen bei der Weiterkultur und im praktischen Anbau / Schimmelpfend H. // Obstbau (Bonn), 1983.-Jg 8, N7.- S. 321-324.

153.Schuster G. Der Einfluß von Zytokininen und Verbindungen mit Zytokini-nanaloger Wirkung auf die Vermehrung von Pflanzenviren und mögluche praktische Anwendüngen / Schuster G. // Potsdam Forsch. 1983. № 35. S. 127-142.

154.Shudo, K. 1994. Chemistry of phenylurea cytokinins / Shudo, K. // In: Mok D., Mok M. (Eds.) Cytokinins: Chemistry, Activity, and Function. CRC Press, Boca Ration, London-Tokyo, 1994. - c. 35-42.

155.Strik B. Impact of Raspberry Bushy Dwarf virus on 'Marion' Blackberry/ Strik B., Martin R.R. // Plant Disease. 2003. Vol. 87, №3. P.294-296.

156.Swartz H.J. Small fruit and grape tissue culture from 198 to 1985 commercialization of the technique. Tissue culture as a plant production system for horticultural crops / Swartz H.J., Lindstrom I.T. // Conf. on tissue culture (October 20-23, 1985).- Beltsville, 1986. P. 201-220.

157.Swartz H.J. Field performance and phenotypic stability of tissue culture-propagated strawberries / Swartz H.J., Galetta G.J., Zimmerman R.H. // J. Am. Hortic.Sci. 1981. V.106. P. 667-675.

158.Takahashi S. Cytokinin activity of pyrimidine derivatives /Takahashi S., Yatsunami T., Shudo K., Okamoto T., Yamada K., Isogai Y. // Chem. pharm, bull. - 1978. - 26: 2286-2289.

159. Thanutong, P. Resistat tobacco plants from protoplast - derived calluses selected for their resistance to Preudomonas and Altemaria toxins / P. Thanutong, M. Yamamoto // Theor. And Appl. Genet -1983. - vol. 66. -P. 209 -215.

160.Walkey D.G.A. Production of apple plantlets from axillary bud meristems / Walkey D.G.A. // Plant Sei. 1972. V. 52. P. 6.

161.Wareing P.F. Phase chende and vegetative propagation / Wareing P.F. // Improving vegetatively propagated crops. Academic Press Limited., 1987.-P. 263-270.

162.Zawadzka M. Factors modifying regeneration in vitro of adventitious shoots in five red raspberry cultivars / Zawadzka M.; Orlikowska T. // J.Fruit ornamental Plant Res., 2006; T.14, N Ann.. - P. 105-115

163.Ziv M. Enhanced embryogenesis and plant regeneration from cucumber (Cucumis sativus L.) callus by activated charcoal in solid/liquid double-layer cultures / Ziv M.; Gadasi G. // Plant 1 T A1 N 2. - p. 115-122.