Сохранение биологической полноценности мужских гамет Gallus gallus domesticus при криоконсервации и лиофилизации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Силюкова Юлия Леонидовна
Силюкова Юлия Леонидовна
кандидат наук
2024
- Специальность ВАК РФ00.00.00
- Количество страниц 149
Оглавление диссертации кандидат наук Силюкова Юлия Леонидовна
ВВЕДЕНИЕ
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1 Значение сохранения репродуктивных клеток птиц
1.2 Сохранение женских гамет
1.3 Сохранение эмбриональных клеток
1.4 Сохранение семени. Используемые технологи замораживания семени
1.5 Методы оценки качества семени
1.6 Проблемы криоконсервации семени сельскохозяйственных птиц
1.7 Криопротекторы. Криопротекторные свойства сахаридов
1.8 Криобанки и их вклад в сохранение генетического разнообразия
1.19 Лиофилизация репродуктивных клеток самцов
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Схема исследования
2.2 Содержание экспериментального поголовья. Получение семени петухов
2.3 Состав среды для криоконсервации семени петухов
2.4 Протокол замораживания и оттаивания семени петухов
2.5 Оценка подвижности нативного и заморожено/оттаянного семени петухов
2.6 Искусственное осеменение кур для оценки функциональности заморожено/оттаянных сперматозоидов петухов
2.7 Оценка продолжительности функциональной полноценности заморожено/оттаянных сперматозоидов петухов в половых путях курицы
2.8 Оценка жизнеспособности сперматозоидов петухов
2.9 Оценка сохранности хроматина сперматозоидов петухов
2.10 Количественный хроматографический анализ углеводов и
полиолов цитозоля сперматозоидов
Статистический анализ
Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Модификация метода оценки функциональной полноценности сперматозоидов in vitro
3.2. Разработка и оценка эффективности криопротекторной среды с содержанием невосстанавливающего дисахарида трегалоза в протоколе замораживания/оттаивания семени петухов
3.2.1. Разработка составов новых криозащитных разбавителей для семени петухов на основе комбинации моно- и дисахаридов и анализ их физико-химических параметров
3.2.2. Разработка и оценка эффективности криопротекторной среды с содержанием невосстанавливающего дисахарида трегалоза в протоколе замораживания/оттаивания семени петухов
3.3. Разработка и оценка эффективности криопротекторной среды с содержанием восстанавливающего дисахарида мальтоза в протоколе замораживания/оттаивания семени петухов
3.4. Верификация состава криопротекторной среды, содержащей восстанавливающий и невосстанавливающий дисахариды в комбинации с моносахаридом в протоколе замораживания/оттаивания семени петухов на связи с его фертильностью
3.4.1 Результаты хроматографического анализа содержания углеводов и полиолов в цитозоле заморожено/оттаянных сперматозоидов при использовании восстанавливающего или невосстанавливающего дисахаридов в составе криопротекторного разбавителя
3.5. Разработка методов поддержания биостаза сперматозоидов петухов в состоянии ангидробиоза
Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Выводы
Практические предложения
Перспективы дальнейшей разработки темы
Список сокращений и условных обозначений
Список использованной литературы
Приложение
Приложение
ВВЕДЕНИЕ
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Разработка методов криоконсервации спермы трутней для сохранения генофонда Apis mellifera L.2022 год, кандидат наук Гулов Алексей Николаевич
Усовершенствование биотехнологических методов получения и сохранения семени домашних коз и их гибридов с сибирским козерогом2012 год, кандидат биологических наук Воеводин, Владимир Александрович
Разработка и совершенствование способа криоконсервации спермы водоплавающих птиц1983 год, кандидат биологических наук Андреев, Валерий Иванович
Совершенствование методов замораживания и оценки спермы хряков1998 год, доктор сельскохозяйственных наук Шапиев, Исмаил Шапиевич
Результативность осеменения коров и телок при использовании усовершенствованных сред и сексированного семени2010 год, кандидат биологических наук Дунин, Михаил Иванович
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Сохранение биологической полноценности мужских гамет Gallus gallus domesticus при криоконсервации и лиофилизации»
Актуальность темы исследований
Проблема сохранения фертильности заморожено/оттаянных сперматозоидов петухов решается с момента разработки протоколов криоконсервации семени с начала сороковых годов прошлого века. Одним из ярчайших событий в области криобиологии XX века явился метод криоконсервации семени животных, разработанный советскими учеными Миловановым В.К., Соколовской И.И., Смирновым И.В. Государственный реестр открытий СССР №103. дата приоритета 1 июня 1947 г. Исследования по повышению качества заморожено/оттаянного семени сельскохозяйственных птиц актуальны по сегодняшний день. Медленное продвижение исследований в части повышения фертильного потенциала, заморожено/оттаянного семени петухов препятствует продвижению данной технологии в промышленном применении. В то же время современные репродуктивные технологии в скотоводстве позволяют получать большое количество потомства от одного самца, а современные транспортные коммуникации способны доставлять зародышевую плазму по всему миру быстро и эффективно.
За последние несколько десятилетий генетическое разнообразие сельскохозяйственных животных, включая птиц, значительно сократилось, из-за ограниченного числа селекционных программ, проводимых национальными и международными компаниями, которые оказывают сильное селекционное давление на несколько пород [Prentice J.R., 2011], а также из-за изменения рыночного спроса и интенсификации сельского хозяйства. Сельское хозяйство перешло от небольших производственных систем к крупным коммерческим системам, в результате чего цели отбора и производственная среда во всем мире стали схожи.
Проблема сохранения генетических ресурсов и биоразнообразия сельскохозяйственных животных (ГРЖ) является глобальной, и на её решение направлены усилия мирового сообщества. Координирующую роль в области сохранения ГРЖ выполняет FAO - Продовольственная и сельскохозяйственная организация при ООН и её профильные подразделения [FAO, 2015].
Программы сохранения для ГРЖ решают следующие задачи: экономические (поддержание сектора животноводства, способность реагировать на экологические изменения, меняющиеся потребности рынка, меняющиеся нормативные требования, изменения в доступности импорта-экспорта); социальные и культурные; сохранение биоразнообразия; поддержание ресурсов для исследовательских или образовательных целей, генетики, геномики и адаптации к климатическим и другим изменениям окружающей среды.
Метод сохранения генофонда ex situ in vitro через поддержание в криогенных условиях (криобанк) клеток или тканей, которые могут быть использованы для восстановления породы/популяции или снижения чрезмерного давления инбридинга в сверхмалых популяциях, признан необходимым дополнением к методу in vivo [FAO, 2015]. Именно сочетание методов ex situ in vivo и ex situ in vitro может сформировать основу эффективной стратегии сохранения генетического разнообразия животных.
Криоконсервация спермы является ключевой биотехнологической стратегией, используемой для сохранения и защиты генетических ресурсов животных, которые подвергаются все более серьезному сокращению их биоразнообразия. Однако вспомогательные репродуктивные технологии все еще не используются у птиц, в такой степени как у млекопитающих. Начиная с 2010 года было опубликовано значительное число разработок и новых стратегий, которые являются многообещающими для сохранения генетических ресурсов птиц. Особое внимание уделяется двум основным типам технологий хранения, которые используются для сохранения птичьей
спермы: краткосрочное хранение (несколько дней) и долгосрочное хранение — криоконсервация [Seigneurin F., 2010; Ciftci Y., 2018; Blesbois E., 2007; Long J.A., 2010; Thelie A., 2019]. Вопросы, которым уделяется особое внимание, включают разработку составов синтетических криопротекторных разбавителей для семени сельскохозяйственных птиц с использованием различных соединений, использование различных типов агентов-криопротекторов и результаты оценки фертильности семени in vitro. Результаты недавних исследований показывают, что есть возможности сохранения фертильности сперматозоидов при длительном их хранении в состоянии криобиоза. Очевидно, что состав криоразбавителя может быть важнейшим фактором для разработки эффективных методов криоконсервации спермы птиц [Partyka A., 2022].
Существующая стратегия криоконсервация репродуктивных клеток самцов стала отправной точкой для разработки инновационных методов сухого хранения сперматозоидов. Ангидробиоз, также, как и криобиоз — это состояние гипометаболизма, связанное с полной остановкой жизненных процессов, но формируется в ответ на экстремальное обезвоживание, за счет утраты протоплазмой большей части, содержащейся в ней воды. Использование метода лиофильной сушки сперматозоидов - это возможности более дешёвого способа сохранения и транспортировки (в том числе в космос) генетического материала диких и домашних животных. За последние несколько десятилетий предпринимались многочисленные попытки лиофилизировать сперму различных видов животных, в том числе лабораторных, диких и домашних, с разной эффективностью. Следует отметить, что исследования по лиофилизации мужских гамет были направлены на сохранение ядерного материала сперматозоидов в ангидробиозе. Большинство исследователей руководствуется догмой о том, что сперматозоиды не способны выживать в процессе лиофилизации, и относительно неповрежденной остается только ДНК клетки. Исследования по лиофилизации спермы проводились с целью последующего ее использования
в технологии интрацитоплазматической инъекции спермы (ИКСИ). Такой подход невозможен для класса птиц (Aves) ввиду полилецитального строения яйцеклетки. Создание протоколов лиофилизации семени птиц с учетом физиолого-биохимических показателей позволит сохранить необходимую функциональную полноценность сперматозоидов для последующего получения потомства при использовании технологии искусственного осеменения, что внесет дополнительный весомый практический вклад в сохранение редких и исчезающих пород кур и других видов птиц.
Таким образом, разработка и совершенствование биотехнологических методов сохранения репродуктивных клеток самцов в условиях in vitro в состоянии криобиоза и ангидробиоза является необходимым условием развития национальных программ сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц.
