Соматическая полиплоидия в гистогенезах брюхоногих моллюсков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, доктор биологических наук в форме науч. докл. Анисимов, Алим Петрович

• Анисимов, Алим Петрович
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1999

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Анисимов, Алим Петрович

Актуальность проблемы

Соматическая полиплоидия представляет явление ненормированного умножения целых геномов в соматических клетках тех или иных тканей у организмов, развивающихся из обычной диплоидной зишты. Соматическая полиплоидия — общебиологическое явление. Уже сам факт широкого распространения у различных животных и растений свидетельствует о неслучайности этого феномена и его определенной роли в развитии тканей. В ряде работ даже делается заключение об эволюционно-стратегическом значении соматической полиплоидии (Nagl, 1976, 1978; Barlow, 1978; Бродский, Урываева, 1981; Brodsky, Uryvaeva, 1985).

Между тем в литературе нет полного понимания природы соматической полиплоидии, механизмов эндорепродукции клеток. Исследования полиплоидных эндоциклов выходят на молекулярно-генетический уровень (Nagl, 1995; Lehner, Lane, 1997; Datta et al., 1998; Graft, 1998; Macauley et al., 1998; Nakayama et al., 1998), и в то же время не решен ряд цитологических вопросов, от которых зависит правильная интерпретация новых данных. В частности, открытый Гейтлером (Geitler, 1939,1953) эндомитоз - как процесс репродукции, спирализации и разделения хромосом внутри ядра - поставлен под сомнение, наметилась тенденция к пересмотру концепции эндомитоза в пользу полиплоидизирующего митоза и скрытой политении (Бродский, Урываева, 1981). Так называемый ангиоспермный тип эндомитоза у растений на самом деле оказался вариантом эндоредупликации хромосом (Barlow, 1976, 1978; Cavallini et al., 1981). В ряде аналогичных случаев вместо "эндомитотической полиплоидии" выявлены скрытая политения, псевдоэндомитоз как состояние деполитенизации хромосом, различные варианты аберрантного, реституционного митоза и отдаленные последствия этих процессов в виде хромоцешрических ядер, напоминающих эндомитоз (Бродский, Урываева, 1970, 1981; Nagl, 1978, 1981; Урываева, 1979; Зыбина, 1983,1986; Зыбина, Зыбина, 1985; D'Amato, 1989; Vitrât et al., 1998). Даже один из классических примеров эндомитоза-в клетках семенника саранчи - оказался лишь имитацией деления хромосом: в зоне расположения ядер с морфологией эндомитоза в клетках септ отсутствовал синтез ДНК, но зато выявлена активная транскрипция на компактизованных хромосомах, которые имели "ершистый" вид (Кикнадзе, Тутурова, 1970; Бахтадзе, 1975; Кикнадзе и др., 1975; -teadze, Istomina, 1980; Therman et al., 1983). В связи с критическим состоянием проблемы эндомитоза стали появляться * im необоснованного применения понятия политении, смешения понятий • учхоза и политении, в том числе и в учебной вузовской литературе. Это делается, дмер, в отношении ядер гигантских нейронов улиток, где содержится много продолжается ее синтез, но не видны обычные хромосомы. По сути концепция ■<итоза столкнулась с недостаточностью его обычных морфологических „риев. Само существование эндомитоза поставлено под вопрос до тех пор, а не будут даны его новые обоснования с использованием современных методов изучения клеточного цикла (Бродский, Урываева, 1981). Это требование оказалось вполне актуальным, поскольку другие предложения, например, различать два типа эндомитоза- основной и некий "стационарный эндомитоз" (Therman et al., 1983) -не решают, а лишь усложняют проблему.

Не вполне ясны также причины и практически не изучены филогенетические закономерности возникновения гистогенезов с участием полиплоидии. Для обнаружения и объяснения эволюционных тенденций нужны максимально полные сведения о проявлениях полиплоидии в независимых и достаточно протяженных филогенетических рядах. В последнее время такие сравнительные исследования начаты на печени и миокарде млекопитающих (Кудрявцев, 1991; Anatskaya et al., 1994; Кудрявцев и др., 1997). Наша работа решает эту проблему на примере эволюции класса брюхоногих моллюсков (Mollusca: Gastropoda), то есть в другом стволе исторического развития животных. Попытка объяснить гигантизм нервных клеток у гастропод сделана со стороны малакологов (Gillette, 1991), но она не раскрывает сам феномен полиплоидии нейронов и возможность коррелятивного проявления полиплоидии в других органах тех же моллюсков, а значит не решает проблемы системного возникновения полиплоидного роста как морфогенетической стратегии.

Выбор класса гастропод в нашей работе не случаен. Во-первых, полиплоидия разных уровней - от умеренных (16с-64с) до гигантских (65-260 тыс. с) -достоверно показана для клеток слюнных желез (Swift, 1953; Schreiber, Schreiber, 1964) и нейронов (Вепринцев и др., 1964; Coggeshall et al., 1970; Lasek, Dower, 1971; Boer et ai., 1977) у ряда легочных и заднежаберных моллюсков, а обзор литературы (20-26)* позволяет предположить и более широкое распространение полиплоидных гистогенезов у представителей разных подклассов. Во-вторых, класс гастропод достаточно обширный и сложный (Миничев, Старобогатов, 1979; Haszprunar, 1988; Barnes, Harrison, 1994), по разнообразию видов он занимает второе место после насекомых, что дает хорошую основу для эволюционного анализа. В-третьих, региональная специфика южного Приморья позволяла рассчитывать на доступность сравнительного (прежде всего морского) материала, как и на выбор удобного модельного объекта для углубленных цитологических исследований.

Цели и задачи работы Цель работы состояла в том, чтобы на примере брюхоногих моллюсков выявить закономерности онто- и филогенетического развития соматической полиплоидии и объяснить биологический смысл этого феномена.

Соответственно цели поставлен ряд задач: 1) на модельном объекте - улитке Succinea lauta - изучить характер и степень проявления полиплоидии в различных органах и тканях; 2) изучить онтогенез модельного объекта, динамику развития полиплоидных клеток, возрастные и функциональные стадии, удобные для выявления механизмов полиплоидизации клеток; 3) выявить кинетику синтеза ДНК в ходе полиплоидизации и дифференциации клеток; 4) установить механизмы полиплоидизации клеток модельного объекта, в частности подтвердить или Цифры в скобках обозначают работы автора, приведенные в списке литературы. отвергнуть механизм эндомитоза; 5) выявить распространение и степень проявления соматической полиплоидии в пределах класса гастропод; 6) объяснить причины и биологический смысл феномена соматической полиплоидии.

Научная новизна и теоретическое значение работы

На основе модельных и сравнительных исследований на брюхоногих моллюсках выяснены клеточные механизмы, эволюционные закономерности и биологическое значение соматической полиплоидии в развитии тканей.

Впервые: 1) проведен детальный скрининг в различных органах и тканях гастропод и показана тканеспецифичность проявления полиплоидии; 2) проведено комплексное изучение динамики цолиплоидизации клеток, показаны, связь полиплоидии с цитодифференциацией, тканеепец^фическая возрастная динамика, сохранение диплоидного резерва и возможность регенерации полиплоидных клеточных популяций; 3) установлено сходство кинетики синтеза ДНК, в том числе в позднореплицирующихся хромосомах, для клеток разной плоидности и зависимость этих показателей от хода дифференциации клеток; 4) показано преемственное сочетание нормальных митозов, аномальных (неполных) митозов и эндомитозов в развитии полиплоидных клеточных популяций и зависимость этих изменений клеточного цикла от хода дифференцировки клеток; 5) доказано, что классический эндомитоз Гейтлера - реальный механизм эндорепродукции клеток, дана его комплексная цитологическая характеристика, определены псевдоэндомитотические состояния; 6) установлена филогенетическая обусловленность полиплоидных гистогенезов в разных группах гастропод, показаны как ароморфные, так и алломорфные (идиоадаптивные) проявления соматической полиплоидии в морфогенезах; 7) полиплоидная клетка представлена как эндоклон и результат олигомеризации на клеточно-тканевом уровне, что позволило прогностически сформулировать ее свойства и определить значение полиплоидной стратегии роста.

В целом биология развития полиплоидных клеточных популяций есть элемент фундаментального знания в области цитологии, гистологии и эмбриологии. С учетом того, что гигантакл еточно сть и полиплоидия характерны для некоторых тканей и органов человека, а также раковых опухолей, эти знания представляют интерес и для решения ряда медико-биологических задач. Предложенная концепция эндоклоногенеза по сути содержит теоретическое решение проблемы соматической полиплоидии.

Практическое значение работы

Обобщения и частные выводы, полученные в работе, характеристики и иллюстрации эндомитоза могут быть использованы при переизданиях учебников по цитогенетике, цитологии, гистологии и биологии развития, а также при чтении спецкурсов и написании, руководств по частным разделам этих дисциплин (репродукция клеток, сравнительная гистология и др.).

Тест на проявление соматической полиплоидии в разных тканях, в особенности в нейронах ЦНС, может служить дополнительным критерием в решении спорных вопросов филогении и систематики гастропод.

Разработанный способ получения давленых препаратов с использованием целлофана (8) исключает процедуру замораживания, что позволяет легко готовить препараты для цитологических исследований в полевых условиях, на учебных занятиях, в патогистологических лабораториях.

Результаты работы уже используются в лекциях и на лабораторных занятиях по курсам биологии клетки, гистологии, биологии развития, а также в большом практикуме по цитологии для студентов ДВГУ.

Апробация работы Основные результаты были представлены на Всесоюзном совещании "Клеточная репродукция: сравнительные аспекты и механизмы регуляции" (Ленинград, 1981), на VIII, X, XI и XII Всесоюзных (Российских) симпозиумах "Структура и функции клеточного ядра" (Пущино, 1984; Гродно, 1990; Санкт-Петербург, 1993, 1996), на 2-м рабочем совещании "Прикладная цитохимия хроматина" (Ленинград, 1985), на Всесоюзном совещании "Теория параллелизмов А.А.Заварзина и современная биология" (Ленинград, 1986), на 37-ой и 38-ой научных конференциях ДВГУ (Владивосток, 1994, 1996), на Региональной конференции по проблемам морской биологии и экологии (Владивосток, 1988), на Всероссийском совещании по изучению моллюсков Дальнего Востока России (Владивосток, 1998), на IV (Х1П) Малакологическом совещании (С.-Петербург, 1998), на Международном симпозиуме по изучению Восточно-Азиатских маргинальных морей (Фукуока, Япония, 1999).

Объем и структура работы

Диссертация изложена в настоящей брошюре в форме научного доклада, обобщающего результаты исследований автора, выполненных в 1979-1998 гг. Основное содержание работы представлено в 33 публикациях, из которых 22 журнальных статьи и 11 тезисов докладов.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Явление соматической полиплоидии изучено нами на моллюсках класса Gastropoda (брюхоногие). Это наиболее многочисленный и сложный класс в типе Mollusca, насчитывающий около 100 тысяч современных видов.

В качестве модельного объекта для изучения органно-тканевой локализации, возрастной динамики и механизмов развития полиплоидных клеток использована наземная легочная улитка янтарка Succinea lauta Gould, 1859 - массовый вид малакофауны южного Приморья (Хасанский район, биостанция ДВГУ). Предварительный скрининг выявил у этого моллюска типичное для легочных присутствие полиплоидных ¿слеток в ганглиях, различных железах и других органах (1), а короткий онтогенез (4) позволял в один полевой сезон получать сопоставимый материал по динамике полиплоидизации клеток. В течение 1979-1997 гг. в различных тестах и экспериментах обследовано около 3000 улиток разного возраста.

Для выявления эволюционной динамики феномена соматической полиплоидии исследован 71 вид морских, наземных и пресноводных гастроп од, принадлежащих к 43 семействам, 20 отрадам и 7 подклассам. Фиксировано по 3-10'особей каждого вида. Материал собран в основном на литорали залива Петра Великого Японского моря и территории южного Приморья. Отдельные виды любезно предоставлены из коллекций и экспедиционных сборов сотрудниками ИБМ ДВО РАН и ТИНРО. В качестве тестовых органов выбраны слюнные железы, пищеварительная железа и ганглии ЦНС, где полиплоидия от умеренных до гигантских значений проявляется наиболее устойчиво.

2.2. МЕТОДЫ

Гистоморфологические и цитохимические методы применяли для идентификации тканей и клеточных типов. Препарированные органы или целые животные фиксировались жидкостью Навашина, забуференным 10 %-ным формалином и спирт-уксусной смесью (3:1). Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином с эозином (морфология), галлоцианином (РНК и ДНК), прочным зеленым (белки), ШИК-альциановым синим (нейтральные и кислые мукополисахариды); при этом использовали контрольную обработку препаратов РНКазой и амилазой.

Цитогенетический анализ хромосомных циклов проводили на давленых препаратах, приготовленных по модифицированной технологии с использованием целлофана (8). Исключение процедуры замораживания позволило значительно упростить методику и применять ее в полевых условиях. Давленые препарат использовались также для цитофотометрии и авторадиографии клеточных ядер.

Для электронной микроскопии кусочки органов фиксировали 3 %-ным глутаральдегидом (2-3 ч) и 2 %-ной осмиевой кислотой (1-2 ч), обезвоживали спиртом и ацетоном, одновременно контрастируя 2 %-ным уранил-ацетатом, и заключали в Эпон-812 или Эпон-Аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и исследовали на электронном микроскопе 1ЕМ-100В. Ультраструктурные исследования проводили параллельно с цитофотометрическим определением плоидности ядер и авторадиографическим контролем на ядерные синтезы.

Цитофотометрйя ДНК при окраске по Фёльгену применялась для определения уровней плоидности ядер и их положения в клеточном цикле. Эуплоидными эталонами служили ядра мужских половых клеток (1с-2с-4с) или ядра мелких соматических клеток (2с). Фотометрию производили на мазках, полученных методом щелочной диссоциации или на давленых препаратах. Использовали фотометрическую насадку ФМЭЛ-1 на базе микроскопа МБН-11 и интегрирующий микроденситомегр М-85 (Уюкеге) в спектральной области 534-555 нм.

