Солевая чувствительность связывания экструзионных комплексов когезина с хроматином тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Голов Аркадий Константинович

• Голов Аркадий Константинович
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Голов Аркадий Константинович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цель и задачи исследования

Научная новизна. Теоретическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личное участие автора в проведении исследований

Структура и объем работы

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура когезина и принципы взаимодействия когезинового комплекса с ДНК

1.1.1. SMC1-SMC3 димер вместе с RAD21 клейзиновой субъединицей образуют коровый тример когезинового комплекса

1.1.2. Вспомогательные регуляторные HAWK-белки взаимодействуют с клейзиновой субъединицей

1.1.3. Конформационный полиморфизм когезинового комплекса

1.1.3.1. Димеризация головных доменов и гидролиз АТФ

1.1.3.2. Дополнительные конформационные изменения, сопряженные со связыванием и гидролизом АТФ

1.1.3.3. Спонтанные изменения конформации когезинового комплекса

1.1.4. Разнообразие взаимодействий когезина с ДНК

1.1.4.1. Когезин может связывать ДНК-нить топологически внутри 8-К кольца

1.1.4.2. Электростатические контакты когезина с ДНК

1.1.4.2.1. Головные домены связывают ДНК в Е-состоянии с образованием короткоживущего "ДНК-захвата"

1.1.4.2.2. Взаимодействие петлевых доменов с ДНК

1.1.4.2.3. STAG1/2 HAWK-субъединица может взаимодействовать с ДНК, не кооперируясь с головными или петлевыми доменами

1.П. Роль когезина в клеточной физиологии

1.11.1. Когезия сестринских хроматид

1.11.1.1. Два молекулярных пути ведут к установлению когезии

1.11.1.2. Ацетилирование SMC3-субъединицы и привлечение сорорина обеспечивают стабильность связывания когезивных колец в G2-фазе и митозе

1.11.1.3. Контролируемое разрушение когезии в митозе

1.11.2. Экструзия - базовая биохимическая активность когезина наравне с когезией

1.П.2.1. Взаимодействие когезина с геномной ДНК и белками ядра в ходе экструзии

1.11.2.1.1. Динамическое равновесие между инициацией и терминацией

когезин-зависимой экструзии

1.П.2.1.2. Геномная локализация сайтов инициации экструзии

1.11.2.1.3. WAPL и PDS5A/B - негативные регуляторы процессивности когезин-зависимой экструзии

1.11.2.1.4. CAR-сайты и сайты связывания белка CTCF являются местами остановки когезин-зависимой экструзии

1.П.2.1.5. Взаимодействие транскрипционного аппарата клетки и когезиновых комплексов, принимающих участие в экструзии

1.П.2.2. Когезин-зависимая экструзия поддерживает ряд ключевых процессов в клетке

1.П.2.2.1. Когезин- и конденсин-зависимая экструзия обеспечивает пострепликативную индивидуализацию сестринских хромосом и компактизацию митотических хромосом

1.П.2.2.2. Когезин-зависимая экструзия благоприятствует локальным взаимодействиям ДНК и поддерживает эукариотические геномы в

декатенированном состоянии

1.11.2.2.3. Роль экструзионной активности когезина в репарации

двухцепочечных разрывов ДНК

1.П.2.2.4. Когезин-зависимая экструзия и регуляция транскрипции в клетках

позвоночных

1.Ш. Цикл конформационных изменений когезинового комплекса при экструзии

ДНК-петель

1.Ш.1. Модель коалесценции-прокачивания (pumping / hold-and-feed model)

1.Ш.2. Экструзия за счет сгибания локтей (scrunching models)

1.Ш.2Л. Модель броуновского храповика (Brownian ratchet model)

1.III.2.2. Модель "гребок-захват" (swing-and-clamp)

1.IV Когезия и когезин-зависимая экструзия могут быть механистически связаны

между собой

1.V. С-методы внесли значимый вклад в развитие представлений о когезин-зависимой экструзии и когезии

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.I. Материалы

2.II. Методы

2.11.1. Выделение бакмидной (BAC-) ДНК

2.11.2. Приготовление библиотек биотинилированных зондов

2.11.3. Культивирование и синхронизация клеток HeLa по фазам клеточного цикла

2.11.4. Фракционирование белков с помощью солевой экстракции

2.11.5. Вестерн-блот анализ

2.11.6. Фиксация и лизис в С-TALE экспериментах на интактных клетках

2.11.7. Солевая экстракция и фиксация хроматина для C-TALE и ChIP-seq экспериментов

2.11.8. Приготовление ЗС-seq библиотек

2.11.9. С-TALE: гибридизация ЗС-seq библиотек с биотинилированными зондами

2.11.10. Анализ данных секвенирования C-TALE библиотек

2.11.11. ChIP-seq эксперименты

2.11.12. Анализ данных секвенирования ChIP-seq библиотек

2.11.15. Поиск CTCF-мотивов

2.11.16. Депонирование данных С-TALE и ChIP-seq экспериментов

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.I. C-TALE: модификация Hi-C/3C-seq протокола для анализа пространственной укладки мегабазных участков генома с высоким разрешением

3.1.1. Место C-TALE среди других C-методов и ключевые особенности экспериментальной процедуры C-TALE

3.1.2. Процедура нормировки Hi-C матриц, адаптированная для анализа C-TALE данных

3.1.3. Преимущества и недостатки C-TALE в сравнении с другими С-методами, разработанными для изучения протяженных непрерывных регионов генома

3.11. Чувствительность CTCF-ассоциированных когезиновых колец к солевой экстракции в клетках млекопитающих указывает на нетопологический характер процесса экструзии

3.11.1. Большая часть когезиновых комплексов может быть экстрагирована из G1-ядер при обработке высокосолевыми буферами

3.11.2. Образующиеся в результате когезин-зависимой экструзии структурные ДНК-петли чувствительны к обработке высокосолевыми буферами

3.11.3. Когезиновые комплексы, ассоциированные с CTCF-сайтами, теряют связь с ДНК после 1 минуты инкубации в высокосолевом буфере

3.11.4. Нетопологическая природа экструзии наилучшим образом объясняет солевую чувствительность связывания когезина с хроматином в основаниях структурных петель

3.III. Ассоциированная с топологическим надеванием PDS5A/B-WAPL-зависимая терминация экструзии: недостающее звено, связывающее процессы экструзии и когезии

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

3С (chromosome conformation capture) - фиксация конформации хромосом;

3C-seq - 3С-эксперимент, сопряженный с NGS-секвенированием полученных продуктов

лигирования;

4С (circular chromosome conformation capture) - фиксация конформации хромосом с получением ДНК-колец;

5С (chromosome conformation capture carbon copy) - фиксация конформации хромосом с получением ДНК-отпечатка;

ABC АТФазы - белки, содержащие АТФазный домен, гомологичный домену, встречающемуся в АТФ-связывающих кассетных транспортерах (ATP-binding cassette transporters);

ATAC-seq (assay for transposase-accessible chromatin with sequencing) - выявление участков

генома, доступных для ДНК-транспозазы, совмещенное с NGS-секвенированием;

BAC (bacterial artificial chromosome) - искусственная бактериальная хромосома;

bBBr - дибромобиман;

BMOE - бис-малеимидоэтаном;

CAR-регионы (cohesin-associated regions) - ассоциированные с когезином области генома; ChIP-seq - иммунопреципитация хроматина (ChIP) с последующим NGS-секвенированием;

ChIP (chromatin immunoprecipitation) - иммунопреципитация хроматина; DMEM (Dulbecco modified Eagle medium) - модифицированная Дульбекко среда Игла; DPBS (Dulbecco's phosphate-buffered saline) - фосфатно-солевой буферный раствор Дульбекко;

E.coli - Escherichia coli;

E-S - SMC-компартмент в момент пребывания SMC-комплекса в E-состоянии;

E-K - клейзиновый (kleisin) компартмент в момент пребывания SMC-комплекса в

E-состоянии;

E-состояние - конформация SMC-комплекса с продуктивно взаимодействующими (engaged) головными доменами;

FBS (fetal bovine serum) - сыворотка крови новорожденных телят; FRET (Förster resonance energy transfer) - фёрстеровский перенос энергии; HAWK-белки (HEAT repeat proteins associated with kleisin) - белки, взаимодействующие с клейзинами и состоящие из HEAT-повторов;

HEAT-повторы - аминокислотные повторы, встречающиеся в хангтингтине (Huntingtin), факторе элонгации 3 (Elongation factor 3), одной из субъединиц фосфатазы 2A (protein phosphatase 2A) и белке TOR1

HEPES (N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid)

4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота;

J-K - клейзиновый (kleisin) компартмент в момент пребывания SMC-комплекса в J-состоянии;

J-состояние - конформация SMC-комплекса с наложенными (juxtaposed) головными доменами;

LB (lysogeny broth) - лизогенная среда;

LLPS (liquid-liquid phase separation) - разделение жидких фаз;

MC-3C (multiple contact 3C) - фиксация конформации хромосом с детекцией серий контактов;

NGS (next generation sequencing) - высокопроизводительное секвенирование, секвенирование второго поколения;

NHEJ (non-homologous end joining) - негомологичное соединение концов ДНК; NHEK (normal human epidermal keratinocytes) - эпидермальные кератиноциты человека; PVDF (polyvinylidene difluoride) - поливинилиденфторид;

RPKM (reads per kilobase per million) - среднее число прочтений на одну тысячу пар оснований ДНК на один миллион прочтений;

RNA-seq - анализ уровня рибонуклеиновых кислот при помощи NGS-секвенирования комплементарной ДНК;

5-K (SMC-kleisin) - SMC-клейзиновый; S. pombe - Schizosaccharomyces pombe; S. cerevisiae - Saccharomyces cerevisiae;

SMC-комплексы - белковые комплексы на основе димера белков, относящихся к семейству SMC (structural maintenance of chromosomes); SDS (sodium dodecyl sulfate) - додецилсульфат натрия;

T2C (targeted chromatin capture) - таргетная фиксация (конформации) хроматина;

TEV (Tobacco Etch Virus) - вирус гравировки табака;

TEMED (tetramethylethylenediamine) - тетраметилэтилендиамин;

АТФ - аденозинтрифосфат;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

дАТФ - дезоксиаденозинтрифосфат;

дГТФ - дезоксигуанозинтрифосфат; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; дТТФ - дезокситимидинтрифосфат; дЦТФ - дезоксицитидинтрифосфат; млн.п.о. - миллионы пар оснований (ДНК); НТФ - нуклеозидтрифосфат; п.о. - пары оснований (ДНК); ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ТАД (topologically associated domain) - топологически-ассоциированный домен;

тыс.п.о. - тысячи пар оснований (ДНК);

УЗ - ультразвуковой;

Э-П - энхансер-промоторный;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Солевая чувствительность связывания экструзионных комплексов когезина с хроматином»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Когезин - это исключительно консервативный белковый комплекс, обеспечивающий пострепликативное сцепление (когезию) сестринских хроматид в эукариотических клетках [1,2]. Когезиновый комплекс представляет собой белковое кольцо массой более 500 кДа, состоящее из двух субъединиц, относящихся к семейству SMC-белков, SMC1 и SMC3, а также клейзиновой субъединицы - БА021. С тремя перечисленными коровыми субъединицами взаимодействует ряд вспомогательных регуляторных белков. Характерная черта когезина, а также родственных ему SMC-комплексов, - кольцевая структура со сравнительно большим межсубъединичным пространством - порой. Наличие поры определяет способность когезина к необычному типу взаимодействия с ДНК, отличающему этот комплекс от большинства других ДНК-связывающих белков, а именно к топологическому надеванию на ДНК. Изучение молекулярного механизма когезии привело сначала к выдвижению, а затем и к экспериментальному подтверждению гипотезы топологического удерживания сестринских хроматид внутри поры когезинового комплекса.