Степень разработанности темы
Многочисленные исследования были проведены для разработки и определения наиболее эффективного протокола замораживания спермы птиц для поддержания жизнеспособности, морфологической целостности, подвижности и способности к оплодотворению сперматозоидов. Однако, уровень оплодотворяющей способности деконсервированной спермы недостаточно высок, по данным разных авторов, в зависимости от методов замораживания показатели оплодотворенности яиц при использовании заморожено/оттаянного семени составляют от 2% до 85% [Partyka et al., 2011; Santiago-Moreno et al., 2019; Thananurak et al., 2019]. Также, существует проблема повторяемости результатов представленных протоколов замораживания семени петухов различными исследователями. В большинстве случаев при определении эффективности своих разработок исследователи ограничиваются оценкой подвижности сперматозоидов и наличием морфологических повреждений, такие тесты, с нашей точки зрения, не
являются достаточно информативными в прогнозе оплодотворяющей способности спермы.
Существуют различные принципиальные подходы в технологии замораживания семени: fast-протокол (в гранулах) и slow-протокол (в пайетах) [Thieu Ngoc Lan Phuong et al., 2014; Svoradová et al., 2017]. Технология замораживания семени петухов в гранулах, разработанная во ВНИИГРЖ [Tselutin et al., 1999] показывала более высокую эффективность данного протокола по сравнению с протоколом замораживания в пайетах до настоящего времени.
В настоящее время исследования по криоконсервации семени сельскохозяйственных птиц направлены на поиск высокоэффективных комбинаций криозащитных агентов эндо- и экзоцеллюлярного действия, ингибирующих рост ледяных кристаллов неколлигативным образом. Установлено, что включение таких комбинаций криопротекторов в среду для замораживания семени петухов обеспечивает более эффективную защиту клеточных структур за счет воздейст вия на различные внутриклеточные процессы; при включении непроникающих веществ в криопротекторный разбавитель возникает осмотическое давление, приводящее к более низкой температуре замерзания среды и меньшему образованию внеклеточного льда [Yong et al., 2020]. Доказано, что действие низкомолекулярных криопротекторов, в свою очередь, связано с меньшим внутриклеточным образованием кристаллов льда [Santiago-Moreno et al., 2019; Thananurak et al., 2019].
В доступной современной литературе отсутствуют данные о лиофилизации спермы птиц. Единственная попытка лиофилизации спермы птиц была предпринята в 1949 г. Polge et al. В опыте при разбавлении спермы перед ее замораживанием использовали раствор Рингера с содержанием 20% и 30% глицерина. Исследователям удалось сохранить 50% подвижности регидратированных сперматозоидов. Но не было представлено информации о протоколе сублимационной сушки и степени высушивания, не дана оценка
оплодотворяющей способности регидратированных сперматозоидов [Ро1§е е1 а1., 1949]. Дальнейшего развития этот проект не получил.
Цели и задачи исследования
Целью работы являлось разработка методов сохранения биологической полноценности мужских гамет Gallus gallus domesticus при криоконсервации и лиофилизации для использования в программах сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц.
Объектом исследования являлось семя петухов генофондных пород: род-айланд красный и русская белая, содержащихся в БРК «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
1. Модифицировать протокол оценки фертильности гамет самцов Gallus gallus domesticus in vitro на основе оценки состояния вителлиновой мембраны желтка куриных яиц в результате взаимодействия со сперматозоидами.
2. Разработать составы новых криозащитных разбавителей для семени петухов на основе комбинации моно- и дисахаридов.
3. Апробировать новые составы криозащитных разбавителей при использовании в протоколе замораживания/оттаивания сперматозоидов Gallus gallus domesticus и оценить качество оттаянного семени по комплексу морфофункциональных показателей.
4. Определить состав углеводов и полиолов цитозоля сперматозоидов петухов и исследовать изменения в его составе под влиянием протокола замораживания/оттаивания в зависимости от разработанного состава экспериментального криозащитного разбавителя; изучить связь этих изменений с показателями сохранности функциональной полноценности сперматозоидов.
5. Разработать поэтапный протокол лиофильной сушки гамет самцов Gallus gallus domesticus (пробоподготовка, замораживание, первичная сушка, регидратация), обеспечивающего сохранение их морфологической полноценности.
6. Апробировать разработанный экспериментальный протокол лиофильной сушки гамет самцов Gallus gallus domesticus и оценить результаты по показателям оценки сохранения функциональной и морфологической полноценности сперматозоидов.
Научная новизна работы
Впервые доказана проницаемость мембран репродуктивных клеток самцов для невосстанавливающего дисахарида трегалозы, и показан его дозозависимый эффект на показатели фертильности сперматозоидов петухов в протоколе замораживания/оттаивания.
Впервые предложен восстанавливающий дисахарид мальтоза в качестве непроникающего криопротектора в составе криозащитного разбавителя для семени петухов и доказана эффективность использования мальтозы в качестве компонента среды для замораживания сперматозоидов петухов —достигнута оплодотворенность яиц на уровне, максимально приближенном к показателям использования нативного семени — 92,6% и с сохранением значимого показателя оплодотворенности яиц — 62,5% через 7 дней от последнего осеменения.
Впервые разработан и апробирован эффективный протокол по лиофилизации и регидратации семени петухов с сохранением морфологической целостности и кинетической способности регидратитрованных сперматозоидов петухов.
Впервые получен полноценный эмбрион in vivo при использовании регидратированного семени при искусственном осеменении виргинной курицы.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость работы заключается в создании биологического обоснования для разработки методов поддержания биостаза репродуктивных клеток петухов in vitro. Определена роль углеводов, содержащихся в цитозоле сперматозоидов, в поддержании гомеостаза гамет самцов Gallus gallus domesticus при криобиозе и ангидробиозе.
Практическая значимость работы заключается в том, что разработан состав криозащитного разбавителя, содержащего комбинацию моносахарида и невосстанавливающего дисахарида (трегалоза) и состав криозащитного разбавителя, содержащего комбинацию моносахарида и восстанавливающего дисахарида (мальтоза), обеспечивающих высокую сохранность морфологических и кинетических показателей сперматозоидов в цикле замораживания/оттаивания и высокие показатели их оплодотворяющей способности на уровне 86,0% и 92,6% соответственно.
Результаты исследований по разработке технологии лиофилизации семени петухов найдут применение при сохранении генофонда промышленных линий и редких и исчезающих пород кур, а также в различных программах обмена репродуктивным материалом в научных и прикладных селекционных целях в области птицеводства.
Результаты исследований по разработке и апробации состава криозащитных разбавителей используются в создании криобанка репродуктивных клеток петухов генофодных пород в рамках Сетевой биоресурсной коллекции сельскохозяйственных животных, птиц, рыб и насекомых ФГБНУ ФИЦ им. Л.К. Эрнста [https: //www.brc-vij .ru/].
Методология и методы исследования
В исследованиях использовано поголовье кур и петухов БРК «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ. Методологической и методической основой исследований послужили труды
отечественных и зарубежных ученых в области криобиологии, цитологии, биохимии и биотехнологии. При выполнении экспериментов использовали цитологические методы оценки морфологической структуры сперматозоидов (светопольная и фазово-контрастная микроскопия Motic BA410E, Китай, 2019, негативный фазовый контраст, х200; цифровая система ввода изображения BASLER acA1300, флуоресцентная микроскопия Leica DM 4000b, Leica Micro systems GmbH., Германия), биофизические (спектрофлуориметрия), комплексные цитологические методы оценки сперматозоидов (прижизненное окрашивание, окрашивание фиксированных образцов, оценка проницаемости цитоплазматической мембраны сперматозоидов), хроматографический метод (оценка состава углеводов и полиолов цитозоля сперматозоидов), гравиметрические методы измерения (аналитические весы OHAUS EX125D, Китай). Работа выполнена с использованием современного оборудования: микроскопы с системами визуализации (Zeiss Axio Imager A1, Leica DM 4000b, Leica Micro systems GmbH. Германия), CASA (АргусСофт, Россия), лабораторная лиофильная установка (TFD-8501, ilShinbiobase Co. Ltd, Южная Корея), а также реагентов высокой степени очистки, произведенных компанией Sigma-Aldrich (США). Для определения функционального статуса сперматозоидов использовался микроскоп с фазовым контрастом (Motic BA410E). Полученные экспериментальные данные обработаны с использованием критерия достоверности Стьюдента, Манна-Уитни на персональном компьютере с помощью программ Microsoft Excel 2010 и Statistica 7.0 (США).
Основные положения работы, выносимые на защиту:
1. Модифицированный протокол оценки фертильности гамет самцов Gallus gallus domesticus на основе оценки состояния вителлиновой мембраны желтка куриных яиц в результате взаимодействия со сперматозоидами позволяет оценить уровень фертильности сперматозоидов in vitro.
2. Использование новых составов криозащитных разбавителей на основе комбинации моно- и дисахаридов в протоколе замораживания/оттаивания in vivo позволяет сохранять морфофункциональную полноценность гамет самцов Gallus gallus domesticus и получать показатели оплодотворенности яиц от заморожено/оттаянных сперматозоидов на уровне, приближенном к показателям при использовании нативного семени (82,0-92,6%).
3. Плазматические мембраны сперматозоидов петухов проницаемы для невосстанавливающего дисахарида трегалозы, входящей в состав криопротекторной среды.
4. Разработанный протокол поэтапной лиофильной сушки гамет самцов Gallus gallus domesticus (замораживание, первичная сушка, регидратация) позволяет сохранить их морфологическую целостность.
5. Использование разработанного экспериментального протокола лиофильной сушки сперматозоидов Gallus gallus domesticus позволяет сохранить их функциональную полноценность и получить от них потомство in vivo.
Степень достоверности и апробация результатов
Работа соответствует паспорту специальности 4.2.5. «Разведение, генетика, селекция и биотехнология животных», раздел 5. «Совершенствование существующих и разработка новых биотехнологических методов воспроизводства и селекции животных, включая клонирование и геномное редактирование» и раздел 6. «Разработка систем сохранения и рационального использования генофонда локальных и исчезающих пород сельскохозяйственных животных». Достоверность результатов диссертационной работы основывается на наличии в каждом эксперименте положительного и отрицательного контроля, а также проведением каждого независимого эксперимента в необходимом количестве повторностей (не менее двух). Полученные данные были обработаны методами статистического
анализа с определением степени достоверности с помощью современного программного обеспечения статистической обработки Microsoft Excel и Statistica 7.0 и подтверждены высоким порогом достоверности (p <0,01).