Методом авторадиографии выявляли ядерные биосинтезы в ходе размножения, роста и дифференциации клеток. Предшественники ДНК и РНК - ЗН-тимидин (740920 ГБк/ммоль) и ЗН-уридин (960 ГБк/ммоль) - вводили улиткам микроинъектором в область пищеварительной железы, либо кусочки органов инкубировали в растворе изотопов. Дозировка составляла 40-200-400 кБк/г(мл). Использовались одно- и многократные режимы введения, импульсные (0,5 - 1 ч) и отставленные (до 24 ч) режимы циркуляции предшественников. Радиоавтографы готовили методом погружения или петлей, как правило, на давленых препаратах, которые окрашивали по Фёльгену, Гимза или кармином. Определяли индексы (долю) меченых ядер (ИМЯ, %) и индексы (интенсивность) метки. В особых случаях авторадиография сочеталась с цитофотометрией ДНК. Меченые ядра фотометрировали на радиоавтографах, окрашенных по Фёльгену, при 555 нм (суммарное светопоглощение ДНК-фуксина и метки) и 700 нм (светопоглощение метки) и вычитанием находили отдельно условную массу ДНК и интенсивность метки.

В последних наших работах по ряду причин преимущество отдавалось давленым препаратам. Во-первых, расплющенные ядра имели оптимальную для фотометрии оптическую плотность; во-вторых, они были удобны для совмещенной фотометрии ДНК-фуксина и авторадиографической метки, поскольку исключалось самопоглощение радиоактивности крупными ядрами; в-третьих, отношение площадей ядер разных классов плоидности приобретает двукратную прогрессию (12), что позволило в ряде случаев оценивать классы плоидности визуально по размерам ядер.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. ПРОЯВЛЕНИЕ СОМАТИЧЕСКОЙ ПОЛИПЛОИДИИ В РАЗЛИЧНЫХ ОРГАНАХ И ТКАНЯХ ЯНТАРКИ

Скрининг на проявление полиплоидии в тканях улитки янтарки (1, 3, 6, 14) выполнен на крупных (около 24 мм) половозрелых особях. На срезах идентифицировали ткани и клеточные типы, а на мазках из соответствующих органов оценивали уровни плоидности клеточных ядер.

Изучено 54 типа клеточных популяций. Установлено, что во всех тканях клетки, как правило, одноядерные. Единичные двуядерные клетки встречены в слюнной железе, гонаде и в некоторых других органах; Далее они отдельно не учитывались, так как заметной роли в установлении гетероплоидности тканей не играют. Показано, что основные эпителиальные клетки эпидермиса, органов пищеварительной и половой систем, так же как и клетки почки, соединительной, мышечной и нейроглиальной тканей, имеют диплоидные ядра. В то же время для многих специализированных клеток характерна полиплоидия, которая выступает в ряде случаев ведущим фактором соматического роста (рис. 1,2). Полиплоидизируются прежде-всего секреторные эпителиальные клетки. Ядра слизистых и белковых субэпидермальных желез мантии, легкого и нош содержат 32с и 256с-512с ДНК соответственно. В пищеварительной системе слизистые клетки глотки и пищевода полиплоидизируются до 8с; белковые базофильные клетки кишечника и пищеварительной железы - до 32с-64с; белковые секреторные клетки глоточных желез - до 32с-64с и даже 128с; слизистые клетки слюнных желез - до 32с, а белковые - до 64с-128с. В половой системе питающие клетки гонады, секреторные клетки белковой и предстательной желез содержат 16с-32с-64с ДНК; эпителиальные

Рис. 1. Гистоморфология некоторых органов янтарки с выраженной полиплоидией, а - край мантии; б - слюнная железа; в - пищеварительная железа; г -кишка; д -белковая железа; е - предстательная железа; ж - нервный ганглий. клетки гермафродитного протока, яйцевода и семяприемника - до 8с-16с. Нейроны ЦНС - наиболее высокоплоидные клетки, в различных ганглиях их ядра содержат до 2048с-16384с ДНК. Полиплоидные нейроны уровней 16с-64с обнаружены также в наружных оболочках различных органов и в кутисе. Характер гистограмм указывает на то, что умножение геномов происходит в основном в геометрической прогрессии, не синхронно и не тотально, так что во всех случаях выявляются растянутые ряды гетероплоидных значений. Последнее обстоятельство могло свидетельствовать о продолжающихся в постнатальном онтогенезе ростовых процессах.

С учетом данных литературы (20-26) и результатов скрининга на других видах (30, 31,33) можно заключить, что возможность полиплоидизации клеток в тканях гастропод не ограничивается каким-либо типом специализации, но степень проявления полиплоидии тканеспецифична. Полиплоидия чаще встречается в железах, причем уровни плоидности белковых клеток выше, че^^и^щ^.ц Наиболее выражена полиплоидия в нейронах ЦНС. ГОСУДАРСТВЕН

БИБЛИОТЕКА i г ч s к ж №728 256 т т Ш гм шъ sm tsm

Рис. 2. Гистограммы распределения клеточных ядер по уровням плоидности в различных органах янтарки. По оси абсцисс - уровни плоидности, с; по оси ординат - число ядер, а - сперматогенные клетки (эталон); б - клетки края мантии; в - эпителий пищевода; г - эпителий тонкой кишки; д - пищеварительная железа; е - глоточная железа; ж - слюнная железа; з - эпителий гонады; и - белковая железа; к - эпителий яйцевода; л - предстательная железа; м - эпителий семяприемника; н - клетки ганглиев нервного кольца.

Для изучения онтогенеза полиплоидных тканей предварительно определены параметры жизненного и полового циклов янтарок. На протяжении года производили анализ размерно-весовой структуры изучаемой популяции, наблюдали за яйцекладками и появлением молоди (4). Установлено, что жизненный цикл янтарки Succinea lauta в условиях южного Приморья составляет 13-15 мес (лето -зима - лето) с периодом зимней спячки с октября до мая, половое созревание и размножение приходятся на второе лето жизни. При выборе модельных органов изучены три возрастные группы: 1 - сеголетки (конец июля, высота раковины -1012 мм, вес - 0,19-0,40 г); 2 - растущие годовики (соответственно: июнь, 16-20 мм, 0,75-1,80 г); 3 - взрослые годовики (конец июля, 22-25 мм, 1,95-2,75 г). В качестве потенциальных модельных систем отобраны: белковая и предстательная железы -вспомогательные органы гермафродитной половой системы, эпителий кишечника, пищеварительная и слюнные железы и ганглии ЦНС. Определяли возрастные изменения плоидности ядер и ИМЯт - индекса меченых ядер при импульсном введении ЗН-тимидина - раздельно для фракций диплоидных (2с-4с) и полиплоидных (4с и более) ядер (табл . 1).

Таблица 1. Изменения уровней плоидности ядер и ИМЯт в некоторых органах у янтарок трех возрастных групп

Орган Гру- Классы плоидности яаер, с ИМЯт ИМЯт Число ппа 2с-4с, % ' 4с+, % ядер/жив.

Белковая 1 • 2-4 (зачаток) 16,3+2,1 - 870/ железа 2 2-4-8-16-32 8,9+1,8 17,0+2,9 14500/

3 2-(4-8)-16-32-(64) 3,3±0,6 0,5+0,2 10700/

Предста- 1 2-4 (зачаток) 18,5+2,4 - 950/ тельная . 2: 2-4-8-16-32-(64) 6,4+1,4 15,2+1,5 12800/ железа 3 2-(4-8)-16-32-(64) 0,7+0,3 0,8+0,3 11500/

Кишечник 1 2-4-8-16-32 8,0+1,2 12,5+4,2 8500/

2 2-4-8-16-32 7,0+1,6 8,3+2,9 11400/

- 3 2-4-8-16-32 3,2+0,9 1,2+0,6 14700/

Пищевари- 1 2-4-8-16,32-64 14,8+3,0 22,6+1,8 3530/ тельная 2 2-4-8-16-32-64 12,8+2,2 6,5+2,0 5960/ железа 3 2-4-8-16-32-64 4,6+1,3 1,2+0,3 4750/

Слюнные 1 2-4-8-16-32-64-(128) 15,4+1,8 13,9+2,8 8850/ железы 2 2-4-8-16-32-64-128-(256) 11,4+2,3 9,7+2,5 8450/

3 2-4-8-16-32-64-128-(256) 4,1+1,0 .1,3+0,

Ганглии 1 2-4-.,-512-(1024) 47,5+2,3 .54,2+2,7 23300/

ЦНС . 2 2-4-,. -2048-(4096) 39,5+3,2 29,6+1,6 21500/

3 2-4-.-4096-(8192-16384) 13,3+2,8 4,9±0,9 19300/

Результаты показывают, что полиплоидия в тканях янтарки не является следствием старения, а представляет их неотъемлемое свойство уже в начале развития. В кишечнике, пищеварительной и слюнных железах полиплоидные клетки всех классов закладываются уже у сеголеток (1-я группа), у них же отмечаются и максимальные значения ИМЯт как для диплоидных, так и для полиплоидных фракций клеток. Репродуктивные процессы продолжаются и у годовиков, но у старых животных они резко замедляются. Поскольку нарастание классов плоидности у годовиков практически отсутствует (небольшой сдвиг имеется в слюнных железах), продолжающийся синтез ДНК свидетельствует о приросте числа клеток и, возможно, их обновлении. В ганглиях ЦНС гетероплоидный ряд нейронов вплоть до 512с-1024с тоже сформирован у сеголеток, но репродуктивные процессы и нарастание классов плоидности продолжаются и у взрослых улиток (9,32). Иная динамика, но тот же принцип сопряжения полиплоидии и тканевой дифференцировки характерны для желез полового тракта. В первое лето формируются лишь маленькие зачатки, состоящие из диплоидных клеток, а во второе лето происходит их динамичное развитие на основе полиплоидии, связанное с половым созреванием улиток. Именно эти органы - белковая и предстательная железы - были выбраны для модельных исследований. Основное их преимущество состоит в том, что весь процесс развития происходит в короткие сроки у достаточно крупных особей-годовиков, удобных для сбора и проведения опытов. Последующие работы ограничились белковой железой. Ее Эпителий демонстрирует типичный уровень полиплоидии(16с-64с), имеет один тип полиплоидных секреторных клеток вырабатывают белково-полисахаридный секрет для формирования яиц) и хорошо различимую популяцию вспомогательных диплоидных клеток, среди которых предположительно могли быть и камбиальные элементы (3). Остальные органы использовались как объекты сравнения, в основном при морфологических исследованиях эндомитоза. Особый интерес представляли нейроны, которые демонстрировали максимальную полиплоидию (до 16384с) и непрерывный рост вместе с ростом животного.

3.2. ВОЗРАСТНАЯ ДИНАМИКА ПОЛИПЛОИДИЗАЦИИ И ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ КЛЕТОК БЕЛКОВОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЯНТАРКИ

Для правильного понимания механизмов полиплоидизации клеток необходимо было четкое видение гистогенетической динамики изучаемой ткани. Ошибки и неудачи в определении сущности "эндомитотических" ядер, имевшие место в работах на клетках растений и животных, были обусловлены как раз игнорированием или неудачным выбором стадий развития полиплоидных клеток. Описывая эндомитоз или любой другой механизм полиплоидизации клеток, нужно прежде всего быть уверенным в том, что это действительно репродуктивный процесс, а не морфологический артефакт. Необходимым контролем здесь выступает фотометрическая и.авторадиографическая регистрация синтеза ДНК. С учетом опыта предыдущих исследователей было важно также знать и учитывать динамику дифференциации полиплоидизирующихся клеток, стадийность их функционирования, включая возможные периоды покоя и реактивации. Наряду с морфологическими характеристиками растущих клеток, ценным критерием здесь выступает транскрипционная активность хромосом (синтез РНК), которая в любых гистогенезах должна соответствовать известным закономерностям клеточной репродукции и дифференциации. Установлению этих гистогенетических параметров нашего модельного объекта - белковой железы янтаркй - и посвящена настоящая

глава. Кроме того, закономерности цикла полиплоидных клеток интересны сами по себе. Они изучены в основном на млехопитающих и насекомых, чего явно не достаточно для общих суждений. Поэтому мы уделили внимание и таким вопросам, как порядок и скорость синтеза ДНК в полиплоидных циклах.

3.2.1. Динамика репродукции и полиплоидизации клеток Для получения общей картины развития белковой железы в течение года исследовали ее гистологическую организацию и определяли суточную норму ДНК-синтезирующих (8-фазных) ядер - ИМЯсут при 3-кратном введении ЗН-тимидина с интервалом 10 ч и фиксацией через 4 ч после третьей инъекции (4). Установлено, что у сеголеток в августе-сентябре (в возрасте 2-3 мес) зачаток белковой железы образован мелкими диплоидньши клетками с умеренной пролиферативной активностью - ИМЯсут в августе не превышает 20 % (рис. 3).

В период зимней спячки рост останавливается, включение ЗН-тимидина в конце сентября—начале мая отсутствует. В мае рост возобновляется, зачаток увеличивается в объеме, ИМЯсут сильно колеблется, достигая 25-30 %, но гистологическая картина существенно не меняется. Решающие, события в развитии железы происходят в июне: образуются ацинусы, эпителий дифференцируется на секреторные и

Рис. 3. Суточное число ядер, синтезирующих ДНК, в процессе развития белковой и предстательной желез янтарки.

По горизонтали - даты взятия материала; по вертикали - индекс меченых ядер, %. а - сеголетки, б -годовики. 1 - зачаток, 2 - белковая, 3 - предстательная железы. Заштрихованная полоса - период зимней спячки. вспомогательные ресничные клетки, резко увеличивается объем секреторных клеток и их ядер, ИМЯсут достигает максимальных значений - 50-60 %. В июле-августе ростовые процессы затухают. В это время имеются зрелые функционирующие железы, продолжаются копуляции и яйцекладки. В сентябре у погибающих улиток синтез ДНК отсутствует. Подчеркнем, что яйцекладки у годовиков и вылупление молоди отмечаются непрерывно на протяжении июля-августа, поэтому каждое новое поколение формируется с разницей в возрасте до 2 мес, и половое созревание перезимовавших особей, в том числе развитие белковой железы, происходит в популяции асинхронно. Теперь понятны большие вариации ИМЯсут в одно и то же время года (например, в июне - 5-60 %) - они отражают различия в степени зрелости желез, обусловленные возрастной неоднородностью годовиков. Это обстоятельство не позволяло объективно характеризовать данный показатель средним значением, зато представлялась возможность в одной выборке, взятой в конце июня - начале июля, исследовать всю динамику созревания и полиплоидизации клеток, а в августе иметь однородный материал в стадии продолженного функционирования желез. При ежесуточной зависимости роста янтарок от погодных условий, прежде всего от влажности, такой подход оказался наиболее целесообразным. Он и использован во всех дальнейших опытах.

Для выявления динамики полиплоидизации клеток белковой железы в сборах 1981,1983 и 1984 гг. улиткам-годовикам разного размера однократно вводили ЗН-тимидин с фиксацией через 0,5-1 ч. На радиоавтографах определяли долю меченых и немеченых ядер разных классов плоидности, общий ИМЯ, а также митотический индекс (МИ) диплоидной фракции клеток. Всего в 3 опытах обработан материал от 52 животных, представлявших весь ряд полового созревания; для каждой белковой железы просчитывали от 1000 до 4000 ядер (4,7). Онтогенетическая динамика белковой железы представлена на рис. 4. В ней выделено 5 стадий.