Результатом исследований последних 15 лет стало открытие роли когезина, не связанной с когезией. Оказалось, что когезин - ключевой компонент клеточного аппарата, контролирующего высшие, наднуклеосомные, уровни укладки хроматина [2,3]. Реализация этой функции связана с тем, что когезин является АТФ-зависимой ДНК-транслоказой, способной к процессивному формированию ДНК-петель длиной до нескольких сотен тыс.п.о. по механизму, получившему название экструзии. Молекулярный механизм экструзии остается загадкой, до сих пор неизвестны многие базовые характеристики этого процесса. Так, ведутся споры о том, сопряжена ли экструзионная активность когезина с топологическим надеванием комплекса на нить ДНК. Эта структурная проблема непосредственно связана с одним из ключевых неразрешенных вопросов биологии когезина: являются ли две основные активности когезина, когезия и экструзия ДНК-петель, проявлениями единого молекулярного каскада?

Экструзионная активность - не уникальное свойство когезина, она присуща целому ряду родственных ему SMC-комплексов, как прокариотических, так и эукариотических. Считается, что SMC-зависимая экструзия, необходимая для пострепликативной индивидуализации длинных молекул геномной ДНК, появилась на заре клеточной жизни.

В то же время участие в поддержании когезии - отличительная черта когезина, не описанная более ни для одного другого типа SMC-комплексов. Таким образом, взаимоотношение процессов экструзии и когезии - не только структурная, но и эволюционная загадка. На сегодняшний день у нас нет ответа на вопрос, возникла ли когезия на основе имеющейся экструзионной активности предкового SMC-комплекса или развилась как дополнительная функция когезина de novo.

Когезин-зависимая экструзия - один из ключевых факторов создания и поддержания трехмерной структуры хроматина в интерфазных клетках. На экструзионной активности когезина основаны важнейшие наднуклеосомные паттерны укладки ДНК: структурные петли и топологические домены. В то же время наднуклеосомная укладка ДНК тесно связана с контролем транскрипции. В клетках высших эукариот когезин-зависимая экструзия принимает участие в регуляции транскрипции через модуляцию силы энхансер-промоторных контактов и играет роль в тонкой настройке транскрипционной активности [4,5]. Мутации субъединиц когезина могут приводить к синдромальным нарушениям развития человека, известным под общим названием "когезинопатий" [6,7]. Наиболее распространенной и изученной когезинопатией является синдром Корнелии де Ланге, встречающийся, по крайней мере, у одного из 10000 новорожденных и сопровождающийся умственной отсталостью, разнообразными видимыми морфологическими дефектами и нарушениями развития внутренних органов. Кроме того, мутации в субъединицах когезина, в большинстве случаев не влияющие на когезию, широко представлены во многих типах злокачественных опухолей [8,9]. Так, по данным проекта "Геномный Атлас Рака" ("The Cancer Genome Atlas") около 26% опухолей имеют мутации по крайней мере в одной из субъединиц когезина. Таким образом, изучение механизма когезин-зависимой экструзии и ее связи с транскрипционной регуляцией имеет важное значение для понимания патогенеза ряда заболеваний человека.

В нашей работе мы изучили модальность связывания когезинового комплекса с ДНК-нитью в процессе экструзии, а также механистическую связь между феноменами когезин-зависимой экструзии и когезии.

Изучение процесса экструзии в клетках, а не в in vitro системах, ведется, главным образом, с использованием С-методов [10,11]. Высокопроизводительные варианты C-методов, такие как Hi-C и Micro-C, позволяют картировать на полногеномном уровне паттерны пространственной укладки хроматина, формирующиеся в результате экструзии: топологические домены и структурные петли [12,13]. Таким образом, эти подходы дают возможность для непрямого изучения феномена когезин-зависимой экструзии. Однако,

для получения детальных полногеномных карт укладки ДНК высших эукариот необходимо чрезвычайно глубокое секвенирование библиотек продуктов лигирования, что делает подобные эксперименты весьма затратными, несмотря на постоянное удешевление технологий секвенирования. Тем не менее многие типы исследований, примером которых является изучение биохимических основ процесса экструзии, не требуют построения полногеномных контактных карт. Поэтому на основе полногеномных С-методов возник целый ряд протоколов, направленных на обогащение библиотек продуктов лигирования фрагментами из небольших геномных регионов размером от нескольких сотен тыс.п.о. до нескольких млн.п.о. Такие протоколы позволяют на порядки уменьшить затраты на секвенирование для получения подробных карт пространственной укладки регионов интереса. Однако, в подавляющем большинстве протоколов таргетного обогащения используются коммерческие наборы зондов, что частично нивелирует экономию, связанную с уменьшением глубины секвенирования, и уменьшает гибкость планирования исследования. В представленной работе мы попытались снизить затраты, связанные с получением детальных карт пространственной укладки ДНК в регионах интереса, за счет разработки нового, менее затратного, пути получения гибридизационных зондов.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы было установление природы (модальности) связывания когезинового комплекса с хроматином в процессе экструзии ДНК-петель в клетках. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. На основе протокола фиксации конформации хромосом (3С) разработать доступный метод для изучения структурных ДНК-петель в пределах мегабазных регионов генома позвоночных.

2. Охарактеризовать влияние высокосолевых буферов (0,5 М №С1) на стабильность структурных ДНК-петель, сформированных в результате когезин-зависимой экструзии, в клетках человека.

3. Изучить устойчивость связывания с хроматином когезиновых комплексов, расположенных в основаниях структурных ДНК-петель, в высокосолевых буферах (0,5 М №С1) в клетках человека.

Научная новизна. Теоретическая и практическая значимость работы

В процессе выполнения данной работы на основе протокола фиксации конформации хромосом (3С) был разработан новый метод для детального изучения трехмерной структуры хроматина в мегабазных участках генома позвоночных, получивший название С-ТАЬЕ. Низкая стоимость приготовления гибридизационных зондов в процедуре С-ТАЬЕ по сравнению с похожими методами таргетного обогащения 3С-библиотек делают С-ТАЬЕ предпочтительным инструментом для целого класса исследований, в которых основное внимание уделяется определенным участкам генома, и описание трехмерной структуры хроматина на полногеномном уровне является избыточным. Кроме того, предложенный нами протокол приготовления гибридизационных зондов может оказаться востребованным для экспериментов по таргетному обогащению других типов NGS-библиотек, RNA-seq, ChIP-seq, ATAC-seq и др., в работах по изучению эпигенетических особенностей ограниченных участков генома.

В работе также было впервые показано, что структурные хроматиновые петли, сформированные в результате экструзии в клетках человека, удерживаются когезиновыми комплексами, взаимодействующими с основаниями петель нетопологически. На основании этих данных с учетом результатов, полученных другими исследователями, был сделан вывод о том, что когезин-зависимая экструзия в клетках осуществляется в соответствии с нетопологическим механизмом. Также была сформулирована новая концепция механистического взаимоотношения между процессом экструзии и феноменом когезии. В рамках этой модели предполагается, что терминация экструзии сопряжена с PDS5A/B-WAPL-зависимым топологическим надеванием когезиновых колец на ДНК-нить.Также предполагается, что в S-фазе такое временное топологическое надевание может конвертироваться в когезивное связывание. Таким образом, полученные результаты вносят вклад в понимание общих принципов когезин-зависимой экструзии.

Несмотря на ярко выраженный фундаментальный характер, исследование представляет интерес и с практической точки зрения, поскольку понимание механизма экструзии открывает новые возможности для изучения вклада этого процесса в регуляцию транскрипции и, в конечном итоге, может привести к уточнению современных представлений о патогенезе онкологических заболеваний и когезинопатий.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования, современных вычислительных методов, а также методов молекулярной и клеточной биологии, таких как вестерн-блот анализ, фиксация конформации хромосом (3С), иммунопреципитация хроматина (СЫР), таргетное обогащение библиотек фрагментов ДНК за счет гибридизации в растворе и высокопроизводительное секвенирование (NGS).

Положения, выносимые на защиту

1. Изучение тонких паттернов пространственной организации хроматина, таких как топологические домены и структурные ДНК-петли, на полногеномном уровне в клетках позвоночных связано со значительными затратами на секвенирование. Разработанный нами метод таргетного обогащения Hi-C/3C-seq библиотек, C-TALE, позволяет идентифицировать эти паттерны в заранее выбранных мегабазных участках генома позвоночных, сокращая при этом затраты на секвенирование более чем на порядок.

2. Часть когезиновых комплексов в клетках млекопитающих надевается на ДНК-нить топологически в G1-фазе вне связи с репликацией (удерживают хроматиновую нить внутри замкнутого когезинового кольца). Такие взаимодействия в отличие от стабильных когезивных взаимодействий, также имеющих топологическую природу, довольно быстро разрешаются.

3. В клетках млекопитающих когезиновые комплексы, участвующие в поддержании стабильности CTCF-ассоциированных структурных петель, взаимодействуют с основаниями этих петель исключительно нетопологическим образом, не удерживая ни одну из двух взаимодействующих ДНК-нитей внутри белкового кольца. При высокосолевой обработке такие когезиновые комплексы удаляются с ДНК, что приводит к разрушению петель.

4. Процесс когезин-зависимой экструзии, в результате которого формируются структурные петли, реализуется в клетках по нетопологическому механизму. Косвенные данные указывают на то, что терминация экструзии сопряжена с транзиентной топологической погрузкой когезиновых колец на ДНК-нить и является, таким образом, связующим звеном между процессом экструзии и феноменом когезии.

Степень достоверности и апробация результатов

По теме диссертационной работы опубликованы 3 статьи в международных рецензируемых научных изданиях. Результаты работы также были представлены в виде постерного доклада на конференции с международным участием.

Публикации в журналах:

1. Ulianov S.V., Galitsyna A.A., Flyamer I.M., Golov A.K., Khrameeva E.E., Imakaev M.V., Abdennur N.A., Gelfand M.S., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2017). Activation of the alpha-globin gene expression correlates with dramatic upregulation of nearby non-globin genes and changes in local and large-scale chromatin spatial structure. Epigenetics Chromatin 10, 35

2. Golov A.K., Ulianov S.V., Luzhin A.V., Kalabusheva E.P., Kantidze O.L., Flyamer I.M., Razin S.V., Gavrilov A.A. (2020). C-TALE, a new cost-effective method for targeted enrichment of Hi-C/3C-seq libraries. Methods 170, 48-60

3. Golov A.K., Golova A.V., Gavrilov A.A., Razin S.V. (2021). Sensitivity of cohesin-chromatin association to high-salt treatment corroborates non-topological mode of loop extrusion. Epigenetics Chromatin 14, 36

Тезисы конференции:

1. Голов А.К., Галицына А.А., Лужин А.В., Разин С.В., Ульянов С.В., Гаврилов А.А. C-TALE (Chromatin-Targeted Ligation Enrichment) - новый подход к целевому обогащению 3C-seq и Hi-C библиотек. Конференция с международным участием "Клеточная биология: проблемы и перспективы". Санкт-Петербург, Россия, 2017, c.15

Личное участие автора в проведении исследований

Диссертационная работа основана на данных, полученных автором в период с 2016 по 2020 гг. Большая часть представленных в работе экспериментов выполнены автором, биоинформатический анализ полностью выполнен автором. Получение и культивирование нормальных кератиноцитов человека осуществлялось Екатериной Калабушевой (ИБР РАН). Эксперименты с этими клетками проводились в сотрудничестве с Сергеем Ульяновым (ИБГ РАН). В разработку инструментов для биоинформатического анализа

C-TALE данных значительный вклад внесли Артем Лужин (ИБГ РАН) и Илья Флямер (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research). Высокопроизводительное секвенирование C-TALE и ChlP-seq библиотек было проведено компаниями "Genetico" и "Genewiz". Автор принимал ведущее участие в интерпретации полученных данных и в подготовке публикаций.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение»), выводов и приложения. Работа изложена на 158 страницах, содержит 27 рисунков и 2 таблицы. Список литературы включает 258 источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.I. Структура когезина и принципы взаимодействия когезинового комплекса с ДНК

Когезин - это панэукариотический белковый комплекс, относящийся к группе SMC-комплексов, участвующий в процессах индивидуализации сестринских хроматид, декатенации клеточных геномов, митотической и мейотической когезии, создания и поддержания специфической укладки ДНК в интерфазных клетках, репарации двухцепочечных разрывов и стабилизации остановленных репликативных вилок [1,14]. Как и другие SMC-комплексы, когезин представляет из себя с одной стороны мультисубъединичную ABC АТФазу, а с другой - ДНК-связывающий комплекс, не имеющий предпочтений к специфическим нуклеотидным последовательностям. Связывание и гидролиз АТФ, осуществляемые когезином, сопряжены с конформационными изменениями комплекса, а также с изменениями аффинности разных элементов комплекса к ДНК. Повторяющиеся циклы связывания-гидролиза АТФ приводят к направленному движению комплекса вдоль ДНК-нити, таким образом когезин является моторным белком - ДНК-транслоказой.

Специфический процесс транслокации, осуществляемый SMC-комплексами, получил название экструзии, он представляет из себя захват небольшой ДНК-петли с последующим ее ростом, происходящим за счет процессивного затягивания фланкирующих фрагментов ДНК внутрь петли [2,3,15]. В основании петель, растущих за счет экструзии, располагается активный SMC-комплекс, а их размер может достигать сотен тысяч пар оснований. Экструзия, возникшая на заре эволюции клеточной жизни как способ пострепликативного разделения массивных молекул геномной ДНК, по всей видимости, является универсальной биохимической активностью SMC-комплексов. Накапливаются данные, указывающие на то, что большая часть разнообразных клеточных процессов, в которых принимают участие SMC-комплексы, зависит от их экструзионной активности. Примечательно, что с этой точки зрения когезин выделяется на фоне других представителей группы: по крайней мере одна из его активностей - участие в когезии сестринских хроматид - не связана с экструзией напрямую.

Генетические данные указывают на исключительную важность когезина и других SMC-комплексов для эукариотических клеток. Все эукариотические геномы кодируют по крайней мере 4 SMC-комплекса из 3 разных классов: 2 разновидности когезина

(митотический и мейотический), конденсин I и SMC5/6-комплекс [2,15] (таблица 1). Когезин (а также SMC5/6 и по крайней мере одна из разновидностей конденсина) абсолютно необходим для роста как одноклеточных эукариот, так и культивируемых клеток многоклеточных организмов [16-18]. У человека редкие и de novo генетические варианты в генах субъединиц когезина и его регуляторов являются причиной редкого синдромального нарушения развития - синдрома Корнелии де Ланге [6], а соматические мутации ассоциированы с развитием онкологических заболеваний [8,9].

Таблица 1. Субъединичный состав панэукариотических SMC-комплексов. HAWK-субъединицы присутствуют только в когезинах и конденсинах, в то время как прокариотические SMC-комплексы и 8МС5/6-комплекс имеют в своем составе вспомогательные субъединицы, объединяемые в группу KITE-белков [19]._

комплекс ^ мейотический когезин митотический когезин конденсин I SMC5/6-комплекс

1 субъединица

v-SMC SMC3 (Smc3) SMC3 (Smc3) SMC2 (Smc2) SMC6 (Smc6)

x-SMC SMC1£ (Smc1) SMC1a(Smc1) SMC4 (Smc4) SMC5 (Smc5)

клейзин REC8 (Rec8) RAD21 (Scc1) CAP-H (Brn1) NSE4A/B (Nse4)

HAWKa PDS5A/B (Pds5) NIPBL (Scc2) и PDS5A/B (Pds5) CAP-D2 (Ycs4) -

HAWKB STAG3 (Scc3) STAG1/2 (Scc3) CAP-G (Ycg1) -

KITEa - - - NSE5 (Nse5)

KITEB - - - NSE6 (Nse6)

Информация о структуре белков важна для понимания их активности и вдвойне важна для понимания активности моторных белков. Поэтому в этом разделе мы приведем данные о структуре когезина, а также суммируем современные представления о его взаимодействиях с ДНК, конформационных изменениях и о том, как взаимодействия с ДНК и цикл связывания-гидролиза АТФ контролируют эти конформационные изменения.

1Л. SMC1-SMC3 димер вместе с RAD21 клейзиновой субъединицей образуют коровый тример когезинового комплекса

Несмотря на то, что разные классы SMC-комплексов разделены сотнями миллионов лет эволюции, все они имеют общую базовую субъединичную структуру. Инвариантной основой всех SMC-комплексов является тример, состоящий из двух SMC-субъединиц и

одной молекулы белка, называемого клейзином [14,15,20]. SMC-белки [21] и клейзины [22] представляют собой два неродственных белковых семейства. На уровне аминокислотной последовательности филогенетически далекие представители каждого из этих семейств утратили всякую гомологию. Тем не менее структурная организация как SMC-белков, так и клейзинов исключительно консервативна.

^^^ ^ северный

"локоть" - . ЭМСЗ

плечевой

домен I I ~50 нм I Т ' междоменная

сустав

пора

головной домен

В

ДИК-связывающая поверхность

сайт взаимодеиствия с клейзином

МРВС4

Рисунок 1. Субъединичная структура когезинового комплекса. А. Фолдинг и основные структурные особенности SMC-белков. Б. Общая структура трехчастного когезинового кольца и взаимодействие с ним HAWK-субъединиц. В. Общая структура крючкообразных HAWK-субъединиц SMC-комплексов.

В случае когезина1 пара SMC-белков представлена гетеродимером SMC12 ^тс1)^МС3 (Smc3), а клейзиновая субъединица - белком RAD21 (Scc1). SMC-белки представляют собой палочковидные молекулы длиной порядка 50 нм с двумя глобулярными доменами на концах, соединенными между собой относительно лабильной фибриллярной структурой (рис. 1А) [23-25]. Полипептидная цепь длиной 1200-1300 аминокислотных остатков внутри описываемой палочковидной структуры SMC-белка сложена вдвое, так что один из терминальных глобулярных доменов образуется в результате взаимодействия К- и ^концов SMC-белка, а другой образован непрерывным

1 Под когезином мы будем подразумевать более изученный митотический вариант комплекса; во всех случаях, когда речь будет идти о мейотическом когезине, это будет специально оговорено.

2 В основном тексте указаны названия белков человека, в скобках - названия гомологичных белков

Saccharomyces cerevisiae.

фрагментом полипептидной цепи, расположенным приблизительно посредине в линейной последовательности [24,26]. Первый из глобулярных доменов носит название головного домена, а второй - петлевого (hinge), так как внутри него происходит поворот полипептидной цепи SMC-белка на 180°. Фибриллярная структура, соединяющая два глобулярных домена SMC-белка представляет собой внутримолекулярную антипараллельную суперспиральную (coiled-coil) структуру, называемую плечевым доменом. Стабильная димеризация SMC-белков достигается за счет гомотипического взаимодействия между петлевыми доменами [24,25].

Суперспиральные плечевые домены направлены в одну сторону от взаимодействующих петлевых доменов, таким образом SMC1-SMC3 димер в отсутствии АТФ представляет собой V-образную структуру с димеризованными петлевыми доменами на одном полюсе и парой разобщенных головных доменов на другом [24,27].

RAD21-клейзиновая субъединица представляют собой полипептид длиной порядка 500-700 аминокислотных остатка с двумя структурированными доменами на N- и C-концах и протяженной, в значительной мере неупорядоченной, областью между ними [22]. N-концевой домен клейзина взаимодействует с областью сочленения головного и плечевого доменов SMC3-субъединицы, а C-концевой - с головным доменом SMC1 (рис. 1Б) [28].

Молекулы трех коровых субъединиц когезина за счет устойчивых концевых взаимодействий образуют замкнутую кольцевую структуру [24,29]. Вытянутая форма каждой из коровых субъединиц приводит к тому, что в некоторых конформациях когезин обладает пространным топологически замкнутым межсубъединичным компартментом, называемым S-K кольцом (рис. 2Б). Просвет S-K кольца, также называемый S-K компартментом, может поддерживать сквозное прохождение глобулярных частиц диаметром порядка 10 нм [30,31]. Показано, что через S-K компартмент могут также проходить одна или две ДНК-нити, в этом случае кольцевой комплекс оказывается надет на ДНК как бисеринка на нить. В G2-фазе клеточного цикла за счет такого топологического взаимодействия десятков молекул когезина с парами сестринских хроматид осуществляется когезия [32].

Петлевые домены SMC-белков представляют собой компактные структуры, состоящие из двух (N- и C-концевого) субдоменов a/ß класса, каждый из субдоменов имеет в своем составе небольшой ß-лист [24,25]. N-концевой субдомен взаимодействует с C-концевым субдоменом своего димеризационного партнера с образованием единого составного ß-листа. Таким образом два петлевых домена в составе димера имеют пару

взаимодействующих поверхностей. За счет того, что субдомены в составе каждого из петлевых доменов разделены небольшим желобом, димеризованные петлевые домены выглядят как тороидальная структура с вращательной псевдосимметрией второго порядка (симметрия не идеальна, т.к. петлевые домены SMC1 и SMC3 субъединиц немного отличаются друг от друга) (рис. 1Б). Небольшой канал внутри димера петлевых доменов содержит группу функционально важных положительно заряженных аминокислотных остатков, потенциально этот канал может взаимодействовать с ДНК электростатически. Асимметрия в гетеродимере SMC-субъединиц когезина позволяет различать две поверхности взаимодействия петлевых доменов между собой, одну из них, более удаленную от головных доменов, принято называть северной, другую - южной (рис. 1Б).

Плечевой домен каждого из SMC-белков представляет собой пару антипараллельных суперспирализованных a-спиралей (coiled coil), каждая из которых имеет длину порядка 300-400 аминокислотных остатка. Суперспираль плечевого домена имеет несколько дефектов, в которых одна или обе антипараллельных цепи теряют регулярную a-спиральную структуру [26]. Два таких разрыва в суперспирали плечевого домена обладают высокой эволюционной консервативностью и, по всей вероятности, играют важную роль в активности SMC-комплексов. Первый, расположенный около середины плечевого домена, чуть ближе к димеру петлевых доменов, получил название "локоть" ("elbow") (рис. 1А). Эта область обеспечивает механическую гибкость плечевых доменов: одновременное сгибание локтевых регионов обеих SMC-субъединиц комплекса может приводить к сближению петлевых доменов с головными доменами (рис. 2А). Второй консервативный разрыв суперспирали находится вблизи головного домена, на расстоянии примерно 50 аминокислотных остатков, его принято называть "суставом" ("joint") (рис. 1А). "Суставы" SMC-субъединиц являются важными сайтами для взаимодействия с дополнительными субъединицами комплекса [33], также они принимают участие в движениях головных доменов друг относительно друга [34].

Головные домены SMC-белков представляют собой ABC АТФазы [23,35]. Как и другие ABC белки когезин способен гидролизовать АТФ исключительно при физическом взаимодействии двух АТФазных доменов в составе димера (рис. 2Б) [36,37]. Головной домен одной из субъединиц димера связывает АТФ, а головной домен другой необходим для гидролиза связанной молекулы. Каждый цикл когезин-зависимого гидролиза АТФ включает связывание АТФ каждым из головных доменов, таким образом в каждом цикле расходуется две молекулы. Взаимодействие головных доменов двух SMC-субъединиц прекращается при гидролизе нуклеозидтрифосфата и вновь формируется при связывании

новой пары молекул АТФ. Таким образом, в отличие от взаимодействия петлевых доменов связывание головных доменов зависит от субстрата и носит динамический характер (рис.

Рисунок 2. Разнообразие конформационных состояний когезина. А. Основные конформационные состояния когезина, обнаруженные с помощью микроскопических методов. Б. O-, E- и J-конфигурации головных доменов когезина и переходы между ними, RAD21-субъединица не показана для ясности рисунка. На пиктограммах обозначены S-K кольцо и субкомпартменты (E-S, E-K и J-K), образуемые при взаимодействии головных доменов между собой.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Голов Аркадий Константинович, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Yatskevich S, Rhodes J, Nasmyth K. Organization of Chromosomal DNA by SMC Complexes. Annu Rev Genet. 2019;53: 445-482.

2. Davidson IF, Peters J-M. Genome folding through loop extrusion by SMC complexes. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021;22: 445-464.

3. Oldenkamp R, Rowland BD. A walk through the SMC cycle: From catching DNAs to shaping the genome. Mol Cell. 2022;82: 1616-1630.

4. Lupiáñez DG, Kraft K, Heinrich V, Krawitz P, Brancati F, Klopocki E, et al. Disruptions of topological chromatin domains cause pathogenic rewiring of gene-enhancer interactions. Cell. 2015;161: 1012-1025.

5. Rao SSP, Huang S-C, Glenn St Hilaire B, Engreitz JM, Perez EM, Kieffer-Kwon K-R, et al. Cohesin Loss Eliminates All Loop Domains. Cell. 2017;171: 305-320.e24.

6. Dorsett D, Krantz ID. On the molecular etiology of Cornelia de Lange syndrome. Ann N Y Acad Sci. 2009;1151: 22-37.

7. Barbero JL. Genetic basis of cohesinopathies. Appl Clin Genet. 2013;6: 15-23.

8. Romero-Pérez L, Surdez D, Brunet E, Delattre O, Grünewald TGP. STAG Mutations in Cancer. Trends Cancer Res. 2019;5: 506-520.

9. Waldman T. Emerging themes in cohesin cancer biology. Nat Rev Cancer. 2020;20: 504-515.

10. Denker A, de Laat W. The second decade of 3C technologies: detailed insights into nuclear organization. Genes Dev. 2016;30: 1357-1382.

11. McCord RP, Kaplan N, Giorgetti L. Chromosome Conformation Capture and Beyond: Toward an Integrative View of Chromosome Structure and Function. Mol Cell. 2020;77: 688-708.

12. Rao SSP, Huntley MH, Durand NC, Stamenova EK, Bochkov ID, Robinson JT, et al. A 3D map of the human genome at kilobase resolution reveals principles of chromatin looping. Cell. 2014;159: 1665-1680.

13. Hsieh T-HS, Cattoglio C, Slobodyanyuk E, Hansen AS, Rando OJ, Tjian R, et al. Resolving the 3D Landscape of Transcription-Linked Mammalian Chromatin Folding. Mol Cell. 2020;78: 539-553.e8.

14. Gligoris T, Löwe J. Structural Insights into Ring Formation of Cohesin and Related Smc Complexes. Trends Cell Biol. 2016;26: 680-693.

15. Lee H, Noh H, Ryu J-K. Structure-function relationships of SMC protein complexes for

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

DNA loop extrusion. Biodesign. 2021;9: 1-13.

Strunnikov AV, Larionov VL, Koshland D. SMC1: an essential yeast gene encoding a putative head-rod-tail protein is required for nuclear division and defines a new ubiquitous protein family. J Cell Biol. 1993;123: 1635-1648.

Sonoda E, Matsusaka T, Morrison C, Vagnarelli P, Hoshi O, Ushiki T, et al. Scc1/Rad21/Mcd1 is required for sister chromatid cohesion and kinetochore function in vertebrate cells. Dev Cell. 2001;1: 759-770.

Peters J-M, Tedeschi A, Schmitz J. The cohesin complex and its roles in chromosome biology. Genes Dev. 2008;22: 3089-3114.

Wells JN, Gligoris TG, Nasmyth KA, Marsh JA. Evolution of condensin and cohesin complexes driven by replacement of Kite by Hawk proteins. Curr Biol. 2017;27: R17-R18. Nasmyth K, Haering CH. The structure and function of SMC and kleisin complexes. Annu RevBiochem. 2005;74: 595-648.

Cobbe N, Heck MMS. The evolution of SMC proteins: phylogenetic analysis and structural implications. Mol Biol Evol. 2004;21: 332-347.

Schleiffer A, Kaitna S, Maurer-Stroh S, Glotzer M, Nasmyth K, Eisenhaber F. Kleisins: a superfamily of bacterial and eukaryotic SMC protein partners. Mol Cell. 2003;11: 571-575.

Löwe J, Cordell SC, van den Ent F. Crystal structure of the SMC head domain: an ABC ATPase with 900 residues antiparallel coiled-coil inserted. J Mol Biol. 2001;306: 25-35. Haering CH, Löwe J, Hochwagen A, Nasmyth K. Molecular Architecture of SMC Proteins and the Yeast Cohesin Complex. Mol Cell. 2002;9: 773-788.

Kurze A, Michie KA, Dixon SE, Mishra A, Itoh T, Khalid S, et al. A positively charged channel within the Smc1/Smc3 hinge required for sister chromatid cohesion. EMBO J. 2011;30: 364-378.

Bürmann F, Lee B-G, Than T, Sinn L, O'Reilly FJ, Yatskevich S, et al. A folded

conformation of MukBEF and cohesin. Nat Struct Mol Biol. 2019;26: 227-236.

Melby TE, Ciampaglio CN, Briscoe G, Erickson HP. The symmetrical structure of

structural maintenance of chromosomes (SMC) and MukB proteins: long, antiparallel

coiled coils, folded at a flexible hinge. J Cell Biol. 1998;142: 1595-1604.

Uhlmann F, Wernic D, Poupart MA, Koonin EV, Nasmyth K. Cleavage of cohesin by the

CD clan protease separin triggers anaphase in yeast. Cell. 2000;103: 375-386.

Gruber S, Haering CH, Nasmyth K. Chromosomal Cohesin Forms a Ring. Cell. 2003;112:

765-777.

30

31

32

33

34

35

36

37

38

39

40

41

42

43

Stigler J, Çamdere GÖ, Koshland DE, Greene EC. Single-Molecule Imaging Reveals a Collapsed Conformational State for DNA-Bound Cohesin. Cell Rep. 2016;15: 988-998. Davidson IF, Goetz D, Zaczek MP, Molodtsov MI, Huis In't Veld PJ, Weissmann F, et al. Rapid movement and transcriptional re-localization of human cohesin on DNA. EMBO J. 2016;35: 2671-2685.

Srinivasan M, Scheinost JC, Petela NJ, Gligoris TG, Wissler M, Ogushi S, et al. The Cohesin Ring Uses Its Hinge to Organize DNA Using Non-topological as well as Topological Mechanisms. Cell. 2018;173: 1508-1519.e18.

Shi Z, Gao H, Bai X-C, Yu H. Cryo-EM structure of the human cohesin-NIPBL-DNA complex. Science. 2020;368: 1454-1459.

Diebold-Durand M-L, Lee H, Ruiz Avila LB, Noh H, Shin H-C, Im H, et al. Structure of Full-Length SMC and Rearrangements Required for Chromosome Organization. Mol Cell. 2017;67: 334-347.e5.

Krishnan A, Burroughs AM, Iyer LM, Aravind L. Comprehensive classification of ABC ATPases and their functional radiation in nucleoprotein dynamics and biological conflict systems. Nucleic Acids Res. 2020;48: 10045-10075.

Lammens A, Schele A, Hopfner K-P. Structural biochemistry of ATP-driven dimerization and DNA-stimulated activation of SMC ATPases. Curr Biol. 2004;14: 1778-1782. Arumugam P, Nishino T, Haering CH, Gruber S, Nasmyth K. Cohesin's ATPase Activity Is Stimulated by the C-Terminal Winged-Helix Domain of Its Kleisin Subunit. Curr Biol. 2006;16: 1998-2008.

Arumugam P, Gruber S, Tanaka K, Haering CH, Mechtler K, Nasmyth K. ATP hydrolysis is required for cohesin's association with chromosomes. Curr Biol. 2003;13: 1941-1953. Gligoris TG, Scheinost JC, Bürmann F, Petela N, Chan K-L, Uluocak P, et al. Closing the cohesin ring: structure and function of its Smc3-kleisin interface. Science. 2014;346: 963-967.

Bürmann F, Shin H-C, Basquin J, Soh Y-M, Giménez-Oya V, Kim Y-G, et al. An asymmetric SMC-kleisin bridge in prokaryotic condensin. Nat Struct Mol Biol. 2013;20: 371-379.

Haering CH, Schoffnegger D, Nishino T, Helmhart W, Nasmyth K, Löwe J. Structure and

stability of cohesin's Smc1-kleisin interaction. Mol Cell. 2004;15: 951-964.

Roig MB, Löwe J, Chan K-L, Beckouët F, Metson J, Nasmyth K. Structure and function of

cohesin's Scc3/SA regulatory subunit. FEBS Lett. 2014;588: 3692-3702.

Lee B-G, Roig MB, Jansma M, Petela N, Metson J, Nasmyth K, et al. Crystal Structure of

the Cohesin Gatekeeper Pds5 and in Complex with Kleisin Sccl. Cell Rep. 2016;14: 2108-2115.

44. Petela NJ, Gligoris TG, Metson J, Lee B-G, Vulgaris M, Hu B, et al. Scc2 Is a Potent Activator of Cohesin's ATPase that Promotes Loading by Binding Sccl without Pds5. Mol Cell. 2018;70: 1134-1148.e7.

45. Ouyang Z, Zheng G, Tomchick DR, Luo X, Yu H. Structural Basis and IP6 Requirement for Pds5-Dependent Cohesin Dynamics. Mol Cell. 2016;62: 248-259.

46. Neuwald AF, Hirano T. HEAT repeats associated with condensins, cohesins, and other complexes involved in chromosome-related functions. Genome Res. 2000;10: 1445-1452.

47. Losada A, Yokochi T, Kobayashi R, Hirano T. Identification and characterization of SA/Scc3p subunits in the Xenopus and human cohesin complexes. J Cell Biol. 2000;150: 405-416.

48. Collier JE, Lee B-G, Roig MB, Yatskevich S, Petela NJ, Metson J, et al. Transport of DNA within cohesin involves clamping on top of engaged heads by Scc2 and entrapment within the ring by Scc3. Elife. 2020;9: e59560.

49. Nora EP, Caccianini L, Fudenberg G, So K, Kameswaran V, Nagle A, et al. Molecular basis of CTCF binding polarity in genome folding. Nat Commun. 2020;11: 5612.

50. Dauban L, Montagne R, Thierry A, Lazar-Stefanita L, Bastié N, Gadal O, et al. Regulation of Cohesin-Mediated Chromosome Folding by Eco1 and Other Partners. Mol Cell. 2020;77: 1279-1293.e4.

51. Muir KW, Li Y, Weis F, Panne D. The structure of the cohesin ATPase elucidates the mechanism of SMC-kleisin ring opening. Nat Struct Mol Biol. 2020;27: 233-239.

52. Chapard C, Jones R, van Oepen T, Scheinost JC, Nasmyth K. Sister DNA Entrapment between Juxtaposed Smc Heads and Kleisin of the Cohesin Complex. Mol Cell. 2019;75: 224-237.e5.

53. Higashi TL, Eickhoff P, Sousa JS, Locke J, Nans A, Flynn HR, et al. A Structure-Based Mechanism for DNA Entry into the Cohesin Ring. Mol Cell. 2020;79: 917-933.e9.

54. Bauer BW, Davidson IF, Canena D, Wutz G, Tang W, Litos G, et al. Cohesin mediates DNA loop extrusion by a "swing and clamp" mechanism. Cell. 2021;184: 5448-5464.e22.

55. Hons MT, Huis In't Veld PJ, Kaesler J, Rombaut P, Schleiffer A, Herzog F, et al. Topology and structure of an engineered human cohesin complex bound to Pds5B. Nat Commun. 2016;7: 12523.

56. Ryu J-K, Katan AJ, van der Sluis EO, Wisse T, de Groot R, Haering CH, et al. The condensin holocomplex cycles dynamically between open and collapsed states. Nat Struct

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

Mol Biol. 2020;27: 1134-1141.

Higashi TL, Pobegalov G, Tang M, Molodtsov MI, Uhlmann F. A Brownian ratchet model for DNA loop extrusion by the cohesin complex. Elife. 2021;10: e67530. Huang CE, Milutinovich M, Koshland D. Rings, bracelet or snaps: fashionable alternatives for Smc complexes. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2005;360: 537-542. Anderson DE, Losada A, Erickson HP, Hirano T. Condensin and cohesin display different arm conformations with characteristic hinge angles. J Cell Biol. 2002;156: 419-424. Ciosk R, Shirayama M, Shevchenko A, Tanaka T, Toth A, Shevchenko A, et al. Cohesin's binding to chromosomes depends on a separate complex consisting of Scc2 and Scc4 proteins. Mol Cell. 2000;5: 243-254.

Gerlich D, Koch B, Dupeux F, Peters J-M, Ellenberg J. Live-cell imaging reveals a stable cohesin-chromatin interaction after but not before DNA replication. Curr Biol. 2006;16: 1571-1578.

Uhlmann F, Lottspeich F, Nasmyth K. Sister-chromatid separation at anaphase onset is promoted by cleavage of the cohesin subunit Scc1. Nature. 1999;400: 37-42. Cuylen S, Haering CH. Deciphering condensin action during chromosome segregation. Trends Cell Biol. 2011;21: 552-559.

Kanno T, Berta DG, Sjögren C. The Smc5/6 Complex Is an ATP-Dependent Intermolecular DNA Linker. Cell Rep. 2015;12: 1471-1482.

Wilhelm L, Bürmann F, Minnen A, Shin H-C, Toseland CP, Oh B-H, et al. SMC condensin entraps chromosomal DNA by an ATP hydrolysis dependent loading mechanism in Bacillus subtilis. Elife. 2015;4. doi:10.7554/eLife.06659

Murayama Y, Uhlmann F. Biochemical reconstitution of topological DNA binding by the cohesin ring. Nature. 2014;505: 367-371.

Minamino M, Higashi TL, Bouchoux C, Uhlmann F. Topological in vitro loading of the budding yeast cohesin ring onto DNA. Life Sci Alliance. 2018;1. doi:10.26508/lsa.201800143

Haering CH, Farcas A-M, Arumugam P, Metson J, Nasmyth K. The cohesin ring concatenates sister DNA molecules. Nature. 2008;454: 297-301.

Privalov PL, Dragan AI, Crane-Robinson C. Interpreting protein/DNA interactions: distinguishing specific from non-specific and electrostatic from non-electrostatic components. Nucleic Acids Res. 2011;39: 2483-2491.

Privalov PL, Crane-Robinson C. Forces maintaining the DNA double helix and its complexes with transcription factors. Prog Biophys Mol Biol. 2018;135: 30-48.

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

Dignam JD, Lebovitz RM, Roeder RG. Accurate transcription initiation by RNA polymerase II in a soluble extract from isolated mammalian nuclei. Nucleic Acids Res. 1983;11: 1475-1489.

Cook PR, Brazell IA, Jost E. Characterization of nuclear structures containing superhelical DNA. J Cell Sci. 1976;22: 303-324.

von Holt C, Brandt WF, Greyling HJ, Lindsey GG, Retief JD, Rodrigues JD, et al. Isolation and characterization of histones. Methods Enzymol. 1989;170: 431-523. Bermudez VP, Farina A, Higashi TL, Du F, Tappin I, Takahashi TS, et al. In vitro loading of human cohesin on DNA by the human Scc2-Scc4 loader complex. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2012;109: 9366-9371.

Hancock R. A new look at the nuclear matrix. Chromosoma. 2000;109: 219-225. Ivanov D, Nasmyth K. A physical assay for sister chromatid cohesion in vitro. Mol Cell. 2007;27: 300-310.

Zuin J, Dixon JR, van der Reijden MIJA, Ye Z, Kolovos P, Brouwer RWW, et al. Cohesin

and CTCF differentially affect chromatin architecture and gene expression in human cells.

Proceedings of the National Academy of Sciences. 2014;111: 996-1001.

Shaltiel IA, Datta S, Lecomte L, Hassler M, Kschonsak M, Bravo S, et al. A hold-and-feed

mechanism drives directional DNA loop extrusion by condensin. Science. 2022;376:

1087-1094.

Kueng S, Hegemann B, Peters BH, Lipp JJ, Schleiffer A, Mechtler K, et al. Wapl Controls the Dynamic Association of Cohesin with Chromatin. Cell. 2006;127: 955-967. Chan K-L, Roig MB, Hu B, Beckouet F, Metson J, Nasmyth K. Cohesin's DNA exit gate is distinct from its entrance gate and is regulated by acetylation. Cell. 2012;150: 961-974. Huis in 't Veld PJ, Herzog F, Ladurner R, Davidson IF, Piric S, Kreidl E, et al. Characterization of a DNA exit gate in the human cohesin ring. Science. 2014;346: 968-972.

Ouyang Z, Zheng G, Song J, Borek DM, Otwinowski Z, Brautigam CA, et al. Structure of the human cohesin inhibitor Wapl. Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110: 11355-11360. Gandhi R, Gillespie PJ, Hirano T. Human Wapl is a cohesin-binding protein that promotes sister-chromatid resolution in mitotic prophase. Curr Biol. 2006;16: 2406-2417. Ouyang Z, Yu H. Releasing the cohesin ring: A rigid scaffold model for opening the DNA exit gate by Pds5 and Wapl. Bioessays. 2017;39. doi:10.1002/bies.201600207 Hauf S, Waizenegger IC, Peters JM. Cohesin cleavage by separase required for anaphase and cytokinesis in human cells. Science. 2001;293: 1320-1323.

86

87

88

89

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99

Murayama Y, Samora CP, Kurokawa Y, Iwasaki H, Uhlmann F. Establishment of DNA-DNA Interactions by the Cohesin Ring. Cell. 2018;172: 465-477.e15. Nagasaka K, Davidson IF, Stocsits RR, Tang W, Wutz G, Betty P, et al. Cohesin mediates DNA loop extrusion and sister chromatid cohesion by distinct mechanisms. bioRxiv. 2022. p. 2022.09.23.509019. doi:10.1101/2022.09.23.509019

Davidson IF, Bauer B, Goetz D, Tang W, Wutz G, Peters J-M. DNA loop extrusion by human cohesin. Science. 2019;366: 1338-1345.

Chiu A, Revenkova E, Jessberger R. DNA interaction and dimerization of eukaryotic SMC hinge domains. J Biol Chem. 2004;279: 26233-26242.

Soh Y-M, Bürmann F, Shin H-C, Oda T, Jin KS, Toseland CP, et al. Molecular basis for SMC rod formation and its dissolution upon DNA binding. Mol Cell. 2015;57: 290-303. Griese JJ, Witte G, Hopfner K-P. Structure and DNA binding activity of the mouse condensin hinge domain highlight common and diverse features of SMC proteins. Nucleic Acids Res. 2010;38: 3454-3465.

Kschonsak M, Merkel F, Bisht S, Metz J, Rybin V, Hassler M, et al. Structural Basis for a Safety-Belt Mechanism That Anchors Condensin to Chromosomes. Cell. 2017;171: 588-600.e24.

Lee B-G, Rhodes J, Löwe J. Clamping of DNA shuts the condensin neck gate. Proc Natl Acad Sci USA. 2022;119: e2120006119.

Sjögren C, Nasmyth K. Sister chromatid cohesion is required for postreplicative double-strand break repair in Saccharomyces cerevisiae. CurrBiol. 2001;11: 991-995. Covo S, Westmoreland JW, Gordenin DA, Resnick MA. Cohesin Is limiting for the suppression of DNA damage-induced recombination between homologous chromosomes. PLoS Genet. 2010;6: e1001006.

Holzmann J, Politi AZ, Nagasaka K, Hantsche-Grininger M, Walther N, Koch B, et al. Absolute quantification of cohesin, CTCF and their regulators in human cells. Elife. 2019;8. doi:10.7554/eLife.46269

McNicoll F, Stevense M, Jessberger R. Cohesin in gametogenesis. Curr Top Dev Biol. 2013;102: 1-34.

Srinivasan M, Fumasoni M, Petela NJ, Murray A, Nasmyth KA. Cohesion is established during DNA replication utilising chromosome associated cohesin rings as well as those loaded de novo onto nascent DNAs. Elife. 2020;9: e56611.

Xu H, Boone C, Brown GW. Genetic dissection of parallel sister-chromatid cohesion pathways. Genetics. 2007;176: 1417-1429.

100. Rhodes JDP, Haarhuis JHI, Grimm JB, Rowland BD, Lavis LD, Nasmyth KA. Cohesin Can Remain Associated with Chromosomes during DNA Replication. Cell Rep. 2017;20: 2749-2755.

101. Waizenegger I, Giménez-Abiân JF, Wernic D, Peters J-M. Regulation of human separase by securin binding and autocleavage. Curr Biol. 2002;12: 1368-1378.

102. Unal E, Heidinger-Pauli JM, Kim W, Guacci V, Onn I, Gygi SP, et al. A molecular determinant for the establishment of sister chromatid cohesion. Science. 2008;321: 566-569.

103. Zhang J, Shi X, Li Y, Kim B-J, Jia J, Huang Z, et al. Acetylation of Smc3 by Eco1 is required for S phase sister chromatid cohesion in both human and yeast. Mol Cell. 2008;31: 143-151.

104. Ivanov MP, Ladurner R, Poser I, Beveridge R, Rampler E, Hudecz O, et al. The replicative helicase MCM recruits cohesin acetyltransferase ESCO2 to mediate centromeric sister chromatid cohesion. EMBO J. 2018;37. doi:10.15252/embj.201797150

105. Chan K-L, Gligoris T, Upcher W, Kato Y, Shirahige K, Nasmyth K, et al. Pds5 promotes and protects cohesin acetylation. ProcNatl Acad Sci USA. 2013;110: 13020-13025.

106. Beckouët F, Hu B, Roig MB, Sutani T, Komata M, Uluocak P, et al. An Smc3 acetylation cycle is essential for establishment of sister chromatid cohesion. Mol Cell. 2010;39: 689-699.

107. Beckouët F, Srinivasan M, Roig MB, Chan K-L, Scheinost JC, Batty P, et al. Releasing Activity Disengages Cohesin's Smc3/Scc1 Interface in a Process Blocked by Acetylation. Mol Cell. 2016;61: 563-574.

108. Nishiyama T, Ladurner R, Schmitz J, Kreidl E, Schleiffer A, Bhaskara V, et al. Sororin mediates sister chromatid cohesion by antagonizing Wapl. Cell. 2010;143: 737-749.

109. Mota IP, Galova M, Schleiffer A, Nguyen T-T, Kovacikova I, Nishiyama T, et al. SORORIN is an evolutionary conserved antagonist of WAPL. bioRxiv. 2022. p. 2022.10.24.513534. doi:10.1101/2022.10.24.513534

110. Ladurner R, Kreidl E, Ivanov MP, Ekker H, Idarraga-Amado MH, Busslinger GA, et al. Sororin actively maintains sister chromatid cohesion. EMBO J. 2016;35: 635-653.

111. Waizenegger IC, Hauf S, Meinke A, Peters JM. Two distinct pathways remove mammalian cohesin from chromosome arms in prophase and from centromeres in anaphase. Cell. 2000;103: 399-410.

112. Hauf S, Roitinger E, Koch B, Dittrich CM, Mechtler K, Peters J-M. Dissociation of cohesin from chromosome arms and loss of arm cohesion during early mitosis depends on

phosphorylation of SA2. PLoS Biol. 2005;3: e69.

113. Kitajima TS, Sakuno T, Ishiguro K-I, Iemura S-I, Natsume T, Kawashima SA, et al. Shugoshin collaborates with protein phosphatase 2A to protect cohesin. Nature. 2006;441: 46-52.

114. Riedel CG, Katis VL, Katou Y, Mori S, Itoh T, Helmhart W, et al. Protein phosphatase 2A protects centromeric sister chromatid cohesion during meiosis I. Nature. 2006;441: 53-61.

115. Liu H, Rankin S, Yu H. Phosphorylation-enabled binding of SGO1-PP2A to cohesin protects sororin and centromeric cohesion during mitosis. Nat Cell Biol. 2013;15: 40-49.

116. Hornig NCD, Knowles PP, McDonald NQ, Uhlmann F. The dual mechanism of separase regulation by securin. CurrBiol. 2002;12: 973-982.

117. Zhang H, Emerson DJ, Gilgenast TG, Titus KR, Lan Y, Huang P, et al. Chromatin structure dynamics during the mitosis-to-G1 phase transition. Nature. 2019;576: 158-162.

118. Michaelis C, Ciosk R, Nasmyth K. Cohesins: chromosomal proteins that prevent premature separation of sister chromatids. Cell. 1997;91: 35-45.

119. Costantino L, Hsieh T-HS, Lamothe R, Darzacq X, Koshland D. Cohesin residency determines chromatin loop patterns. Elife. 2020;9. doi:10.7554/eLife.59889

120. Losada A, Hirano M, Hirano T. Identification of Xenopus SMC protein complexes required for sister chromatid cohesion. Genes Dev. 1998;12: 1986-1997.

121. Sumara I, Vorlaufer E, Gieffers C, Peters BH, Peters JM. Characterization of vertebrate cohesin complexes and their regulation in prophase. J Cell Biol. 2000;151: 749-762.

122. Ganji M, Shaltiel IA, Bisht S, Kim E, Kalichava A, Haering CH, et al. Real-time imaging of DNA loop extrusion by condensin. Science. 2018;360: 102-105.

123. Pradhan B, Kanno T, Umeda Igarashi M, Loke MS, Baaske MD, Wong JSK, et al. The Smc5/6 complex is a DNA loop-extruding motor. Nature. 2023;616: 843-848.

124. Wang X, Hughes AC, Brandao HB, Walker B, Lierz C, Cochran JC, et al. In Vivo Evidence for ATPase-Dependent DNA Translocation by the Bacillus subtilis SMC Condensin Complex. Mol Cell. 2018;71: 841-847.e5.

125. Kim Y, Shi Z, Zhang H, Finkelstein IJ, Yu H. Human cohesin compacts DNA by loop extrusion. Science. 2019;366: 1345-1349.

126. Bastie N, Chapard C, Dauban L, Gadal O, Beckouet F, Koszul R. Smc3 acetylation, Pds5 and Scc2 control the translocase activity that establishes cohesin-dependent chromatin loops. Nat Struct Mol Biol. 2022;29: 575-585.

127. Golfier S, Quail T, Kimura H, Brugues J. Cohesin and condensin extrude DNA loops in a cell cycle-dependent manner. Elife. 2020;9: e53885.

128. McNairn AJ, Gerton JL. Intersection of ChIP and FLIP, genomic methods to study the dynamics of the cohesin proteins. Chromosome Res. 2009;17: 155-163.

129. Wutz G, Várnai C, Nagasaka K, Cisneros DA, Stocsits RR, Tang W, et al. Topologically associating domains and chromatin loops depend on cohesin and are regulated by CTCF, WAPL, and PDS5 proteins. EMBO J. 2017;36: 3573-3599.

130. Haarhuis JHI, van der Weide RH, Blomen VA, Omar Yáñez-Cuna J, Amendola M, van Ruiten MS, et al. The Cohesin Release Factor WAPL Restricts Chromatin Loop Extension. Cell. 2017;169: 693-707.e14.

131. Wutz G, Ladurner R, St Hilaire BG, Stocsits RR, Nagasaka K, Pignard B, et al. ESCO1 and CTCF enable formation of long chromatin loops by protecting cohesinSTAG1 from WAPL. Elife. 2020;9: e52091.

132. Mizuguchi T, Fudenberg G, Mehta S, Belton J-M, Taneja N, Folco HD, et al. Cohesin-dependent globules and heterochromatin shape 3D genome architecture in S. pombe. Nature. 2014;516: 432-435.

133. Schmidt CK, Brookes N, Uhlmann F. Conserved features of cohesin binding along fission yeast chromosomes. Genome Biol. 2009;10: R52.

134. Banigan EJ, Tang W, van den Berg AA, Stocsits RR, Wutz G, Brandäo HB, et al. Transcription shapes 3D chromatin organization by interacting with loop extrusion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2023;120: e2210480120.

135. Li Y, Haarhuis JHI, Sedeño Cacciatore Á, Oldenkamp R, van Ruiten MS, Willems L, et al. The structural basis for cohesin-CTCF-anchored loops. Nature. 2020;578: 472-476.

136. Hansen AS, Pustova I, Cattoglio C, Tjian R, Darzacq X. CTCF and cohesin regulate chromatin loop stability with distinct dynamics. Elife. 2017;6: e25776.

137. Mishra A, Hu B, Kurze A, Beckouët F, Farcas A-M, Dixon SE, et al. Both interaction surfaces within cohesin's hinge domain are essential for its stable chromosomal association. CurrBiol. 2010;20: 279-289.

138. Abramo K, Valton A-L, Venev SV, Ozadam H, Fox AN, Dekker J. A chromosome folding intermediate at the condensin-to-cohesin transition during telophase. Nat Cell Biol. 2019;21: 1393-1402.

139. Busslinger GA, Stocsits RR, van der Lelij P, Axelsson E, Tedeschi A, Galjart N, et al. Cohesin is positioned in mammalian genomes by transcription, CTCF and Wapl. Nature. 2017;544: 503-507.

140. Vian L, Pçkowska A, Rao SSP, Kieffer-Kwon K-R, Jung S, Baranello L, et al. The Energetics and Physiological Impact of Cohesin Extrusion. Cell. 2018;173:

1165-1178.e20.

141. Tedeschi A, Wutz G, Huet S, Jaritz M, Wuensche A, Schirghuber E, et al. Wapl is an essential regulator of chromatin structure and chromosome segregation. Nature. 2013;501: 564-568.

142. Ur SN, Corbett KD. Architecture and Dynamics of Meiotic Chromosomes. Annu Rev Genet. 2021;55: 497-526.

143. Nasmyth K. Disseminating the genome: joining, resolving, and separating sister chromatids during mitosis and meiosis. Annu Rev Genet. 2001;35: 673-745.

144. Schalbetter SA, Fudenberg G, Baxter J, Pollard KS, Neale MJ. Principles of meiotic chromosome assembly revealed in S. cerevisiae. Nat Commun. 2019;10: 4795.

145. Lengronne A, Katou Y, Mori S, Yokobayashi S, Kelly GP, Itoh T, et al. Cohesin relocation from sites of chromosomal loading to places of convergent transcription. Nature. 2004;430: 573-578.

146. Sanborn AL, Rao SSP, Huang S-C, Durand NC, Huntley MH, Jewett AI, et al. Chromatin extrusion explains key features of loop and domain formation in wild-type and engineered genomes. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112: E6456-65.

147. Gómez-Marín C, Tena JJ, Acemel RD, López-Mayorga M, Naranjo S, de la Calle-Mustienes E, et al. Evolutionary comparison reveals that diverging CTCF sites are signatures of ancestral topological associating domains borders. Proc Natl Acad Sci USA. 2015;112: 7542-7547.

148. Nanni L, Ceri S, Logie C. Spatial patterns of CTCF sites define the anatomy of TADs and their boundaries. Genome Biol. 2020;21: 197.

149. Dixon JR, Selvaraj S, Yue F, Kim A, Li Y, Shen Y, et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions. Nature. 2012;485: 376-380.

150. Nora EP, Lajoie BR, Schulz EG, Giorgetti L, Okamoto I, Servant N, et al. Spatial partitioning of the regulatory landscape of the X-inactivation centre. Nature. 2012;485: 381-385.

151. Pradhan B, Barth R, Kim E, Davidson IF, Bauer B, van Laar T, et al. SMC complexes can traverse physical roadblocks bigger than their ring size. Cell Rep. 2022;41: 111491.

152. Hsieh T-HS, Fudenberg G, Goloborodko A, Rando OJ. Micro-C XL: assaying chromosome conformation from the nucleosome to the entire genome. Nat Methods. 2016;13: 1009-1011.

153. Valton A-L, Venev SV, Mair B, Khokhar ES, Tong AHY, Usaj M, et al. A cohesin traffic

pattern genetically linked to gene regulation. Nat Struct Mol Biol. 2022;29: 1239-1251.

154. Sundin O, Varshavsky A. Terminal stages of SV40 DNA replication proceed via multiply intertwined catenated dimers. Cell. 1980;21: 103-114.

155. Wang JC. Cellular roles of DNA topoisomerases: a molecular perspective. Nat Rev Mol Cell Biol. 2002;3: 430-440.

156. Orlandini E, Marenduzzo D, Michieletto D. Synergy of topoisomerase and structural-maintenance-of-chromosomes proteins creates a universal pathway to simplify genome topology. Proceedings of the National Academy of Sciences. 2019;116: 8149-8154.

157. Nolivos S, Sherratt D. The bacterial chromosome: architecture and action of bacterial SMC and SMC-like complexes. FEMS Microbiol Rev. 2014;38: 380-392.

158. Ono T, Losada A, Hirano M, Myers MP, Neuwald AF, Hirano T. Differential contributions of condensin I and condensin II to mitotic chromosome architecture in vertebrate cells. Cell. 2003;115: 109-121.

159. Ono T, Fang Y, Spector DL, Hirano T. Spatial and temporal regulation of Condensins I and II in mitotic chromosome assembly in human cells. Mol Biol Cell. 2004;15: 3296-3308.

160. Houlard M, Cutts EE, Shamim MS, Godwin J, Weisz D, Presser Aiden A, et al. MCPH1 inhibits Condensin II during interphase by regulating its SMC2-Kleisin interface. Elife. 2021;10: e73348.

161. Piazza I, Haering CH, Rutkowska A. Condensin: crafting the chromosome landscape. Chromosoma. 2013;122: 175-190.

162. Oomen ME, Hedger AK, Watts JK, Dekker J. Detecting chromatin interactions between and along sister chromatids with SisterC. Nat Methods. 2020;17: 1002-1009.

163. Mitter M, Gasser C, Takacs Z, Langer CCH, Tang W, Jessberger G, et al. Conformation of sister chromatids in the replicated human genome. Nature. 2020;586: 139-144.

164. Batty P, Langer CCH, Takacs Z, Tang W, Blaukopf C, Peters J-M, et al. Cohesin-mediated DNA loop extrusion resolves sister chromatids in G2 phase. EMBO J. 2023;n/a: e113475.

165. Freeman L, Aragon-Alcaide L, Strunnikov A. The condensin complex governs chromosome condensation and mitotic transmission of rDNA. J Cell Biol. 2000;149: 811-824.

166. Nagasaka K, Hossain MJ, Roberti MJ, Ellenberg J, Hirota T. Sister chromatid resolution is an intrinsic part of chromosome organization in prophase. Nat Cell Biol. 2016;18: 692-699.

167. Renshaw MJ, Ward JJ, Kanemaki M, Natsume K, Nedelec FJ, Tanaka TU. Condensins

promote chromosome recoiling during early anaphase to complete sister chromatid separation. Dev Cell. 2010;19: 232-244.

168. Schalbetter SA, Goloborodko A, Fudenberg G, Belton J-M, Miles C, Yu M, et al. SMC complexes differentially compact mitotic chromosomes according to genomic context. Nat Cell Biol. 2017;19: 1071-1080.

169. Gibcus JH, Samejima K, Goloborodko A, Samejima I, Naumova N, Nuebler J, et al. A pathway for mitotic chromosome formation. Science. 2018;359. doi:10.1126/science.aao6135

170. Hirano T. Condensins: universal organizers of chromosomes with diverse functions. Genes Dev. 2012;26: 1659-1678.

171. Hoencamp C, Dudchenko O, Elbatsh AMO, Brahmachari S, Raaijmakers JA, van Schaik T, et al. 3D genomics across the tree of life reveals condensin II as a determinant of architecture type. Science. 2021;372: 984-989.

172. Tavares-Cadete F, Norouzi D, Dekker B, Liu Y, Dekker J. Multi-contact 3C reveals that the human genome during interphase is largely not entangled. Nat Struct Mol Biol. 2020;27: 1105-1114.

173. Goundaroulis D, Lieberman Aiden E, Stasiak A. Chromatin Is Frequently Unknotted at the Megabase Scale. Biophys J. 2020;118: 2268-2279.

174. Hildebrand EM, Polovnikov K, Dekker B, Liu Y, Lafontaine DL, Nicole Fox A, et al. Chromosome decompaction and cohesin direct Topoisomerase II activity to establish and maintain an unentangled interphase genome. bioRxiv. 2022. p. 2022.10.15.511838. doi: 10.1101/2022.10.15.511838

175. Portugal J, Rodríguez-Campos A. T7 RNA Polymerase Cannot Transcribe Through a Highly Knotted DNA Template. Nucleic Acids Res. 1996;24: 4890-4894.

176. Watrin E, Peters J-M. Cohesin and DNA damage repair. Exp Cell Res. 2006;312: 2687-2693.

177. Gelot C, Guirouilh-Barbat J, Le Guen T, Dardillac E, Chailleux C, Canitrot Y, et al. The Cohesin Complex Prevents the End Joining of Distant DNA Double-Strand Ends. Mol Cell. 2016;61: 15-26.

178. Dion V, Kalck V, Seeber A, Schleker T, Gasser SM. Cohesin and the nucleolus constrain the mobility of spontaneous repair foci. EMBO Rep. 2013;14: 984-991.

179. Piazza A, Bordelet H, Dumont A, Thierry A, Savocco J, Girard F, et al. Cohesin regulates homology search during recombinational DNA repair. Nat Cell Biol. 2021;23: 1176-1186.

180. Ström L, Lindroos HB, Shirahige K, Sjögren C. Postreplicative recruitment of cohesin to

double-strand breaks is required for DNA repair. Mol Cell. 2004;16: 1003-1015.

181. Unal E, Arbel-Eden A, Sattler U, Shroff R, Lichten M, Haber JE, et al. DNA damage response pathway uses histone modification to assemble a double-strand break-specific cohesin domain. Mol Cell. 2004;16: 991-1002.

182. Arnould C, Rocher V, Finoux A-L, Clouaire T, Li K, Zhou F, et al. Loop extrusion as a mechanism for formation of DNA damage repair foci. Nature. 2021;590: 660-665.

183. Collins PL, Purman C, Porter SI, Nganga V, Saini A, Hayer KE, et al. DNA double-strand breaks induce H2Ax phosphorylation domains in a contact-dependent manner. Nat Commun. 2020;11: 3158.

184. Gasperini M, Tome JM, Shendure J. Towards a comprehensive catalogue of validated and target-linked human enhancers. Nat Rev Genet. 2020;21: 292-310.

185. Karr JP, Ferrie JJ, Tjian R, Darzacq X. The transcription factor activity gradient (TAG) model: contemplating a contact-independent mechanism for enhancer-promoter communication. Genes Dev. 2022;36: 7-16.

186. Hsieh T-HS, Cattoglio C, Slobodyanyuk E, Hansen AS, Darzacq X, Tjian R. Enhancer-promoter interactions and transcription are largely maintained upon acute loss of CTCF, cohesin, WAPL or YY1. Nat Genet. 2022;54: 1919-1932.

187. Golov AK, Gavrilov AA, Kaplan N, Razin SV. A genome-wide nucleosome-resolution map of promoter-centered interactions in human cells corroborates the enhancer-promoter looping model. bioRxiv. 2023. p. 2023.02.12.528105. doi:10.1101/2023.02.12.528105

188. Kagey MH, Newman JJ, Bilodeau S, Zhan Y, Orlando DA, van Berkum NL, et al. Mediator and cohesin connect gene expression and chromatin architecture. Nature. 2010;467: 430-435.

189. Fudenberg G, Imakaev M, Lu C, Goloborodko A, Abdennur N, Mirny LA. Formation of Chromosomal Domains by Loop Extrusion. Cell Rep. 2016;15: 2038-2049.

190. Thiecke MJ, Wutz G, Muhar M, Tang W, Bevan S, Malysheva V, et al. Cohesin-Dependent and -Independent Mechanisms Mediate Chromosomal Contacts between Promoters and Enhancers. Cell Rep. 2020;32: 107929.

191. Aljahani A, Hua P, Karpinska MA, Quililan K, Davies JOJ, Oudelaar AM. Analysis of sub-kilobase chromatin topology reveals nano-scale regulatory interactions with variable dependence on cohesin and CTCF. Nat Commun. 2022;13: 1-13.

192. Song W, Sharan R, Ovcharenko I. The first enhancer in an enhancer chain safeguards subsequent enhancer-promoter contacts from a distance. Genome Biol. 2019;20: 197.

193. Chakraborty S, Kopitchinski N, Zuo Z, Eraso A, Awasthi P, Chari R, et al.

Enhancer-promoter interactions can bypass CTCF-mediated boundaries and contribute to phenotypic robustness. Nat Genet. 2023;55: 280-290.

194. Shlyueva D, Stampfel G, Stark A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions. Nat Rev Genet. 2014;15: 272-286.

195. Gasperini M, Hill AJ, McFaline-Figueroa JL, Martin B, Kim S, Zhang MD, et al. A Genome-wide Framework for Mapping Gene Regulation via Cellular Genetic Screens. Cell. 2019;176: 377-390.e19.

196. Northcott PA, Lee C, Zichner T, Stütz AM, Erkek S, Kawauchi D, et al. Enhancer hijacking activates GFI1 family oncogenes in medulloblastoma. Nature. 2014;511: 428-434.

197. Franke M, Ibrahim DM, Andrey G, Schwarzer W, Heinrich V, Schöpflin R, et al. Formation of new chromatin domains determines pathogenicity of genomic duplications. Nature. 2016;538: 265-269.

198. Lieberman-Aiden E, van Berkum NL, Williams L, Imakaev M, Ragoczy T, Telling A, et al. Comprehensive mapping of long-range interactions reveals folding principles of the human genome. Science. 2009;326: 289-293.

199. Schwarzer W, Abdennur N, Goloborodko A, Pekowska A, Fudenberg G, Loe-Mie Y, et al. Two independent modes of chromatin organization revealed by cohesin removal. Nature. 2017;551: 51-56.

200. Riggs AD. DNA methylation and late replication probably aid cell memory, and type I DNA reeling could aid chromosome folding and enhancer function. Philos Trans R Soc LondB Biol Sci. 1990;326: 285-297.

201. Alipour E, Marko JF. Self-organization of domain structures by DNA-loop-extruding enzymes. Nucleic Acids Res. 2012;40: 11202-11212.

202. Davidson IF, Barth R, Zaczek M, van der Torre J, Tang W, Nagasaka K, et al. CTCF is a DNA-tension-dependent barrier to cohesin-mediated loop extrusion. Nature. 2023;616: 822-827.

203. Barth R, Pradhan B, Kim E, Davidson IF, van der Torre J, Peters J-M, et al. Testing pseudotopological and nontopological models for SMC-driven DNA loop extrusion against roadblock-traversal experiments. Sci Rep. 2023;13: 1-11.

204. Bürmann F, Basfeld A, Vazquez Nunez R, Diebold-Durand M-L, Wilhelm L, Gruber S. Tuned SMC Arms Drive Chromosomal Loading of Prokaryotic Condensin. Mol Cell. 2017;65: 861-872.e9.

205. Marko JF, De Los Rios P, Barducci A, Gruber S. DNA-segment-capture model for loop

extrusion by structural maintenance of chromosome (SMC) protein complexes. Nucleic Acids Res. 2019;47: 6956-6972.

206. Terakawa T, Bisht S, Eeftens JM, Dekker C, Haering CH, Greene EC. The condensin complex is a mechanochemical motor that translocates along DNA. Science. 2017;358: 672-676.

207. Wendt KS, Yoshida K, Itoh T, Bando M, Koch B, Schirghuber E, et al. Cohesin mediates transcriptional insulation by CCCTC-binding factor. Nature. 2008;451: 796-801.

208. Gause M, Schaaf CA, Dorsett D. Cohesin and CTCF: cooperating to control chromosome conformation? Bioessays. 2008;30: 715-718.

209. Matityahu A, Onn I. Hit the brakes - a new perspective on the loop extrusion mechanism of cohesin and other SMC complexes. J Cell Sci. 2021;134. doi:10.1242/jcs.247577

210. Schmitt AD, Hu M, Ren B. Genome-wide mapping and analysis of chromosome architecture. Nat Rev Mol Cell Biol. 2016;17: 743-755.

211. Davies JOJ, Oudelaar AM, Higgs DR, Hughes JR. How best to identify chromosomal interactions: a comparison of approaches. Nat Methods. 2017;14: 125-134.

212. Jerkovic I, Cavalli G. Understanding 3D genome organization by multidisciplinary methods. Nat Rev Mol Cell Biol. 2021;22: 511-528.

213. Splinter E, Heath H, Kooren J, Palstra R-J, Klous P, Grosveld F, et al. CTCF mediates long-range chromatin looping and local histone modification in the beta-globin locus. Genes Dev. 2006;20: 2349-2354.

214. Hadjur S, Williams LM, Ryan NK, Cobb BS, Sexton T, Fraser P, et al. Cohesins form chromosomal cis-interactions at the developmentally regulated IFNG locus. Nature. 2009;460: 410-413.

215. Nativio R, Wendt KS, Ito Y, Huddleston JE, Uribe-Lewis S, Woodfine K, et al. Cohesin is required for higher-order chromatin conformation at the imprinted IGF2-H19 locus. PLoS Genet. 2009;5: e1000739.

216. Hou C, Dale R, Dean A. Cell type specificity of chromatin organization mediated by CTCF and cohesin. ProcNatl Acad Sci USA. 2010;107: 3651-3656.

217. de Wit E, Vos ESM, Holwerda SJB, Valdes-Quezada C, Verstegen MJAM, Teunissen H, et al. CTCF Binding Polarity Determines Chromatin Looping. Mol Cell. 2015;60: 676-684.

218. Yoon S, Chandra A, Vahedi G. Stripenn detects architectural stripes from chromatin conformation data using computer vision. Nat Commun. 2022;13: 1-14.

219. van Ruiten MS, van Gent D, Sedeño Cacciatore Á, Fauster A, Willems L, Hekkelman ML, et al. The cohesin acetylation cycle controls chromatin loop length through a PDS5A brake

mechanism. Nat Struct Mol Biol. 2022;29: 586-591.

220. Hsieh T-HS, Weiner A, Lajoie B, Dekker J, Friedman N, Rando OJ. Mapping Nucleosome Resolution Chromosome Folding in Yeast by Micro-C. Cell. 2015;162: 108-119.

221. Krietenstein N, Abraham S, Venev SV, Abdennur N, Gibcus J, Hsieh T-HS, et al. Ultrastructural Details of Mammalian Chromosome Architecture. Mol Cell. 2020;78: 554-565.e7.

222. Hua P, Badat M, Hanssen LLP, Hentges LD, Crump N, Downes DJ, et al. Defining genome architecture at base-pair resolution. Nature. 2021;595: 125-129.

223. Zhang S, Übelmesser N, Barbieri M, Papantonis A. Enhancer-promoter contact formation requires RNAPII and antagonizes loop extrusion. bioRxiv. 2022. p. 2022.07.04.498738. doi:10.1101/2022.07.04.498738

224. Bintu B, Mateo LJ, Su J-H, Sinnott-Armstrong NA, Parker M, Kinrot S, et al. Super-resolution chromatin tracing reveals domains and cooperative interactions in single cells. Science. 2018;362: eaau1783.

225. Brandäo HB, Gabriele M, Hansen AS. Tracking and interpreting long-range chromatin interactions with super-resolution live-cell imaging. Curr Opin Cell Biol. 2021;70: 18-26.

226. Takei Y, Zheng S, Yun J, Shah S, Pierson N, White J, et al. Single-cell nuclear architecture across cell types in the mouse brain. Science. 2021;374: 586-594.

227. Gabriele M, Brandäo HB, Grosse-Holz S, Jha A, Dailey GM, Cattoglio C, et al. Dynamics of CTCF- and cohesin-mediated chromatin looping revealed by live-cell imaging. Science. 2022;376: 496-501.

228. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970;227: 680-685.

229. Golov AK, Ulianov SV, Luzhin AV, Kalabusheva EP, Kantidze OL, Flyamer IM, et al. C-TALE, a new cost-effective method for targeted enrichment of Hi-C/3C-seq libraries. Methods. 2020;170: 48-60.

230. Langmead B, Salzberg SL. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nat Methods. 2012;9: 357-359.

231. Imakaev M, Fudenberg G, McCord RP, Naumova N, Goloborodko A, Lajoie BR, et al. Iterative correction of Hi-C data reveals hallmarks of chromosome organization. Nat Methods. 2012;9: 999-1003.

232. Kruse K, Hug CB, Hernández-Rodríguez B, Vaquerizas JM. TADtool: visual parameter identification for TAD-calling algorithms. Bioinformatics. 2016;32: 3190-3192.

233. Ay F, Bailey TL, Noble WS. Statistical confidence estimation for Hi-C data reveals

regulatory chromatin contacts. Genome Res. 2014;24: 999-1011.

234. Cairns J, Freire-Pritchett P, Wingett SW, Vârnai C, Dimond A, Plagnol V, et al. CHiCAGO: robust detection of DNA looping interactions in Capture Hi-C data. Genome Biol. 2016;17: 127.

235. Won H, de la Torre-Ubieta L, Stein JL, Parikshak NN, Huang J, Opland CK, et al. Chromosome conformation elucidates regulatory relationships in developing human brain. Nature. 2016;538: 523-527.

236. Thorvaldsdottir H, Robinson JT, Mesirov JP. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Brief Bioinform. 2013;14: 178-192.

237. Feng J, Liu T, Qin B, Zhang Y, Liu XS. Identifying ChIP-seq enrichment using MACS. NatProtoc. 2012;7: 1728-1740.

238. Ulianov SV, Velichko AK, Magnitov MD, Luzhin AV, Golov AK, Ovsyannikova N, et al. Suppression of liquid-liquid phase separation by 1,6-hexanediol partially compromises the 3D genome organization in living cells. Nucleic Acids Res. 2021;49: 10524-10541.

239. Amemiya HM, Kundaje A, Boyle AP. The ENCODE Blacklist: Identification of Problematic Regions of the Genome. Sci Rep. 2019;9: 1-5.

240. Hnisz D, Abraham BJ, Lee TI, Lau A, Saint-André V, Sigova AA, et al. Super-enhancers in the control of cell identity and disease. Cell. 2013;155: 934-947.

241. Heinz S, Benner C, Spann N, Bertolino E, Lin YC, Laslo P, et al. Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities. Mol Cell. 2010;38: 576-589.

242. Dostie J, Richmond TA, Arnaout RA, Selzer RR, Lee WL, Honan TA, et al. Chromosome Conformation Capture Carbon Copy (5C): a massively parallel solution for mapping interactions between genomic elements. Genome Res. 2006;16: 1299-1309.

243. Kim JH, Titus KR, Gong W, Beagan JA, Cao Z, Phillips-Cremins JE. 5C-ID: Increased resolution Chromosome-Conformation-Capture-Carbon-Copy with in situ 3C and double alternating primer design. Methods. 2018;142: 39-46.

244. Dryden NH, Broome LR, Dudbridge F, Johnson N, Orr N, Schoenfelder S, et al. Unbiased analysis of potential targets of breast cancer susceptibility loci by Capture Hi-C. Genome Res. 2014;24: 1854-1868.

245. Martin P, McGovern A, Orozco G, Duffus K, Yarwood A, Schoenfelder S, et al. Capture Hi-C reveals novel candidate genes and complex long-range interactions with related autoimmune risk loci. Nat Commun. 2015;6: 1-7.

246. Jäger R, Migliorini G, Henrion M, Kandaswamy R, Speedy HE, Heindl A, et al. Capture Hi-C identifies the chromatin interactome of colorectal cancer risk loci. Nat Commun. 2015;6: 6178.

247. Kolovos P, van de Werken HJ, Kepper N, Zuin J, Brouwer RW, Kockx CE, et al. Targeted Chromatin Capture (T2C): a novel high resolution high throughput method to detect genomic interactions and regulatory elements. Epigenetics Chromatin. 2014;7: 10.

248. Kolovos P, Brouwer RWW, Kockx CEM, Lesnussa M, Kepper N, Zuin J, et al. Investigation of the spatial structure and interactions of the genome at sub-kilobase-pair resolution using T2C. NatProtoc. 2018;13: 459-477.

249. Oudelaar AM, Beagrie RA, Gosden M, de Ornellas S, Georgiades E, Kerry J, et al. Dynamics of the 4D genome during in vivo lineage specification and differentiation. Nat Commun. 2020;11: 1-12.

250. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome. Nature. 2012;489: 57-74.

251. Kanke M, Tahara E, Huis in't Veld PJ, Nishiyama T. Cohesin acetylation and Wapl-Pds5 oppositely regulate translocation of cohesin along DNA. EMBO J. 2016;35: 2686-2698.

252. Liu Y, Dekker J. CTCF-CTCF loops and intra-TAD interactions show differential dependence on cohesin ring integrity. Nat Cell Biol. 2022;24: 1516-1527.

253. Murayama Y, Uhlmann F. DNA Entry into and Exit out of the Cohesin Ring by an Interlocking Gate Mechanism. Cell. 2015;163: 1628-1640.

254. Rowland BD, Roig MB, Nishino T, Kurze A, Uluocak P, Mishra A, et al. Building sister chromatid cohesion: smc3 acetylation counteracts an antiestablishment activity. Mol Cell. 2009;33: 763-774.

255. Sutani T, Kawaguchi T, Kanno R, Itoh T, Shirahige K. Budding yeast Wpl1(Rad61)-Pds5 complex counteracts sister chromatid cohesion-establishing reaction. Curr Biol. 2009;19: 492-497.

256. Kim E, Barth R, Dekker C. Looping the Genome with SMC Complexes. Annu Rev Biochem. 2023;92: 15-41.

257. Karaboja X, Ren Z, Brandäo HB, Paul P, Rudner DZ, Wang X. XerD unloads bacterial SMC complexes at the replication terminus. Mol Cell. 2021;81: 756-766.e8.

258. Bürmann F, Funke LFH, Chin JW, Löwe J. Cryo-EM structure of MukBEF reveals DNA loop entrapment at chromosomal unloading sites. Mol Cell. 2021;81: 4891-4906.e8.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Рисунок П1. Контактные карты региона интереса для отдельных биологических повторностей С-TALE экспериментов на контрольных пермеабилизированных клетках (0,15 М ^С1) и пермеабилизированных клетках, обработанных высокосолевым буфером (0,5 М ^С1).

Таблица П1. Статистика картирования и обработки данных секвенирования C-TALE библиотек.

Библиотека Число па ) прочтений

сырые картированные (обоими концами) пригодные для построения матриц (валидные) уникальные валидные (после удаления дубликатов)

СТАЬЕ_соп^о1_1 11,777,302 4,391,119 620,620 296,024

CTALE_contro1_2 18,660,528 8,617,441 1,519,622 674,087

CTALE_contro1_3 17,420,499 7,884,132 1,277,029 536,948

CTALE_sa1t_1 20,611,939 3,834,042 480,633 231,430

CTALE_sa1t_2 13,681,864 5,765,398 803,334 352,634

CTALE_sa1t_3 18,123,950 7,840,440 895,634 332,061

Таблица П2. Статистика картирования и обработки данных секвенирования обогащенных ChIP-seq библиотек.

Библиотека Число пар прочтений

сырые картированные (обоими концами) уникальные (после удаления дубликатов)

ChIP_1min_input_control_1 4,028,391 995,769 775,231

ChIP_1min_input_control_2 3,905,615 938,409 731,019

ChIP_1min_input_salt_1 5,274,484 1,269,879 946,612

ChIP_1min_input_salt_2 4,813,205 1,217,751 918,224

ChIP_1min_CTCF_control_1 4,044,108 803,081 606,644

ChIP_1min_CTCF_control_2 4,562,380 1,008,915 676,053

ChIP_1min_CTCF_salt_1 4,283,385 1,049,207 733,957

ChIP_1min_CTCF_salt_2 4,954,562 1,276,476 973,222

ChIP_1min_Smc3_control_1 3,965,801 772,953 557,853

ChIP_1min_Smc3_control_2 3,402,620 667,066 479,500

ChIP_1min_Smc3_salt_1 4,836,275 1,071,168 804,210

ChIP_1min_Smc3_salt_2 5,709,959 1,318,239 979,616

ChIP_30min_input_control_1 3,461,126 1,262,669 994,440

ChIP_30min_input_control_2 4,949,695 1,567,422 1,093,228

ChIP_30min_input_salt_1 4,280,107 1,622,571 1,244,469

ChIP_30min_input_salt_2 5,101,719 1,722,070 1,245,755

ChIP_30min_CTCF_control_1 5,015,998 1,217,423 774,118

ChIP_30min_CTCF_control_2 4,517,698 1,289,284 813,884

ChIP_30min_CTCF_salt_1 6,642,253 1,816,290 1,046,950

ChIP_30min_CTCF_salt_2 6,867,664 2,077,149 1,054,693

ChIP_30min_Smc3_control_1 4,130,380 1,140,399 704,872

ChIP_30min_Smc3_control_2 5,149,328 1,255,375 799,590

ChIP_30min_Smc3_salt_1 6,997,939 2,091,598 1,384,204

ChIP_30min_Smc3_salt_2 8,030,148 2,421,233 1,542,284

ChIP_30min_Rad21_control_1 3,923,253 1,125,194 729,827

ChIP_30min_Rad21_control_2 5,482,466 1,433,873 864,354

ChIP_30min_Rad21_salt_1 6,327,481 1,744,341 1,175,482

ChIP_30min_Rad21_salt_2 7,069,804 2,148,215 1,390,909

Таблица П3. Статистика картирования и обработки данных секвенирования полногеномных ChIP-seq

библиотек.

Библиотека Число па р прочтений

сырые картированные, уникальные (после удаления дубликатов)

ChIP_gw_CTCF_control_1 35,593,356 23,116,253

ChIP_gw_CTCF_control_2 36,539,701 25,365,074

ChIP_gw_CTCF_salt_1 46,099,981 27,863,652

ChIP_gw_CTCF_salt_2 39,250,070 24,335,816

ChIP_gw_Smc3_G1_control_1 31,730,413 20,927,795

ChIP_gw_Smc3_G1_control_2 32,870,959 21,663,055

ChIP gw Smc3 G1 1 38,016,583 25,451,338

ChIP gw Smc3 G1 salt 2 45,760,237 30,814,510

ChIP_gw_Smc3_G2_control_1 29,555,072 18,827,045

ChIP_gw_Smc3_G2_control_2 32,750,269 21,300,464

СЫР gw Smc3 G2 salt 1 40,068,252 26,703,739

СЫР gw Smc3 G2 2 44,837,609 30,482,798