Результаты исследований были представлены на российских и международных конференциях:
2018 год.
European Society for Domestic Animal Reproduction (ESDAR) «Influence of osmolality of the media for dilution and cryopreservation of turkey toms' sperm on fertilization ability of thawed sperm» (постерный доклад);
2019 год.
European Society for Domestic Animal Reproduction (ESDAR) 2019 «The influence membranes damage and activity of roosters' sperm on the fertilization of eggs when using cured cryopreserved sperm» (постерный доклад); Международная научно-практическая конференция "Развитие агропромышленного комплекса на основе современных научных достижений и цифровых технологий", СПбГАУ, Санкт-Петербург - Пушкин, 24-26 января
2019 г. http://spbgau.ru/news/node/7701 «Влияние степени инбридинга на качество криоконсервированной спермы петухов генофондных пород»; Научно-практическая конференция с международным участием «Генетика, селекция и биотехнология животных: на пути к совершенству», приуроченная к 80-летию ВНИИГРЖ. Санкт-Петербург-Пушкин, 13-15 октября 2020 г. «Сравнение эффективности сред для криоконсервации семени петухов с различным составом» (устный доклад);
2020 год.
Международная научно-практическая конференция "Развитие агропромышленного комплекса на основе современных научных достижений и цифровых технологий", СПбГАУ, Санкт-Петербург - Пушкин, 23-25 января
2020 г. http://spbgau.ru/news/node/7701 «Методы оценки качества семени петухов редких и исчезающих пород кур, применяемые при создании криобанка» (устный доклад);
2021 год.
Международная научно-практическая конференция профессорско-преподавательского состава, посвященная году науки и технологий: «Приоритеты развития АПК в условиях цифровизации и структурных изменений национальной экономики». 26-28.05.2021г. СПбГАУ, г. Пушкин. «Влияние состава среды для криоконсервации семени петухов на уровень оплодотворенности яиц»;
Международная конференция Российского отделения ВНАП - НП «Научный центр по птицеводству»: «Мировое и российское птицеводство: состояние, динамика развития, инновационные перспективы», посвященная 90-летию ФГБНУ ФНЦ «ВНИТИП» РАН. 27 - 29.09.2021г. г. Сергиев Посад. «Определение взаимосвязи дисахаридов с мембранной оболочкой сперматозоидов петухов и ее влияния на криоустойчивость семени»; Международная научно-практическая конференция «Генетика, селекция, биотехнология: интеграция науки и практики в животноводстве». 1-3 ноября 2021 (ВНИИГРЖ) «Определение степени поврежденности хроматина сперматозоидов петухов при использовании различных методов их окрашивания»;
European Society for Domestic Animal Reproduction ESDAR Conference 2021 Online 11th to 16th October, 2021 «Development of an effective medium for cryopreservation of rooster semen using a disaccharide» (устный доклад).
Результаты исследований доложены и обсуждены на ежегодных заседаниях ученого совета Всероссийского научно-исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста» (ВНИИГРЖ) в 2018-2021 гг. по теме «Изучение биологических механизмов формирования продуктивных и адаптационных признаков домашних кур (Gallus gallus domesticus) с использованием физиолого-биохимических, цитологических, генетических и
вирусологических методов исследований с целью создания новых селекционных форм».
Публикации
По теме диссертации в период 2017-2023 гг. опубликовано 21 научная работа в журналах, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Российской Федерации и к ним приравненных, в том числе 5 статей в журналах, индексируемых Web of Science и Scopus (из них 3 — в журналах Q1), в том числе 8 статей в ведущих рецензируемых научных журналах из перечня ВАК при Министерстве образования и науки РФ.
Личный вклад автора
Автором выполнен основной объем теоретических разработок и экспериментальных исследований, изложенных в работе, включая выбор и обоснование научного направления, целей и задач исследования. Автор осуществлял прямое личное участие в постановке задач, проведении экспериментов, включая их разработку и дизайн, работу по формированию экспериментальных групп животных, пробоподготовку и оценку биоматериалов, теоретического анализа и обобщения полученных результатов, статистической обработки данных и представление результатов, апробации основных положений на международных конференциях, написании статей.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, список литературы, включающий 202 источника, в том числе 16 на русском языке и 186 на английском. Работа изложена на 149 страницах, содержит 24 рисунка, 12 таблиц и 2 приложения.
Место проведения и благодарности
Работа выполнена в лаборатории генетики, разведения и сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц Всероссийского научно -исследовательского института генетики и разведения сельскохозяйственных животных - филиала Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный исследовательский центр животноводства - ВИЖ имени академика Л. К. Эрнста» с использованием биоресурсной коллекции «Генетическая коллекция редких и исчезающих пород кур» ВНИИГРЖ. Работа проведена в рамках выполнения государственного задания № АААА-А18-118021590134-3, № АААА-А18-118021590132-9, № 121052600357-8, а также при поддержке Российского научного фонда Проект №19-16-00009.
Автор выражает глубокую признательность своему научному руководителю г.н.с., д.б.н. Станишевской О.И. за возможность проведения разработки представленной темы, внимание и поддержку в период проведения экспериментальной работы и подготовки настоящей диссертации. Автор искренне благодарен коллегам - сотрудникам лаборатории генетики, разведения и сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц ВНИИГРЖ - Плешанову Н.В., Курочкину А.А. и Федоровой Е.С. за плодотворное сотрудничество, интересные идеи и помощь в проведении экспериментов.
ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ
Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Значение сохранения репродуктивных клеток птиц
За последние несколько десятилетий в мировом птицеводстве наблюдается значительная потеря генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц и прогрессирующая эрозия многих местных генотипов из-за массового использования высокопроизводительных коммерческих кроссов [Fulton J.E., 2006], что фактически привело к критическому снижению численности популяции местных пород сельскохозяйственных птиц, подвергающихся давлению инбридинга и значительному снижению генетического разнообразия [Zanon A., 2001; Фисинин В.И. и др. 2012]. Сохранение биоразнообразия домашней птицы -ключевая задача каждой развитой страны. В Российской Федерации была принята научно-техническая программа развития генетических технологий на 2019 - 2027 годы [Постановление Правительства РФ от 22.04.19 №479], в том числе определяющая изучение и использование генетических ресурсов сельскохозяйственных животных. В настоящее время практически отсутствуют данные об обширных генетических ресурсах птиц, выращиваемых в Российской Федерации, и существует необходимость в конкретных программах сохранения генофондных пород домашней птицы. Практика локальных фермерских хозяйств заменяется централизованным коммерческим птицеводством, местные породы кур находятся под угрозой исчезновения. Потеря местных экотипов с их уникальным генетическим разнообразием ставит под угрозу будущие улучшения адаптации сельскохозяйственных животных не только к климату, но и устойчивых методам ведения сельского хозяйства. Сокращены возможности проведения селекционных программ в будущем, направленных на повышение
Похожие диссертационные работы по специальности «Другие cпециальности», 00.00.00 шифр ВАК
Искусственное осеменение и криоконсервация семени для сохранения и рационального использования генетических ресурсов лисиц и песцов2012 год, кандидат биологических наук Жвакина, Анна Рудольфовна
Совершенствование методов репродукции свиней с использованием криоконсервированной спермы2018 год, кандидат наук Ушакова Светлана Николаевна
Разработка методов улучшения репродукции зааненских коз2016 год, кандидат наук Приданова Ирина Евгеньевна
Криоконсервация эпидидимального семени млекопитающих с разным сезонным ритмом репродукции в целях сохранения биоразнообразия2006 год, кандидат биологических наук Шишова, Наталья Владимировна
Особенности криоконсервации спермы северных оленей (Rangifer tarandus)2020 год, кандидат наук Мусидрай Артем Алексеевич
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Силюкова Юлия Леонидовна, 2024 год
Список использованной литературы
1. А. с. 1130339 A1 СССР, МПК A61D 7/02. Среда для низкотемпературной консервации спермы птиц: / А. Д. Курбатов, Л. Е. Нарубина, Г. Б. Бубляева, Л.И. Москаленко, К.В. Целютин, Т.Г. Мавродина (СССР) № 3434811: заявл. 18.03.1982: опубл. 23.12.1984. - 4 с.
2. Пушкарь, Н.С. Актуальные проблемы криобиологии / Н.С. Пушкарь, А. М. Булоус. - Киев: Наукаю думка, 1981. - 608 с.
3. Белоус, А.М. Криоконсервация репродуктивных клеток / А.М. Белоус, В.И. Грищенко, Ю.С. Паращук // Киев: Наук. думка. - 1986 - 208 с.
4. Белоус, А.М. Молекулярные механизмы криоповреждения мембранных структур / А.М. Белоус, Т.П. Бондаренко, В.А. Бондаренко // Криобиология и кримедицина. - 1979. - № 5. - С. 3-13
5. Волкова, Л.А. Изменение биологических параметров семени петухов при генетической модификации сперматогенных клеток семенников in vivo / Л. А. Волкова, Б. С. Иолчиев, А. Н. Ветох [и др.] // Достижения науки и техники АПК. - 2019. - Т. 33. - № 10. - С. 54-57. doi: 10.24411/0235-24512019-11012.
6. Иолчиев, Б.С. Изменение биологических параметров семени сельскохозяйственной птицы при криоконсервации /Б. С. Иолчиев, В.А. Багиров, М.А. Жилинский [и др.] // Сельскохозяйственная биология. - 2018. -№ 6(53). - С. 1230-1237. doi: 10.15389/agrobiology.2018.6.1230rus.
7. Плешанов, Н. Оплодотворяющая способность криоконсервированной спермы петухов в зависимости от уровня холестерина в ней и его влияния на степень повреждения мембранный структур спермиев / Н. Плешанов, О. Станишевская, Ю. Силюкова // Генетика и разведение животных. - 2017b. - № 3. - С. 25-31.
8. Постановление Правительства РФ от 22.04.2019 г. N 479 Об утверждении Федеральной научно-технической программы развития генетических технологий на 2019 - 2027 годы
9. Прытков, Ю.А. Перспективы использования криоконсервации семени птицы / Ю.А. Прытков, А.Н. Ветох // Теоретические и прикладные проблемы агропромышленного комплекса. - 2017- № 3(32). -С. 50-53.
10. Пушкарь Н.С. Теория и практика криогенного и сублимированного консервирования / Н.С. Пушкарь, А.М. Белоус, Ц.Д. Цветков. - Киев: Наук. Думка. 1984. - 263 с.
11. Силюкова, Ю. Современное состояние проблемы сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственных птиц in vitro / Ю. Силюкова, О. Станишевская, Н. Дементьева // Вавиловский журнал генетики и селекции. -2020. № 24(2). - С. 176-184. doi: 10.18699/VJ20.611.
12. Эффективность использования комбинаций сахаридов в средах для криоконсервации спермы петухов / Ю.Л. Силюкова, О.И. Станишевская, Н.В. Плешанов, А.А. Курочкин // Сельскохозяйственная биология. - 2020. - т. 55. - № 6. - С. 1148-1158. doi: 10.15389/agrobiology.2020.6.1148rus.
13. Трегалоза: особенности химического строения, биологические функции и практическое значение / Е.П. Феофилова, А.И. Усов, И.С. Мысякина, Г.А. Кочкина // Микробиология. - 2014. - № 83(3). - С. 271-283. doi: 10.7868/S0026365614020074.
14. Криоконсервация мужских половых клеток как метод сохранения генетических ресурсов сельскохозяйственной птицы / В. И. Фисинин, В. А. Багиров, Н. А. Волкова [и др.] // Достижения науки и техники АПК. - 2012. -№ 8. - С. 65-68.
15. Целютин, К. В. Криоконсервация спермы птиц - как инструмент сохранения генофонда / К.В. Целютин // Генетика и разведение животных. -2015. - № 1. - С. 50-52.
16. Целютин, К. В Искусственное осеменение и криоконсервация спермы сельскохозяйственной птицы (петухи, индюки, гусаки, селезни) / К. В. Целютин, Б. Л. Тур. - СПб-Пушкин. - 2013. - с. 87.
17. Ahmed, M. Cholesterol loaded cyclodextrin improves sperm survival in tris-based extender with less egg yolk used in buffalo bulls semen / M. Ahmed,
A. Sattar, S. Iqbal [et al.] // The Thai Journal of Veterinary Medicine. - 2014. - V. 44. - P. 129-130.
18. Amini, M.R. The effects of different levels of catalase and superoxide dismutase in modified Beltsville extender on rooster post-thawed sperm quality / M.R. Amini, H. Kohram, A. Zare-Shahaneh[et al.] // Cryobiology. - 2015. - V. 70(3). - P. 226-232. doi: 10.1016/j.cryobiol.2015.03.001.
19. Andrabi, S.M.H. A review on reproductive biotechnologies for conservation of endangered mammalian species / S.M.H. Andrabi, W.M.C. Maxwell // Animal Reproduction Science. - 2007. - V. 99(3-4). - P. 223243. doi: 10.1016/j.anireprosci.2006.07.002.
20. Ansari, M.S. Effect of cryopreservation on lipid peroxidation, antioxidant potential, chromatin integrity, and mitochondrial activity of Indian Red Jungle fowl (Gallus gallus murghi) semen / M. S. Ansari, B. A. Rakha, S. Akhter, E. Blesbois, J. Santiago-Moreno // Biopreserv Biobank. - 2019. - V. 17. - P. 288295. doi: 10.1089/bio.2018.0111.
21. Anzalone, D.A. Freeze-dried spermatozoa: An alternative biobanking option for endangered species / D.A. Anzalone, L. Palazzese, D. Iuso, G. Martino, P. Loi // Animal Reproduction Science. - 2018. - V. 190. - P. 85-93. doi: 10.1016/j.anireprosci.2018.01.010.
22. Arav, A. High post-thaw survival of ram sperm after partial freeze-drying / A. Arav, A. Idda, S.M. Nieddu, Y. Natan, S. Ledda // Journal of Assisted Reproduction and Genetics. - 2018. - V. 35(7). - P.1149-1155. doi: 10.1007/s10815-018-1145-1.
23. Askarianzadeh, Z. Sperm quality characteristics and fertilization capacity after cryopreservation of rooster semen in extender exposed to a magnetic field / Z. Askarianzadeh, M. Sharafi, M.A.K. Torshizi // Animal Reproduction Science. - 2018. - V. 198. - P. 37-46. doi: 10.1016/j.anireprosci.2018.08.043.
24. Attfield, P.V. Trehalose accumulates in Saccharomyces cerevisiae during exposure to agents that induce heat shock response / P.V. Attfield // FEBS Lettes. - 1987. - V. 225(1-2). P. 259-263. doi:10.1016/0014-5793(87)81170-5.
25. Bakst, M. The inner perivitelline layer sperm hole assay: Use of filter paper rings for the isolation of the perivitelline layer overlying the germinal disc and new observations on its morphology / M. Bakst, J. Eastridge, I. Malecki // Journal of Applied Poultry Research. - 2014. - V. 23. - P. 121-128. doi: 10.3382/japr.2013-00873.
26. Bielanski, A. Biosafety in embryos and semen cryopreservation, storage, management and transport / A. Bielanski // Advances in Experimental Medicine and Biology. — V. 753. — P. 429-465.
27. Benesova, B. Possibilities for preserving genetic resources in birds / B. Benesova, P. Trefil // World's Poultry Science Journal. - 2016. - V. 72(3). - P. 628641. doi: 10.1017/ S0043933916000489.
28. Benesova, B. Possibilities for preserving genetic resources in birds / B. Benesova, P. Trefil // World's Poultry Science Journal. - 2016. - V. 72(3). - P. 628641. doi: 10.1017/S0043933916000489.
29. Bernal, B. Effect of supplementation of valine to chicken extender on sperm cryoresistance and post-thaw fertilization capacity / B. Bernal, N. Iglesias-Cabeza, U. Sánchez-Rivera, [et al.] // Poultry Science. - 2020. - V. 99(12). - P. 7133-7141. doi: 10.1016/j.psj.2020.09.060.
30. Bilton, R.J. Proceedings: Storage of cattle embryos / R.J. Bilton, N.W. Moore // Journal Reproduction Fertility. - 1976. - V. 46(2). - P. 537-538. doi: 10.1530/jrf.0.0460537.
31. Bilton, R.J. Successful transport of frozen cattle embryos from New Zealand to Australia / R.J. Bilton, N.W. // Journal Reproduction Fertility. - 1977. -V. 50(2). P. 363-364. doi: 10.1530/jrf.0.0500363.
32. Blackburn, H.D. The national animal germplasm program: challenges and opportunities for poultry genetic resources / H.D. Blackburn // Poultry Science. - 2006. - V. 85. - P. 210-215. doi: 10.1093/ps/85.2.210
33. Blesbois, E. Biological Features of the Avian Male Gamete and their Application to Biotechnology of Conservation / E. Blesbois // The Journal of Poultry Science. - 2012. - V. 49. - P. 141-149. doi: 10.2141/jpsa.011120.
34. Blesbois, E. Freezing Avian Semen / E. Blesbois // Avian Biology Research. - 2011. - V. 4(2). - P. 52-58. doi: 10.3184/175815511X13069413108523.
35. Blesbois, E. Semen Cryopreservation for ex situ Management of Genetic Diversity in Chicken: Creation of the French Avian Cryobank / E. Blesbois, F. Seigneurin, I. Grasseau [et al.] // Poultry Science. - 2007. - V. 86(3). - P. 555564. doi: 10.1093/ps/86.3.555
36. Blesbois, E., Predictors of success of semen cryopreservation in chickens / E. Blesbois, I. Grasseau, F. Seigneurin [et al.] // Theriogenology. - 2008. - V. 69(2). - P. 252-261. doi: 10.1016/j.theriogenology.2007.09.019.
37. Boettcher, P.J. The combined use of embryos and semen for cryogenic conservation of mammalian livestock genetic resources / P.J. Boettcher, F. A. Stella, F. Pizzi, G. Gandini // Genetics Selection Evolution. - 2005. - V. 37(6). - P. 657675. doi: 10.1186/1297-9686-37-7-657.
38. Boettcher, P.J. The combined use of embryos and semen for cryogenic conservation of mammalian livestock genetic resources / P.J. Boettcher, A. Stella, F. Pizzi, G. Gandini // Genetics Selection Evolution. - 2005. - V. 37(6). - P. 657675
39. Bogle, O.A. Identification of protein changes in human spermatozoa throughout the cryopreservation process / O.A. Bogle, K. Kumar, C. Attardo-Parrinello [et al.] // Andrology. - 2017. - V. 5. - P. 10-22. doi: 10,1111 / andr.12279.
40. Brobst, K.M. Modern Chromatographic Methods for the Analysis of Carbohydrate Mixtures / K.M. Brobst, H.D. Scobell // Starch - Stärke. - 1982. - V. 34(4). - P. 117-121. doi: 10.1002/star.19820340405.
41. By Thieu Ngoc Lan Phuong Comparison between Low/Programmable Freezing and Fast Freezing Protocols of Hungarian Guinea Fowl Semen / Thieu Ngoc Lan Phuong, E. Varadi, B. Vegi [et al.] // Athens Journal of Natural & Formal Science. - 2014. - V. 1(3). - P. 175-183. doi: 10.13140/2.1.2727.2322.
42. Burrows, W. H. method of obtaining spermatozoa from the domestic fowl / W.H. Burrows, J.P. Quinn // Poultry Science. - 1935. - V. 14(4). - P. 251253. doi: 10.3382/ps.0140251
43. Checura, C.M. Effect of macromolecules in solutions for vitrification of mature bovine oocytes / C.M. Checura, G.E. Seidel // Theriogenology. - 2007. -V. 67(5). - P. 919-930. doi: 10.1016/j.theriogenology.2006.09.044.
44. Chen T. Effect of Intracellular Trehalose on the Membrane Integrity of Dried Mammalian Cells / T. Chen, J.P. Acker, A. Eroglu [et al.]// Cryobiology. -2001. - V. 43(2). - P. 168-181. doi: 10.1006/cryo.2001.2360.
45. Cheng, C.Y. Differential protein expression in chicken spermatozoa before and after freezing-thawing treatment / P.R. Chen, C.J. Chen, S.H. Wang [et al.] / Animal Reproduction Science. - 2015. - V. 152. - P. 99-107. doi: 10,1016/j.anireprosci.2014.11.011.
46. Choi, Y.H. Production of live foals via intracytoplasmic injection of lyophilized sperm and sperm extract in the horse / Y.H. Choi, D.D. Varner, C.C. Love [et al.] // Reproduction. - 2011. - V. 142. - P. 529-538. doi:10.1530/REP-11-0145.
47. Ciftci, Y. Poultry semen cryopreservation technologies / Y. Ciftci, A. Aygun // World's Poultry Science Journal. - 2018. - V. 74(4). - P. 1-11. doi: 10.1017/s0043933918000673.
48. Comizzoli, P. Biobanking efforts and new advances in male fertility preservation for rare and endangered species / P. Comizzoli // Asian Journal of Andrology. - 2015. - V. 17. - P. 640-645. doi: 10.4103 / 1008-682X.153849.
49. Corradini, D. Microscopic mechanism of protein cryopreservation in an aqueous solution with trehalose / Corradini D., Strekalova, E., Stanley, H. // Science Rep/ - 2013. - V. 3. - P. 1218. https://doi.org/10.1038/srep01218
50. Demirci, B. The cryopreservation of ovarian tissue: uses and indications in veterinary medicine / B. Demirci, J. Lornage, B. Salle [et al.]// Theriogenology. - 2003. - V. 60(6). - P. 999-1010. doi: 10.1016/s0093-691x(03)00121-3.
51. Di Iorio, M. Finding an effective freezing protocol for turkey semen: benefits of ficoll as non-permeant cryoprotectant and 1:4 as dilution rate / M. Di Iorio, G. Rusco, R. Iampietro [et al.]// Animals. - 2020. - V. 10(3). - P. 421. doi: 10.3390/ani10030421.
52. Donoghue, A.M. Storage of poultry semen / A.M. Donoghue, G.J. Wishart // Animal Reproduction Science. - 2000. - V. 62 (1-3). - P. 213-232. doi: 10.1016/s0378-4320(00)00160-3.
53. Ehling, C. Cryopreservation of semen from genetic resource chicken lines / C. Ehling, U. Taylor, U. Baulain [et al.] // Agriculture and Forestry Research. - 2012. - V. 62. - P.151-158.
54. Elkina, Y.L. Recombinant human sperm-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: Structural basis for enhanced stability / Y.L. Elkina, M.L. Kuravsky, M.A. El'darov [et al.] // Biochimica et Biophysica Acta. - 2010. - V. 1804(12). - P. 2207-2212. doi: 10.1016/j.bbapap.2010.09.002.
55. Erkek, S. Molecular determinants of nucleosome retention at CpG-rich sequences in mouse spermatozoa / S. Erkek, M. Hisano, C.Y. Liang [et al.] // Nature Structural & Molecular Biology. - 2013. - V. 20(7). - P. 868-785. doi: 10.1038/nsmb.2599.
56. Etches, R.J. Reproduction in poultry / R.J. Etches // Wallingford. OXON - UK: CAB Internacional. - 1998.
57. Eubaid, H.J. Possible role for cholesterol in human seminal fluidin relations to other semen parameters & fertility / H.J. Eubaid, B.A. Al-Haidary, L.J. Tawfiq // Journal of Babylon University / Pure and Applied Sciences. - 2015. -V. 23(2). - P. 654-659.
58. FAO. 2012. FAOSTAT. Food and Agriculture Organization of the United Nations
59. FAO. 2007. Global Plan of Action for Animal Genetic Resources and the Interlaken Declaration. https://www.fao.org/3/a1404e/a1404e.pdf
60. FAO. 2015. The second report on the state of the world's animal genetic resources for food and agriculture, edited by B.D. Scherf & D. Pilling. FAO
Commission on Genetic Resources for Food and Agriculture Assessments. Rome http://www.fao.org/3/a-i4787e/index.html.
61. Fattah, A. L-Carnitine in rooster semen cryopreservation: flow cytometric, biochemical and motion findings for frozen-thawed sperm / A. Fattah, M. Sharafi, R. Masoudi [et al.] // Cryobiology. - 2017. - V. 74. - P. 148-153. doi: 10.1016/j.cryobiol.2016.10.009.
62. Feiden, S. Expression and compartmentalisation of the glycolytic enzymes GAPDH and pyruvate kinase in boar spermatogenesis / S. Feiden, U. Wolfrum, G. Wegener, G. Kamp // Reproduction, Fertility and Development. -2008. - V. 20(6). - P. 713-723. doi: 10.1071/rd08004
63. Feofilova, E. P. Trehalose: Chemical structure, biological functions, and practical application / E. P. Feofilova, I. S. Mysyakina, A. I. Usov, G. A. Kochkina // Microbiology. - 2014. - V. 83. - P. 184-194.
64. Foote, R. The history of artificial insemination; selected notes and notables / R. Foote // Journal Animal Science. - 2002. - V. 80. - P. 1-10.
65. Fulton, J.E. Avian genetic stock preservation: an industry perspective / J.E. Fulton // Poultry Science. - 2006. - V. 85. - P. 227-231.
66. Gadella, B.M. Capacitation induces cyclic adenosine 3',5'-monophosphate-dependent, but apoptosis-unrelated, exposure of aminophospholipids at the apical head plasma membrane of boar sperm cells / B.M. Gadella, R.A. Harrison // Biology of Reproduction. - 2002. - V. 67. - P. 340-350. doi: 10.1095/biolreprod67.1.340.
67. Ganatsios, V. Promotion of maltose fermentation at extremely low temperatures using a cryotolerant Saccharomyces cerevisiae strain immobilized on porous cellulosic material / V. Ganatsios, A.A. Koutinas, A. Bekatorou, M. Kanellaki, P. Nigam // Enzyme and microbial technology. - 2014. - V. 66. - P. 5659.
68. Gil, L. Current status of freeze-drying technology to preserve domestic animals sperm / L. Gil, M. Olaciregui, V. Luno [et al.] // Reproduction in Domestic Animals. - 2014. - V. 49(4). - P. 72-81. doi: 10.1111/rda.12396.
69. Gloria, A. Cryopreservation of turkey spermatozoa without permeant cryoprotectants / A. Gloria, T. Toscani, D. Robbe [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2019. - V. 211. - P. 106-218. doi: 10.1016/j.anireprosci.2019.106218.
70. Golshahi, K. Disaccharide supplementation of extenders is an effective means of improving the cryopreservation of semen in sturgeon / K. Golshahi, M.S. Aramli, R.M. Nazari, H. Habibi // Aquaculture. - 2018. - V. 486. - P. 261-265. doi: 10.1016/j.aquaculture.2017.12.045.
71. Hamburger, V. A series of normal stages in the development of the chick embryo / V. Hamburger, H.L. Hamilton // Journal of Morphology. - 1951. -V. 88. - P. 49-92. doi: 10.1002/jmor.1050880104.
72. Harris, C.C. The carbohydrate metabolism of chicken semen/ C.C. Harris, F.H. Wilcox // Poultry Science. - 1962. - V. 41(2). - P. 409-416. doi: 10.3382/ps.0410409.
73. Hayashi, T. Effects of resveratrol treatment on mitochondria and subsequent embryonic development of bovine blastocysts cryopreserved by slow freezing / T. Hayashi, K. Kansaku, T. Abe [et al.] // Animal Science. - 2019. - P. 90(7). - P. 849-856. doi: 10.1111/asj.13219.
74. Hezavehei, M. Membrane lipid replacement with nano-micelles in human sperm cryopreservation improves post-thaw function and acrosome protein integrity / M. Hezavehei, M. Sharafi, R. Fathi[et al.] // Reproductive BioMedicine Online. - 2021. - V.43(2). - P. 257-268. doi: 10.1016/j.rbmo.2021.05.005
75. Hirabayashi, M. Factors affecting production of transgenic rats by ICSI-mediated DNA transfer: effects of sonication and freeze-thawing of spermatozoa, rat strains for sperm and oocyte donors, and different constructs of exogenous DNA / M. Hirabayashi, M. Kato, A. Ishikawa [et al.] // Molecular Reproduction and Development. - 2005. - V. 70(4). - P. 422-8. doi: 10.1002/mrd.20223.
76. Hopshi, K. Pronuclear formation and cleavage of mammalian eggs after microsurgical injection of freeze-dried sperm nuclei / K. Hoshi, K. Yanagida, H. Katayose, H. Yazawa // Zigote. - 1994. - V. 2(3). - P. 237-242. doi: 10.1017/s0967199400002033
https://www.visitvalencia.com/sites/default/files/pdfs/valencia_convention_bureau/ candidaturas/epc2022valenciabid.pdf.
77. Huebinger, J. Direct measurement of water states in cryopreserved cells reveals tolerance toward ice crystallization / J. Huebinger, H.-M. Han, O. Hofnagel [et al.] // Biophysical Journal. - 2016. - V. 110. - P. 840-849. doi: 10.1016/j.bpj.2015.09.029.
78. Iaffaldano, N. Italian semen cryobank of autochthonous chicken and turkey breeds: a tool for preserving genetic biodiversity / N. Iaffaldano, M. Di Iorio, G. Rusco [et al.] // Italian Journal of Animal Science. - 2021. - V. 20(1). - P. 20222033. doi: 10.1080/1828051X.2021.1993094.
79. Ito, D. Effect of trehalose on the preservation of freeze-dried mice spermatozoa at room temperature / D. Ito, S. Wakayama, Y. Kamada[et al.] // Journal of Reproduction Development. - 2019. - V. 65(4). - V. 353-359. doi: 10.1262/jrd.2019-058.
80. Iuso, D. Genomic stability of lyophilized sheep somatic cells before and after nuclear transfer / D. Iuso, M. Czernik, F. Di Egidio [et al.] // PLoS One. -2013. - V. 8(1). - P. e51317. doi: 10.1371/journal.pone.0051317.
81. Jain, M.K. Long-Range Order in Biomembranes. / M.K. Jain, H.B. White // Advances in Lipid Research. - 1977. - V. 15. - P. 1-60. doi: 10.1016/B978-0-12-024915-2.50007-4.
82. Jain, N.K. Effect of trehalose on protein structure / N.K. Jain, I. Roy // Protein Science. - 2009. - V. - 18(1). - P. 24-36. doi: 10.1002/pro.3.
83. Jia, B.Y. Quality of vitrified porcine immature oocytes is improved by coculture with fresh oocytes during in vitro maturation / B.Y. Jia, D.C. Xiang, B. Zhang [et al.] // Molecular Reproduction and Development. - 2019. - V. 86(11). -P. 1615-1627. doi: 10.1002/mrd.23249.
84. Kaneko, T. New possibilities of sperm freeze-drying / T. Kaneko // Journal of fertilization: in vitro - IVF-Worldwide, Reproductive Medicine, Genetics & Stem Cell Biology. - 2012. - 2(5). doi: 10.4172/2165-7491.1000e119.
85. Kaneko, T. Sperm preservation by freeze-drying for the conservation of wild animals / T. Kaneko, H. Ito, H. Sakamoto [et al.] // PloS one. - 2014. - V. 9(11).
- P. e113381. doi: 10.1371/journal.pone.0113381.g001.
86. Kawase, Y. Possibility of long-term preservation of freeze-dried mouse spermatozoa / Y. Kawase, H. Araya, N. Kamada [et al.] // Biology of Reproduction.
- 2005. - V. 72(3). - P. 568-573. doi: 10.1095/biolreprod.104.035279.
87. Kazerooni, T. Evaluation of sperm's chromatin quality with acridine orange test, chromomycin A3 and aniline blue staining in couples with unexplained recurrent abortion / T. Kazerooni, N. Asadi, L. Jadid[et al.] // Journal of assisted reproduction and genetics - 2009. - V. 26. - P. 591-596.
88. Keskintepe, L. Bovine blastocyst development from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa / L. Keskintepe, G. Pacholczyk, A. Machnick [et al.] // Biology of Reproduction. - 2002. - V. 67(2). - P. 409-415. Doi: 10.1095/biolreprod67.2.409.
89. Khan, I.M. Impact of Cryopreservation on Spermatozoa Freeze-Thawed Traits and Relevance OMICS to Assess Sperm Cryo-Tolerance in Farm Animals / I.M. Khan, Z. Cao, H. Liu [et al.] // Frontiers in Veterenary Science. — 2021. — V. 25(8). — P. 609180. doi: 10.3389/fvets.2021.609180.
90. Kino, K. Production of chicken chimeras from injection of frozen-thawed blastodermal cells / K. Kino, B. Pain, S.P. Leibo [et al.] // Poultry Science. -1997. - V. 76(5). - P. 753-60. doi:10.1093/ps/76.5.753.
91. Kosova, A.A. Role of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) in DNA repair / A.A. Kosova, S.N. Khodyreva, O.I. Lavrik // Biochemistry (Moscow). - 2017. - V. 82(6). - P. 643-654.
92. Kowalczyk, A. Successful preservation of capercaillie (Tetrao urogallus L.) semen in liquid and frozen states / A. Kowalczyk, E.T. Lukaszewicz, Z. Rzonca // Theriogenology. - 2012. - V.77. - P.899-907. doi: 10.1016/j.theriogenology.2011.09.015.
93. Kwon, I.K. Activation, pronuclear formation, and development in vitro of pig oocytes following intracytoplasmic injection of freeze-dried spermatozoa /
I.K. Kwon, K.E. Park, K. Niwa // Biology of Reproduction. - 2004. - V. 71. - P. 1430-1436. doi: 10.1095/biolreprod.104.031260.
94. Lavoir van der, M. Germline transmission of genetically modified primordial germ cells / M. Lavoir van der, J. Diamond, P. Leighton [et al.] // Nature. - 2006. - V. 441(7094). - P. 766-769. doi: 10.1038/nature04831.
95. Ledda, S. Oocyte cryopreservation and ovarian tissue banking / S. Ledda, G. Leoni [et al.] // Theriogenology. - 2001. - V. 55(6). - P.1359-1371. doi: 10.1016/s0093-691x(01 )00487-3.
96. Leroy, G. Next-generation metrics for monitoring genetic erosion within populations of conservation concern / G. Leroy, E. L. Carroll, M. W. Bruford [et al.] // Evolutionary Applications. - 2017. - V. 11(7). - P.1066-1083. doi: 10.1111/eva.12564.
97. Leslie, S.B. Trehalose and sucrose protect both membranes and proteins in intact bacteria during drying / S.B. Leslie, E. Israeli, B. Lighthart [et al.] // Applied and Environmental Microbiology. - 1995. - V. 61. - P. 3592-3597. doi: 10.1128/AEM.61.10.3592-3597.1995.
98. Li, M.W. Assessment of three generations of mice derived by ICSI using freeze-dried sperm / M.W. Li, B.J. Willis, S.M. Griffey [et al.] // Zygote. -2009. - V. - 17(03). - P. 239-251. doi: 10.1017/s0967199409005292.
99. Liptoi, K. Investigation of possible genetic background of early embryonic mortality in poultry / K. Liptoi, A. Hidas // World's Poultry Science Journal. - 2006. - V. 62(02). - P. 326-337. doi: 10.1079/wps2005101.
100. Liptoi, K. Preliminary results of the application of gonadal tissue transfer in various chicken breeds in the poultry gene conservation / K. Liptoi, G. Horvath, J. Ga [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2013. - V. 141(1-2). - P. 86-89. doi: 10.1016/j.anireprosci.2013.06.016.
101. Liu, J. Novel needle-in-straw vitrification can effectively preserve the follicle morphology, viability, and vascularization of ovarian tissue in Japanese quail (Coturnix japonica) / J. Liu, K.M. Cheng, F.G. Silversides // Animal reproduction science. - 2009. - V. 134. - P. 197-202. doi: 10.1016/j.anireprosci.2012.08.002.
102. Liu, J.-L. Freeze-dried sperm fertilization leads to full-term development in rabbits / J.-L. Liu, H. Kusakabe, C.-C. Chang[et al.] // Biology of Reproduction. - 2004. - V. 70(6). - P. 1776-1781. doi: 10.1095/biolreprod.103.025957.
103. Liu, J.L. Freeze-dried sperm fertilization leads to full-term development in rabbits / J.L. Liu, H. Kusakabe, C.C. Chang [et al.] // Biology Reproduction. -
2004. - V. 70(6). - P. 1776-1781. doi: 10.1095/biolreprod.103.025957.
104. Liu, X.H. Trehalose loading through the mitochondrial permeability transition pore enhances desiccation tolerance in rat liver mitochondria / X.H. Liu, A. Aksan, M.A. Menze [et al.] // Biochimical et Biophysical Acta Biomembranes. -
2005. - V. 1717(1). - P. 21-26. doi: 10.1016/j.bbamem.2005.09.012.
105. Long, J.A. Avian semen cryopreservation: what are the biological challenges? / J.A. Long // Poultry Science. - 2006. - V. 85(2). - P. 232-236. doi: 10.1093/ps/85.2.232.
106. Long, J.A. Rooster semen cryopreservation: Effect of pedigree line and male age on post-thaw sperm function / J.A. Long, D.C. Bongalhardo, J. Pelaez [et al.] // Poultry Science. - 2010. - V. 89(5). - P. 966-973. doi:10.3382/ps.2009-00227.
107. Lotfi, S. Hyaluronic acid improves frozen-thawed sperm quality and fertility potential in rooster / S. Lotfi, M. Mehri, M. Sharafi, R. Masoudi // Animal Reproduction Science. - 2017. - V. 184. - P. 204-210. doi: 10.1016/j.anireprosci.2017.07.018.
108. Madeddu, M. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen / M. Madeddu, F. Mosca, A. Abdel Sayed [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2016. - V. 171. - P. 58-64. doi: org/10.1016/j.anireprosci.2016.05.014.
109. Mara, L. Cryobanking of farm animal gametes and embryos as a means of conserving livestock genetics / L. Mara, S. Casu, A. Carta, M. Dattena // Animal
Reproduction Science. - 2013. - V. 38(1-2). - P. 2538. doi: 10.1016/j.anireprosci.2013.02.006.
110. Mavrodina, T. Influence of sperm quality (cryopreserved and native) on the duration of spermatozoa storage in reproductive tracts of turkeys / T. Mavrodina, O. Stanishevskaya, S. Cherepanov, Y. Silyukova // Animal Reproduction Science. -2018a. - 194: e13. doi: org/10.1016/j.anireprosci.2018.04.034.
111. Mavrodina, T. Influence of osmolality of the media for dilution and cryopreservation of turkey toms' sperm on fertilization ability of thawed sperm / T. Mavrodina, O. Stanishevskaya, S. Cherepanov, Y. Silyukova // Reproduction in Domestic Animals. - 2018b. - V. 53(2). - P. 164.
112. Men, N.T. Effect of trehalose on DNA integrity of freeze-dried boar sperm, fertilization, and embryo development after intracytoplasmic sperm injection / N.T. Men, K. Kikuchi, M. Nakai [et al.] // Theriogenology. - 2013. -V. 80(9). -P. 1033-1044. doi: 10.1016/j.theriogenology.2013.08.001.
113. Menezes, G.F.O. Dimetilacetamida associada ou nao ao glicerol para criopreserva?ao de semen ovino. [Dimethylacetamide associated or not to glycerol for criopreservation of sheep semen] / G.F.O. Menezes, R.F. Bittencourt, A.L. Ribeiro Filho [et al.] // Ciencia Animal Brasileir. - 2018. - V. 19. - P. e-48026. doi: 10.1590/1809-6891v19e-48026.
114. Meryman, H.T. Survival of spermatozoa following drying / H.T. Meryman, E. Kafaic // Nature. - 1959. - V. 184. - P. 470 -471, doi: 10.1038/184470a0.
115. Morris, G.J. Freezing injury: The special case of the sperm cell / G. John Morris, E. Acton, B.J. Murray, F. Fonseca // Cryobiology. - 2012. - V. 64. -P. 71-80. doi: 10.1016/j.cryobiol.2011.12.002.
116. Mosca, F. Effect of dimethylacetamide and N-methylacetamide on the quality and fertility of frozen/thawed chicken semen / F. Mosca, L. Zaniboni, A. Abdel Sayed [et al.] // Poultry Science. - 2019. - V. 98(11). - P. 6071-6077. doi: 10.3382/ps/pez303.
117. Mosca, F. Combined effect of permeant and non-permeant cryoprotectants on the quality of frozen/thawed chicken sperm / F. Mosca, M. Madeddu, A.A. Sayed [et al.] // Cryobiology. -- 2016. - V. 73(3). - P. 343-347. doi: 10.1016/j.cryobiol.2016.10.001.
118. Mosca, F. Data on the positive synergic action of dimethylacetamide and trehalose on quality of cryopreserved chicken sperm / F. Mosca, M. Madeddu, A.A. Sayed [et al.] // Data in Brief. - 2019. - V. 9. - P. 1118-1121. doi: 10.1016/j.dib.2016.11.059.
119. Muir, W.M. Genome-wide assessment of worldwide chicken SNP genetic diversity indicates significant absence of rare alleles in commercial breeds / W.M. Muir, G.K. Wong, Y. Zhang [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences USA. - 2008. - V. 105(45). - P. 17312-17317. doi: 10.1073/pnas.0806569105.
120. Muneto, T. Full-term development of hamster embryos produced by injecting freeze-dried spermatozoa into oocytes / T. Muneto, T. Horiuchi // Journal of Mammalian Ova Research. - 2011. - V. 28. - P. 32-39. doi:10.1274/jmor.28.32.
121. Naing, S.W. Effect of sugars on characteristics of Boer goat semen after cryopreservation / S.W. Naing, H. Wahid, K. Mohd Azam [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2010. - V. 122(1-2). - P. 23-28. doi: 10.1016/j.anireprosci.2010.06.006.
122. Najafi, A. Lycopene-loaded nanoliposomes improve the performance of a modified Beltsville extender broiler breeder roosters / A. Najafi, R.A. Taheri, M. Mehdipour [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2018. - V. 195. - P. 168175. doi: 10.1016/j.anireprosci.2018.05.021.
123. Nakamura, Y. Poultry genetic resource conservation using primordial germ cells / Y. Nakamura // The Journal of Reproduction and Development. - 2016. - V. 62(5). - P. 431-437. doi: 10.1262/jrd.2016-052.
124. Nakamura, Y. Production of functional gametes from cryopreserved primordial germ cells of the Japanese Quail / Y. Nakamura, M. Tasai, K. Takeda [et
al.] // The Journal of Reproduction and Development. - 2013. - V. 59(6). - P:580-587. doi: 10.1262/jrd.2013-065.
125. Nandi, S. Cryopreservation of specialized chicken lines using cultured primordial germ cells / S. Nandi, J. Whyte, L. Taylor [et al.] // Poultry Science. -2016. - V. 95. - P. 1905-1911. doi: 10.3382/ps/pew133
126. Naing, S. W. Effect of sugars on characteristics of Boer goat semen after cryopreservation / S.W. Naing, H. Wahid, K. Mohd Azam [et al.] // Animal reproduction science. - 2010. - V. 122(1-2). - P. 23-28.
127. Okano, T. Characteristics of captive Japanese black bears (Ursus thibetanus japonicus) semen collected by electroejaculation with different voltages for stimulation and frozen-thawed under different conditions / T. Okano, T. Murase, C. Yayota [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2006. - V. 95(1-2). - P. 134143. doi: 10.1016/j.anireprosci.2005.10.002.
128. Olaciregui, M. In vitro developmental ability of ovine oocytes following intracytoplasmic injection with freeze-dried spermatozoa / M. Olaciregui, V. Luño, P. Domingo, N. González, L. Gil // Sciencific Reports. - 2017. - V. 7(1).
- P. 1096. doi: 10.1038/s41598-017-00583-0.
129. Orief, Y. Vitrification: will it replace the conventional gamete cryopreservation techniques? / Y. Orief, A. Schultze-Mosgau, K. Dafopoulos, and S. Al-Hasani // Middle East Fertility Society Journal. - 2005. - V. 10(3). - P. 171184.
130. Palazzese, L. DNA fragmentation in epididymal freeze-dried ram spermatozoa impairs embryo development / L. Palazzese, J. Gosálvez, D.A. Anzalone [et al.] // Journal of Reproduction and Development. - 2018. - V. 64(5).
- P. 393-400. doi: 10.1262/jrd.2018-033.
131. Partyka, A. Advances in storage of poultry semen / A. Partyka, W. Nizanski // Animal Reproduction Science. - 2022. - V. 3. - P.106921. doi: 10.1016/j.anireprosci.2021.106921.
132. Partyka, A. Flow cytometric assessment of fresh and frozen-thawed Canada goose (Branta canadensis) semen / A. Partyka, E. Lukaszewicz, W.
Nizanski // Theriogenology. - 2011. - V. - 76(5). - P. 843-850. doi: 10.1016/j.theriogenology.2011.04.016.
133. Partyka, A. Modification of membrane cholesterol and its impact on frozen-thawed chicken sperm characteristics / A. Partyka, D. Bonarska-Kujawa, M. Sporniak [et al.] // Zygote. - 2016. - V. 24(5). - P. 714-723. doi: 10.1017/S0967199416000022.
134. Patterson, D.L. Farm Animal Genetic Resource Conservation. Why and how? Canadian Farm Animal Genetic Resource Foundation / D.L. Patterson, F.G. Silversides // 2003. -http: //www.cfagrf.com/Farm_Animal_Gentetic_Resource_Conservation_Why_and _How.htm.
135. Pelaez, J. Characterizing the glycocalyx of poultry spermatozoa: II. In vitro storage of Turkey semen and mobility phenotype affects the carbohydrate component of sperm membrane glycoconjugates / J. Pelaez, J.A. Long // Journal of Andrology. - 2008. - V. 29(4). - P. 431-439. doi: 10.2164/jandrol.107.004259.
136. Pereira, R.M. Animal oocyte and embryo cryopreservation / R.M. Pereira, C.C. Marques // Cell and Tissue Banking. - 2008. - V. 9(4). - P. 267-277. doi: 10.1007/s10561-008-9075-2.
137. Pini, T. Sublethal sperm freezing damage: manifestations and solutions / T. Pini, T. Leahy, S. Graaf // Theriogenology. - 2018. - V. 118. - P. 172-181. doi: 10.1016/j .theriogenology.2018.06.006.
138. Pintado, B. Permeability of boar and bull spermatozoa to the nucleic acid stains propidium iodide or Hoechst 33258, or to eosin: Accuracy in the assessment of cell viability / B. Pintado, J. de la Fuente, E.R.S. Roldan // Journal of reproduction and fertility. - 2000. - V. 118(1). - P. 145-152. doi: 10.1530/reprod/118.1.145.
139. Pleshanov, N. Chicken sperm cryopreservation as a tool of maintenance genetic diversity in small scale populations / N. Pleshanov, S. Cherepanov, O. Stanishevskaya // World's Poultry Science Journal. Proceedings of the XVth European Poultry Conference. Dubrovnik. — 2018a. — P. 445.
140. Pleshanov, N. Evaluation of the cocks spermatozoa membranes' damaging during cryopreservation with use of Sperm VitalStain colorant / N. Pleshanov, O. Stanishevskaya // Reproduction in Domestic Animals. - 2018b. - V. 53(S2). - P. 183.
141. Pleshanov, N. Inheritance of cock's sperm cryostability / N. Pleshanov, O. Stanishevskaya, Y. Silyukova // Reproduction in Domestic Animals. - 2019. -V. 54(3). - P. 133.
142. Polge, C. Revival of spermatozoa after vitrification and dehydration at low temperatures / C. Polge, A.U. Smith, A.S. Parkes // Nature. - 1949. - V. 164. -P. 666. doi: 10.1038/164666a0.
143. Ponglowhapan, S. Influence of glucose and fructose in the extender during long-term storage of chilled canine semen / S. Ponglowhapan, B. Essen-Gustavsson, C.L. Forsberg // Theriogenology. - 2004. - V. 62(8). - P. 1498-1517. doi: 10.1016/j .theriogenology.2004.02.014.
144. Prentice, J.R. Cryopreservation of Mammalian oocyte for conservation of animal genetics / J.R. Prentice, M. Anzar // Veterinary Medicine International. -2011. - V11. - ID:146405. doi: 10.4061/2011/146405.
145. Qadeer, S. Efficiency of beetle (Dendroides canadensis) recombinant antifreeze protein for buffalo semen freezability and fertility / S. Qadeer, M. Khan, Q. Shahzad [et al.] // Theriogenology. - 2016. - V. 86(7). - P. 1662-1669. doi: 10.1016/j.theriogenology.2016.05.028.
146. Rabbani, G. Roles of osmolytes in protein folding and aggregation in cells and their biotechnological applications / G. Rabbani, I. Choi // International Journal of Biological Macromolecules. - 2018. - V. 109. P. 483-491. doi: 10.1016/j.ijbiomac.2017.12.100.
147. Rakha, B.A. Effect of dimethylformamide on sperm quality and fertilizing ability of Indian red jungle fowl (Gallus gallus murghi) / B.A. Rakha, M.S. Ansari, S. Akhter [et al.] // Theriogenology. - 2020. - V. 149. - P. 55-61. doi: 10.1016/j.theriogenology.2020.03.023.
148. Rakhaa, B. Cryopreservation of Indian red jungle fowl (Gallus gallusmurghi) semen / B. Rakhaa, M. Ansarib, S. Akhterc [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2016. - V.174. - P.45-55. doi: 10.1016/j.anireprosci.2016.09.004.
149. Rao, W. Nanoparticle-Mediated Intracellular Delivery Enables Cryopreservation of Human Adipose-Derived Stem Cells Using Trehalose as the Sole Cryoprotectant / W. Rao, H. Huang, H. Wang [et al.] // ACS applied materials & interfaces. - 2015. - V. 7(8). - P. 5017-5028. doi:10.1021/acsami.5b00655.
150. Robertson, L. Characterization and application of an avian in vitro spermatozoa-egg interaction assay using the inner perivitelline layer from laid chicken eggs / L. Robertson, H. Brown, H. Staines, G. Wishart // Journal of Reproduction and Fertility. - 1997. - V. 110(2). - P. 205-211.
151. Saint Jalme, M. Cryopreservation of semen from endangered pheasants: the first step towards a cryobank for endangered avian species / M. Saint Jalme, R. Lecoq, F. Seigneurin [et al.] // Theriogenology. - 2003. - V.59(3-4). - P. 875-88. doi: 10.1016/s0093-691x(02)01153-6.
152. Salehi, M. Cryopreservation of rooster semen: evidence for the epigenetic modifications of thawed sperm / M. Salehi, A.H. Mahdavi, M. Sharafi, A. Shahverdi // Theriogenology. - 2020. - V. 142. - P. 15-25. doi: 10.1016/j.theriogenology.2019.09.030.
153. Samans, B. Uniformity of nucleosome preservation pattern in Mammalian sperm and its connection to repetitive DNA elements / B. Samans, Y. Yang, S. Krebs [et al.] // Developmental Cell. - 2014. - V. 30(1). - P. 23-35. doi: 10.1016/j.devcel.2014.05.023.
154. Santiago-Moreno, J. Semen cryopreservation for the creation of a Spanish poultry breeds cryobank: optimization of freezing rate and equilibration time / J. Santiago-Moreno, C. Castaño, A. Toledano-Díaz [et al.] // Poultry Science. - 2011. - V. 90(9). - P. 2047-2053. doi: 10.3382/ps.2011-01355.
155. Santiago-Moreno, J. Seminal plasma amino acid profile in different breeds of chicken: Role of seminal plasma on sperm cryoresistance / J. Santiago-
Moreno, B. Bernal, S. Pérez-Cerezales [et al.] // PLoS One. - 2019. - V. 14(1). - P. e0209910. doi: 10.1371/journal.pone.0209910.
156. Sasaki, K. A method for cryopreserving semen from Yakido roosters using (N-methylacetamide as a cryoprotective agent / K. Sasaki, T. Tatsumi, M. Tsutsui [et al.] // Journal of Poultry Science. — 2010. — V. 47. — P. 297-301. doi: 10.2141/jpsa.009111.
157. Sciarretta, S. Trehalose-Induced Activation of Autophagy Improves Cardiac Remodeling After Myocardial Infarction / S. Sciarretta, D. Yee, N. Nagarajan [et al.] // Journal of the American College of Cardiology. - 2018. - V. 71(18). P. 1999-2010. doi:10.1016/j.jacc.2018.02.066.
158. Seigneurin, F. Update on semen cryopreservation metothods in poultry species. / F. Seigneurin, E. Blesbois // Proceedings of the XIIIth European Poultry Conference. — 2010. - P. 172.
159. Shahba, M. The effect of freeze-drying media and storage temperature on ultrastructure and DNA of freeze-dried buffalo bull spermatozoa / M.I. Shahba, R.I. El-Sheshtawy, A.-S.T. El-Azab [et al.] // Asian Pacific Journal of Reproduction.
- 2016. - V. 5(6). - P. 524-535. doi: 10.1016/j.apjr.2016.11.002.
160. Shahverdi, A. Fertility and flow cytometric evaluations of frozen-thawed rooster semen in cryopreservation medium containing low-density lipoprotein / A. Shahverdi, M. Sharafi, H. Gourabi [et al.] // Theriogenology. - 2015.
- V. 83(1). - P. 78-85. doi: 10.1016/j.theriogenology.2014.07.044.
161. Silversides, F.G. Cryoconservation of avian gonads in Canada / F.G. Silversides, M.C. Robertson, J. Liu // Poultry Science. - 2013. - V.92(10). - P.2613-2617. doi: 10.3382/ps.2013-03185
162. Silyukova, Y. The influence membranes damage andactivity of roosters' sperm on the fertilization of eggs when using cured cryopreserved sperm / Y. Silyukova, N. Pleshanov, O. Stanishevskaya // Reproduction in Domestic Animals. - 2019. - V. 54(3). - P. 101.
163. Smith, A.M.J. Mineral profiling of Ostrich (Struthio camelus) seminal plasma and its relationship with semen traits and collection day / A.M.J. Smith, M.
Bonato, K. Dzama [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2018. - V. 193. - P. 98-106. doi:10.1016/j.anireprosci.2018.04.004.
164. Somogui, M. Determination of blood sugar / M. Somogui // Journal of Biological Chemistry. - 1945. - V. 160. - P. 69.
165. Song, X.Y. Offspring Produced from Orthotopic Transplantation of Chicken Ovaries / X.Y. Song, F. Silversides // Poultry science. - 2007. - V. 86. - P. 107-111. doi: 10.1093/ps/86.1.107.
166. Stanishevskaya, O. Effects of saccharides supplementation in the extender of cryopreserved rooster (Gallus domesticus) semen on the fertility of frozen/thawed spermatozoa / O. Stanishevskaya, Y. Silyukova, N. Pleshanov [et al.] // Animals. - 2021. - V. 11. - P. 189. doi:10.3390/ani11010189.
167. Stanishevskaya, O. Cryotolerance of cocks' sperm depending on their breed and individual properties / O. Stanishevskaya, N. Pleshanov // Animal Reproduction Science. - 2018a. - V. 194. - P. e1-e27. doi: 10.1016/j.anireprosci.2018.04.031.
168. Stanishevskaya, O. Livability of chicken embryos, obtained after insemination by frozen/thawed sperm, depending on storage duration of incubation eggs / O. Stanishevskaya, N. Pleshanov // Reproduction in Domestic Animals. -2018c. - V. 53(2). - P. 199.
169. Starciuc, T. Trehalose or Sucrose: Which of the Two Should be Used for Stabilizing Proteins in the Solid State? A Dilemma Investigated by In Situ Micro-Raman and Dielectric Relaxation Spectroscopies During and After Freeze-Drying / T. Starciuc, B. Malfait, F. Danede [et al.] // Journal Pharmaceutical Science. — 2020. - V. 109(1). - P. 496-504. doi: 10.1016/j.xphs.2019.10.055.
170. Suzuki, K. Effect of hyaluronan on monospermic penetration of porcine oocytes fertilized in vitro / K. Suzuki, B. Eriksson, H. Shimizu [et al.] // International Journal Andrology. — 2000. — V. 23(1). — P. 13-21. doi: 10.1046/j.1365-2605.2000.t01-1-00198.x.
171. Svoradova, A. In vitro effect of various cryoprotectants on the semen quality of endangered Oravka chicken / A. Svoradova, L. Kuzelova, J. Vasicek [et al.] // Zygote. - 2017. - V. 26(01). - P. 33-39. doi: 10.1017/s0967199417000685.
172. Svoradova, A. The Assessment of Cryopreservation on the Quality of Endangered Oravka Rooster Spermatozoa Using Casa and Cytometry / A. Svoradova, L. Kuzelova, J. Vasicek [et al.] // Cryo Letters. - 2018. - V. 39(6). - P. 359-365.
173. Sztan, N. Successful chimera production in the Hungarian goose (Anser anser domestica) by intracardiac injection of blastodermal cells in 3-day-old embryos / N. Sztan, B. Lazar, N. Bodzsar [et al.] // Reproduction, Fertility and Development. - 2017. - V. 29(11). - P. 2206-2216. doi: 10.1071/RD16289.
174. Thananurak, P. Different concentrations of cysteamine, ergothioneine, and serine modulate quality and fertilizing ability of cryopreserved chicken sperm / P. Thananurak, N. Chuaychu-noo, A. Thélie [et al.] // Poultry Science. - 2020. - V. 99(2). - P. 1185-1198. doi: 10.1016/j.psj.2019.10.040.
175. Thananurak, P. Sucrose increases the quality and fertilizing ability of cryopreserved chicken sperms in contrast to raffinose / P. Thananurak, N. Chuaychu-Noo, A. Thélie [et al.] // Poultry Science. - 2019. - V. 98(9). - P. 41614171. doi: 10.3382/ps/pez196.
176. The second report on the state of the world's animal genetic resources for food and agriculture. Scherf B.D. and D. Pilling. FAO Commission on Genetic Resources for Food and Agriculture Assessments. Rome. 2015 http://www.fao.org/3/a-i4787e/index.html.
177. Thélie, A. Chicken semen cryopreservation and use for the restoration of rare genetic resources / A. Thélie, A. Bailliard, F. Seigneurin [et al.] // Poultry Science. - 2019. - V. 98(1). - P. 447-455. doi: 10.3382/ps/pey360.
178. Thélie, A. Chicken semen cryopreservation and use for the restoration of rare genetic resources / A. Thélie, A. Bailliard, F. Seigneurin [et al.] // Poultry Science. - 2018. - V. 98(1). - P. 447-455. doi: 10.3382/ps/pey360.
179. Tian, Y. Orodispersible films based on blends of trehalose and pullulan for protein delivery / Y. Tian, J.C. Visser, J.S. Klever [et al.] // European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. - 2018. - V. 133. - P. 104-111. doi: 10.1016/j.ejpb.2018.09.016.
180. Toldra, F. Advances in Food and Nutrition Research 1st edition / F. Toldra // 2020. - V. 100. doi:10.1002/14356007.h12_h01.pub2.
181. Tonus, C. Cryopreservation of chicken primordial germ cells by vitrification and slow freezing: A comparative study / C. Tonus, D. Connan, O. Waroux [et al.] // Theriogenology. - 2017. - V. 88. - P. 197-206. doi: org/10.1016/j .theriogenology.2016.09.022.
182. Tonus, C. Long term-cultured and cryopreserved primordial germ cells from various chicken breeds retain high proliferative potential and gonadal colonisation competency / C. Tonus, K. Cloquette, F. Ectors [et al.] // Reproduction Fertility Development. - 2016. - V. 28. - P. 628-639. doi: 10.1071/RD14194.
183. