СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДИАГНОСТИКИ ИММУНОДЕФИЦИТА КОШЕК ПУТЕМ РАЗРАБОТКИ НОВОГО СПОСОБА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Мелеховец Юлия Алексеевна

• Мелеховец Юлия Алексеевна
• кандидат наук
• 2017

Оглавление диссертации кандидат наук Мелеховец Юлия Алексеевна

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Вирусный иммунодефицит кошек: состояние изученности вопроса в историческом аспекте и эпизоотическая ситуация

2.2 Характеристика возбудителя иммунодефицита кошек и его генетических детерминант, патогенез инфекции

2.3 Методы лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита кошек вирусологические, микроскопические, серологические и молекулярно - генетические

2.3.1 Вирусологические методы исследования

2.3.2 Микроскопические методы исследования

2.3.3 Серологическая диагностика ретровирусных инфекций кошек

2.3.4 Полимеразная цепная реакция в диагностике ретровирусных инфекций кошек: преимущества, недостатки, модификации метода

3 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 Материал и методы исследования

3.2 Результаты исследований

3.2.1 Эпизоотическая обстановка по вирусному иммунодефициту кошек в Саратове и Саратовской области

3.2.2 Изучение влияния возбудителя вирусного иммунодефицита кошек на основные клетки - мишени

3.2.3 Совершенствование лабораторной диагностики вирусного иммунодефицита кошек

3.2.3.1 Сравнительный анализ эффективности серологической и молекулярно-генетической диагностики ПУ

3.2.3.2 Анализ молекулярно-генетической структуры Е1У и ЕвЬУ

3.2.3.3 Разработка способа детекции Е1У методом классической ПЦР

3.2.3.4 Разработка способа детекции Е1У и ЕвЬУ методом мультиплексной ПЦР

4 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5 БЛАГОДАРНОСТИ

6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

8 СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

9 ПРИЛОЖЕНИЯ

1. ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ДИАГНОСТИКИ ИММУНОДЕФИЦИТА КОШЕК ПУТЕМ РАЗРАБОТКИ НОВОГО СПОСОБА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ»

Актуальность темы исследования.

Вирусный иммунодефицит кошек является тяжелым неизлечимым заболеванием, возбудитель которого, Feline immunodeficiency virus (FIV), поражает нервную и иммунную системы животного. Развитие болезни протекает медленно, характеризуясь полиморфностью клинических проявлений, высокой летальностью. Вирусный иммунодефицит кошек относятся к инфекциям, не поддающимся специфической профилактике.

В эндемичных регионах степень инфицирования кошек вирусным иммунодефицитом может составлять 41 % и более, в частности, среди диких представителей семейства кошачьих, таких как горные львы, пумы, гепарды и др., что ставит под угрозу существование популяций редких видов животных (Muchaamba F. et al., 2014).

Возбудитель этого заболевания - РНК-содержащий вирус семейства Retroviridae. В настоящее время антиретровирусная терапия кошек ограничена высокой стоимостью лечения и выраженной токсичностью препаратов. По этой причине диагностика вирусного иммунодефицита является основным способом контроля распространения данной инфекции (Бажибина Е.Б., Бажибина В.А., 2016). При этом большинство исследователей сходятся во мнении, что эффективность молекулярно-генетических методов диагностики в силу уникальной природы ретровирусов намного выше других способов (Hartmann K., 2007; Бажибина Е.Б., 2011; Красникова Е.С., 2014).

Часто вирусный иммунодефицит осложняется другой неизлечимой инфекцией - вирусной лейкемией кошек. Это усугубляет тяжесть течения заболевания и затрудняет диагностику инфекции, так как в случае поражения вирусом лейкемии костного мозга у животного развивается иммунодефицитное состояние. Вирусный иммунодефицит кошек, а также лейкемия являются на сегодняшний день одной из самых частых причин гибели кошек во всем мире, что обусловлено также высокой контагиозностью заболеваний (Hartmann K., 2012; Соломахина Л.А.,2016).

Степень разработанности темы.

Изучению вирусного иммунодефицита кошек посвящен ряд работ отечественных и зарубежных исследователей. Однако, несмотря на многолетний опыт и многочисленные попытки, до сих пор так и не удалось создать эффективную вакцину, защищающую кошек от заражения вирусным иммунодефицитом. Не получила распространения в силу низкой эффективности и малой доступности терапия этого заболевания у животных. Наиболее распространенные диагностические тесты имеют ряд ограничений. Так, эффективность серологической диагностики снижается в связи с иммунотропностью вируса и склонностью инфекции к длительной латенции. Другие методы (вирусологические, ПЦР в реальном времени) малодоступны из-за сложности выполнения или необходимости наличия специального оборудования (Hartmann K., 2015).

Тем не менее, высокая степень распространения вирусного иммунодефицита кошек, обусловленная малой эффективностью существующих превентивных мероприятий, учитывая тенденцию к сочетанному протеканию ретровирусных инфекций кошек, свидетельствуют о необходимости изучения данных заболеваний и совершенствования методов их диагностики.

Цель и задачи исследования.

В связи с этим целью наших исследований явилась разработка высокочувствительного и специфичного способа диагностики вирусного иммунодефицита кошек.

В соответствии с целью, нами были определены следующие задачи:

1. Оценить эпизоотическую обстановку по вирусному иммунодефициту кошек в Саратовской области с учетом лейкемии.

2. Охарактеризовать ультрамикроскопические изменения, возникающие в лимфоцитах переферической крови кошек при ретровирусных инфекциях.

3. Сравнить эффективнось серологической и молекулярно-генетической диагностики вирусного иммунодефицита кошек.

4. Провести сравнительный компьютерный анализ полногеномных последовательностей и сиквенсов отдельных генов ретровирусов кошек.

5. Разработать эффективные и доступные способы молекулярно-генетической диагностики и дифференциальной диагностики вирусного иммунодефицита кошек.

Научная новизна.

Впервые выявлены эпизоотологические закономерности распространения вирусного иммунодефицита кошек в г. Саратов и Саратовской области, как среди домашних, так и среди бродячих животных.

Впервые изучены морфометрические и биофизические характеристики лимфоцитов кошек, инфицированных вирусами иммунодефицита и лейкемии в сравнении с лимфоцитами интактных животных.

Разработаны, запатентованы и внедрены в практику два новых способа эффективной детекции вируса иммунодефицита кошек с возможностью дифференциальной диагностики инфекции от иммунодефицитной формы лейкемии кошек.

Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа относится к области фундаментальных и прикладных исследований.

Выявленные эпизоотологические закономерности распространения вирусного иммунодефицита кошек в г. Саратове и Саратовской области дают возможность изучить характер развития эпизоотического процесса в зависимости от образа жизни животных и оценить эффективность превентивных мероприятий в условиях отдельно взятого региона. Полученные данные топографических и биофизических изменений в инфицированных лимфоцитах восполняют недостающие сведения и формируют базу для более глубокого понимания патологического процесса в организме инфицированного животного.

Внедрение в ветеринарную практику двух разработанных и запатентованных способов эффективного выявления кошек, инфицированных вирусом иммунодефицита, с возможностью дифференцировать данную патологию от иммунодефицитной формы лейкемии кошек, позволит успешно

контролировать эпизоотическую ситуацию по данным инфекциям, так как своевременная диагностика в настоящее время является приоритетным способом контроля этих заболеваний.

Методология и методы исследований. Для решения поставленных задач использован комплекс как общенаучных, так и частнонаучных методов исследования.

Первые предусматривали применение совокупности общетеоретических и эмпирических методов исследования, таких как системный подход, измерение, анализ, сравнение, эксперимент, моделирование, в том числе компьютерное, статистическая обработка результатов и т.д.

Из частнонаучных использованы эпизоотологические, микроскопические, молекулярно-генетические, серологические, морфометрические, и другие методы исследования, выполненные на высокотехнологичном оборудовании научных подразделений ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ, ФГБОУ ВО Ульяновский ГУ, ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Вирусный иммунодефицит кошек широко распространен в г. Саратове и Саратовской области, характеризуется выраженными эпизоотическими закономерностями и часто регистрируется сочетано с лейкемией.

2. Патогенетическая сущность вирусного иммунодефицита кошек выражается комплексом морфологических и биофизических изменений, развивающихся в инфицированных лимфоцитах.

3. Информативность молекулярно - генетической детекции вируса иммунодефицита кошек значительно превосходит таковую серологической, что положено в разработку новых подходов к диагностике и дифференциальной диагностике данной инфекции.

Степень достоверности и апробация результатов. Достоверность результатов обусловлена значительным объемом экспериментального материала, полученного с использованием высокоинформативных методов исследования в

лабораторных и производственных условиях с подтверждением данных математической статистикой.

Основные материалы диссертационной работы представлены, обсуждены и одобрены на межвузовских, Международных, межрегиональных, Всероссийских научно-практических конференциях: «Новые материалы и технологии: состояние вопроса и перспективы развития», г. Саратов, 2014; «Актуальные направления инновационного развития животноводства и ветеринарной медицины», посвященная 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР и Башкирской АССР, доктора биологических наук, профессора Петра Трофимовича Тихонова, г. Уфа, 2014; «Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России», г. Пенза, 2014; «Молодежь и наука XXI века», г. Ульяновск , 2014; «Молодые ученые в решении актуальных проблем науки», Троицк, 2015; «Актуальные проблемы и перспективы развития ветеринарной медицины, зоотехнии и аквакультуры», г. Саратов, 2016; "Современные аспекты сельскохозяйственной микробиологии", приуроченная к 120-летию со дня создания кафедры микробиологии и посвященная юбилейной дате - 150-летию со дня рождения основателя кафедры и ее первого заведующего, профессора Н.Н. Худякова, г. Саратов, 2016.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Вирусный иммунодефицит кошек: состояние изученности вопроса в историческом аспекте и эпизоотическая ситуация

Вирус иммунодефицита кошек является представителем семейства Retroviridae. В семействе объединены возбудители медленно развивающихся болезней, зачастую неизлечимые и чаще всего заканчивающиеся летальным исходом: вирус опухоли молочной железы, возбудители иммунодефицита человека и обезьян, инфекционной анемии лошадей, возбудитель саркомы Рауса, Т-лимфотропные вирусы человека, вирус энзоотического лейкоза крупного рогатого скота, онкогенные вирусы, Висна-Маеди овец и коз и др. (Сюрин В.Н., Фомина Н.В., 1990).

На сегодня изучение ретровирусов представляет собой большой интерес, как для фундаментальной биологии, так и для составных ее частей, например, генной инженерии, вирусологии, иммунологии.

Для фундаментальной биологии эти представители вирусов интересны тем, что большое количество эндогенных ретровирусов и похожих элементов очень распространены в природе, однако их влияние на организм до конца не изучено. Вместе с тем ретровирусы - единственные представители РНК-содержащих вирусов, способных вызывать онкологию. Другие онкогенные вирусы содержат ДНК.

Ретровирусы являются первыми из обнаруженных инфекционных онкогенных агентов (Ellermann V., Bang O., 1908). Все представители семейства характеризуются наличием определяющих свойств:

• липидная оболочка и сердцевина;

• свойственная морфология;

• обратная транскриптаза (РНК-зависимой ДНК-полимеразы);

• внутри вириона - геном в форме однонитчатой линейной РНК, комплекс, состоящий из двух идентичных субъединиц (около 3 кД

каждая), репликация происходит стадию образования двухнитчатого ДНК-провируса;

• интеграция ДНК-провируса с клеточным геномом;

• осуществление транскрипции клеточной РНК-полимеразой;

• созревание вирионов путем почкования на клеточных мембранах.

Принадлежность агента к ретровирусам определяют по его морфологии,

чувствительности репликации к ингибиторам синтеза ДНК в первые 4 - 6 часов после заражения физическим и химическим свойствам (Teich N., 1982; Супотницкий М.В., 2009).

Одно из самых важных свойств ретровирусов - это высокая степень генетической изменчивости, которая сильно снижает эффективность мер специфической борьбы и профилактики, а также приводит к расширению ареала действия и способствует переходу к новым видам организмов. Данная группа вирусов неоднократно преодолевала межвидовой барьер. Имеют место быть случаи адаптации вирусов животных на человеке. Одним из таких ярких примеров являются вирусы иммунодефицита человека ВИЧ 1 и ВИЧ 2, которые ранее вызывали заболевания только у обезьян (Супотницкий М.В., 2009).

Критичность состоит ещё и в том, что представители этого семейства зачастую могут не один год жить в заражённом организме, не давая никаких признаков о себе, при этом представлять угрозу инфицирования для здоровых восприимчивых организмов. Эти вирусы характеризуются горизонтальной и вертикальной передачей. Первая представляет собой передачу инфекции при контакте, с пищей, при случке, а вторая - от матери к плоду (Coats K.S. et al., 2010; Chang-Fung-Martel et al., 2013). Замечено, что очень часто вирусный иммунодефицит кошек протекает сочетанно с другой ретровирусной инфекцией -лейкемией (Hartmann K., 2012).

Злокачественные новообразования и оппортунистические (вторичные) инфекции представляют собой тяжелые и очень опасные последствия вируса лейкемии и иммунодефицита, проявляющиеся в трансформации зараженных

клеток и нарушении иммунитета (Maddon P.J. et al., 1986; Bucy D.S. et al., 2011; Baxter K.J. et al., 2012).

Впервые выделение ретровируса из лейкоза кур описали в 1908 году датские ученые Эллерман и Банг. Затем интерес к данному семейству разгорелся благодаря пионерским исследованиям Пейтона Рауса, который в 1911 году выделил первый официально признанный онкогенный вирус - возбудитель саркомы кур, а в 1950 г Людвиг Гросс доказал вирусную этиологию лейкоза мышей.

Вероятнее всего ретровирусы произошли от ретротранспозонов, являющихся подвижными участками генома эукариот.

Впервые название Retroviridae предложено в 1973 г В.Парксом. В отдельное семейство этот вид вирусов был отнесен в 1974 г.

Сегодня семейство ретровирусов не расположилось ни в одном из 7 порядков, имеет самостоятельный таксон царства Vira.

На основе данных Международного комитета по таксономии вирусов (ICTV) ретровирусы принято классифицировать следующим образом:

Family: Retroviridae (2 Subfamilies)

Subfamily: Orthoretrovirinae (6 Genuses) Genus: Alpharetrovirus (9 Species) Genus: Betaretrovirus (5 Species) Genus: Deltaretrovirus (4 Species) Genus: Epsilonretrovirus (3 Species) Species: Feline leukemia virus Genus: Gammaretrovirus (17 Species) Genus: Lentivirus (9 Species)

Species: Feline immunodeficiency virus Subfamily: Spumaretrovirinae (1 Genus) Genus: Spumavirus (6 Species)

Первый случай выделения вируса иммунодефицита кошек (FIV) был зарегистрирован в 1986 году в питомнике северокалифорнийского города Паталума ветеринарным врачом Педерсеном и его коллегами (Pedersen N.C. et al., 1987). После этого вирус был обнаружен в Швейцарии и в других европейских странах таких, как Великобритания, Франция и Голландия. В настоящее время заболевание приобрело эндемичный характер у кошек по всему свету. Оно сопровождается развитием разнообразных клинических симптомов, что влечет за собой нарушение правильного функционирования иммунной системы. При этом в колонии не была выявлена инфекция, вызванная вирусом лейкемии кошек. Секвенирование дало основание отнести вирус к семейству Retroviridae и его назвали Т-лимфотропный лентивирус кошек (ТЛЛК).

(http: //www.ictvonl ine.org/virusTaxonomy .asp).

Профессор патобиологии в колледже ветеринарной медицины Ямамото посвятил большую часть своей карьеры изучению этого заболевания и способов борьбы с ним. В 1985 году она основала лабораторию сравнительной иммунологии и ретровирологии в университете Дэвис. Вместе с Нильсом Педерсоном они трудились над выделением FIV, а уже в 1987 году обнародовали свои результаты в журнале Наука.

В 1991 году FIV был отнесен к роду Lentivirus семейства Retroviridae, а в 2002 род Lentivirus включили в подсемейство Orthoretrovirinae.

В настоящее время в группе Feline lentivirus выделяют 6 генотипов: A, B, C, D, E и F, вирусное разнообразие среди FIV определяет ген env (Olmsted R.A. et al., 1989). Помимо этого, в природных популяциях выявлены несколько интерподтипов FIV-рекомбинантов: A/B, A/C и B/D (Bachmann M.H. et al., 1997; Hayward J.J., Rodrigo A.G., 2008). Кроме всего прочего изучаемый вирус отличается особым генетическим разнообразием: последовательности нуклеотидов могут изменяться до 15% внутри подтипов и до 38% между подтипами. (Сулимов А.А., 2004). Субтип А распространен в Австралии, Новой Зеландии, Соединенных Штатах, Южной Африке и Северо-Западной Европе (Steinrigl A., Klein D., 2003; Kann R. et al., 2006a; 2006b; 2007a; 2007b). Подтип B

был выявлен в Центральной и Восточной части США, Центральной Европе, Бразилии, Восточной Японии (Sodora D.L. et al., 1994; Kakinuma S. et al., 1995; Pistello M. et al., 1997; Nishimura Y. et al., 1998; Steinrigl A. Klein D., 2003; Martins A.N. et al., 2008). Субтип С - в Канаде, Новой Зеландии и юго-Восточной Азии (Uema M. et al., 1999; Nakamura K. et al., 2003; Reggeti F. et al., 2004). Подтипы D и Е встречаются редко, обнаружены на юго-западе Канады, в Японии и в Аргентине (Pecoraro M.R. et al., 1996; Nishimura Y. et al., 1998). Вариант F определен сравнительно недавно и территория его распространения недостаточно изучена (Westman M.E. et al., 2015).

Возбудитель вирусного иммунодефицита кошек, Feline immunodeficiency virus (FIV), включен в род лентивирусов. Лентивирусы не являются онкогенными и способны приводить организм к медленным, хроническим и дегенеративным патологическим изменениям в инфицированном организме, часто их относят к развитию аутоиммунных поражений (Desrosiers R.A., 2001). Все лентивирусы поражают прежде всего моноциты и макрофаги крови. FIV инфицирует Т-клетки и, следовательно, связан в основном с клиническими признаками иммунодефицита в зараженном организме (Turelli P. et al., 1997; Chen H. et al., 1999; Agnarsdottir G. et al., 2000).

Вирус лейкемии кошек (FeLV), являющийся близкородственым FIV, впервые обнаружил у домашних животных доктор Джарнетт в 1964 году в Шотландии в Университете Глазго. FeLV включает в себя пять подгрупп согласно антигенным различиям, детерминированных геномом. Различают A, B, С, Т и D типы вируса. Возбудитель лейкемии кошек существует в двух формах -экзогенной (патогенной) и эндогенной (непатогенной). (Anderson M.M. et al., 2000).

Эпизоотическая ситуация по вирусному иммунодефициту кошек

Вирусный иммунодефицит относят к контагиозным инфекциям. Его возбудитель переносятся контактно, аэрогенно, алиментарно, трансмиссивно. Существует как в клетках гемопоэтической системы, так и в слизистых оболочках

респираторных путей и желудочно-кишечного тракта. Можно выделить со слюной, мочой и калом животных, которые заболевают.

Вирусом иммунодефицита страдают все без исключения из семейства кошачьих. В их числе и львы, и пумы, и снежные барсы, и леопарды, тигры, пантеры, ягуары, рысь и манула. Данное заболевание признано природно-очаговым. Так в Северной Америке FIV инфекция обнаружена у пум - 41 %, рыси - 22 %, домашней кошки - 10%. Распространение вируса кошачьего иммунодефицита обуславливается прежде всего видом и возрастом животных и на него не влияет географическое местоположение. (Troyer J.L. et al., 2008; VandeWoude S. et al., Poss M., 2010). Филогенетический анализ дает возможность понять, что FIV переносится всеми кошачьими, по причине того, что адаптация вируса к ним была достаточно давно, более 10000 лет назад (Frank L. et al., 2005; Antunes A. et al., 2008; Pecon-Slattery J. et al., 2008). Известно также, что FIV поражает и африканских гиен. (VandeWoude S. et al., 2006).

Вирус иммунодефицита кошек нашел наибольшее распространение среди бездомных животных и в семьях, где одновременно проживают нескольких питомцев. Скорость распространения вируса напрямую зависит от числа бродячих кошек, при этом даже в развитых странах патология существует у 20 % всей популяции кошачьих. Данной инфекции свойственны два пути передачи возбудителя. Горизонтальная передача наблюдается при непосредственном близком контакте. Зачастую заражение производится через слюну при драках кошек. Это послужило причиной половой детерминации вируса и объясняется тем, что среди самцов ВИК встречается в три раза чаще. Вертикальный способ передачи возбудителя инфекции фиксируется намного реже и на сегодня его механизм детально не изучен. При этом до сих пор нет достоверных данных о половом способе заражения кошек.

К заражению предрасположены кошки всех возрастов, но патология замечена у представителей старше 6 лет, это позволяет чаще всего отличить болезнь от лейкоза. Информации о том, что вирус иммунодефицита кошек может причинить вред здоровью человека, нет, все наблюдения и исследования показали

обратный результат. Также не обнаружено заражение ВИК-ом других видов животных.(http://vetacademy.ru/publ/bolezni/infekcionnye/virusnyj_imшunodefícit_ko shek/3-1-0-64)

Замечено, что персидские кошки менее чувствительные к заболеваниям, нежели сиамские, соответственно, распространенность вируса может зависеть и от породы. Вирусной лейкемией, например, заболевают не только домашние, но и дикие кошки, такие, как камышовые коты, тигры, львы и т.п. Болезнь можно обнаружить у животного в возрасте от года до шести лет (Cunningham M.W. et al., 2008).

В результате рассмотрения влияния каждого фактора на частоту, с которой кошка будет сталкиваться с другими кошками вне дома, где она проживает, эпизоотологические тенденции могут быть сформированы по-разному. Практически во всех возможных вариантах при наблюдении достаточный уровень распространения заболевания замечается у кошек, чаще других встречающихся и контактирующих с другими представителями своего семейства. К примеру, старые кошки рискуют больше по причине того, что у них активно социальное поведение и наблюдается агрессивность характера по сравнению с молодыми особями; самцы больше передвигаются и чаще затевают драки, чем самки; непородистым кошкам зачастую позволено гулять свободнее, а породистых представителей семейства полностью или частично ограничивают в перемещениях, соответственно, и в контактах с другими особями.

Вирус иммунодефицита чаще всего передается котятам от инфицированных кошек внутриутробно, через слюну во время ухода, с молоком (Pepin A.C. et al., 2008). Сведения, полученные экспериментальным путем, информируют о том, что не все котята в помете инфицируются внутриутробно (Coats K.S. et al., 2010). Заражение плода от FIV-инфицированных самок возникает на 3 - 4 недели беременности, и заболевание прогрессирует по мере развития беременности, затрагивается нервная система плода и неизбежна его гибель в первой половине беременности. Вирус находят у 0-5-38-60 % котят, которые извлекают из матки в 3-5-7-9 недель беременности соответственно (Rogers A.B. et al., 1998). В помете

FIV-инфицированной кошки от 51 до 95 % котят получают заражение внутриутробно. Вирус и провирус могут быть обнаружены в крови, мозге, печени, костном мозге, селезенке и вилочковой железе плода (Weaver C.C. et al., 2005; Boudreaux C.E. et al., 2009), даже при отсутствии вируса в плаценте (O'Neil L.L. et al.,1996; Rogers A.B. et al., 2002). FeLV практически не переносится вертикально котятам, в отличие от FIV (O'Neil L.L. et al., 1995). Лейкемия кошек наследуется лишь в 5 % случаев. Заражение котят возникает клострально и контактно в постнатальный период (Allison R.W. et al., 2003; Coats K.S. et al., 2010). Наиболее беззащитными к заболеванию оказываются молодые животные, нежели их более взрослые представители семейства (Meli M.L. et al., 2009). У кошек, несущих виремию, беременность ведет к эмбриональной смерти, рождению мертвых котят или котят с виремией, это, безусловно, приводит к гибели в кратчайшие сроки. У кошек с латентной инфекцией передача вируса осуществляется не в период беременности (LL O'Neil et al, 1996). Очень редко у некоторых котят виремия наблюдается после рождения. Так, заражение возникает через отдельные молочные пакеты. В них вирус реплицировался в последний период беременности (Meli M.L. et al., 2009).

Иммунодефицит широко распространен по всему свету. Происходит это потому, что велико число бездомных кошек и часто возникают контакты между ними. Было доказано, что 1 - 12 % здоровых и 10 - 20 % больных кошек во всем мире являются носителями вируса иммунодефицита. Например, иммунодефицит наблюдается и у долго живущих кошачьих. Серологические исследования также доказывают широкое распространение этого заболевания. Вероятно, оно существовало в популяции кошек многие годы, но оставалась неопознанным. Так, самый высокий процент распространения вируса иммунодефицита кошек отмечается в Японии и составляет почти 44 %. Несколько ниже цифра получена при проведении исследований во Франции, Канаде и США; 22,1 % ,19 % и 14 % соответственно. В Англии число инфицированных кошек составляет 12,8 %, в Швейцарии - 3,7 %, в Голландии - 3,1 %. Есть данные о высоком распространении

данного заболевания в нашей стране - от 12 % до 18 % (Povey R., 1989; Федосов Д.В., 2007).

Анализы, выявляющие данную инфекцию, проводят сочетано с анализами на выявление лейкемии. Причина всему то, что прогноз заболевания и характер применяемой терапии будут связаны с диагнозом, несмотря на то, что клинические признаки при FeLV- и FIV-инфекции зачастую очень похожи. Вероятность выявления FIV, по сравнению с FeLV росла с увеличением возраста животных (Bimal K Chhetri et al., 2015). К примеру, в Северной Каролине лейкоз был обнаружен у 2,7 %, а иммунодефицит - у 7,3 % среди кошек, у которых диагностировались офтальмологические патологии (Jinks M.R. et al., 2015). В Канаде помимо обнаружения ретровирусов у кошек исследование показало серораспространенность FeLV - 2,3-3,5 % и FIV - 2,5-5,5 %, несмотря на то, что микст-инфекция была выявлена в 0,3-0,5 % случаев. В качестве исключения из выявленного правила выступила столица страны, Оттава, там FeLV диагностировали у 17,4 %, а FIV у 28,9 % кошек (Little S. et al., 2011; Stojanovic V. et al., 2011). Подобные тестирования имели место быть и на острове Ньюфаундленд, они также были направлены на выявление вируса иммунодефицита кошек и лейкоза среди домашних и диких популяций. Положительные результаты на наличие FIV были отмечены у 2,2-2,7 %, а на FeLV у 1,8-6,2 % животных (Hannah J. et al., 2014). Изучение распространения данных заболеваний не останавливаются лишь на домашних и бродячих кошках. Тестирование проводят и на диких представителях семейства, не только для оценки распространения инфекций, но и для рассмотрения того, нет ли угроз вымирания видов популяций. К примеру, в Калифорнии лейкоз нашли у 5,4 % горных львов (Foley J.E. et al., 2013). При этом во Флориде в сообществе дикой рыжей рыси иммунодефицит выявили у 7,1 % особей (Levy J.K. et al., 2011; Lagaña D.M. et al., 2013). В Аргентине благодаря Вестерн-блоттингу иммунодефицит был определен у 34,6 % кошек (Uhart M.M. et al., 2012). В Мексике заболеваемость животных FeLV приблизилась к 7,5 % и FIV - к 2,5 % (Ortega-Pacheco A. et al., 2014). Антитела к FIV в Бразилии составила 11,7-16,6 %

у изучаемых кошек, а посредством ПЦР вирусный антиген выявили у 37,5 % животных, РИФ при определении FeLV дала положительный результат в 11,52 % случаях (de Almeida N.R. et al., 2012; Furtado M.M. et al., 2013; Mar?ola T.G. et al., 2013). В Чили исследования проводили методом ПЦР и секвенирования, там от 3 до 13 % диких и домашних кошек были инфицированы FIV и 20-33,3 % FeLV (Mora M. et al., 2015). В ирландском городе Дублин кровь, которую приготовили для переливания, имела в своем составе FIV и FeLV в 4,35 % и 1,09 % соответственно (Juvet F. et al., 2011). Подобные исследования проводилось и в Польше, были получены не менее интересные результаты. Исследователи говорят о том, что вирус лейкемии носят в этой стране 6,4 %, а вирус иммунодефицита 4,3 % кошек (Rypula K. et al., 2014). В Германии серопозитивными по отношению к ретровирусам стали чуть более 1 % кошек (Englert T. et al., 2012; Morgenthal D. et al., 2012). На Ибице бродячие представители семейства были инфицированы по отношению к FeLV в 16,2 % и к FIV в 20,9 % пробах, оба заболевания обнаружились у 9,5 % кошек (Miro G. et al., 2011;Sherry K. et al., 2011). Пиренейская рысь принадлежит к редкому, исчезающему виду из представителей кошачьих, проживает в Национальном парке Кото Доньяна, располагающемся на юго-западе Испании. В 2006-2007 г. была зафиксирована критичность FeLV, в результате воздействия которой погибли около 2/3 заразивщихся особей. Все FeLV - инфицированные были заражены кошачьей гемоплазмой (Geret C.P. et al., 2011). Инфицированность FIV и FeLV в Каире обнаружилось у 33,9 % и у 4,6 % особей соответственно. В Зимбабве FeLV определили у 41 % кошек (Muchaamba F. et al., 2014). В сообществе домашних и бродячих кошек в Стамбуле FeLV зарегистрирован у 11 %, а FIV у 1 % животных (Tekelioglu B.K. et al., 2015). У 24,5 % исследуемых кошек была зафиксирована инфицированность FeLV и у 20,1 % FIV. Наличие антител FIV в высокой степени зависит и от пола, и от возраста, а наличие FeLV - в прямой зависимости от возраста. Если говорить о FIV, то чаще болеют особи мужского пола, чем женского; у кошек возрастом более 10 лет возможность заразиться в 13,5 раза больше, чем у кошек, младше 1

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мелеховец Юлия Алексеевна, 2017 год

— —

Рисунок 24 - Электрофореграмма результатов исследования биологического материала от кошек с применением разработанных праймеров

Примечание: пробы 3, 4, 5, 17, 18 - положительные; К+ - положительный контроль; К- отрицательный контроль.

Как показано на рисунке 24, пробы 3, 4, 5, 17, и 18 являются положительными при исследовании клинического материала, полученного от

кошек (кровь, слюна), разработанным способом детекции FIV. Следовательно, разработанный способ является воспроизводимым.

На разработанный способ получен Патент РФ №2553534. Способ позволяет детектировать на ранних стадиях FIV - инфекции высоко консервативную область гена gag вируса иммунодефицита кошек, общую для всех типов данного возбудителя, что позволяет выявлять животных, инфицированных любым типом вируса. Проведение реакции обратной транскрипции перед постановкой ПЦР позволяет выявлять вирусную РНК возбудителя FIV в слюне животных. Использование предлагаемой модификации ПЦР позволяет значительно снизить себестоимость анализа по сравнению с проведением ПЦР в реальном времени, что важно для владельцев животных, и делает диагностику доступной для рядовой ветеринарной лаборатории.

3.2.3.4 Разработка способа детекции FIV и FeLV методом

мультиплексной ПЦР

Результаты наших исследований и литературные данные свидетельствуют, что ретровирусные инфекции кошек достаточно часто обнаруживают у одного животного в виде микст-инфекции. При этом прогноз заболевания напрямую коррелирует с формой инфекции. Следовательно, разработка эффективного, быстрого и недорогого способа обнаружения ДНК провирусов иммунодефицита и лейкемии кошек методом мультиплексной ПЦР является важной задачей при дифференциальной диагностике ретровирусных инфекций у кошек.

Разработка способа диагносики и дифференциальной диагностки вирусного иммунодефицита и лейкемии кошек методом мультиплексной ПЦР осуществлялась в четыре этапа:

- анализ структуры геномов FIV и FeLV и конструирование праймеров к наиболее консервативным участкам генома каждого из возбудителей;

- подбор оптимально сочетающихся между собой двух пар праймеров (для FIV и FeLV);

- моделирование состава реакционной смеси;

- определение воспроизводимости способа.

Анализ и сравнительный анализ геномных последовательностей FIV и FeLV, размещенных на ресурсе NCBI, осуществлялись методом компьютерного моделирования с применением авторских компьютерных программ: «Нуклеотидные последовательности и характеристики геномов, вариабельных тандемных повторов, олигонуклеотидных праймеров и зондов штаммов возбудителей бактериальных и вирусных инфекций I—II групп патогенности» (Свидетельство о госрегистрации базы данных №2011620585 (авторы - Яшечкин Ю.И., Найденова Е.В., Щербакова С.А.)). С помощью авторской компьютерной программы «Программа расчета олигонуклеотидных праймеров на гомологичных геномах РНК-содержащих вирусов для их выявления в ПЦР и формирования базы данных» (Свидетельство о госрегистрации программ для ЭВМ №2013613699 (авторы - Яшечкин Ю.И., Найденова Е.В., Щербакова С.А.)) геном вирусов в формате FASTA применяли для подбора праймеров на участке гена gag FIV и на участке, расположенном непосредственно перед геном gag-pro-pol FeLV, как наиболее консервативных областях геномов данных вирусов, как показали наши предыдущие исследования.

В результате компьютерного моделирования был осуществлен дизайн нескольких пар праймеров для каждого из исследуемых возбудителей. При дизайне праймеров главными требованиями были: высокая степень гомологии с выбранным участком гена; отсутствие самокоплементарных участков внутри праймеров и комплементарности друг другу, чтобы не допускать возникновения устойчивых вторичных структур (димеров); близость значений температуры отжига и плавления праймеров. Проверку качества и термодинамический анализ праймеров осуществляли с помощью программ OLIGO DNA/RNA primer analysis software, v.5.0. и BLAST. Подбор оптимально сочетающихся между собой двух пар праймеров был осуществлен по результатам исследований in vitro.

В таблице 5 представлены характеристики двух пар праймеров, которые были отобраны основании проведенного компьютерного анализа и экспериментов in vitro.

Таблица 5 - Характеристика разработанных праймеров

Genom FIV FeLV

Prm F AAGAGTCCCAAATA GAATAAACCTCTTGCT

TGCCATAGG GTTTGC

Prm R TCCATCCAAATTGCT AATCAGATCGAATGA

ACTGTTC CAGAGACAC

lenAmp, п.н. 397 221

GCprm, % 42 42

GCproduct, % 40 56

Tproduct, °С 74 79

Topt, °С 55 55

dG3, cal/mol 0 0

dGall, cal/mol -1 -1

GomMedian, % 96 96

Как следует из данных таблицы 3, выбранные пары олигонуклеотидных праймеров (FIVF и FIVR; FeLVF и FeLVR) имеют оптимальные размер, а также структуру, о чем свидетельствуют показатели энергии Гиббса на 3' конце (0 cal/mol) и энергии Гиббса димерных структур (-1 cal/mol). GC состав (42 %) и температуру отжига для обоих пар праймеров (55 °С) также являются оптимальными. Продуктом амплификации при использовании одной пары (FIV F и FIV R) является фрагмент длиной 397 п.н., в результате работы другой пары (FeLVF и FeLVR) образуется длиной 221 п.н.

ПЦР с подобранными двумя парами праймеров проводили в объеме реакционной смеси 25 мкл на 1 пробу. Состав реакционной смеси представлен в таблице 6.

Таблица 6 - Состав реакционной смеси

Компоненты Объем на 1 реакцию (25 мкл), мкл

Буфер 10-и кратный для ПЦР 2,5

дНТФ (2 мМ) 0,4

праймер FIV F (15 пмоль/мкл) 1

праймер FIV R (15 пмоль/мкл) 1

праймер FeLV F (15 пмоль/мкл) 1

праймер FeLV F (15 пмоль/мкл) 1

Полимераза Тад (5 ед./мкл) 0,2

MgCl2 (25 мМ) 1,5

Вода бидистиллированная 11,4

Проба ДНК 5

Состав реакционной смеси подбирали таким образом, чтобы концентрация ионов М^СЬ обеспечивала оптимальную скорость и точность работы фермента Taq-полимеразы, а концентрация дНТФ могла обеспечить синтез двух ампликонов. Содержание праймеров было 15 пмоль/мкл и объем пробы - 5 мкл для повышения специфичности реакции. При использовании амплификатора с крышкой без нагрева на смесь наслаивали 20 мкл минерального масла для ПЦР. При использовании амплификатора с нагревающейся крышкой минеральное масло не требовалось.

Проведение ПЦР с разработанными двумя парами праймеров осуществляли на амплификаторах «АМПЛИ 4» («Биоком», Россия) и «Т100» («BюRad», США). Температурно-временной режим проведения реакции для используемых амплификаторов представлен в таблице 7.

Таблица 7 - Температурно-временной режим проведения ПЦР

Этап Т, °С Время, сек. Количество повторов

«АМПЛИ 4» «ЫоЯаё Т100»

Начальная денатурация 95 180 180 1

Денатурация 95 60 20 35 циклов

Отжиг 56 60 20

Элонгация 72 60 40

Заключительная элонгация 72 300 300 1

Хранение 4 - 600 1

Для амплификаторов с активным регулированием температуры по раствору в пробирке, таких как, «Т-100», время прохождения всех этапов амплификации было установлено меньше, чем для амплификатора с матричным регулированием температуры, например «АМПЛИ 4».

Учет осуществляли методом гельэлектрофореза в 1,5% агарозном геле с добавлением бромистого этидия в качестве интерколирующего красителя для ДНК. Фоторегистрацию результатов ПЦР осуществляли на оборудовании фирмы «BioRad» (США). Для определения размера ампликонов после проведения ПЦР с разработанными праймерами использовали маркер молекулярных масс «1 кЬ

DNA ladder» («Stratagene», США) (рисунок 25). Разница в размере ампликонов составляла около 200 п.н., что оптимально для фиксации результатов реакции.

Рисунок 25 - Определение размеров амплифицируемых фрагментов

Примечание: пробы 1, 4, 5, 7 и 8 являются FIV и FeLV - положительные;

пробы 2, 3 и 6 содержат только ДНК FeLV

На рисунке 25 показано, что в электрофоретических треках проб 1, 4, 5, 7 и 8 визуализируются полосы на уровнях 397 п.н. и 221 п.н., что свидетельствует о наличии в пробах ДНК провирусов FIV и FeLV. В электрофоретических треках проб 2, 3 и 6 присутствуют только полосы на уровне 221 п.н., что является показателем присутствия в пробах только ДНК провируса FeLV.

Для проверки воспроизводимости разработанного способа с клиническим материалом в качестве положительного контроля использовали ДНК, выделенную из крови кошек, у которых наличие FIV и FeLV были установлены методом иммунной хроматографии (Animal Genetics, inc., Корея) и подтверждены методом Real-time PCR (ООО ИнтерЛабСервис, Россия). Для исследования разработанным способом использовали пробы крови, полученные от кошек, подозрительных в заражении вирусным иммунодефицитом и лейкемией (рисунок 26).

123456789 10 К+ К

Рисунок 26 - Результаты исследования крови кошек разработанным способом

Примечание: пробы 1, 2, 3, 4, 5, 9 - У1У и УвЬУ - положительные;

пробы 6, 7, 10 содержат только ДНК ЕвЬУ;

проба 8 - отрицательная;

К+ - положительный контроль;

К - отрицательный контроль.

На рисунке 26 отражено, что пробы 1, 2, 3, 4, 5 и 9 содержат ДНК провирусов Е1У и ЕвЬУ, электрофоретическая подвижность ампликонов которых составляет 397 п.н. и 221 п.н. соответственно, что совпадает с размерами ампликонов, содержащихся в положительном контроле (К+). Пробы 6, 7 и 10 содержат только ДНК провируса ЕвЬУ, электрофоретическая подвижность ампликонов которого составляет 221 п.н., а проба 8 - отрицательная. В электрофоретическом треке, соответствующем отрицательному контролю (К-), полосы отсутствуют.

На разработанный способ получен Патент РФ 2586504. Способ является доступным по стоимости, достоверным, высокоспецифичным и высокочувствительным методом детекции провирусной ДНК вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в лимфоцитах крови животных в короткие сроки. При этом компьютерный анализ показал отсутствие реакции на гомологичные и гетерологичные организмы.

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Согласно литературным данным и результатам собственных исследований ретровирусы широко распространены в популяции кошек. Чтобы эффективно контролировать распространение ретровирусов, необходимо учитывать специфичность биологии возбудителей: особенности их взаимодействия с макроорганизмом, механизм патогенетического воздействия и развития инфекционного процесса, особенности эпизоотических проявлений и много других факторов.

Благодаря высокому адаптивному потенциалу ретровирусы распространились повсеместно. В эндемичных регионах степень инфицирования среди восприимчивых организмов стремиться к 100 % (Suh G.H. et al., 2005).

Иммунная система - одна из важнейших гомеостатических систем организма, которая во многом определяет степень здоровья, как людей, так и животных, и их адаптивные возможности (Федоров Ю.Н., 2006). Ретровирусы избрали ее местом своего паразитирования. Они медленно, но верно выводят ее из равновесия, уничтожают, а вместе с ней и зараженный организм, делая его уязвимым для любых агрессивных факторов внешней и внутренней среды (Corredor A.G et all, 2009).

Диагностика, в том числе дифференциальная, в ретровирусной патологии, несомненно, играет огромную роль. Важно вовремя выявлять инфицированных животных, чтобы защитить от заражения здоровых. В случае лейкемии кошек поможет вакцинирование, а при иммунодефиците - только изоляция. Защитить необходимо не только животных, но и человека. Животные, инфицированные вирусом лейкоза, представляют собой опасность и для определенных категорий людей, так как FeLV потенциально опасен для человека (Hartmann К., 2015).

Прогноз при заражении животных вирусами иммунодефицита и лейкемии неблагоприятный. Однако в последнее время ведутся активные поиски как протективных средств, так и препаратов специфической терапии, вызываемых данными вирусами заболеваний. Лечение заболеваний, вызываемых ретровирусами у животных, представляет большую трудность. Так как

специфические антиретровирусные препараты не только токсичны, они также дорогостоящие и достаточно редкие. А поддерживающая терапия не дает ожидаемых владельцами животных результатов.

Поэтому владельцы животных должны ответственно подходить к своему выбору: брать кошек у проверенных заводчиков, а подобранных на улице животных обязательно подвергать исследованиям на носительство инфекции.

В общей сложности, серологическими и молекулярно-генетическими методами нами было исследовано 388 кошек. По нашим данным, из числа обследованных бродячих животных FIV-позитивными оказались 50 % кошек, а FeLV- положительными - 43 %. При этом сочетанное инфицирование обоими вирусами было выявлено у 33 % обследованных животных. Среди обследованных нами клинически здоровых животных лишь 9 % показывали наличие в крови провируса иммунодефицита кошек. Возбудитель FeLV у них обнаружен не был. Тогда как среди животных со стоматологическими проблемами, другими воспалительными поражениями слизистых оболочек и кожи FIV- носительство было установлено у 60 % кошек. У 37 % животных констатировали наличие FeLV. При этом в 23 % случаев у кошек регистрировали одновременно FIV-FeLV-микстинфекцию. Полученные нами результаты показывают довольно высокий уровень инфицирования животных, что коррелирует с данными мировой литературы (Sherry K. et al., 2011; Uhart M.M. et al., 2012).

При определении эпизоотологических закономерностей было установлено, что более половины инфицированных животных являлись самцами, треть -самками и лишь 16 % из них были вазэктомированными самцами. Согласно полученным данным наиболее часто вирусный иммунодефицит выявляется у котов, что можно объяснить их высокой агрессивностью и большей контактностью. Степень FIV-инфицирования у кошек с возрастом прогрессирует. Однако во взрослом состоянии организм способен более или менее эффективно сдерживать инфекцию. Поэтому некоторые исследователи констатируют, что FIV-инфекция, по большому счету, не сказывается на продолжительности жизни кошек (Orosz C.G. et al., 1985; Jenkins K.S. et al., 2013;Соломахина Л.А.,2016). По

нашим данным среди FIV-инфицированых животных почти 90 % являлись представителями беспородных домашних кошек, не ограниченных в передвижении. Выявленные закономерности свидетельствуют о том, что для заражения вирусом иммунодефицита кошки должны регулярно контактировать с носителями инфекции. Единичные контакты, вероятнее всего, не приведут к заражению.

Результаты клинических исследований животных показали, латентное течение FIV-инфекции регистрируется в 4 раза чаще, чем острое, а наиболее частыми осложнениями FIV-инфекции являются: хронические рецидивирующие стоматиты, признаки поражения печени и почек, диарея, отиты, конъюнктивиты, риниты, поражения кожи, бронхиты и пневмония. Следует отметить, что в большинстве случаев наблюдалось сочетанное развитие симптомов, а клинические проявления носили рецидивирующий характер.

При АСМ-сканировании нами были установлены достоверные различия лимфоцитов крови здоровых и инфицированных ретровирусами кошек: инфицированные лимфоциты имели меньший диаметр и объем клеток, поверхность их была менее шероховатой, и при этом наблюдалось уменьшение величины модуля Юнга по сравнению с показателями лимфоцитов здоровых кошек.

Сравнительный анализ результатов серологических и молекулярно-генетических исследований показал, что диагностическая ценность ПЦР превышает эффективность ИХА при диагностике FIV-инфекции в 2,58 раз. Наши данные подтверждают результаты бразильских исследователей, показавших превосходство ПЦР по сравнению с ИХА в 2,65 раз (Furtado M.M. et al, 2013).

Результаты наших исследований подтверждают мнение ряда авторов, что с помощью ПЦР можно исследовать широкий диапазон биологического материала с высокой вероятностью обнаружения инфицирующих агентов (Pacitti A.M. et al, 1986; Gomes-Keller M.A. et al, 2006, 2009; Cattori V. et al, 2009;).

Сравнительный компьютерный анализ вирусных геномов показал, что вирусы иммуннодефицита и лейкоза содержат аналогичный набор генов и имеют

примерно одинаковый размер геномов, что объясняется их тесной филогенетической связью. Однако набор продуктов экспрессии этих генов, образовавшийся в процессе эволюции вирусов, различен, что определяет высокие адаптивные способности ретровирусов. Так, уровень генетической вариабельности между «дикими» и «городскими» штаммами FIV достаточно выраженный. Внутри каждой группы различают по 5-6 субтипов. Наибольшая вариабельность обнаруживается у вирусов диких представителей семейства кошачьих, что, вероятнее всего, обусловлено более жесткими условиями естественного отбора.

Как уже было отмечено, ПЦР является самым достоверным и удобным способом диагностики ретровирусных инфекций животных (Zhang S. et al, 1997; Прохватилова Л.В. и соавторы, 2001; Комарова И.Н., 2005). Каждая модификация имеет свои минусы и плюсы. Так ПЦР в реальном времени является наиболее специфичным, но дорогостоящим методом. Провести анализ методом классической ПЦР можно на оборудовании стоимостью более чем на порядок ниже. Однако для скрининговых исследований Real-Time PCR может оказаться незаменимым, так как данный способ не только сокращает время анализа, но и значительно снижает вероятность контаминации нуклеиновыми кислотами в лаборатории. Кроме того, ПЦР в реальном времени позволяет дать количественную оценку результатам, то есть определить вирусную нагрузку на организм животного. Что касается мультиплексного варианта ПЦР, исследование животных одновременно на обе инфекции сокращает не только время проведения, но и стоимость анализа вдвое. Поэтому возникла необходимость разработки и внедрения в практику новых доступных и безопасных методов детекции вирусов иммунодефицита и лейкемии животных. Всего нами было разработано 2-а новых способа.

Выводы

Полученные нами данные позволяют сделать следующие выводы:

1. ^/К-носительство было выявлено у 9 % обследованных клинически здоровых животных, среди кошек с клиническими осложнениями ^/К-инфекция была констатирована в 60 % случаев, у 50 % обследованных бродячих кошек в крови был обнаружен провирус ПУ.

2. У 33 % бродячих кошек была зарегистрирована - ГвЬК коинфекция, при этом ЕвЬУ-инфекцию выявляли у 43 % обследованных животных.

3. У 23 % домашних кошек с клиническими осложнениями была зарегистрирована Е1У - ЕвЬУ коинфекция, при этом ЕвЬУ-инфекцию выявляли у 37 % обследованных животных.

4. Ультрамикроскопические исследования показали, что инфицированные ретровирусами лимфоциты кошек имеют меньший объем клеток по сравнению с неинфицированными, при этом у них зафиксировано уменьшение шероховатости и величины модуля упругости цитолеммы.

5. Эффективность ПЦР при диагностике ^/К-инфекции превосходит информативность ИХА в 2,5 раза.

6. Сравнительный компьютерный анализ вирусных геномов показал, что уровень генетической вариабельности между «дикими» и «городскими» штаммами достаточно выраженный, внутри каждой группы различают по 5-6 субтипов и наибольшая вариабельность обнаруживается у вирусов диких представителей семейства кошачьих.

7. Разработанные способы диагностики и дифференциальной диагностики ^/К-инфекции позволяют достоверно выявлять инфицированных животных при исследовании крови и слюны.

Практические предложения.

1. Предложен способ, позволяющий детектировать на ранних стадиях высоко консервативную область гена gag вируса иммунодефицита кошек, общую для всех генетических вариантов FIV, что позволяет выявлять животных, инфицированных любым типом вируса. Проведение обратной транскрипции позволяет выявлять вирусную РНК возбудителя ВИК в слюне животных. Патент №2553534 «Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выявления ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек с их использованием».

2. Предложен способ единовременного выявления фрагментов провирусной ДНК вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в лимфоцитах крови животных. Патент №2586504 «Две пары синтетических олигонуклеотидных праймеров и способ их применения для индикации вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в клиническом материале методом мультиплексной полимеразной цепной реакции».

5. БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражет глубокую признательность ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (г. Саратов), в том числе коллективу Центра индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней, за неоценимую поддержку в проведении научных исследований по изучению генома ЕвЬУ и Е1У и осуществлении разработок в области ПЦР-диагностики вызываемых данными возбудителями инфекций.

Так же автор выражает огромную благодарность ФГБОУ ВО УлГУ (г. Ульяновск), в том числе канд. биол. наук, доценту Столбовской Ольге Вениаминовне и коллективу НИТИ УлГУ Лаборатории сканирующей и зондовой микроскопии, за методическую помощь и техническое обеспечение при изучении морфофункциональных особенностей лимфоцитов ^¿^-инфицированных кошек методом АСМ.

Искреннюю признательность автор выражает ФГБОУ ВО Саратовский ГАУ, в том числе УНТЦ «Ветеринарный госпиталь», за предоставление материала для исследований и техническую поддержку при изучении гемато-биохимических показателей ^/^-инфицированных кошек.

Автор очень признателен док. вет. наук, профессору Анникову Вячеславу Васильевичу и док. вет. наук, профессору Домницкому Ивану Юьевичу за помощь в изучении патоморфологических изменений у кошек, погибших с диагнозом «^/У-инфекция».

6. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИД - синдром приобретенного иммунодефицита ВИЧ - вирус иммунодефицита человека ВИК - вирусный иммунодефицит кошек ВЛК - вирус лейкемии кошек

FeLV - Feline leukemia virus (enFeLV - эндогенный вариант FeLV)

FIV - Feline immunodeficiency virus

HIV - human immunodeficiency virus

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

НК - нуклеиновые кислоты

АГ - антиген

АТ - антитело

ФНО - фактора некроза опухоли

SU - поверхностные белки оболочки

ТМ - трансмембранный белок

FOCMA - feline oncornavirus cell membrane antigen

TTP - тристетрапролин

LTR - длинный концевой повтор

ЦНС - центральная нервная система

ЖКТ - желудочно-кишечный тракт

АСМ - атомно-силовая микроскопия

СОЭ - скорость оседания эритроцитов

РНИФ - реакция непрямой иммунофлуоресценции

ИФА - иммуноферментный анализ

ИХА - иммунохроматографический анализ

ПЦР - полимеразная цепная реакция

RT-PCR - ПЦР в реальном времени

ЦПЭ - цитопатогенный эффект

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Анализ инфицированности кошек ретровирусными инфекциями в Саратовской области / Ю.А. Марушева, О.С. Ларионова, А.В.Красников, Ю.А. Марушева // Аграрный научный журнал -2015 - №2 - стр. 14-16.

2. Бажибина Е.Б., Бажибина В.А. Мониторинг результатов лабораторных исследований кошек - носителей хронических вирусных инфекций / Е.Б. Бажибина, В.А Бажибина // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. -2016. - № 3. - С. 6-8

3. Бажибина, Е.Б. Алгоритм диагностики инфекционных и инвазионных заболеваний кошек / Е.Б. Бажибина // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. - 2011. - №2. - С. 4 - 12.

4. Бажибина, Е.Б. Лейкемия и иммунодефицит - скрытые вирусные инфекции кошек /Е.Б. Бажибина, Ю.Б. Соколова // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные. - 2010. - №1. - С. 14 -17.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Глик, Дж. Пастернак// Пер. с англ. — Москва: Мир, 2002. —589 с.

6. Золототрубов, А. П. Эпизоотология и профилактика ретровирусных инфекций кошек / А. П. Золототрубов // Ветеринарная патология. - 2007. - №3. -С. 153-155.

7. Зорина В.В Основы полимеразно цепной реакции / В.В Зорина // Методическое пособие. - Москва - 2012.

8. Красникова, Е.С. Изучение структурно-функционального состояния лимфоцитов здоровых и ^¿У-инфицированных кошек методом атомно-силовой микроскопии / Е.С. Красникова, О.В. Столбовская, Д.А. Артемьев, Б.Б. Костишко // Научная жизнь. - 2014. - №6. - С. 156-162.

9. Лопухов, Л.В. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике / Л.В. Лопухов, М.В. Эйнштейн // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. - № 3 - Том 2. С. 16-19.

10. Марушева, Ю.А. Изучение вязко-эластических и топографических свойств мембран лимфоцитов при Е1У и ^¿У-инфекции / Ю.А Марушева, Д.А.

Артемьев // Современные тенденции сельскохозяйственного производства в мировой экономике: материалы XV Международной научно-практической конференции. - Кемерово: ФГБОУ ВО «Кемеровский ГСХИ»., 2017. - С. 271-275.

11. Марушева, Ю.А. Клинический случай диагностики СПИДа у кота / Ю.А Маршева, А.С. Белякова // Молодежь и наука XXI века: Материалы IV Международной научно-практической конференции: сборник научных трудов. -Том I.- Ульяновск: УГСХА им. П.А. Столыпина, 2014. - С. 73-77.

12. Марушева, Ю.А. Определение роли бродячих кошек в эпизоотическом процессе при FIV-инфекции / Ю.А. Марушева, А.С. Белякова // Вестник АПК Ставрополья. -№ 1. - 2015. - С. 75-78.

13. Марушева, Ю.А. Разработка нового способа молекулярно-генетической детекции FIV у кошек больных СПИДом / Ю.А Марушева, А.С.Белякова // Новые материалы и технологии: состояние вопроса и перспективы развития: сборник материалов Всероссийской молодежной научной конференции. - Саратов: СГТУ, 2014 - С. 191-195.

14. Марушева, Ю.А. Совершенствование диагностики вирусного иммунодефицита кошек путем разработки нового способа молекулярно-генетической детекции FIV/ Ю.А. Марушева, Е.С. Красникова // Вестник ветеринарии. - Вып. 70 - N 3. - 2014. - С. 29-33.

15. Марушева, Ю.А. Совершенствование диагностики вирусной лейкемии и иммунодефицита кошек путем разработки нового способа молекулярно-генетической детекции / Ю.А Марушева // Актуальные проблемы и перспективы развития ветеринарной медицины, зоотехнии и аквакультуры: материалы Международной научно-практической конференции. - Саратов: Научная книга, 2016. - С 33-34.

16. Марушева, Ю.А. Совершенствование диагностики ретровирусных инфекций кошек / Ю.А Марушева, А.С. Белякова, В.А Савельева // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки» - Научные и инновационные подходы в ветеринарной медицине, биологии и экологии: материалы

Международной научно - практической конференции молодых ученых и специалистов. - Троицк: ЮУрГАУ, 2015 - С. 157-159.

17. Марушева, Ю.А. Совершенствование диагностики ретровирусных инфекций кошек /Ю.А Марушева // Материалы Международной конференции "Современные аспекты сельскохозяйственной микробиологии", приуроченная к 120-летию со дня создания кафедры микробиологии и посвященная юбилейной дате - 150-летию со дня рождения основателя кафедры и ее первого заведующего профессора Н.Н. Худякова. - Москва: РГАУ-МСХ имени К.А. Тимирязева, 2016. -С. 56 -57.

18. Марушева, Ю.А. Эпизоотологические особенности ретровирусных инфекций домашних и бродячих кошек в саратовской области / Ю.А Марушева, А.С. Белякова // Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России: сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции -Производство и переработка продукции АПК; механизация процессов производства и переработки сельскохозяйственной продукции; проектирование, ремонт и эксплуатация машин и оборудования - Том 2. - Пенза: РИО ПГСХА, 2014. - С. 80-82.

19. Марушева, Ю.А. Эффективность симптоматической и патогенетической терапии при вирусном иммунодефиците кошек / Ю.А Марушева // Актуальные направления инновационного развития животноводства и ветеринарной медицины: материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием, посвященно 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР и Башкирской АССР, доктора биологических наук, профессора Петра Трофимовича Тихонова. - Уфа: Башкирский ГАУ, 2014. - С. 301-303.

20. Пат. 2553534 Российская Федерация. МПК С12Ш5/49, СВД1/68. Пара синтетических олигонуклеотидных праймеров, применяемых для выявления ДНК провируса и РНК вируса иммунодефицита кошек и способ диагностики вирусного иммунодефицита кошек с их использованием / Красникова Е.С., Ларионова О.С., Красников А.В., Марушева Ю.А.; заявитель и патентообладатель ФГБО ВО

Саратовский ГАУ. - №2014130601/10; заявл. 22.07.2014; опубл. 20.06.2015 Бюл. № 17.- 12с.

21. Пат. 2586504 Российская Федерация. МПК C12N15/49, C12Q1/68. Две пары синтетических олигонуклеотидных праймеров и способ их применения для индикации вирусов иммунодефицита и лейкемии кошек в клиническом материале методом мультиплексной полимеразной цепной реакции / Красникова Е.С., Ларионова О.С., Яшечкин Ю.И., Найденова Е.В., Красников А.В., Белякова А.С., Марушева Ю.А.; заявитель и патентообладатель ФГБО ВО Саратовский ГАУ. - № 2015116411/10; заявл. 29.04.2015; опубл. 10.16.2016 Бюл. № 16. - 12 с.

22. Патрушев, Л.И. Искусственные генетические системы/ Л.И. Патрушев// Институт органической химии имени М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН - Москва, 2004.-526.

23. Разработка способа мультиплексной ПЦР для диагностики FIVи FeLV инфекции / Е.С. Красникова, В.А. Агольцов, А.В. Красников, Ю.А. Марушева // Научная жизнь. - №3. - 2017. - С. 42 - 53.

24. Марушева Ю.А., Белякова А.С. Эпизоотологические особенности ретровирусных инфекций домашних и бродячих кошек в саратовской области / Ю.А. Марушева, А.С. Белякова // Вклад молодых ученых в инновационное развитие АПК России: сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции Том 2. Производство и переработка продукции АПК; механизация процессов производства и переработки сельскохозяйственной продукции; проектирование, ремонт и эксплуатация машин и оборудования; гуманитарные науки - Пенза: РИО ПГСХА, 2014. - С. 80-82.

25. Егорова, Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Н.С. Егорова // Наука - Москва, 1995.

26. Соломахина, Л.А. Офтальмологические проявления вирусной лейкемиикошек / Л.А Соломахина // Ветеринария, зоотехния и биотехнология.-2016. - № 12.-С. 35-42.

27. Сулимов, АА. Вирусные болезни кошек / А.А. Сулимов. - М.: КолосС, 2004. - 88 с.

28. Супотницкий, М.В. Эволюционная патология. К вопросу о месте ВИЧ-инфекции и ВИЧ/СПИД-пандемии среди других инфекционных, эпидемических и пандемических процессов / М.В. Супотницкий. - Москва, 2009. - 400 с.

29. Федосов, Д. В. Молекулярно-генетический метод определения ретровирусов кошек с использованием специфических праймеров / Д. В. Федосов, А. П. Золототрубов // Мат. II регион. Конф. Практикующих ветеринарных врачей. - Воронеж, 2004. - С. 72-73.

30. Щелкунов С. Н.Генетическая инженерия / С. Щелкунов // Сиб. унив. изд-во.- Новосибирск, 2004. — 496 с.

31. Ястреб, В.Г. Случай отодемокоза у кошки с вирусом иммунодефицита (ВИК) / В.Г. Ястреб // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями. -2016.- № 17(7).- С. 542-543.

32. A comparison of three methods of feline leukaemia virus diagnosis / O. Jarrett, M.C. Golder, K. Weijer / Vet Rec. - 1982, Apr 3. -110(14):325-8.

33. A door-to-door prevalence study of feline immunodeficiency virus in an Australian suburb / J. Chang-Fung-Martel, B. Gummow, G. Burgess et al. // J Feline Med Surg. - 2013, Dec. - Vol. 15(12):1070-8.

34. A retrospective clinical and epidemiological study on feline coronavirus (FCoV) in cats in Istanbul / B.K. Tekelioglu, E. Berriatua, N. Turan et al. // Prev Vet Med. - Turkey. - 2015, Apr 1. - № 119(1-2). - P. 41-7.

35. A serological and molecular study of Leishmania infantum infection in cats from the Island of Ibiza (Spain) / K. Sherry, G. Miró, M. Trotta et al. // Vector Borne Zoonotic Dis. - 2011, Mar. - Vol. 11(3). - P. 239-45.

36. A survey of feline leukaemia virus infection of domestic cats from selected areas in Harare, Zimbabwe / F. Muchaamba, T.H. Mutiringindi, M.T. Tivapasi et al. // J S Afr Vet Assoc. - 2014, Nov 14. - Vol. 85(1). - P. 1126.

37. Allison, R.W., Feline immunodeficiency virus is concentrated in milk early in lactation / R.W. Allison, E.A. Hoover // AIDS Res Hum Retroviruses. - 2003. -Vol.19. - P. 245-253.

38. An update on FIV and FeLV test performance using a Bayesian statistical approach / M.D. Pinches, G. Diesel, C.R. Helps et al. // Vet Clin Pathol. - 2007, Jun. -№ 36(2). - P. 141-7.

39. Analysis of the genetic diversity and phylogenetic relationship of Italian isolates of feline immunodeficiency virus indicates a high prevalence and heterogeneity of subtype B / M. Pistello, G. Cammarota, E. Nicoletti et al. // J. Gen. Virol. - 1997. -№ 78. - P. 2247-2257.

40. Antibody response of kittens after vaccination followed by exposure to feline leukemia virus-infected cats / D.M. Hawks, A.M. Legendre, B.W. Rohrbach et al. // J Am Vet Med Assoc. - 1991, Nov 15. - Vol. 199(10): 1463-9.

41. Assembly of type C oncornaviruses: A model / D.P. Bolognesi, R.C. Montelaro, H. Frank, W. Schafer // Science. - 1978. - Vol. 199. - P. 183 - 186.

42. Association between endogenous feline leukemia virus loads and exogenous feline leukemia virus infection in domestic cats / R. Tandon, V. Cattori, A.C. Pepin et al. // Virus Res. - 2008, Jul. - № 135(1). - P. 136-43.

43. Atomic force microscopy study of the antibacterial effects of chitosans on Escherichia coli and Staphylococcus aureus /P. Eaton., J.C. Fernandes, E.Pereira, M.E. Pintado // Ultramicroscopy 108. - 2008., 1128-1134.

44. Three pathogens in sympatric populations of pumas, bobcats, and domestic cats: implications for infectious disease transmission / S.N. Bevins, S. Carver, E.E. Boydston et al. // PLoS One. - 2012 - 7 (2):e31403 - Feb 8.

45. Biophysical characterization of the feline immunodeficiency virus p24 capsid protein conformation and in vitro capsid assembly / J. Serriere, D. Fenel, G. Schoehn et al. // PLoS One. - 2013. - Vol. 8(2). - e56424.

46. Black, J.W. Bluetongue and bovine retrovirus committee report. In: Proceedings of the 93rd Annual Meeting of the US / J.W. Black, Carter Printing Co., VA. Richmond // Animal Health Association. - 1990. - P. 150-152.

47. Bovine leukemia virus: Molecular biology and epidemiology / A. Burny, C. Bruck, H. Chantrenne et al. // In: Klein G, editor. Viral Oncology. Raven Press. - New York.- 1980.

48. Bustin S. A. Absolute quantification of mRNA using realtimereverse transcription polymerase chain reactionassays / S.A. Bustin // Journal of Molecular Endocrinology - 2000.-169-193

49. Characterization of regionally associated feline immunodeficiency virus (FIV) in bobcats (Lynx rufus) / D.M. Lagana, J.S. Lee, J.S. Lewis et al. // J Wildl Dis. -2013, Jul. - Vol.49(3):718-22.

50. Coffin, J. M. Retroviruses / J. M. Coffin, S.H. Hughes, H.E. Varmus // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. - 1997.

51. Co-infection with different subtypes of feline immunodeficiency virus can complicate subtype assignment by phylogenetic analysis / R.K. Kann, J.M. Seddon, M. Kyaw-Tanner and J. Meers // Arch. Virol. - 2007. - Vol.152. - Vol. 1187-1193.

52. Comparison of risk factors for seropositivity to feline immunodeficiency virus and feline leukemia virus among cats: a case-case study / Bimal K Chhetri, Email, Olaf et al. // BMC Vet Res. - 2015. - Vol. 11: 30.

53. Comparison of six in-house tests for the rapid diagnosis of feline immunodeficiency and feline leukaemia virus infections / K. Hartmann, R.M. Werner, H. Egberink and O. Jarrett // Vet Rec. - 2001, Sep 15. - Vol. 149(11):317-20.

54. Construction and Molecular Analysis of Gene Transfer Systems Derived from Bovine Immunodeficiency Virus / R. Berkowitz, H. Ilves, W.Y. Lin et al. // Virol. - 2001, April. - Vol. 75, № 7. - P. 3371-3382.

55. Contemporary developments in the biology of the bovine Immunodeficiency like virus / M.A. Gonda, M.S. Oberste, K.J. Garvey et al. / //In: H. Schlloakens, M. Horzinke, editors. Animal models in AIDS. - Amsterdam.- 1991. - P. 233-255.

56. Corredor, A.G The Bovine Immunodeficiency Virus Rev Protein: Identification of a Novel Lentiviral Bipartite Nuclear Localization Signal Harboring an Atypical Spacer Sequence / A.G Corredor and D. Archambault // J Virol. - 2009, December. - Vol. 83(24). - P. 12842-12853.

57. Crittenden, L.B. Exogenous and endogenous leukosis virus genes. Avian / L.B Crittenden // Pathol. - 1981. - №10. - P.101-112.

58. De Parseval, A. Demonstration that Orf2 encodes the feline immunodeficiency virus transactivating (tat) protein and characterization of a unique gene product with partial rev activity / A. de Parseval, J.H Elder // J. Virol. - 1999. -Vol. 73. - P. 608-617.

59. Decreased expression of endogenous feline leukemia virus in cat lymphomas: a case control study / M. Krunic, R. Ertl, B. Hagen et al. // BMC Vet Res. -2015, Apr 10. - Vol. 11. - P.90.

60. Decreased expression of endogenous feline leukemia virus in cat lymphomas: a case control study / M. Krunic, R. Ertl, B. Hagen et al. // BMC Vet Res. -2015, Apr 10. - Vol. 11. - P.90.

61. Desrosiers, R. A review of some aspects of the epidemiology diagnosis and control of Mycoplasma hyopneumoniae infections / R. Desrosiers // J Swine Health Prod. - 2001. - Vol.9(5). - P. 233-237.

62. Detection of feline leukemia virus RNA in saliva from naturally infected cats and correlation of PCR results with those of current diagnostic methods / Gomes-Keller MA, Gönczi E, Tandon R, et al. // J Clin Microbiol. - 2006, Mar. - Vol. 44(3). -P. 916-22.

63. Early detection of neuropathophysiology using diffusion-weighted magnetic resonance imaging in asymptomatic cats with feline immunodeficiency viral infection / D.S. Bucy, M.S. Brown, H. Bielefeldt-Ohmann et al. // J Neurovirol. - 2011, Aug. -Vol. 17(4):341-52.

64. Efficacy of siRNA on feline leukemia virus replication in vitro / M. Lehmann, K. Weber, G. Rauch et al. // Berl Munch Tierarztl Wochenschr. - 2015, May-Jun. - Vol. 128(5-6):209-17.

65. Ellermann, V. Experimented leukamie bei Huhnern Zen- tralbl / V. Ellermann, O. Bang // Bakteriol. - 1908. - Vol. 46. - P. 595—609.

66. English, R.V. Feline immunodeficiency virus. In: Bonagura J.D., editor. Kirk's current veterinary therapy / R.V. English // WB Saunders. - Philadelphia. -1995.

67. Env-Expressing Autologous T Lymphocytes Induce Neutralizing Antibody and Afford Marked Protection against Feline Immunodeficiency Virus / M. Pistello, F. Bonci, E. Zabogli et al. // J Virol. - 2010, April. - № 84(8). - P. 3845-3856.

68. Epizootiology and management of feline leukemia virus in the Florida puma / M.W. Cunningham, M.A. Brown, D.B Shindle et al. // J Wildl Dis. - 2008, July. -Vol. 44(3). - P. 537-552.

69. Evolution of feline immunodeficiency virus in Felidae: Implications for human health and wildlife ecology / J. Pecon-Slattery, J.L.Troyer, W.E. Johnson and S.J. O'Brien // Vet Immunollmmunopathol. -2008. - № 23. - Vol. 32-44.

70. Exposure of cats to low doses of felv: Seroconversion as the sole parameter of infection / A. Major, V. Cattori, E. Boenzli et al. // Vet Res. - 2010. -Vol. 41. - P. 17.

71. Feline immunodeficiency virus and feline leukemia virus infection in freeranging guignas (Leopardus guigna) and sympatric domestic cats in human perturbed landscapes on Chiloé Island, Chile / M. Mora, C. Napolitano, R. Ortega et al. // J Wildl Dis. - 2015, Jan. - Vol. 51(1). - P.199-208.

72. Feline immunodeficiency virus OrfA alters gene expression of splicing factors and proteasome-ubiquitination proteins / M. Sundstrom, U. Chatterji, L. Schaffer et al. // Virology. - 2008. - № 371. - P. 394-404.

73. Feline immunodeficiency virus subtypes in domestic cats in New Zealand / R.K. Kann, J.M. Seddon, J. Meers, R.J Zwijnenberg // N. Z. Vet. J. - 2007. - Vol. 55. -P. 358-360.

74. Feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus in Canada: Recommendations for testing and management / Little S, Bienzle D, Carioto L, et al. // Can Vet J. - 2011, August. - Vol. 52(8). - P. 849-855.

75. Feline leukemia virus and feline immunodeficiency virus in Canada: Recommendations for testing and management / S. Little, D. Bienzle, L. Carioto, H. Chisholm et al. // Can Vet J. - 2011, Aug. - Vol. 52(8). - P. 849-855.

76. Feline leukemia virus outbreak in the critically endangered Iberian lynx (Lynx pardinus): high-throughput sequencing of envelope variable region A and

experimental transmission / C.P. Geret, V. Cattori, M.L. Meli et al. // Arch Virol. -2011, May. - Vol. 156(5). - P. 839-54.

77. First description of naturally acquired Tritrichomonas foetus infection in a Persian cattery in Spain / G. Miró, L. Hernández, A. Montoya, et al. // Parasitol Res. -2011, Oct. - Vol. 109(4). - P. 1151-4.

78. Fogle, J.E. Tompkins, W.A. CD4+CD25+ T regulatory cells from FIV+ cats induce a unique anergic profile in CD8+ lymphocyte targets / J.E. Fogle, W.A. Tompkins / Retrovirology. - 2010, Nov. 19. - Vol. 7. - P. 97.

79. Functional comparison of the rev trans-activators encoded by different primate immunodeficiency virus species / M.H. Malim, S. Bohnlein, R. Fenrick et al // Proc. Natl. Acad. Sci. - USA. - 1989. - Vol. 86. - P. 8222-8226.

80. Genetic determinants of feline leukemia virus-induced multicentric lymphomas / G.B. Athas, B. Choi, S. Prabhu et al. // Virology. - 1995. - Vol. 214, № 2.

- P. 431-438.

81. Genetic diversity of Argentine isolates of feline immunodeficiency virus / M.R. Pecoraro, K. Tomonaga, T. Miyazawa et al. // J. Gen. Virol. - 1996. - № 77(Pt 9).

- P. 031-2035.

82. Genetic diversity of feline immunodeficiency virus: dual infection, recombination, and distinct evolutionary rates among envelope sequence clades / M.H. Bachmann, C. Mathiason-Dubard, G.H. Learn et al. // J. Virol. - 1997. Vol. 71. - P. 4241-4253.

83. Genetic heterogeneity of env gene of feline immunodeficiency virus obtained from multiple districts in Japan / Y. Nishimura, Y. Goto, H. Pang et al // Virus Res. - 1998. - Vol. 57. - P. 101-112.

84. Godfrey T., Norwood D., Shaad N. Real-time PCR: Emerging Application. На сайте www.bio.com, 2002

85. Hartmann K. Efficacy of antiviral chemotherapy for retrovirus-infected cats: What does the current literature tell us? / K. Hartmann // J Feline Med Surg. - 2015, Nov. - Vol. 17(11). - P. 925-39.

86. Hashimoto H. Nucleotide sequence of feline immunodeficiency virus: classification of Japanese isolates into two subtypes which are distinct from non-Japanese subtypes / S. Kakinuma, K. Motokawa, T. Hohdatsu et al. // J. Virol. - 1995. -69. - P. 3639-3646.

87. Hayward, J.J. Molecular epidemiology of feline immunodeficiency virus in the domestic cat (Felis catus) / J.J. Hayward, A.G. Rodrigo // Vet Immunol Immunopathol. - 2010, March 15. - Vol. 134(1-2). - P. 68.

88. Hayward, J.J. Phylogenetic analysis of feline immunodeficiency virus in feral and companion domestic cats of New Zealand / J.J. Hayward, J. Taylor, A.G. Rodrigo // J. Virol. - 2007. - Vol. 81. - P.2999-3004.

89. Hayward, J.J. Recombination in feline immunodeficiency virus from feral and companion domestic cats / J.J. Hayward, A.G. Rodrigo // Virol. J. - 2008. - Vol. 5. - P. 76.

90. Hematological and Virological Characteristics during Early Feline Immunodeficiency Virus (FIV) Infection of Cats as Predictors of Fetal Infection and Reproductive Outcome at Early Gestation / C.E. Boudreaux, N.N. Lockett, Chemerys et al. // Vet Immunol Immunopathol. - 2009, Oct 15. - Vol. 131, № 3-4. - P. 290-7.

91. High genetic stability of TM1 and TM2 strains of subtype B feline immunodeficiency virus in long-term infection / Y. Ikeda, T. Miyazawa, Y. Nishimura et al. // J. Vet. Med. Sci. - 2004. - Vol. 66. - P. 287-289.

92. Host RNA Packaging by Retroviruses: A Newly Synthesized Story / M.J. Eckwahl, A. Telesnitsky, S.L. Wolin // MBio. - 2016, Feb 9. - Vol. 7(1). - Pii. e02025-15.

93. Humoral immune reactivity to feline leukemia virus and associated antigens in cats naturally infected with feline leukemia virus / H. Lutz, N. Pedersen, J. Higgins et al. // Cancer Res. - 1980, Oct. - Vol. 40(10). - P. 3642-51..

94. Identification of 3 feline immunodeficiency virus (FIV) env gene subtypes and comparison of the FIV and human immunodeficiency virus type-1 evolutionary patterns / D.L. Sodora, E.G. Shpaer, B.E. Kitchell et al. // J. Virol. - 1994. - № 68. - P. 2230-2238.

95. Identification of a novel subtype of feline immunodeficiency virus in a population of naturally infected felines in the Brazilian Federal District / T.G. Marfola, C.P. Gomes, P.A. Silva et al // Virus Genes. - 2013, Jun. - Vol. 46(3). - P. 546-50.

96. In vivo lymphocyte tropism of feline immunodeficiency virus / R.V. English, C.M. Johnson, D.H. Gebhard et al. // J. Virol. - 1993. - Vol. 67. - P. 51755186.

97. Incorporation of excess wild-type and mutant tRNA(3Lys) into human immunodeficiency virus type 1 / Y. Huang, J. Mak, Q. Cao et al. // J Virol. - 1994. -Vol. 68. - P. 7676-7683.

98. Infection does not alter disease pathogenesis / S.R. Mikkelsen, J.M. Long, L. Zhang et al. // PLoS One. - 2011, Feb 25 - Vol. 6(2):e17183.

99. Isolation of a T-lymphotropic virus from domestic cats with an immunodeficiency syndrome / N.C. Pedersen, E.W. Ho, M.L. Brown, J.K. Yamamoto // Science. - 1987. - № 23. - P. 790-793.

100. Jinks, M.R. Causes of endogenous uveitis in cats presented to referral clinics in North Carolina / M.R. Jinks, R.V. English, B.C. Gilger // Vet Ophthalmol - 2015, Nov 12.

101. Johnson, S.F. Retroviral RNA dimerization and packaging: the what, how, when, where, and why. / S.F. Johnson, A. Telesnitsky // PLoS Pathog. - 2010. - Vol. 6:e1001007.

102. Jr Excretion of feline leukaemia virus by naturally infected pet cats / D.P. Francis, M. Essex, W.D. Hardy // Nature. - 1977. - Vol. 269(5625). - P. 252-254. .

103. Juvet F. Assessment of feline blood for transfusion purposes in the Dublin area of Ireland / F. Juvet, S. Brennan, C.T. Mooney // Vet Rec. - 2011, Apr. - 2. -168(13). - P. 352.

104. Kenyon, J.C. The molecular biology of feline immunodeficiency virus (FIV) / J.C Kenyon, A.M. Lever // Viruses. - 2011, Nov. - Vol. 3(11):2192-213. - Epub. 2011, Nov 9.

105. Kipar, A. Comparative examination of cats with feline leukemia virus-associated enteritis and other relevant forms of feline enteritis / A. Kipar, J.

Kremendahl, M.L. Jackson and M. Reinacher // Vet Pathol. - 2001, Jul. - Vol. 38(4):359-71.

106. Kuznetsov, Y.G. Alexander McPherson Atomic Force Microscopy in Imaging of Viruses and Virus-Infected Cells / Y.G. Kuznetsov // Microbiol Mol Biol Rev. - 2011, Jun. - Vol. 75(2). - P. 268-285.

107. Large granular lymphocytes are universally increased in human, macaque, and feline lentiviral infection / W.S. Sprague, C. Apetrei, A.C. Avery et al. // Vet Immunol Immunopathol. - 2015, Oct 15. - № 167(3-4). - P. 110-21.

108. Markers of feline leukaemia virus infection or exposure in cats from a region of low seroprevalence / J.A. Beatty, S. Tasker, O. Jarrett et al. // J Feline Med Surg. -2011, Dec. - Vol. 13, № 12. - P. 927-33.

109. Molecular and clinical study on prevalence of feline herpesvirus type 1 and calicivirus in correlation with feline leukemia and immunodeficiency viruses / H. Najafi, O. Madadgar, S. Jamshidi et al. // Vet Res Forum. - 2014, Fall. - Vol. 5(4). - P. 255-61.

110. Molecular subtyping of feline immunodeficiency virus from domestic cats in Australia / R.K. Kann, M.T. Kyaw-Tanner, J.M. Seddon et al. // Aust. Vet. J. - 2006. -Vol. 84. - P. 112-116.

111. Multifunctional facets of retrovirus integrase / D.P. Grandgenett, K.K. Pandey, S. Bera, H. Aihara // World J Biol Chem. - 2015, Aug 26. - Vol. 6(3). - P. 8394.

112. Newton C.R., Graham A. PCR. / C.R.Newton, A. Graham // Oxford: Bios Scientific Publishers - 1996- P.18 - 9

113. Novel fused tetrathiocines as antivirals that target the nucleocapsid zinc finger containing protein of the feline immunodeficiency virus (FIV) as a model of HIV infection / C.R. Asquith, M.L. Meli, L.S. Konstantinova et al. // Bioorg Med Chem Lett. - 2015 Mar. - Vol. 15, № 25(6). - P.1352-5.

114. Nucleotide sequence and genome organization of biologically active proviruses of the bovine immunodeficiency-like virus / K.J. Garvey, M.S. Oberste, J.E. Elser et l. // Virology. - 1990, Apr. - Vol. 175(2). - P. 391-409.

115. Nucleotide-sequence analysis of feline immunodeficiency virus—genome organization and relationship to other lentiviruses / R.A.Olmsted, V.M. Hirsch, R.H. Purcell, P.R Johnson // Proc. Natl. Acad. Sci. - U.S.A. - 1989. - Vol. 86. - P. 80888092.

116. O'Neil, L.L. Frequent perinatal transmission of feline immunodeficiency virus by chronically infected cats / L.L. O'Neil, M.J. Burkhard, E.A. Hoover // J Virol. -1996. - Vol. 70. - P. 2894-2901.

117. Pacitti, A.M. Transmission of feline leukaemia virus in the milk of a non-viraemic cat / A.M. Pacitti, O. Jarrett, D. Hay // Vet Rec. - 1986. - № 118(14). - P. 381-384.

118. Pathogens as Important Threats to the Survival of the Critically Endangered Iberian Lynx (Lynx pardinus) / M.L. Meli, V. Cattori, F. Martinez et al. // PLoS ONE. - 2009. - Vol. 4(3). - e4744.

119. Pedersen, N.C. Feline leukemia virus / N.C. Pedersen // Virus infection of carnivores. - 1987. - P. 299-305.

120. Phylogenetic analysis of Vietnamese isolates of feline immunodeficiency virus: genetic diversity of subtype C / K. Nakamura, Y. Suzuki, K. Ikeo et al. // Arch. Virol. -2003. - Vol. 148. - P. 783-791.

121. Phylogenetic analysis to define feline immunodeficiency virus subtypes in 31 domestic cats in South Africa / R.K. Kann, J.M. Seddon, M. Kyaw-Tanner et al. // J. S. Afr. Vet. Assoc. - 2006. - Vol. 77. - P. 108-113.

122. Phylogenetic and genetic analysis of feline immunodeficiency virus gag, pol, and env genes from domestic cats undergoing nucleoside reverse transcriptase inhibitor treatment or treatment-naive cats in Rio de Janeiro, Brazil / A.N. Martins, S.O. Medeiros, J.P. Simonetti, et al // J. Virol. - 2008. - Vol. 82. - P. 7863-7874.

123. Placental immunopathology in the FIV-infected cat: a role for inflammation in compromised pregnancy? / K.S. Coats, C.E. Boudreaux, B.T. Clay et al. // Vet ImmunolImmunopathol. - 2010, Mar 15. - Vol. 134(1-2). - P. 39-47.

124. Polypeptides of feline leukemia virus: a glycosylated gag-related protein is released into culture fluids / J.C. Neil, J.E. Smart, M.J. Hayman and O. Jarrett // Virology. - 1980, Aug. - Vol. 105(1). - P. 250-3.

125. Povey R. Charles, Hawkins Feline immunodeficiency virus: A commentary / Povey R. Charles and J. Gregory // Can Vet J. - 1989, Jul. - № 30(7). - P. 559-562.

126. Prevalence and risk factor analysis of feline haemoplasma infection in New Zealand domestic cats using a real-time PCR assay / K.S. Jenkins, K.E. Dittmer, J.C. Marshall and S. // Tasker J Feline Med Surg. - 2013, Dec;15(12):1063-9.

127. Prevalence and risk factors of feline leukaemia virus and feline immunodeficiency virus in peninsular Malaysia / F. Bande, S.S. Arshad, L. Hassan et al. // BMC Vet Res. - 2012, Mar. - Vol. 22, №8. - P. 33.

128. Prevalence of feline leukemia virus infection in domestic cats in Rio de Janeiro / N.R. de Almeida, M.G. Danelli, L.H. da Silva // J Feline Med Surg. - 2012, Aug. - Vol. 14(8):583-6.

129. Prevalence of haemotropic Mycoplasma spp., Bartonella spp. and Anaplasma phagocytophilum in cats in Berlin / D. Morgenthal, D. Hamel, G. Arndt et al. // Berl Munch Tierarztl Wochenschr. - Brandenburg (Northeast Germany). - 2012, Sep-Oct . - Vol. 125(9-10). - P. 418-27.

130. Prevalence of hematological abnormalities and detection of infected bone marrow cells in asymptomatic cats with feline immunodeficiency virus infection / Y. Fujino, H. Horiuchi, F. Mizukoshi et al. // Vet Microbiol. - 2009, May 12. - Vol. 136(3-4). - P. 217-25.

131. Prevalence of infectious diseases in cats and dogs rescued following Hurricane Katrina / J.K. Levy, M.R. Lappin, A.L. Glaser et al. // J Am Vet Med Assoc. - 2011, Feb 1. - Vol. 238(3):311-7.

132. Prevalence of viral infections in cats in southwestern Poland in the years 2006 to 2010 / K. Rypula, K. Ploneczka-Janeczko, K. Bierowiec et al. // Berl Munch Tierarztl Wochenschr. - 2014, Mar-Apr. - №127 (3-4). - P. 163-5.

133. Quality of different in-clinic test systems for feline immunodeficiency virus and feline leukaemia virus infection / K. Hartmann, P. Griessmayr, B. Schulz et al. // J Feline Med Surg. - 2007. - Vol. 9. - P. 439-445.

134. Quantification of viral ribonucleic acid in plasma of cats naturally infected with feline immunodeficiency virus / Y. Goto, Y. Nishimura, T. Mizuno et al. // Am J Vet Res. - 2000. - Vol. 61. - P. 1609-1613.

135. Quigley, J.G. Cloning of the cellular receptor for feline leukemia virus subgroup C (FeLV-C), a retrovirus that induces red cell aplasia / J.G. Quigley, C.C. Burns, M.M. Anderson // Blood. - 2000. - № 95. - P. 1093-1099.

136. Reduced constitutive cytokine transcription in isolated monocytes of clinically healthy cats, infected with an FIV strain of low pathogenicity / A. Kipar, F.S. Boretti, M.M. Meli et al. // Vet Immunol Immunopathol. - 2004, Apr. - Vol. 98(3-4):215-21.

137. Reggeti, F. Feline immunodeficiency virus subtypes A, B and C and intersubtype recombinants in Ontario, Canada / F. Reggeti, D. Bienzle // J. Gen. Virol. -2004. - № 85. - P. 1843-1852.

138. Renal Disease in Cats Infected with Feline Immunodeficiency Virus / K.J. Baxter, J.K. Levy, C.H. Edinboro et al. // J Vet Intern Med. - 2012, Jan. - 23.

139. Retrovirus-mediated immunosuppression. I. FeLV-UV and specific FeLV proteins alter T lymphocyte behavior by inducing hyporesponsiveness to lymphokines / C.G. Orosz, N.E. Zinn, R.G. Olsen and L.E. Mathes // J Immunol. - 1985, May. - №134 (5). - P. 3396-403.

140. Richards, J.R. Feline immunodeficiency virus vaccine: implications for diagnostic testing and disease management / J.R. Richards // Biologicals. - 2005, Dec. -№ 33(4). - P. 215-7.

141. Risk factors for exposure to feline pathogens in California mountain lions (Puma concolor) / J.E. Foley, P. Swift, K.A. Fleer et al. // J Wildl Dis. - 2013, Apr. -Vol. 49(2):279-93.

142. Rogers, A.B. Fetal feline immunodeficiency virus is prevalent and occult / A.B. Rogers, E.A. Hoover // J Infect Dis. - 2002. - №186. - P. 895-904.

143. Rogers, A.B. Maternal-fetal feline immunodeficiency virus transmission: timing and tissue tropisms / A.B. Rogers, E.A. Hoover // J InfectDis. - 1998. - № 178. -P. 960-967.

144. Serological survey of Toxoplasma gondii, Dirofilaria immitis, Feline Immunodeficiency Virus (FIV) and Feline Leukemia Virus (FeLV) infections in pet cats in Bangkok and vicinities / W. Sukhumavasi, M.L. Bellosa, A. Lucio-Forster et al. // Vet Parasitol. - 2012, Aug 13. - № 188(1-2). - P. 25-30.

145. Seroprevalence and genomic divergence of circulating strains of feline immunodeficiency virus among Felidae and Hyaenidae species / L. Frank, R. Woodroffe, C. Winterbach et al. // J Virol. - 2005. - Vol. 79. - P. 8282-8294.

146. Seroprevalence of feline immunodeficiency virus (FIV) and feline leukemia virus (FeLV) in shelter cats on the island of Newfoundland / Munro J. Hannah, Berghuis Lesley, Lang S. Andrew et al. // Can J Vet Res. - 2014, Apr. - Canada. - Vol. 78(2). - P. 140-144.

147. Seroprevalence of feline immunodeficiency virus, feline leukaemia virus and Toxoplasma gondii in stray cat colonies in northern Italy and correlation with clinical and laboratory data / E. Spada, D. Proverbio, A. Della Pepa et al. // J Feline Med Surg. -2012, Feb 8.

148. Seroprevalence of feline leukemia virus, feline immunodeficiency virus and heartworm infection among owned cats in tropical Mexico / A. Ortega-Pacheco, A.J. Aguilar-Caballero, R.F. Colin-Flores et al. // J Feline Med Surg. - 2014, Jun. - №16(6). - P. 460-4.

149. Serosurvey for selected viral infections in free-ranging jaguars (Panthera onca) and domestic carnivores in Brazilian Cerrado, Pantanal, and Amazon / M.M. Furtado, J.D. de Ramos Filho, K.C. Scheffer et al. // J Wildl Dis. - 2013, Jul. -Vol.49(3). - P.510-21.

150. Steinrigl, A. Phylogenetic analysis of feline immunodeficiency virus in Central Europe: a prerequisite for vaccination and molecular diagnostics / A. Steinrigl, D. Klein // J. Gen. Virol. - 2003. - № 84. - P. 1301-1307.

151. Stojanovic, V. Infectious disease prevalence in a feral cat population on Prince Edward Island / V. Stojanovic, P. Foley // Can Vet J. - Canada. - 2011, Sep. - № 52(9). - P. 979-982.

152. Survey of the feline leukemia virus infection status of cats in Southern Germany / T. Englert, H. Lutz, C. Sauter-Louis, K. Hartmann // J Feline Med Surg. -2012, Jun. 14(6):392-8.

153. Taylor, J.M. An analysis of the role of tRNA species an primers for the transcription into DNA of RNA tumor virus genomes / J.M.Taylor // Biochim. Biophys. Acta. - 1977. - Vol.473. - P. 57-71.

154. The chemical structure of a molecule resolved by atomic force microscopy. / Gross L., Mohn F., Moll N., Liljeroth P., Meyer G.// - 2009 - P. 1110-1114

155. The evolutionary dynamics of the lion Pantheraleo revealed by host and viral population genomics / A. Antunes, J. L. Troyer, M.E. Roelke, J. Pecon-Slattery et al. // PLoS Genet. - 2008. - Vol. 4. - e1000251.

156. The frantic play of the concealed HIV envelope cytoplasmic tail / E. Santos da Silva, M. Mulinge, D. Perez Bercoff // Retrovirology. - 2013, May. - Vol. 24. - № 10. - P. 54.

157. The kinetics of feline leukaemia virus shedding in experimentally infected cats are associated with infection outcome / V. Cattori, R. Tandon, B. Riond et al. // Vet Microbiol. - 2009. - Vol. 133(3). - P. 292-296.

158. The long terminal repeat is a determinant of cell tropism of maedi-visna virus / G. Agnarsdottir, H. Thorsteinsdottir, T. Oskarsson et al. // J Gen Virol. - 2000. -Vol. 81. - P. 1901-1905.

159. The T4 gene encodes the acquired immune deficiency syndrome virus receptor and is expressed in the immune system and the brain / P.J. Maddon, A.G. Dalgleish, J.S. McDougal et al. // Cell. - 1986. - Vol. 43. - P. 333-348.

160. T-lymphocyte profiles in FIV-infected wild lions and pumas reveal CD4 depletion / M.E. Roelke, J. Pecon-Slattery, S. Taylor et al. // J. Wildl. Dis. - 2006. - № 42. - P. 234-248.

161. Tomonaga K. Molecular biology of the feline immunodeficiency virus auxiliary genes/ K. Tomonaga, T. Mikami // J. Gen. Virol. - 1996 - Vol. 77 - P. 16111621.

162. Transcription of DNA from the 70S RNA of Rous sarcoma virus. I. Identification of a specific 4S RNA which serves as primer / J.E. Dahlberg, R.C. Sawyer, J.M. Taylor et al. // J Virol. - 1974. - Vol. 13. - P. 1126-1133.

163. FIV cross-species transmission: An evolutionary prospective / J.L. Troyer, S. VandeWoude, J. Pecon-Slattery et al. // Vet Immunol Immunopathol.- 2008/ -P.123:159-166.

164. dUTPase-minus caprine arthritis-encephalitis virus is attenuated for pathogenesis and accumulates G-to-A substitutions/ P. Turelli, F. Guiguen, J.F. Mornex, R.Vigne, G. Querat// J Virol. - 1997- 71.- P.4522-4530.

165. Feline immunodeficiency virus subtype C is prevalent in northern part of Taiwan / M. Uema, Y. Ikeda, T. Miyazawa et al. // Vet. Med. Sci.- 1999. - 61- P.197-199.

166. Exposure to selected Pathogens in to selected pathogens in Geoffroy's cats and domestic carnivores from central Argentina / Uhart M.M., Rago M.V., Marull C.A., et al // J Wildl Dis. - 2012, Oct. - 48(4). - P. 899-909.

167. Vaccination against the feline leukaemia virus: outcome and response categories and long-term follow-up / Hofmann-Lehmann R, Cattori V, Tandon R, et al. // Vaccine. - 2007, Jul 26. 25(30):5531-9.

168. Vaccination of cats experimentally infected with feline immunodeficiency virus, using a recombinant feline leukemia virus vaccine / R. Lehmann, M. Franchini, A. Aubert, et al. // J Am Vet Med Assoc. - 1991, Nov 15. - Vol. 199(10): 1446-52.

169. VandeWoude, S. Going wild: Lessons from naturally occurring T-lymphotropiclentiviruses / S. VandeWoude, C. Apetrei // ClinMicrobiol Rev. - 2006, -19. - P. 728-762.

170. VandeWoude, S. Restrictions to cross-species transmission of lentiviral infection gleaned from studies of FIV/ S. VandeWoude, J. Troyer, M. Poss // Vet Immunol Immunopathol.-2010 -134. - P. 25-32.

171. Rapid and Specifie Molecular Identification of Methicillin- Resistant Staphylococcus aureus in Endotracheal Aspirates from Mechanically Ventilated Patients. // P.Vannufel, P.F.Laterre, M. Boyer et all // J Clin Microbiol .-1998. -36. -2366 - 8

172. Vertical transmission of feline immunodeficiency virus / L.L. O'Neil, M.J. Burkhard, L.J. Diehl, E.A. Hoover // Semin Vet Med Surg (Small Anim). - 1995. - Vol. 10. - P. 266-278.

173. Identification of a Cullin5-ElonginB-ElonginC E3 complex in degradation of feline immunodeficiency virus Vif-mediated feline APOBEC3 proteins / J. Wang, W. Zhang, M. Lv, et al. // J Virol.- 2011, Dec. -85(23). - P. 12482-91.

174. AFM detection of mitogen-induced morphological changes in Human B lymphocyte / Wang Q, Wang M, Li S, et al. // Scanning. - 2012, Jan-Feb. - 34(1):60-7.

175. Placental immunopathology and pregnancy failure in the FIV-infected cat.Placenta / C.C. Weaver, S.C. Burgess, P.D. Nelson et al. // 2005. - Vol.26. - P.138-147.

176. Structure of the retroviral genomes/ R.A Weiss, N. Teich, H.E. Varmus and J.M. Coffin Molecular // Biology of Tumor Viruses: RNA Tumor Viruses.- 1982. - P. 261-368.

177. Determining the feline immunodeficiency virus (FIV) status of FIV-vaccinated cats using point-of-care antibody kits / Westman ME, Malik R, Hall E, et al.// Comp Immunol Microbiol Infect Dis. - 2015. Aug 6. - 0147-9571(15)00056-9.

178. http : //www. ictvonline. org/virusTaxonomy. asp.

9. СПИСОК ИЛЛЮСТРАТИВНОГО МАТЕРИАЛА

Стр.

Рисунок 1 Схема выполнения исследований..................................................................43

Рисунок 2 Эпизоотология FIV и FeLV в Саратовской области........................44

Рисунок 3 FIV-инфицированность различных половых групп

животных....................................................................................................................................46

Рисунок 4 FIV-инфицированность различных возрастных групп

животных................................................................................................................................47

Рисунок 5 FIV-инфицированность различных пород кошек..............................48

Рисунок 6 Дефекты препарата, препятствующие сканированию клеток 51

Рисунок 7 Определение локализации клеток на препарате..................................52

Рисунок 8 Определение линейных параметров лимфоцита при адгезии 52 Рисунок 9 Снятие показателей силовых кривых для расчета модуля

Юнга............................................................................................................................................53

Рисунок 10 Анализ изображения поверхности лимфоцита....................................54

Рисунок 11 Инфицированный и не инфицированный лимфоциты

кошки при ретровирусной коинфекции......................................................56

Рисунок 12 Сравнение эффекивности ПЦР и ИХА при диагностике FIV 59

Рисунок 13 Уровень генетической вариабельности внутри вида FIV...........60

Рисунок 14 Анализ генетической гомологии внутри вида FIV...........................61

Рисунок 15 Анализ гомологии гена gag FIV.......................................................................61

Рисунок 16 Схема строения генома FIV...................................................................................62

Рисунок 17 Схема строения генома FeLV.............................................................................63

Рисунок 18 Степень гомологии геномов FIV и FeLV...................................................64

Рисунок 19 Кластерное дерево гена gag-pol FeLV...........................................................64

Рисунок 20 Анализ гомологии гена gag-pol FeLV...........................................................65

Рисунок 21 Определение размера амплифицируемого фрагмента... 69

Рисунок 22 Определение чувствительности разработанных праймеров.. 70

Рисунок 23 Определение специфичности разработанных праймеров..........70

Рисунок 24 Электрофореграмма результатов исследования

биологического материала от кошек с применением

разработанных праймеров......................................................................................71

Рисунок 25 Определение размеров амплифицируемых фрагментов............76

Рисунок 26 Результаты исследования крови кошек разработанным

способом..................................................................................................................................77

Таблица 1 Морфометрические и биофизические параметры

лимфоцитов кошек........................................................................................................55

Таблица 2 Характеристика разработанных праймеров............................................67

Таблица 3 Состав реакционной смеси....................................................................................67

Таблица 4 Температурно-временной режим проведения ПЦР........................68

Таблица 5 Характеристика разработанных праймеров............................................74

Таблица 6 Состав реакционной смеси....................................................................................74

Таблица 7 Температурно-временной режим проведения ПЦР........................75

10. ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1

Приложение 2