1. Стадия пролиферации диплоидных клеток (сеголетки в августе-сентябре и годовики в мае-июне). Ядра содержат 2с-4с ДНК, ИМЯ при импульсном мечении ЗН-тимидином в пределах 16-35 %, МИ - 0,8-3,9 %. Мелкие недифференцированные клетки.

П. Стадия ранней полиплоидизации (годовики в мае-июне). Увеличивается доля 4с-ядер, появляются 8с-ядра, ИМЯ варьирует от 10 до 30 %, МИ - от 1 до 2,7 %. Секретообразование еще отсутствует.

70 60 50 40 30 20 10 О

2 4 8 1632 2 4 8 1632 64 2 4 8 1632 64 Рис. 4. Распределение ядер клеток белковой железы янтарки по уровням плоидности на разных стадиях развития (1-У). По оси абсцисс - уровни плоидности, с; по оси ординат - доля ядер, %. Заштрихованные столбики -меченные 3Н-тимидином ядра. Вертикальные отрезки - максимальные и минимальные значения.

III. Стадия интенсивной полиплоидизации и роста (годовики в июне-начале июля). Ядра секреторных клеток полиплоидизируются до уровней 16с-32с, типичный ИМЯ составляет 11-33 %, к концу стадии снижается до 5-7 %, МИ фракции диплоидных клеток около 0,4-1 %. Секреторные клетки резко увеличиваются, синтезируется и накапливается секрет.

IV. Стадия дефинитивной зрелости (годовики в конце июня- июле). Ядра содержат от 2с до 64с ДНК, соотношение диплоидных вспомогательных и полиплоидных (16с-32с-64с) секреторных клеток составляет примерно 1:1, ИМЯ снижается до 25 %, а среди секреторных клеток - до 0,5-3 %, МИ - до 0,1-0,8 %. Клетки зрелые, секрет течет, начинается первая яйцекладка.

V. Стадия продолженного функционирования желез, повторные яйцекладки (годовики в июле-августе). Уровни плоидности те же, синтез ДНК и митозы у большинства о собей практически отсутствуют, но у некоторых регистрируется ИМЯ до 5 %. Клетки зрелые, секрет течет, встречаются пикнотические и дегенерирующие ядра.

В дальнейшей работе при изучения закономерностей репликации ДНК и механизмов полиплоидизации клеток в 1986 г. взята новая выборка из 30 животных, которая также потребовала определения стадий развития и ростовых потенций каждой железы (11). Проводилась цитофотометрия ДНК на ЗН-тимидиновых радиоавтографах — раздельно для меченых (Ь'-фазных) и немеченых (01- и 02фазных) ядер, что позволило выявить положение ядер в клеточном цикле, истинную кратность, полноту и возможные ошибки эндорепродукции геномов. Представленный на рис. 5 ряд из 11 животных, фиксированных в конце июня -начале июля (№ 1-8) и в августе (№ 9-11), отражает динамику развития белковой железы. Животные № 1-3, а также участок 4а от железы животного № 4, демонстрируют стадию II - ранней полиплоидизации; № 46 и 4в - постепенное продвижение в III стадию - интенсивной полиплоидизации (здесь отмечен и максимальный ИМЯ - 33,4 и 25,5 % соответственно); № 5-7 - завершение П1 стадии, формирование модальных классов плоидности; № 8 - максимальная полиплоидизация к IV стадии дефинитивной зрелости (отсутствие класса 8с и минимальный ИМЯ, составивший в популяции секреторных клеток 2,2 %, свидетельствуют о завершении роста); № 9 - типичное состояние терминальной дифференцировки в стадии V, функционирование железы в отсутствие ростовых процессов; № 10-11 - заметная активация ростовых процессов и формирование молодой генерации секреторных клеток (появление новых тетра-октаплоидных ядер, возрастание ИМЯ во фракции 2с-8с ядер до 5,5 %, кластерное расположение молодых ацинусов, уменьшение доли ядер высших классов плоидности). Частота встречаемости животных с признаками регенераторного роста белковой железы

Рис. 5. Распределения ядер, меченных (черные столбики) и не меченных (светлые столбики) ЗН-тимидином, по массе ДНК-фуксина (уровням плоидности) на препаратах-радиоавтографах.

По оси абсцисс - уровни плоидности, с; по оси ординат - число ядер, %.

В результате разграничения фракций меченых и немеченых ядер (рис. 5), установлено, что в циклах эндорепродукции происходит в основном полное, т. е. двукратное, умножение геномов, так что ядра по признаку массы ДНК представляют ряд 2с-4с-8с-16с-32с-64с. В то же время выявляется до 3-5 % немеченых ядер на промежуточных уровнях плоидности - около Зс-6с-12с-24с ДНК (животные № 4в, 5, 6, 8, 9, 11), а также заметные сдвиги гистограмм в сторону гипоэуплоидных значений. Было предположено (11), а потом и показано (15), что промежуточные уровни плоидности возникают в результате асимметричных митозов с последующей эндорепродукцией Зс-ядер (см. раздел 3.3.2). Ядра с гипоэуплоидными значениями ДНК обычно имеют неправильную форму, признаки пикноза или диффузии хроматина и, по-видимому, принадлежат терминально дифференцированным стареющим клеткам. Неполная репликация ДНК представляется маловероятной.

Таким образом, в гистогенезе белковой железы янтарки рост и дифференциация секреторных клеток сопряжены с полиплоидизацией до определенного "рабочего" уровня - 16с-32с-(64с). Причем полиплоидия начинает развиваться прежде, чем появляются видимые включения секрета. В зрелых железах во второй половине лета ростовые процессы отсутствуют, но возможны периодические очаговые проявления регенерации - старение и отмирание в секреторных циклах части высокоплоидных клеток и замена их молодыми растущими клетками из диплоидного резерва с обязательной полиплоидизацией до "рабочего" уровня. Источники регенерации не установлены, но, по-видимому, камбиальные клетки присутствуют среди вспомогательных (опорных, ресничных) диплоидных клеток, которые расположены в ацинусах вперемешку с секреторными клетками. По гистогенетическим проявлениям секреторный эпителий белковой железы янтарки сходен с аналогичными полиплоидизирующимися и медленно обновляющимися клеточными популяциями млекопитающих - такими как мегакариоциты, эпителий печени или мочевого пузыря. По-видимому, здесь возможна и репаративная регенерация. Для белковой железы прудовика Ьутпаеа 1шпса1и1а показана способность к регенерации на основе гиперплазии эпителия после ее атрофии и некроза, вызванных мирацидиями фасциол (Копс1е1аис1, ВапЬс, 1980). 3.2.2. Дифференциация клеток и динамика транскрипционной активности

Морфологические проявления дифференциации клеток белковой железы изучали с помощью электронной микроскопии на зачатках 1-И стадий развития и созревающих железах III стадии (16). Соотношение репликационной и транскрипционной активности ядер секреторных и вспомогательных клеток выявляли путем параллельного "импульсного" инкубирования кусочков от одной и той же белковой железы в присутствии ЗН-тимидина и ЗН-уридина. В трех независимых опытах (1983, 1984, 1986 гг.) для 44 желез по ранее установленным критериям определяли стадии развития и оценивали частоту ядер, включивших ЗН-тимидин (ИМЯт, оценка по 1000 ядрам) и ЗН-уридин (ИМЯу, оценка по 300-900 ядрам) (7,16). Кроме того, на 62 животных с железами III-V стадий развития пул РНК-синтезирующих клеток определяли в режиме насыщения ЗН-уридияом - через 1, 4, 8 и 12 ч после инъекции предшественника. При этом ядра классифицировали по плотности метки как слабо, умеренно и интенсивно меченные. Для каждой железы учитывали по 400-1500 ядер (7).

В зачатках белковой железы (1-П стадии) ядра по данным цитофотометрии содержат 2с-4с-8с ДНК. Обнаружены участки из ди-тетраплоидных клеток с процессами ранней цитодифференциации. Недифференцированные клетки имеют небольшие 2с-ядра с темной кариоплазмой, трофические включения, узкие цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР). В будущих секреторных клетках ядра более крупные и светлые, часть из них, вероятно, уже тетраплоидные, в них четко разграничены гетеро- и эухроматиновые массы, цитоплазма разрежена, цистерны ШЭР расправлены, хотя общий объем цитоплазмы еще невелик. В зачаточных ацинусах имеются и октаплоидные клетки с такими же признаками дифференцировки. В более зрелых железах (III стадия) растущие секреторные клетки классов 8с-16с имеют нормально развитый ШЭР, диктиосомы с гомогенным электронноплотным содержимым и уже вполне зрелые, хотя и малочисленные, секреторные гранулы. В терминально дифференцированных клетках (IV-V стадии) полиплоидные 16с-32с-ядра имеют хромоцентрическую структуру (см. ниже-рис. 9), эухроматические компоненты и перихроматиновые гранулы. В цитоплазме в равной мере представлены участки ШЭР и диктиосомы, число секреторных гранул варьирует - в связи с секреторных циклом. Вспомогательные ресничные клетки узкие, имеют мелкие диплоидные ядра.

Хотя первые гранулы секрета появляются в октаплоидных клетках, есть основания считать, что транскрипция тканеспецифических генов в ядрах будущих железистых клеток начинается уже при уровнях плоидности 4с или даже 2с. При выявлении синтеза РНК с помощью ЗН-уридина в железах II и начала III стадий обнаруживались две категории таких ядер - слабо и сильно меченные, в том числе при 8-часовой циркуляции ЗН-уридина. При этом слабо меченные диплоидные ядра выходили за рамки нормального распределения, они составляли реальную субфракцию объемом 23-30 %. В остальных 70 % клеток интенсивное мечение, вероятно, обусловлено началом гетеросинтезов РНК в ходе секреторной дифференцировки.

При анализе возрастной динамики (рис. 6) видны различия транскрипционной активности двух типов клеточных популяций - вспомогательных и секреторных. Диплоидные ядра вспомогательных клеток на всех этапах сохраняют достаточно высокую активность синтеза РНК - средний ИМЯу незначительно и плавно снижается от 78 до 63 % при развитии от зачатка (1-П стадии) до функционирующей железы (V стадия). В популяции полиплоидизирующихся секреторных клеток транскрипционная активность закономерно изменяется. В процессе роста (П-Ш стадии) высокая эндорепродуктивная активность ядер (ИМЯт около 17 %) сочетается с высоким уровнем синтеза РНК (средний ИМЯу около 54 %). Характерны очень большие колебания ИМЯу у отдельных животных на одной стадий, что должно отражать определенную синхронизацию синтеза РНК в железах. К стадии дефинитивной зрелости (IV) наступает угнетение транскрипции, коррелирующее с затуханием процессов эндорепродукции и завершением

90 80 70 60 50 40 30 20 10 О

4-32с

16-64с

Рис. 6. Соотношение репликационной (ИМЯт) и транскрипционной (ИМЯу) активности ядер вспомогательных (2-4с) и полиплоидных секреторных (4-64с) клеток белковой железы на разных стадиях развития (1-У). Вертикальные отрезки -95% -ный доверительный интервал.

I ИМЯт, % [J ИМЯу, %

1-П III IV V

II III IV V произв одства секретов (средний ИМЯу падает до 6 %, у некоторых животных до 01 %, ИМЯт = 1%). При дальнейшем функционировании зрелой железы (V стадия, август) происходит реактивация транскрипции - ИМЯу вновь возрастает в среднем до 46,5 %, при этом синтез ДНК и рост клеток практически отсутствуют (очаги регенерации можно не учитывать).

Специфичность III, IV и V стадий еще более наглядно показана в опыте с длительной циркуляцией ЗН-уридина (рис. 7). Исследовались железы, которые по морфологическим и кариометрическим критериям и с учетом времени взятия материала были предварительно распределены в три группы: уверенно III, уверенно V стадии и предположительно смешанная группа из желез IV и V стадий развития. В группах III и V стадий с увеличением времени включения ЗН-уридина до 8-12 ч практически все ядра секреторных клеток оказывались мечеными (таким образом, пониженное среднее значение и большая вариабельность ИМЯу при импульсном мечении в предыдущих опытах действительно отражает лишь цикличность синтеза РНК, в то время как участвуют в транскрипции все клетки). В смешанной группе желез четко обозначились две подгруппы: одни имели почти 100%-ный пул активных меченых ядер и даже меченую цитоплазму - V стадия; в других железах было лишь 5-15% слабо меченных ядер или включение ЗН-уридина практически отсутствовало - истинная IV стадия.

Рис. 7. Изменения ИМЯу в секреторных клетках белковой железы при длительной циркуляции 3Н-уридина на разных стадиях развития (III-V). По оси абсцисс -время после введения 3Н-уридина, ч; по оси ординат - ИМЯу, %. Плотность мечения ядер: 1 - слабая, 2 - умеренная, 3 -интенсивная.

Таким образом, в развитии популяции секреторных клеток белковой железы наблюдается закономерная смена трех качественно различных состояний с разным проявлением процессов репликации и транскрипции. Первое - быстрый рост во II-III стадиях на основе эндорепродукции клеток, сопряженной с активной транскрипцией. При этом синтез РНК отражает не только аутосинтетические процессы, но и параллельные гетеросинтезы, связанные с нарастающей дифференцировкой и продукцией секретов. Второе состояние возникает в IV стадии: по завершении роста и дифференцировки репликация и транскрипция блокируются, наступает временное состояние репродуктивного и функционального покоя. Развитие стадии покоя обусловлено особенностями полового поведения янтарок -это период поиска партнера при полной половой зрелости. Третье состояние - новая волна транскрипции, наблюдаемая в зрелых клетках V стадии в отсутствие репликативныХ процессов (гетеросинтезы в чистом виде). Это типичное рабочее состояние терминально дифференцированных клеток, которые поддерживают высокий уровень экспрессии тканеспецифических генов для обеспечения секреции. Выявленные качественно различные состояния полиплоидных клеток были учтены в дальнейшей работе при изучении эндомитоза и имитирующих его явлений (см. раздел 3.3).

3.2.3. Кинетика синтеза ДНК при полиплоидизации и дифференциации клеток

Среди свойств полиплоидных клеток особый интерес представляет скорость синтеза ДНК, которая обратным отношением связана с длительностью синтетического периода. Привлекала вероятная зависимость этого показателя от двух факторов - уровня дифференцировки клеток и уровня плоидности ядер. Скорость синтеза Д НК оценивали по включению ЗН-тимидина в ядра с нарастающей массой ДНК. Использовали комбинированную методику фотометрии метки и ДНК в одном и том же ядре. Такой подход позволял определять уровень плойдности меченого ядра, его положение в Б-периоде, порядок репликации эу- и гетерохроматина, интегральную плотность метки над ядром (индекс метки) и динамику этого показателя в 8-периоде. Эуплоидные (С I - и С2-фазные) значения

Рис. 8. Распределение меченных 3Н-тимидином ядер по массе ДНК и интенсивности метки.

По оси абсцисс - масса ДНК, усл. ед., и уровни шгоидности, с; по оси ординат - интенсивность метки в тех же ядрах, усл. ед. /-IV - категории ядер по локализации метки: /-// -равномерно меченные, Ш -преобладание метки над суперхромоцентрами, IV- мечены только суперхромоцентры. Вертикальными линиями выделены 95%-ные доверительные интервалы эуплоидных значений ДНК. Сплошные кривые -усредненная динамика; пунктирные линии - динамика для быстрой и медленной субфракций диплоидных ядер.

ДНК измеряли на немеченых ядрах. Исследовались животные № 1-7 из выборки 1986 г., у которых белковые железы находились на стадиях II и III - ранней и интенсивной полиплоидизации (у № 4 взяты три участка железы с разной степенью зрелости) (см. раздел 3.2.1, рис. 5). Проанализировано 2356 ядер в последовательных эндоциклах - 2с-4с, 4с-8с, 8с-16с и 16с-32с, протекающих на фоне постепенной дифференпировки железистых клеток (12,13).

Результаты цитофотометрии для одного участка железы № 4 приведены на рис. 8 в виде диаграмм соотношения массы ДНК и индекса метки в ядрах разных классов плоидности (12). В работе (13) имеются такие данные для всех исследованных животных. При построении диаграмм, по которым и оценивалась скорость синтеза ДНК, прежде возникала необходимость разграничения позднего S-периода одного цикла и раннего S-периода следующего цикла, поскольку позиции таких ядер, ввиду определенной ошибки измерения (для эуплоидных ядер CV = 7,5 %), значительно, перекрываются. Использовали два критерия, установленные предварительно. Во-первых, позднее-фазные ядра имеют меньший размер, чем ранне-S-фазные ядра следующего цикла, так как рост ядра в результате полиплоидизации приходится в основном на G1 -период (10). Во-вторых, позднее-фазные ядра характеризуются локальной меткой над 2-4 суперхромоцентрами, что отражает позднюю в S-периоде репликацию особых гетеропикнотических хромосом, подобных половым хромосомам других животных (12). Для установления этого факта измеряемые меченые ядра классифицировали в соответствии .с характером локализации метки на 4 категории: I - слабо и равномерно меченные; II - сильно и равномерно меченные; III - неравномерно меченные с преобладанием метки' над суперхромоцентрами; IV - локально меченные ядра, содержащие метку почти исключительно над суперхромоцетрами. Позиции ядер разных категорий на диаграммах (см; рис. 8) свидетельствуют о том-, что в комплексе гетеропикнотических (половых?) хромосом ДНК начинает реплицироваться ближе к концу S-периода на фоне завершающейся репликации в остальном хроматине, а окончание репликации в этих хромосомах происходит в самом конце S-периода. Общепознавательный интерес этой работы состоял в том, что до сих пор поздняя репликация каких-либо маркерных хромосом не была показана для полиплоидизирующих эндоциклов, хотя в политенных хромосомах двукрылых выявлены познореплицирующиеся участки. Для целей нашей работы локальное мечение ЗН-тимидином могло служить маркером окончания S-периода.

Диаграммы кинетики включения ЗН-тимидина (см. рис. 8) характеризуют изменение скорости синтеза ДНК по ходу S-периода: она максимальна в первой половине и плавно снижается во второй половине периода. Этот результат в целом совпадает с данными других работ, выполненных на клетках растений и животных (см. 12). Важнее то, что кинетические кривые были однотипны в последовательных эндоциклах, и это позволило сопоставить по скорости синтеза ДНК ядра разных классов плоидности и выявить изменения этого параметра в ходе дифференцировки клеток (13). Для каждого класса ядер определяли суммарный (на ядро) индекс метки (СИМ) по максимальной точке кривой включения ЗН-тимидина. Например, в железе 46 (рис. 8) эти максимумы, составили: для ядер класса 2с-4с - 9,3 усл. ед; 4с-8с -16усл. ед.; 8с-16с-33 усл. ед. Однако в оценку СИМ диплоидных ядер были внесены коррективы. Замечено, что фракция диплоидных клеток у всех животных отличается большой гетерогенностью по интенсивности мечения ядер ЗН-тимидином и, следовательно, по скорости синтеза ДНК. Выделяется небольшая (5-33 %) "быстрая" субфракция интенсивно меченных ядер и основная субфракция с умеренно меченными ядрами - "медленная". После такого расчленения (проведенного с определенной условностью) по двум новым кинетическим кривым определяли СИМ раздельно для быстрой и медленной субфракций: в железе № 46 получили соответственно 19 и 8,5 усл. ед. (см. рис. 8, пунктирные линии). Усредненные показатели для всех 7 животных приведены в табл.2.

Таблица 2. Усредненные значения суммарного индекса метки ЗН-тимидина (СИМ) в различных по содержанию ДНК ядрах белковой железы янтаркй

Номер живот-нош Стадия развития железы 2с-4с быстрая субфракция 2с-4с медленная субфракция 4с-8с 8с-16с 16с-32с Число измеренных ядер

3 п - 6 8,

46 ш 19 8,

5 ш 19 6,5 12,5 24,

6 Ш поздн. 28 9 6 4,

7 Щ поздн. 27 . 11

Для стадии ранней полиплоидизации (II) характерны следующие события. Уже в циклах диплоидных клеток (2с-4с) выражена дифференциация на медленные и быстрые клетки (последние составляют на данной стадии 20-25 %). Этот шаг отмечен примерно 3-кратным уменьшением показателя СИМ медленной субфракции по сравнению с бысцюй (6-9 усл. ед. против 20-23; см. табл. 3, № 1-4а). В следующем цикле СИМ тетраплоидных (4с-8с) ядер увеличивается (8-13 усл. ед.), но всего лишь в 1,3-1,4 раза. Это означает, что относительный, приведенный к диплоидному, индекс метки (ОИМ) для ядер тетраплоидного цикла составляет лишь 67-70 % от ядер медленной субфракции диплоидного цикла, т. е. скорость включения уменьшается еще в 1,5 раза. По всей вероятности, здесь наблюдается одна достаточно протяженная (не менее 2 митотических циклов) цепь событий, приводящих в совокупности к снижению скорости включения ЗН-тимидина в 4,5 раза. Имеются аргументы к тому, что падение ОИМ во II стадии хотя бы частично отражает реальное снижение скорости синтеза ДНК, причинно связанное с началом дифференцировки клеток. В разделе 3.2.2 отмечены структурные и метаболические проявления ранней дифференцировки ди-тетраплоидных клеток зачатка белковой железы. В частности, параллельное мечение клеток ЗН-тимидином и ЗН-уридином показало, что уже ранние (2с-4с) циклы сопряжены с гетеросинтетической транскрипцией. Но при этом выделена субфракция слабо меченных ЗН-уридином ядер объемом 23-30 %, которая вполне соответствует по долевой численности быстрой субфракции 2с-4с-клеток с интенсивной меткой ЗН-тимидина. Таким образом, клетки быстрой субфракции отличаются слабым уровнем транскрипции, но высокой скоростью репликации ДНК (и соответственно коротким $-периодом) и должны составлять фонд малодифференцированных клеток - рабочий камбий зачатка. Клетки медленной субфракции находятся уже в состоянии ранней дифференцировки с характерными морфологическими признаками и активной тканеспецифической транскрипцией. Резкое снижение интенсивности включения ЗН-тимидина логично объясняется снижением скорости синтеза ДНК вследствие конкурентных отношений ауто- и гетеросинтезов.

В дальнейших процессах роста и функционирования белковой железы активность камбиальной (быстрой) субфракции диплоидных клеток сначала заметно снижается, а потом снова возрастает. Так, в III стадии - интенсивной полиплоидизации и роста (№ 46,4в, 5) - СИМ этой группы ядер составляет всего 17-19 усл. ед., а ее объем падает до 5-10 % против 22-25 % воПстадии. Но уже в поздней III стадии (Х° 6,7), близкой к состоянию терминальной дифференцировки, значения СИМ увеличиваются в быстрой субфракции до 27-28 усл. ед., и ее объем возрастает до 29-33 %, что даже превышает соответствующие значения на ранних стадиях. Такая динамика еще раз, но с другой стороны, демонстрирует сохранность и возможность регенераторной активации малодифференцированных клеток в зрелых железах, о чем уже говорилось в разделе 3.2.1. Полученные данные свидетельствуют также о том, что в диплоидной фракции клеток в течение всего развития белковой железы должны быть циклы двух типов - пролиферативный (быстрый) и полиплоидизирующий (медленный). Это позволяло надеяться обнаружить впоследствии и митозы двух типов - нормальный и полиплоидизирующий - и выяснить их морфологические особенности.

В развитии популяции секреторных клеток на III стадии, начиная от медленной 2с-4с-субфракции и кончая зрелыми клетками класса 16с-32с, проявляются две закономерности. Когда механизмы дифференциации уже запущены, в тетрагаюидном цикле интенсивность включения ЗН-тимидина заметно возрастает (16 усл. ед. вместо 8-13), и когда процессы полиплоидного роста стабилизированы, в любой отдельно взятой железе показатель СИМ в последовательных эндоциклах увеличивается пропорционально возрастающим уровням плоидности (в табл. 2 эти ряды выделены жирным шрифтом). Имевшее место отставание тетраплоидных ядер по скорости синтеза ДНК преодолено - интегральное включение ЗН-тимидина (СИМ) соответствует дозе ДНК, и это означает, что скорость синтеза ДНК в расчете на диплоидный геном (ОИМ) одинакова в ядрах разной плоидности. Другая закономерность проявляется в том, что по мере созревания железы (№ 46-7) показатели СИМ для ядер всех классов плоидности сначала незначительно (№ 5), а потом резко (№ 6, 7) снижаются. Соответственно в расчете на диплоидный геном ОИМ падает от примерно 8 усл. ед. у животного № 4 до 1,1-1,4 ус л. ед. у животных № 6,7. (Ядра классов 2с-4с и 4с-8с у № 6,7 в этом ряду не рассматриваются, так как они относятся к новой генерации клеток1 и развиваются по закономерностям II стадии, описанным выше)." Как видно, при завершении полиплоидного роста снова регистрируется' 6-7-кратное снижение интенсивности включения ЗН-тимидина второй критический период развития железы, ведущий к состоянию дефинитивной зрелости. В дальнейшем эндорепродукция клеток,прекращается.

Таким образом, уровень включения .ЗН-тимидина в ядрах растущей белковой железы зависит от двух динамических факторов - умножения массы ДНК в последовательных эндоциклах и параллельно идущего процесса цитодифференциации. Сочетание этих факторов создает довольно сложную картину динамики мечения ядер. Первый из факторов проявляется вполне отчетливым эффектом дозы ДНК; на всех этапах дифференцировки, за исключением самого раннего периода, суммарный индекс метки ЗН-тимидина, или интегральная скорость синтеза ДНК, в каждом последующем эндоцикле удваивается. Это означает, что относительная (приведенная к 2с) скорость синтеза ДНК одинакова в ядрах разной плоидности. В то же время относительная интенсивность метки примерно в 17 раз снижается в ходе дифференцировки и созревания секреторных клеток (от 21,3 до 1,25 усл. ед. на 2с ДНК). Эти изменения отражают в основном (о возможных артефактах см. 13) реальное снижение скорости синтеза ДНК на двух критических этапах развития белковой железы - в ди- и тетраплоидных ядрах в связи с началом гетеросинтезов (ранняя дифференцировка) и в высокоплоидных ядрах при завершении роста клеток и синтеза секретов. Торможение репликации ДНК происходит одновременно и пропорционально в ядрах разной плоидности, что объяснимо внешним (нейроэндокринным) контролем развития железы. Аналогичные закономерности показаны для ряда гистогенезов у других животных. Известно о ДНК-дозовой зависимости включения ЗН-тимидина и сохранении длительности Б-периода в циклах эндорепродукции клеток млекопитающих, насекомых и растений (Жинкин, Нилова, 1968; Бродский, Урываева, 1981; см. также 13). Снижение скорости репликации и удлинение Б-периода в момент дифференцировки клеток типично для клеточных популяциях растущего типа, таких как кардиомиоциты млекопитающих, с длительньм совмещением процессов репродукции и дифференциации (Заварзин, 1967; Грачева, 1982; Румянцев, 1982). Такие же изменения, но происходящие на завершающих этапах развития, установлены для ядер с политенными (не менее 128с-256с) хромосомами в трофобласте мыши (Заварзин, 1967) и в слюнных железах личинок хирономуса (Гундеринаидр., 1984;Гундерина, 1992; Гундерина, Серая, 1992). Все это позволяет за частными различиями свойств полиплоидных и политенных клеток видеть общие закономерности регуляции синтеза ДНК в ходе дифференциации и эндорепродукции клеток: скорость репликации не зависит в чистом виде от уровня плоидности или политенности ядра, но закономерно изменяется в соответствии с программой и темпами дифференциации клеток. .',.

3.3. МЕХАНИЗМЫ УМНОЖЕНИЯ ГЕНОМОВ В РАЗВИТИИ

ПОЛИПЛОИДНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ПОПУЛЯЦИЙ ЯНТАРКИ

В первых же наших работах (1,2,3) в тканях янтарки отмечены ядра с морфологией эндомитоза и полиплоидные митозы. Учитывая возможность имитации эндомитоза интерфазными хромосомами, дальнейшее изучение механизмов полиплоидизации и псевдоэндомитозов мы . проводили с учетом выявленных качественно различных состояний генома, полиплоидных клеток: полиплоидный рост,; сопряженный с транскрипцией (II-III стадии); период покоя (IV стадия); транскрипция без роста (V стадия) (см. раздел 3.2).

Для уверенной идентификации эндомитоза кроме известных морфологических критериев требовалось соблюсти ряд дополнительных условий. Необходимо было исключить эндоредупликацию хромосом (полйтению), выявить ультраструктурные о собенно ста эндомитоза, показать эндомитоз как фазу клеточного цикла, в том числе предшествующие синтезу ДНК и РНК и их приостановку при компактизации и разделении хромосом, наконец, объяснить сущность парадоксальных "эндомитозов" - без синтеза ДНК, но с активной транскрипцией, наблюдавшихся рядом авторов. Решению этих задач посвящена настоящая гаава. Основные наблюдения выполнены на белковой железе янтарки. Дополнительные сведения получены на других органах.

3.3.1. Хромоцентрическая морфология полиплоидных ядер; исключение политении Полиплоидные ядра клеток различных органов янтарки обычно содержат множественные гетерохроматические глыбки - хромоцентры (рис, 9). Доля хромоцентрических ядер нередко достигает 80-90 %, что создает впечатление постоянного присутствия делящихся хромосом, сопоставимое с наблюдением "массового эндомитоза" на ряде объектов. Поскольку такие картины были характерны не только дЛя растущих, но и для зрелых и даже старых животных, сделан вывод, что они отражают не эндомитотический процесс, а особое свойство интерфазных хромосом - сохранение высших уровней компактизации как в эндоциклах, так и при терминальной дифференцировке клеток. (Аналогичные "хромонемные", "ретикулярные", "хромоцентрические" или "хромосомные" ядра известны у высших растений, насекомых, простейших и других объектов).

Подробнее морфология хроматина полиплоидных (8е-64с) ядер изучена в растущих (II-III стадии) и зрелых (V стадия) белковых железах с использованием мазков, давленых препаратов, радиоавтографов при малой дозе включения ЗН-тимидина (40 кБк/мл) и электронной микроскопии (10).

Показано, что в ходе полиплоидизации клеток хромоцентрические ядра составляют 45-80 %, причем все они при импульсном введении ЗН-тимидйна оказываются немечеными. Предшественник ДНК включается в ядра с дисперсно-глыбчатым хроматином (S-фазные ядра), доля которых (ИМЯ), как показано выше, достигает 20-30 %. В зрелых железах частота ядер с хромоцентрами достигает 7095 %, остальные ядра имеют сетчатый или конденсированный (пикнотический) хроматин; S-фазные ядра практически отсутствуют - ИМЯ от 0 до 0,6 %.

Различаются обычные хромоцентры и суперхромо центры (рис. 9 а, б), число и размеры которых по-разному изменяются в ходе полиплоидизации ядер. Размеры обычных хромоцентров в интерфазных ядрах колеблются в пределах 0,5-1 мкм, что сопоставимо с толщиной компактизованных хромосом. Мелкие (0,5 мкм) хромоцентры представляют монохроматидные участки хромосом в Gl-периоде, а более крупные (1 мкм) - бихроматидные участки в 02-периоде эндоцикла. На электронограммах различимы гетерохроматиновые массы хроматидного (0,4-0,5 мкм) и, значительно реже, хромонемного (0,1-0,2 мкм) уровней компактизации, а

Рис. 9. Хромоцентрические ядра (фрагменты) клеток белковой железы янтарки. а - 16с-ядро с обычными хромоцентрами (хц); б - 32с-ядро с суперхромоцентрами (схц); в -ультраструктура хромоцентров. также бихроматидные профили диаметром 0,8-1 мкм (рис.9 в, 11 а). По поверхности этих структур и в промежутках видны цепочки хромомеров (0,05-0,1 мкм), эухроматиновые нити (0,01 мкм) и перихроматиновые гранулы (0,03-0,06 мкм) -типичные морфологические проявления активной транскрипции.

Число обычных хромоцентров в ядрах возрастающих классов плоидности примерно удваивается и в Gl-периоде близко соответствует расчетному ряду: 44 (2п) - 88 (4п) - П6 (8п) и т. д.* Имеется, однако, отставание реальных чисел от ожидаемых по той причине, что некоторые хромосомы и в Gl-периоде остаются бихроматидными. Но накопления бихроматидных хромосом в последовательных эндоциклах не происходит. В ядрах трех классов плоидности - 8с, 16с и 32с - их доля составляла соответственно 13,8+1,3, 16¡,1±1,8 и 12,7+1,7 %.

Суперхромоцентры чаще всего организованы в два гетерохроматических блока, размеры которых прогрессивно возрастают с увеличением плоидности ядер (рис. 9 б). Бывает, однако, четыре или большее число блоков меньшего размера, а в циклирующих ядрах (на II-III стадиях) суперхромоцентры, как правило, не Гаплоидный набор хромосом (п), определенный нами на препаратах гонады в позднепрофазных и метафазных сперматоцитах, оказался равным 22; соответственно 2п = 44. По этому показателю Succinea lauta не отличается от европейской S. putris (Burch, 1965). выявляются или узнаются как группы дискретных хромоцентров (рис. 9 а-полурамка). Установлено, что суперхромоцентры формируются по завершений эндоциклов как не вполне устойчивые труппы слияния двух особых гетеропикнотических хромосом, отличающихся поздней репликацией в S-периоде (см. раздел 3.2.3). Суперхромоцентры, как и обычные хромоцентры, одинаково хорошо выражены в полиплоидных клетках разных органов янтарки, в том числе в гигантских нейронах. В диплоидных клетках тоже выделяется пара хроматиновых глыбок, соответствующих двум крупным хромосомам. Все вместе свидетельствует о раннем и тканенеспецифическом отключении этих хромосом в развитии соматических клеток янтарки - подобно половым хромосомам других животных. Слияние хромосом в полиплоидных клетках, по-видимому, обусловлено повышенной адгезивностью больших масс гетерохроматина (эктопическая конъюгация), обширными контактами их с ядерной оболочкой и отсутствием активных механизмов разделения хроматид. Во всяком случае это состояние не эквивалентно тому варианту "скрытой" политении, который известен в гигантских клетках трофобласта грызунов (Зыбина, 1986) и у растений (Nagl, 1978,1981).

Приведенные характеристики хромоцентрических ядер - обычные ультраструктурные параметры, переменные моно- и бихроматидные состояния, постоянство размеров и увеличение числа хромоцентров - позволяют заключить, что хромосомы клеток янтарки не подвержены эндоредупликации ни в явном, ни в скрытом виде, т. е. не являются политенными. Умножение геномов наблюдается в форме истинной полиплоидии с увеличением числа хромосомных наборов. Временные задержки расхождения некоторых хроматидных napv или постмитотическая агрегация гетеропикнотических хромосом не нарушают данного вывода. Исключив политению, далее мы исходили из концепций эндомитоза и полиплоидизирующего (реституционного) митоза. Была исключена также идея эндомитоза ангиоспермного типа, поскольку ее несостоятельность показана на растениях методами авторадиографии и цитофотометрии (Barlow, 1976,1978; Cavallini et al., 1981). В нашем случае речь могла идти об эндомитозе классического (инсектнош) типа (Geitler, 1939, 1953).

3.3.2. Аномальный митоз и эндомитоз как преемственные механизмы полиплоидизации клеток

Исследовали пролиферирующие и растущие клетки белковых желез, строго отобранных по критериям I-III стадий развития (35 животных из выборок 1981s 1983,1984 и 1986 гг.). Это позволяло исключить псевдоэндомитотические состояния терминально дифференцированных клеток, характерные для IV-V стадий (см. раздел 3.3.3). Фигуры митозов и эндомитозов разных уровней плоидности регистрировали с учетом включения ЗН-тимидина и ЗН-уридина. Параллельно те же железы исследовали под электронным микроскопом (15,16,17).

Установлено (15), что в ходе развития белковой железы диплоидные, в том числе камбиальные, клетки воспроизводятся путем нормального митоза. Выявляются все фазы; при этом метафазные пластинки очень компактные - от 8 до 12 мкм в диаметре, хромосомы сгруппированы и радиально ориентированы, ана- и телофазы проходят симметрично (рис. 10 а). Вместе с тем, уже в ранних зачатках (I стадия) регистрируется до 6 % аномальных митозов (рис. 10 б). Их частота резко возрастает на II стадии с началом полиплоидизации клеток и достигает максимума - около 60 % от всех митозов.- в стадии (III) интенсивной полиплоидизации, хотя общий МИ в это время снижается (табл. 3). Для таких митозов характерны широкий разброс хромосом—до 20 мкм в метафазе, их дезориентация, отсутствие нормальных анафаз, что позволяет характеризовать их как тот или иной вириант метафазного блока

Рис. 10. Митоз и эндомитоз в клетках белковой железы янтарки. а - нормальные интерфаза и митозы 4с; б - аномальные митозы 4с; в - эндомитоз 8с; г - эндомитоз 16с; д - меченная 3Н-тимидином интерфаза 16-32с; е - эндомитоз 32с. нерасхождение хромосом, К-митоз, рассеивание хромосом.- по классификации Алова, 1972). Эти структурные отклонения типичны при дезорганизации митотического веретена. Большинство аномальных митозов протекает с нормальным - 2п4с - набором хромосом и завершается образованием тетраплоидных ядер. Изредка встречаются блокированные и асимметричные анафазы и их очевидные последствия: гантелевидные и грушевидные, гаплоидные и триплоидные постмитозные ядра, а также гиподиплоидные (1п2с, 1,5пЗс) и триплоидные (Зпбс) митозы (см. табл. 3). Нормальные двуядерные клетки встречались очень редко.

Таблица 3. Частота нормальных и аномальных митозов д эпителии белковой железы янтарки на разных стадиях развития

Стадия развития железы Общий митогич. индекс, % Относительная доля митозов, % Число животных нормальных аномальных 2п4с 1п2с 2п4с Зпбс.

I 3,1+0,4 94+4 - 6+3

II 1,8±0,3 55+9 1±1 43±8 1+

III 0,8+0,1 40+5 0,5+0,5 59+8 1±1 . 22;

Таким образом, в белковой железе янтарки большинство блокированных митозов дает клетки с тетраплоидными ядрами, от которых беруг начало модальные классы плоидности 8с-16с-32с, а редкие асимметричные митозы лежат в основе минорного ряда Зс-6с-12с-24с. Этот вывод согласуется с данными о содержании ДНК в ядрах полиплоидных клеток (см. раздел 3.2.1).

Максимальные уровни плоидности аномальных митозов в белковой железе составили Зпбс. В других органах янтарки - гонаде, кишке, пищеварительной железе, ганглиях - также выявлены нормальные и аномальные митозы, но и здесь они были в основном диплоидными (2п4с), и Лишь редкие аномальные митозы имели набор хромосом Зпбс или 4п8с. В большинстве же ядер класса 8с и во всех без исключения, ядрах по следующих модальных (1 бс-3 2с.) и промежуточных {12с-24с.) классов плоидности - как в белковой железе, так и в других органах -обнаружен типичный эндомитоз (рис. 10 в-е). В нейронах его морфологические признаки отчётливо выявляются и у сеголеток, и у годовиков в ядрах всех классов плоидности - от начальных (8с-16с.) до гигантских (1024с-2048с и более) (9,32). В белковой железе эндомитоз изучен нами наиболее полно, и в результате получены следующие его характеристики.

Во-первых, подтверждены и дополнены ультраструктурными данными ключевые морфологические признаки эндомитоза (16) (рис. 11): 1) сохраняются ядерная оболочка и ядрышко, а также контакты хромосом с этими;структурами; 2) отсутствует ахроматиновое веретено - микротрубочки ни в цитоплазме, ни вблизи хромосом не обнаружены - и, соответственно, не происходит прометафазных и анафазных движений хромосом; 3) профаза эндомитоза не отличается от обычной митотической профазы (если не считать увеличенное число хромосом) -наблюдается синхронное появление переплетенных бихроматидных тяжей, связанных с ядерной оболочкой; 4) в эндометафазе отмечается полная, сравнимая с

Рис. 11. Ультраструктура эндомитоза. а - интерфаза; б - эндопрофаза; в -эндометафаза; г - секреторные гранулы в эндомитотической клетке; бхт -бихроматиды, бхх - бихроматидные хромосомы, мхт - монохроматиды, сг -секреторные гранулы, хн - хромонемы, яд - ядрышко, яо - ядерная оболочка. митотической, компактизация хромосом и их беспорядочное расположение в объеме ядра, при этом бихроматиды разделены узкой щелью; 5) эндоанафаза характеризуется симметричным положением полностью разделенных сестринских хроматид, но отмечается асинхронность и незавершенность расщепления части хромосом и, как следствие, наличие около 15 % бихроматидных хромоцентров в Gl-периоде интерфазы (см. раздел 3.3.1); 6) эндотелофаза определяется очень условно как продолжение спонтанной сегрегации хроматид, их укорочение в результате частичной декомпактизации и постепенное преобразование в хромоцентры; 7) эндомитоз проходит на фоне прогрессирующей дифференциации клеток, при полном развитии цитоплазматических структур, включая ШЭР, диктиосомы и секреторные гранулы. В целом эндомитоз проходит на разных уровнях плоидности (8с-16с-32с-64с) довольно однообразно и характеризуется необычным сочетанием митотических по сути превращений хромосом с полным блокированием цитоплазматических структур, обеспечивающих в обычном митозе поляризацию хромосомных наборов и цитокинез. В приведенном описании нет противоречий с классическим эндомитозом - в той форме, как он впервые описан Гейтлером (Geitler, 1937,1939). Указания на неполную конденсацию хромосом в эндометафазе (Geitler, 1939; Nur, 1968; Кикнадзе, Тутурова, 1970; Кикнадзе, Истомина, 1972), по-видимому, соответствуют наблюдениям постэндомитотических, но еще достаточно конденсированных хромосом (см. раздел 3.3.3).

Во-вторых, в опытах с ЗН-тимидином эндомитоз выявляется как стадия эндоцикла, в основе которого лежит обычный митотический цикл хромосом (15, 16). С учетом изменений структуры хроматина, содержания ДНК и включения ЗН-тимидина четко прослеживается смена периодов: собственно эндомитоз с максимальной компактизацией хромосом (рис. 10 в, г, е) ; Gl-период с преимущественно монохроматидными (0,5 мкм) хромоцёнтрами; S-период с дисперсно-глыбчатым хроматином, маркируемый включением ЗН-тимидина (рис. 10 д);С2-период с крупными бихроматидными гаыбками (1мкм) и далее следующий эндомитоз на новом уровне плоидности. Принципиально важно то, что эндомитозы, как и митозы, не были мечены при импульсном введении ЗН-тимидина, но в опытах с отставленной меткой наблюдалось продвижение клеток по циклу. Через 4-8 ч после введения ЗН-тимидина появлялись меченые митозы (как нормальные, так и аномальные), а через 8-12 ч - первые меченые эндомитозы, имевшие локальную метку по гетеропикнотическим хромосомам, т. е. меченные в конце S-периода. Эти сроки соответствуют минимальному С2-перйоду клеточного цикла. К 20-24 ч регистрируются эндомитозы с равномерной меткой по всем хромосомам, что означает вступление в эндомитоз новых клеток, получивших ЗН-тимидин в первой половине S-периода. Таким образом, эндомитоз выявляется, как и митоз, реальной стадией в реальном клеточном цикле. Эндомитотический индекс в наиболее активной III стадии оценивается величиной порядка 3-10 % при индексе меченых ядер в пределах 10-30 %.

В-третьих, тесты на транскрипционную активность также выявляют общее свойство митозов и эндомитозов - временное торможение синтеза РНК, связанное с компактизацией хромосом (17). Включение ЗН-уридина в митотические и эндомитотические хромосомы, оцененное относительно максимальных уровней метки в интерфазных ядрах соответствующих классов плоидности, сохраняется на предельно низких значениях - 0,7 % в нормальных и аномальных митозах, 1,1 % в ранних 4с-эндомитозах и около 3-4 % в эндомитозах высших классов Вс-16с-32с. С помощью электронной микроскопии в интерфазных ядрах на поверхности хромоцентров и хромонем обнаруживаются радиально ориентированные эухроматиновые выпетливания с перихроматиновыми гранулами (рис. 9 в, 11 а). Но в эндомитозе хромосомы компактизуются и освобождаются от гранул (рис. 11 б-г), хотя даже в эндометафазе могут сохранять короткую ворсистость. В эндотелофазе моно- и бихроматидные (неразделенные) тяжи, как и более тонкие хромонемы, вновь образуют частые петли эухроматина, покрытые перихроматиновыми гранулами. В это время включение ЗН-уридина резко возрастает и уже соизмеримо с включением в интерфазе.

Таким образом, морфологические и авторадиографические данные свидетельствуют о том, что наблюдаемый нами эндомитоз - не артефакт, не имитация, а вполне нормальный эндорепродуктивный механизм. Эндомитозы разных классов плоидности, как и полиплоидизирующие митозы, проявляют в отношении репликации и транскрипции те же свойства, что и обычный митоз -синтез ДНК заканчивается в интерфазе за несколько часов до деления хромосом, синтез РНК на хромосомах тоже временно прекращается или сохраняется на очень низком уровне. Довольно протяженный 02-период (8-12 ч по сравнению с 4 ч обычного митотического цикла), а также остаточное включение ЗН-уридина в эндомитотические хромосомы (до 3-4 % по сравнению с 0,7 % в митозе) можно рассматривать как специфику эндомитотического цикла, обусловленную его совмещением с дифференцировкой клеток и напряженными гетеросинтезами (см.раздел 3.2).

Принципиально важно то, что в гистогенетической динамике наблюдается закономерная смена нормального пролиферативного митоза сначала аномальным полиплоидизирующим митозом, а далее эндомитозом. Эти события связаны с общей динамикой полиплоидизации и изменением скорости синтеза ДНК в ходе дифференциации клеток. Обнаружение нормальных и аномальных митозов согласуется с гетерогенностью фракции диплоидных клеток по включению ЗН-тимидина и ЗН-уридина (см. разделы 3.2.2 и 3.2.3). Сопоставление этих данных показывает, что смена нормального митоза полиплоидизирующим осуществляется при переходе клеток от камбиальной стадии, с высокой скоростью синтеза ДНК и низким уровнем транскрипции (темноядерные клетки, 30%-ная "быстрая" субфракция), к стадии секреторной дифференцировки, в которой замедляется репликация (падение метки ЗН-тимидина в 3 раза) и активизируется транскрипция. О закономерности этого шага свидетельствует и высокая частота аномальных митозов - до 60 % от всех митозов в стадии интенсивной полиплоидизации, что сравнимо с темпом полиплоидизации путем неполного митоза в тканях млекопитающих (Кудрявцев, 1991; Зыбина и.др., 1994). Появление эндомитозов, начиная с тетра-октаплоидного уровня, совпадает с дальнейшим снижением скорости включения ЗН-тимидина в 1,5 раза. Таким образом, начало и углубление секреторной специализации клеток коррелирует и, по всей вероятности, причинно связано с переходом к аномальным митозам и далее к эндомитозам. Два механизма полиплоидизации не исключают друг друга, а преемственно сочетаются. Эта динамика, со сменой митозов эндомитозами, характерна для разных клеточных популяций янтарки; мы наблюдали ее, кроме эпителия белковой железы, в питающих клетках гонады, базофильных клетках пищеварительной железы и кишечника, в нейронах ЦНС. Комбинирование эндомитозов с полиплоидными реституционными митозами было выявлено уже самим Гейтлером (Сей1ег, 1939) для некоторых тканей водомерки и отмечалось более поздними авторами на различных объектах. Однако недостаточность старых морфологических критериев, последующее описание ряда псевдоэндомитотических состояний аставляли сомнение в реальности эндомитоза. Наши данные не только снимают эти сомнения, но Показывают митоз и эндомитоз как стадии комбинированного механизма умножения геномов, сочетающего различные аномалии митотического процесса й ведущего к многократной ПОЛИПЛОИДИИ.

3.3.3. Псевдоэндомитоз терминально дифференцированных клеток

Анализ проблемы эндомитоза был бы неполным без объяснения природы таких состояний как "стационарный эндомитоз" в септах семенника у саранчевых, где в "отсутствие циклов репликации ДНК наблюдаются полуконденсированные "ершистые" хромосомы с интенсивной транскрипцией (Кикнадзе, Тутурова, 1970; Бахтадзе, 1975; Кикнадзе й др., 1975; Клкпаске, 1&опипа, 1980; ТИегтап ег а!., 1983). Как уже отмечалось, этот странный "эндомитоз" стал основным поводом для ревизии концепции эндомитотической полиплоидии. Не менее удивительны примеры на клетках клубня картофеля (Прокофьева-Бельговская, 1960), стенки семенника пауков (Соколов, 1967), в которых почти все (!) полиплоидные ядра выглядели как ЭДДомета-, ана-или телофазные, хромосомы часто были собраны в розетки, а типичные интерфазы практически отсутствовали. Дифференцировать псевдоэндомитоз от настоящего эндомитоза, желательно на одном объекте, означало бы снять последние возражения против реальности эндомитоза как механизма эндорепродукции клеток.

В белковой железе янтарки транскрипционную активность "ершистых" хромосом можно наблюдать сразу после эндомитоза, даже в эндотелофазе, когда на хромосомах появляются эухроматиновые петли с гранулами и регистрируется подъем включения ЗНгуридина (17; см. раздел 3.3.2). Еще более эффектные проявления псевдоэндомитоза показаны нами при изучении ядер терминально дифференцированных (нециклирующих) клеток (18). Исследовали белковые железы IV и V стадий развития, в которых эндомитоз заведомо отсутствовал, так как в это время модальные классы ядер 16с-32с-64с уже сформированы и ростовые процессы завершены. Клетки молодой генерации классов 4с-8с легко идентифицировались и исключались из рассмотрения. Стадии развития, функциональную активность и морфологию хромосом оценивали с учетом уровней плоидности ядер, включения

ЗН-тимидина и ЗН-уридина, изменения ультраструктур.

В IV стадии наблюдалось состояние функционального покоя: включение ЗН-тимидина практически отсутствовало (ИМЯт менее 1 %), уровень транскрипции полиплоидных ядер был также крайне низок (очень слабая плотность метки ЗН-уридина, либо минимальный ИМЯу — около 4 %), хотя ди-тетраплоидные ядра вспомогательных клеток активно включали ЗН-уридин. Хроматин высокоплоидных ядер (16с-64с) на давленых препаратах представлен дискретными хромоЦентрами или полуконденсированными хромосомами. На элекгронограммаххроматидные и бихроматидные профили бывают окружены нитями эухроматина, но чаще их контуры гладкие. Кариоплазма гомогенная, перихроматиновые гранулы практически отсутствуют (рис. 12). В целом морфологическая картина имитирует массовый и непрерывный эндомитоз.

Рис. 12. Псевдоэндомитоз в клетках белковой железы на стадии терминальной дифференцировки. бхт - бихроматида, сг - секреторные гранулы, хн - хромонема, хт - хроматида, эх - эухроматин.

Железы V стадии находились в состоянии продолженного функционирования. При отсутствии включения ЗН-тимидина и высоком уровне включения ЗН-уридина (плотная метка, ИМЯу=46,6-84,7 %) большинство высокоплоидных ядер даже под плотной меткой имели полуконденсированные хроматиды, хотя и не такие отчетливые, как на,предыдущей стадии, а также хромонемно-хроматидные сечения - места локального развертывания хроматид. Хорошо выражена эухроматиновая ворсистость всех хромосомных структур при обилии перйхроматиновых гранул. Другая часть ядер отличалась более выраженной конденсацией хроматиновых структур и отсутствием гранул; розеткбвидные хромомерьг и петли эухроматина были "голыми". Доля таких ядер сопоставима с частотой слабо меченных и не меченных ЗН-уридином ядер - в них наблюдалось временное торможение транскрипции (см. раздел 3.2.2). Наконец, встречались дегенерирующие ядра, в которых также выявлялись плотные хроматидные структуры, причем их контуры были заметно сглажены.

Таким образом, в V стадии, как и в IV, в той или иной мере проявляются морфологические признаки эндомитоза высокоплоидных (16с-64с) ядер. Наибольшее сходство с эндомитозом возникает в отсутствие или при ослаблении транскрипции - в период функциональной инертности (IV стадия), во время паузы в секреторных циклах (V стадия) и при дегенерации клеток - когда исчезают перихроматиновые гранулы и эухроматиновые петли, гомогенизируется и просветляется кариоплазма. Но даже транскрипционно активные ядра легко принять за эндомитотические, если рядом нет истинных эндомитозов, что и характерно для V стадии.

Имитация эндомитозов в интерфазных ядрах возможна благодаря тому, что хромосомы в состоянии терминальной дифференцировки закрепляют в основном своем объеме высший - хроматидный - уровень компактизации. Хромонемные участки и хромомеры составляют малую часть хроматина, а эухроматиновые петли образуются не только на хромомерных розетках, но и прямо на хроматидах (ворсистость). По-видимому, хроматидные участки (хромоцентры) заключают в себе и хромонемный, и хромомерный уровни компактизации, как это установлено для митотических хромосом (Зацепина и др., 1983; Rattner, Lin, 1985; Ченцов, 1995), но активированные хромомеры дают петли прямо из хроматиды, без ее развертывания в хромонему. Такое состояние, по-видимому, связано с глубокой и узкой специализацией клеток и устанавливается уже при уровне плоидности 4с (см.- раздел 3.2.2). Впечатление вяло текущего эндомитоза усиливается тем, что многие гомологи по завершении эндоцикла еще долго сохраняют связь между собой, а также с ядерной оболочкой, либо формируют розетки, суперхромоцентры.

Очевидно, что многие известные описания эндомитотической полиплоидии, в том числе в семеннике саранчи, на самом деле базировались на наблюдениях постэндомитотических, интерфазных ядер с хорошо выраженной хромоцентрической структурой. Реальный эндомитоз, проходящий на более ранних стадиях развития, ускользал из поля зрения большинства авторов или не был выделен на фоне преобладающих псевдоэндомитотических состояний. Естественно, что в таких случаях почти 100 % ядер могли регистрироваться как эндомета-, ана-, телофазы (Соколов, 1967), а "эндомитотические" хромосомы имели неполную конденсацию (Nur, 1968; Кикнадзе, Тутурова, 1970; Кикнадзе, Истомина, 1972).

В свете изложенного нельзя согласиться с идеей двух типов эндомитоза -обычного и стационарного (Therman et al., 1983). Не корректно говорить о преобразовании политенных хромосом в "эндомитотические" в результате их диссоциации (Зыбина, Зыбина, 1985). Существуют реальный эндомитоз и различные псевдоэндомитотические состояния - хромоцентрические постэндомитозные или деполитенизированные ядра. Обозначать их типами или формами одного явления - эндомитоза - неправомочно.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Анисимов, Алим Петрович

4. ВЫВОДЫ

1. Соматическая полиплоидия широко распространена в гистогенезах гастропод. Возможность полиплоидизации клеток не ограничивается каким-либо функциональным типом, но степень проявления полиплоидии тканеспецифична. У легочных и заднежаберных полиплоидия выявлена в железах покровов, пищеварительного и полового трактов (обычно до 32с-128с), причем уровни плоидности белковых клеток выше, чем слизистых. Полиплоидными бывают поровые и кальциевые клетки соединительной ткани, питающие клетки гонады, минерализующие клетки радулы (до 1бс-64с). Наиболее выражена полиплоидия в нейронах ЦНС - до 16384с у легочных и 262144с у заднежаберных гастропод.

2. Соматическая полиплоидия сопряжена с дифференциацией тканей и не является следствием старения. У легочной улитки янтарки Succinea lauta (модельный объект) процессы эндорепродукции начинаются у ювенильнЫх особей (сеголеток) и продолжаются у взрослых (годовиков). Клетки пищеварительного тракта полиплоидизируются уже в первое лето жизни, белковой и предстательнойжелез -во второе лето; нейроны ЦНС растут и синтезируют ДНК на протяжении всей жизни.

3. Белковая железа янтарки наиболее удобна для изучения динамики и механизмов полиплоидизации клеток. Выделено 5 стадий ее развития. В I стадии происходит пролиферация диплоидных клеток. Во II и III стадиях секреторные клетки растут и полиплоидизируются с полным умножением геномов в ряду 2с-4с-8с-16с-32с-64с; около 3-5 % ядер имеют промежуточные уровни плоидности Зс-6с-12с-24с в результате эндорепродукции клеток после асимметричных митозов. Полиплоидный рост сочетается с высоким уровнем синтеза РНК и продукцией секретов. В стадии IV - дефинитивной зрелости и покоя - различаются вспомогательные (2с) и секреторные (16с-64с) клетки; синтезы ДНК и РНК отсутствуют. В V стадии ростовые процессы и синтез ДНК в зрелых клетках также отсутствуют, но возобновляются синтез РНК и производство секрета. В это же время возможны очаговые проявления регенерации из диплоидного резерва с полиплоидизацией клеток до рабочего уровня 16с-32с. Динамика развития тканей должна учитываться при идентификации эндомитозов. •

4. Кинетика синтеза ДНК в ядрах разной плоидности одинакова: в клетках белковой железы включение ЗН-тимидйна; максимально в первой половине Б-периода и плавно снижается во второй; конец 8-периода обозначен избирательным включением предшественника в гетеропикнотические хромосомы (суперхромоцентры). Интегральное включение ЗН-тимидина в полиплоидные ядра в каждом последующем эндоцикле удваивается, т.е. в расчете на один геном скорость синтеза ДНК остается постоянной. В то же время скорость репликации закономерно снижается на двух критических этапах развития железы - в ди-тетраплоидных ядрах в связи с началом цитодифференцировки и в высокоплоидных ядрах при завершении роста клеток.

5. Полиплоидные ядра в тканях янтарки имеют хромоцентрическую структуру, так как интерфазные хромосомы сохраняют высший (хроматидный) уровень .компактизации. Постоянство размеров (0,5-1 мкм) и увеличение числа хромоцентров, близкое к расчетному ряду 44(2п)-88(4п)-176(8п)., свидетельствуют о том, что хромосомы не подвержены эндоредупликации, т.е. не являются политенными, а умножение геномов происходит в форме истинной полиплоидии -с увеличением числа хромосомных наборов.

6. Полиплоидные клетки в тканях янтарки образуются в результате полиплоидизирующего митоза (4с, реже 6с, 8с) и эндомитоза (от 8с и выше). Аномальные митозы появляются при переходе клеток от камбиальной стадии, с высокой скоростью синтеза ДНК и низким уровнем транскрипции, к стадии секреторной дифференцировки, в которой замедляется репликация и активизируется транскрипция. Появление эндомитозов совпадает с дальнейшим снижением скорости синтеза ДНК. Таким образом, начало и углубление специализации клеток коррелирует и, по всей вероятности, причинно связано с переходом к аномальным митозам и далее к эндомитозам. Два механизма не исключают друг друга, а преемственно сочетаются в процессе эндорепродукции клеток.

7. Эндомитоз проходит на разных уровнях плоидности однообразно и характеризуется сочетанием митотических по сути превращений хромосом с блокированием цитоплазматических структур, обеспечивающих в обычном митозе поляризацию хромосомных наборов и цитокинез. Ультраструктурные данные согласуются с классической схемой эндомитоза Гейтлера. Эндомитоз выявляется как реальная стадия клеточного цикла - синтез ДНК заканчивается в интерфазе за 8-12 ч до деления хромосом (в2-период), синтез РНК временно прекращается или сохраняется на уровне 3-4 % относительно интерфазного максимума. Протяженный 02-период и остаточная транскрипционная активность хромосом представляют специфику эндомитотического цикла, обусловленную его совмещением с дифференцировкой клеток и напряженными гетеросинтезамн.

8. Хромоцентрические ядра дифференцированных полиплоидных клеток способны имитировать эндомитоз, особенно в отсутствие или при ослаблении транскрипции - во время функциональной инертности, паузы секреторного цикла или дегенерации клеток. Псевдоэндомитотические состояния можно отличить от эндомитоза при контроле на синтезы ДНК и РНК. Многие известные описания эндомитотической полиплоидии с парадоксальными характеристиками структуры и метаболизма хромосом, на. самом деле базировались'на наблюдениях постэндомитотических ядер с хорошо выраженной хромоцешрической структурой, но и в этих случаях эндомитоз вполне реален на более ранних ¿гадиях развития.

9. У филогенетически первичных стрептоневральных (переднежаберных) гастропод тканевая полиплоидия или отсутствует, или появляется в малой степени как частная, факультативная модификация гистогенезов, коррелирующая с экологическими, в том числе трофическими, адаптациями видов. У более поздних эвтиневральных групп (заднежаберных, легочных и др.), по-видимому, в связи с анатомической реорганизацией нервной системы, полиплоидия высоких уровней становится общей, стратегической закономерностью развития многих типов клеток и, прежде всего, нейронов. Таким образом, частота и степень развития полиплоидии в разных группах определяются, с одной стороны, ароморфными перестройками онтогенеза в крупных таксонах, а с другой - экологически обусловленными идиоадаптациями на уровне малых групп или отдельных видов. Стабильный признак соматической полиплоидии в тех или иных анатомических системах может являться дополнительным критерием при решении спорных вопросов филогении и систематики гастропод.

10. Полиплоидная клетка по ее гистогенетической сущности представляет эндоклон, а процесс эволюционного преобразования исходно полимерных диплоидно-клеточных клонов в полиплоидные эндоклоны - олигомеризацию на клеточно-тканевом уровне. Слитная форма организации олигомерной системы предполагает её централизацию и структурно-функциональную интеграцию. Вытекающие отсюда свойства олигомерных систем - такие как интенсификация функции, экономичность, упрощение внутрисистемной и надсистемной регуляций, повышение надежности, повышение темпов и сокращение сроков развития -составляют в обобщенном виде особенности и значение полиплоидной стратегии роста. С этими свойствами соматическая полиплоидия выступает в морфогенетических процессах как механизм интегративных онтогенетических корреляций, а через отбор в филогенезе приобретает значение соответствующих координаций. В целом полиплоидия представляет адаптивный (алло- или ароморфный) морфогенетический фактор, конкретное значение которого различно и проявляется в соответствии с характером дифференциации той или иной ткани!

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Анисимов А.П. Скрининг на соматическую полиплоидию в тканях легочного моллюска Succineaputris //Цитология. 1981. Т.,23, № 10. С. 1194.

2. Анисимов А.П. Редупликация и транскрипция хромосом в циклах полиплоидизации соматических клеток улитки-янтарки // VIII Всесоюзн. симп. "Структура и функции клеточного ядра" (15-18 мая 1984 г., Пущино). Пущино: Научн. центр биол. исслед. АН СССР, 1984. С. 244-245. 3. Анисимов А.П. Соматическая полиплоидия в тканях полового тракта улитки янтарки//Цитология. 1985. Т. 27,№3. С. 309-315. .

4. Анисимов А. П. Динамика полиплоидизации клеток в гистогенезе белковой и предстательной желез улитки янтарки // Цитология. 1986. Т. 28, № 3. С. 318-330.

5. Анисимов А. П. Соматическая полиплоидия в индивидуальном и историческом развитии организмов// Цитология. 1986. Т. 28, №10. С. 1125.

6. Повещенко О.С., Анисимов А.П. Морфофункциональная характеристика клеток слюнной железы улитки Succinea putris как объекта изучения соматической полиплоидии // Вестн. ЛГУ. 1986. Сер. 3, вып. 3. С. 3-10.

7. Анисимов А. П. Динамика транскрипционной активности в развитии полиплоидных клеточных популяций белковой и предстательной желез, улитки янтарки// Цитология. 1988. Т. 30, № 4. С. 423-432.

8. Анисимов А.П. Простой способ получения постоянных давленых препаратов с использованием целлофана// Цитология. 1992. Т. 34, № 11/12. С. 110-112.

9. Анисимов А.П., Букина И.А. Возрастная динамика и механизм полиплоидизации ядер гигантских нейронов улитки янтарки // Цитология. 1993. Т. 35, № 10, С. 54-55.

10. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. I. Хромоцентрическая морфология полиплоидных ядер // Цитология. 1994. Т, 36, № 1. С. 75-82.

11. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. П. Возрастная динамика полиплоидизации клеток // Цитология. 1994. Т. 36, № 5. С. 416-426.

12. Анисимов А. П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. III. Позднореплицирующиеся гетеропикнотические хромосомы // Цитология. 1995. Т. 37, №4. С. 331-338. . ■ ,

13. Анисимов А.П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. IV. Скорость синтеза ДНК при полиплоидизации и дифференциации клеток // Цитология. 1995. Т. 37, № 5/6. С. 500-512.

14. Анисимов А.П, Токмакова Н.П., Повещенко О.С. Соматическая полиплоидия в различных тканях улитки янтарки // Цитология. 1995. Т. 37, № 4. С. 311-330.

15. Анисимов А.П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. V. Полиплоидизирующий митоз и эндомитоз // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 218-228.

16. Анисимов А.П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки . VI. Ультраструкгурная характеристика эндомитотического цикла // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 229236.

17. Анисимов А.П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. VII. Транскрипционная активность ядер в эндомитотическом цикле // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 237243.

18. Анисимов А.П. Изучение механизмов умножения генома в развитии полиплоидных клеток белковой железы улитки янтарки. VIII. Псевдоэндомитоз терминально дифференцированных клеток // Цитология. 1997. Т. 39, № 2/3. С. 244252.

19. Анисимов А.П. Эндомитоз - реальный механизм полиплоидизации соматических клеток//Цитология. 1997. Т. 39, № 1. С. 36-37.

20. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая'полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. I. Введение. Ткани внутренней среды // Цитология. 1998. Т. 40, № 4. С. 323-331.

21. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая псшиплоиидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. II. Покровы // Цитология. 1998. Т. 40, № 4. С. 332-339.

22. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. III. Пищеварительная система // Цитология. 1998. Т. 40, № 5. С. 372-382.

23. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. IV. Половая система // Цитология. 1998. Т.

40, № 5. С. 383-393.

24. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. V. Нервная система // Цитология. 1999. Т.

41, № 1. с. 14-22.

25. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. VI. Общие закономерности пролиферации и эндорепродукции клеток // Цитология. 1999. Т. 41, № 1. G. 23-31.

26. Анисимов А.П. Клеточное размножение и соматическая полиплоидия в тканях брюхоногих моллюсков: обзор. VII. Соматическая полиплоидия как морфогенетический фактор // Цитология. 1999. Т. 41, № 1. С. 32-39.

27. Зюмченко Н.Е., Анисимов А.П. Гистологическая организация слюнных желез заднежаберных и легочных брюхоногих моллюсков в связи с развитием в них соматической полиплоидии // Регион, конф. по актуальным проблемам морской биологии и экологии (2-3 октября 1998 г., Владивосток). Владивосток: изд. ДВГУ, 1998. С. 50-52.

28. Зюмченко Н.Е., Анисимов А.П. Соматическая полиплоидия в слюнных железах гастропод // Моллюски. Проблемы систематики и филогении. Автореф. докладов IV (XIII) малакологического совещания (27-29 октября 1998 г. С.

Петербург). С.-Петербург: ЗИН РАН, 1999. С. 00-00.

29. Кирсанова И.А., Анисимов А.11. Полиплоидия нейронов и филогения гастропод // Там же.

30. Расщепкина А.В., Анисимов А.П. Проявление соматической полиплоидии в тканях Odostomia culta - брюхоногош моллюска из п/кл. Sinistrobranchia // Там же.

31. Анисимов А.П., Зюмченко Н.Е., Кирсанова И.А., Токмакова Н.П. Соматическая полиплоидия и филогения гастропод // Бюллетень Дальневосточного малакологического общества. 1999. Т. 4. С. 00-00.

32. Кирсанова И.А., Анисимов А.П. Динамика синтеза ДНК и механизмы постнатального роста нейронов Succinea lauta (Gastropoda, Pulmonata) // Там же.

33. Anisimov А.Р., Zumchenko N.E., Kirsanova Ir.A., Tokmakova N.P. Somatic polyploidy and gastropods phylogeny // Program and abstracts. Int. simp. on circulation research of the East Asian marginal seas - CREAMS'99 (january 26-28,1999; Fukuoka, Japan). Fukuoka: CREAMS, 1999. P. 38.

СПИСОК РАБОТ, ПРОЦИТИРОВАННЫХ В ДИССЕРТАЦИИ

Алов И.А. 1972. Цитофизиология и патология митоза. М.: Медицина. Бахтадзе Г.И. 1975. Изв. АН ГССР. Сер. биол. Т. 1, № 3. С. 225-231: Бродский В.Я., Урываева И.В. 1970. Онтогенез. Т. 1, № 3. С. 229-247. Бродский В.Я., Урываева И.В. 1981. Клеточная полиплоидия.

Пролиферация и дифференцировка. М. : Наука. Вепринцев Б.Н. и др. 1964. Биофизика. Т. 9, № 3. С. 327-336. Голиков А.Н., Старобогатов Я.И. 1988. В сб.: Систематика и фауна брюхоногих, двустворчатых и головоногих моллюсков. Л.: Наука, С. 4-77.

Грачева Н.Д. 1982. Цитология. Т. 24, № 10. С. 1185-1198. Гундерина Л.И. 1992. Цитология. Т. 34, №8. С. 46-53. Гундерина Л.И. и др. 1984. Цитология. Т. 26, № 8. С. 927-935. Гундерина Л.И., Серая Е.И. 1992. Цитология. Т. 34, № 8. С. 54-64. Догель В.А. 1947. Изв. АН СССР. Сер. биол. № 4. С. 471-486. Догель В.А. 1954. Олигомеризация гомологичных органов как один из главных путей эволюции животных. Л. : Изд-во ЛГУ Жинкин Л.Н., Нилова В.К. 1968. Усп. совр. биол. Т. 65, № 2. С. 233-244. Заварзин А.А. 1967. Синтез ДНК и кинетика клеточных популяций в онтогенезе млекопитающих. Л.: Наука. Зацепина О.В. и др. 1983. Цитология. Т. 25, № 2. С. 123-129. Зыбина Е.В. 1983. Цитология. Т. 25, № 10. С. 1103-1119. Зыбина Е.В. 1986. Цитология трофобласта. Л.: Наука. Зыбина Е.В., Зыбина Т.Г. 1985. Цитология. Т.27, № 4. С. 402-410. Зыбина Е.В. и др. 1994. Цитология. Т. 36, № 8. С. 869-873. Кикнадзе И.И. и др. 1975. Цитология. Т. 17, № 5. С. 509-517. Кикнадзе И.И., Истомина А.Г. 1972. Цитология. Т.14, № 12. С. 1519,1528. Кикнадзе И.И., Тутурова К.Ф. 1970. Цитология. Т. 12, № 7. С. 844-853.

Кудрявцев Б.Н. 1991. Клеточные механизмы нормального и репаративного роста печени млекопитающих: Докт. дис. СПб.

Кудрявцев Б.Н. и др. 1997. Цитология. Т. 39, № 10. С. 946-964.

Миничев Ю.С., Старобогатов Я.И. 1975. В сб.: Моллюски, их система, эволюция и роль в природе. JL: Наука. С. 8-11.

Миничев Ю.С., Старобогатов ЯМ. 1979. Зоол. ж. Т. 58, № 3. С. 293-305.

Прокофьева-Бельговская A.A. 1960. В кн.: Вопросы цитологии и общей физиологии. М.; Л.: Изд-во АН СССР. С. 215-253.

Румянцев П.П. 1982. Кардиомиоциты в процессах репродукции, дифференцировки и регенерации. Л.: Наука.

Соколов И.И. 1967. Цитология. Т. 9, № 2. С. 152-161.

Урываева И.В. 1979. Цитология. Т.21, № 12. С. 1427-1437.

Ченцов Ю.С. 1995. Общая цитология (введение в биологию клетки). М.: Изд-во МГУ.

Шеперд Г. 1987. Нейробиология. М.: Мир. Т. 1, 2.

Шмальгаузен И.И. 1982 (1938). Организм как целое в индивидуальном и историческом развитии. М.: Наука.

Anatskaya O.V. et al. 1994. J. Theor. Biol. Vol. 168. P. 191-199:

Baatout S. et al. 1998. Anticancer Res. Vol. 18. P. 1553-1561.

Barlow P.W. 1976. Protoplasma. Vol. 90. P. 381-392.

Barlow P.W. 1978. Acta biotheoretica. Vol, 27. P. 1-18.

Barnes R.D., Harrison F.W. 1994. In: Microscopic anatomy of invertebrates. New York: Wiley-Liss. Vol. 5. P. 1-12.

Boer H.H. et al. 1977. Neth. J. Zool. Vol. 27. P. 245-252.

Brodsky V.Y., Uryvaeva I.V. 1985. Genome multiplication in growth and development. Biology of polyploid and polytene cells. London: Cambridge Univ. Press.

Bullock Т.Н., Horridge G.A. 1965. Structure and function in the nervous system of invertebrates. San Francisco: Freeman Press. Vol. 2.

Cavallini etal. 1981. Protoplasma. Vol. 109. P. 403-414.

Cell cycle control (Eds: C. Hutchison, D.M. Glover). 1995. New York: Oxford Univ. Press.

Coggeshal R.E. et al. 1970. Chromosoma. Vol. 32. P. 205-212.

D'Amato F. 1989. Cariologia. Vol. 42. P. 183-211.

Datta N.S. et al. 1998. Cell Growth Differ. Vol. 9. P. 639-650.

Geitler L. 1937. Z. Zellforsch. Bd 26. S. 641-672.

Geitler L. 1939. Chromosoma. Vol. 1. P. 1-22.

Geitler L. 1953. Protoplasmatologia. Bd 6/C. S. 1-89.

Gillette R. 1991. Biol. Bull. Vol. 180. P. 234-240.

Grafi G. 1998. Exp. Cell Res. Vol. 244. P. 372-378.

Haszprunar G. 1988, J. Moll. Stud. Vol. 54. P. 367-441.

Heitz E. 1944. Rev. suisse de Zool (Geneva). Bd 51. S. 402-409.

Heitz E. 1953. Arch. Julius Klaus-Stiftung. Bd 28. S. 260-271.

54

Hyman L,H. 1967. The invertebrates. Mollusca I. Aplacophora,

Polyplacophora, Monoplacophora, Gastropoda. The coelomate Biiateria. New York: McGraw-Hill. Vol. VI. Kiknadze I.I., Istominä A.G. 1980. Eur. J. Cell Biol. Vol. 21. P. 122-133. Lasek R.J., Dower WJ. 1971. Science. Vol. 172. P. 278-280. Lehner C.E, Lane M.E. 1997. J. Cell Sei. Vol. 110. P. 523-528. Macauley A. et al. 1998. Mol. Biol. Cell. Vol. 9. P. 795-807. Moffett S.B. 1995. Progr. Neurobiol. Vol. 46. P. 289-330. Nagl W. 1976. Nature. Vol. 261. P. 614-615.

Nagl W. 1978. Endopolyploidy and polyteny in differentiation. Amsterdam:

North-Holland. Nagl W. 1981. Int. Rev. Cytol. Vol. 73. P. 21-53. Nagl W. 1995. Protoplasma. Vol. 188. P. 143-150. Nakayama H. et al. 1998. Dev. Biol. Vol. 199. P. 150-163. Nur U. 1968. Chromosoma. Vol. 24. P. 202-209. Rattner J.B., Lin C.C. 1985. Cell. Vol. 42. P. 291-296. Rondelaud D., Barthe D. 1980. Bull. Soc. zool. France. T. 105. P. 481-490. Schreiber M., Schreiber G. 1964. Revista de Biologia. Vol. 57. P. 285-300. Swift H. 1953. Int. Rev. Cytol. Vol. 2. P. 1 -76. Therman E. et al. 1983. Hum. Genet. Vol. 63. P. 13-18. Vitrat N. et alT998. Blood. Vol. 91. P. 3711-3723.

3.5. СОМАТИЧЕСКАЯ ПОЛИПЛОИДИЯ КАК МОРФОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ФАКТОР (ЗАКЛЮЧЕНИЕ)

Анализ литературы и собственных данных (20-25) показывает, что для тканей гастропод характерен камбиальный принцип организации. Наиболее очевидно он проявляется в процессах физиологической и репаративной регенерации тканей внутренней среды, кишечного и кожного эпителиев, популяций половых и соматических клеток гонады. Стволовые клетки выявлены также в сердечной мышце. Недифференцированные клетки и возможность регенерации показаны даже для нервной ткани (Moffett, 1995). Пролиферация и дифференциация клеток у моллюсков контролируются ростовыми факторами и гормонами, иммунологически близкими или идентичными соответствующим факторам позвоночных животных.

В то же время эндорепродукция клеток, сочетаемая с пролиферативными процессами, включается в программу многих гистогенезов и становится в определенных группах важным дополнительным фактором постнатального роста органов. Для большинства случаев характерно 3-5 эндоциклов (16с-64с ДНК), для некоторых - 6-7 циклов (128с-256с), а для слюнных желез одостомии - 13 циклов (16384с). Наиболее закономерна полиплоидия в нейронах эвтиневральных гастропод

-до 13 циклов (16384с) у легочных и до 17 циклов (262144с) у заднежаберных. Сочетая свойства растущих и обновляющихся клеточных популяций, гетероплоидные клетки гастропод в своем развитии проявляют параллелизмы с аналогичными по кинетике роста клеточными популяциями млекопитающих -такими как гепатоциты, кардиомиоциты, мегакариоциты, клетки трофобласта.

Механизмы образования полиплоидных клеток у гастропод в общем те же, что и у других животных. Показана закономерная смена полного пролиферативного митоза сначала неполным полиплоидизирующим митозом (4с, иногда 6с-8с),.а далее эндомитозом (от 8с и выше). Эндомитоз получил подтверждение и дополнительную характеристику с использованием световой и электронной микроскопии, цитофотометрии ДНК, авторадиографии синтезов ДНК и РНК. Ацитокинетический митоз случается редко, двуядерные клетки единичны. Эндоредупликация хромосом и, соответственно, политения у изученных гастропод отсутствуют.

При анализе причин развития полиплоидии непосредственным фактором выступает редукция митотического цикла по тем или иным фазам митоза. Такие изменения, в свою очередь, становятся возможными в результате разобщения ядерного (хромосомного) и цитоплазматического циклов клеточного деления. Это означает отсутствие жестких связей между последовательными событиями митотического цикла: синтезом ДНК, конденсацией хромосом, разрушением ядерной оболочки, сегрегацией хромосом, цитокинезом. В качестве первопричин перестроек митотического цикла могут рассматриваться конкуренция биосинтезов (Бродский, Урываева, 1970, 1981), стабилизация и перестройки цитоскелета (Румянцев, 1982; Кудрявцев и др., 1997; Baatóut et al., 1998), репрессия генов митотического цикла (Cell cycle control, 1995; Nagl, 1995; Graft, 1998) (см. также: 25). Возможно, что разные механизмы и уровни умножения геномов, факультативные и облигатные формы проявления полиплоидии имеют в основе и разные причины редукции цикла.

Значение соматической полиплоидии обычно определяют исходя изреальных или потенциальных свойств полиплоидных клеток. В одних случаях подчеркивается пропорциональное числу геномов увеличение синтетических возможностей клеток, в других — экономия пластических и энергетических ресурсов и более высокие темпы развития тканей, в третьих - защита клеток от генотоксичееких воздействий и т.п.

Действительно, и у животных, и у растений полиплоидия развивается в клетках разного функционального назначения (Geitler, 1953; Nagl, 1978; Бродский, Урываева, 1981; D' Amato, 1989), что показано и нами в отношении гастропод, поэтому частный тканеспецифический смысл полиплоидии будет различным. Для тканей гастропод просматриваются, по крайней мере, два таких аспекта. В железистых, поровых, питающих, кальциевых клетках полиплоидия должна служить поддержанию напряженных биосинтезов. В нервной системе сам по себе гигантизм нейронов и увеличение диаметров аксонов, вытекающие отсюда особые электрофизиологические, метаболические и топологические свойства, особенно важные для командных интернейронов, оказываются функциональным смыслом соматической полиплоидии.

Заметим, однако, что даже при явных корреляциях полиплоидии и какой-нибудь частной функции, например, секреторной, ее роль не всегда очевидна, поскольку не ясно, какие преимущества имеет полиплоидная клетка перед эквивалентным числом диплоидных клеток той же специализации. Кроме того, соматическая полиплоидия, хоть она и возникает в более молодых, продвинутых или специализированных группах, не является непременно "прогрессивным" свойством данной ткани. Так, полиплойдизация и гигантизм нейронов у легочных и заднежаберных гастропод расцениваются в целом как адаптация для согласования роста тела и ЦНС, возникающая у крупных гастропод с несложным типом поведения (Gillette, 1991). В противоположность этому, у высших переднежаберных, особенно у хищных, большое число мелких нейронов обеспечило увеличение комплексности мозга, развитие особо чувствительных органов с высоко разрешающим анализом окружения и в итоге формирование сложного поведения.

Как видно, полиплоидия обеспечивает лишь морфо-функциональные адаптации и часто бывает "выходом из положения", даже в ущерб гистогенетической пластичности, которую могут обеспечить диплоидные клеточные популяции. Подобные неопределенности, отсутствие тканевой специфичности полиплоидии и, наоборот, ее закономерное развитие в определённых филогенетических группах требовали более широкого взгляда на проблему, что и привело нас к формулировке ряда общих положений о биологическом смысле соматической полиплоидии (5,26).

С целью дать универсальное толкование явлению соматической полиплоидии, желая подчеркнуть эндорепродуктйвный механизм объединения геномов, моноклональное происхождение полиплоидной клетки и ее функциональную эквивалентность отдельному клеточному клону (или его части), мы сочли резонным определить полиплоидную клетку по ее гистогенетической сущности как эндоклон, а процесс эволюционного преобразования диплоидно-клеточных клонов в полиплоидные эндоклоны как олигомеризацию на клеточно-тканевом уровне. Таким образом, полиплоидная клетка представляется структурно-функциональным и гистогенетичесйим комплексом, свойства которого поддаются прогностической оценке как свойства олигомеризованной системы - в соответствии со стандартными понятиями из теории полимеризации и олигомеризации Догеля (1947,1954), теории надежности й общей теории систем. Некоторые из этих свойств находят эмпирические основания, другие остаются гипотетическими, но вполне ожидаемыми.

Базовое свойство эндоклона вытекает из его слитной формы организации, которая предполагает централизацию и интеграцию структуры и функции олигомерной системы. В альтернативном варианте для клонов диплоидных клеток имеем блочную (модульную) организацию с тенденцией к децентрализации й дезинтеграции структуры и функции полимерной системы, которая преодолевается усложнением механизмов межклеточной регуляции. Тогда важнейшие производные свойства олигомерных систем - такие как интенсификация функции, экономичность, упрощение внутрисистемной и надсистемной регуляций, повышение надежности, повышение темпов и сокращение сроков развития — могут составить в обобщенном виде особенности и значение полиплоидной стратегии роста.

Ключевым является понятие интенсификации функции - при условии, что оно выражает не просто усиление функции, а противопоставляется альтернативному понятию экстенсификации. Интенсивный способ функционирования полиплоидных эндоклонов по сравнению с экстенсивно функционирующими клонами диплоидных клеток означает не столько увеличение специфической продукции, эквивалентное дозе генов, сколько снижение затрат на ее производство, то есть экономичность. Интенсификация функции предполагает также упрощение внутрисистемной регуляции гомологичных геномов, объединенных в одной клетке под общим рецепторным полем плазмалеммы.

Возможность упрощения надсистемных регуляций исходит из гигантизма и топологических свойств олигомерных систем. В гигантских командных интернейронах гастропод (аналогично - у кальмаров, раков, рыб) при выполнении "комплекса фиксированных действий" (Шеперд, 1987) очевидно упрощение регуляции обширной периферии за счет исключения промежуточных операций и объединения многих иннервируемых структур под единое управление. Та же логика справедлива и для других гигантоклеточных органов улиток, в частности для слюнных желез, полиплоидные клетки которых обладают электровозбудимостью и связаны щелевыми контактами. Потенциалы действия от нейронов быстро распространяются по железе, синхронизируя активность всех клеток. В случае гигантских интернейронов одновременно синхронизируются и другие органы питания. Преимущество такого олигомерного комплекса состоит в том, что он требует менее разветвленной системы иннервации и меньшего числа контактов, что и упрощает надсистемную регуляцию. В этих отношениях виден смысл коррелятивного проявления полиплоидии в нейронах и других органах, столь характерного для эвтиневральных гастропод.

Повышение надежности слитной структуры для полиплоидных клеток должно означать более высокую устойчивость к повреждающим факторам. В частности, избыточность геномных копий должна компенсировать отдельные мутации, поддерживая жизнеспособность клеток в генотоксичной среде. Это свойство полиплоидии активно обсуждается в отношении гепатоцитов млекопитающих (Урываева, 1979; Anat.sk.ayа с1 а1„ 1994).

Повышение темпов и сокращение сроков развития отдельных клеточных популяций, тканей, органов в результате редукции митоза могло бы иметь определенное морфогенетическое значение как в онтогенезе организмов, так и в эволюции групп. В частности, механизм клеточной олигомеризации был бы полезен при согласовании роста и функциональных напряжений эволюционно молодых анатомических структур и уже имеющихся у прёдковой группы органов и тканей, сложившихся на предыдущих этапах эволюции. Особое значение такой механизм мог иметь при резких изменениях онтогенеза в прогрессирующих группах с.высоким темпом эволюции, при специализациях^ ценогенетических перестройках раннего онтогенеза (эмбриональные и личиночные новообразования, гетерохронии, гетеротопии). При этом для новых органов полиплоидия могла выступать и как фактор согласования темпов развития, и как фактор интенсификации функции. По масштабности преобразований полиплоидия в разных органах могла иметь алломорфное (идиоадаптивное) или ароморфное значение. Имеющиеся данные о свойствах и распространении полиплоидных клеток у гастропод, а также и в других группах, согласуются с такой трактовкой явления соматической полиплоидии.

Используя идею и термины Шмальгаузена (1938) о морфо-функционадьных корреляциях и координациях в онто- и филогенезах, можно сказать, что соматическая полиплоидия выступает в морфогенетических процессах как механизм интегративных онтогенетических корреляций, а через отбор в филогенезе приобретает значение соответствующих координации.

Таким образом, в самом общем виде соматическую полиплоидию можно рассматривать по гистогенетической сущности как эндоклоногенез, или олигомеризацию исходно диплоидных клеточных клонов, а по результату как адаптивный (алло- или ароморфный) морфогенетический фактор, конкретное значение которого различно и проявляется в соответствии с характером дифференциации той или иной ткани.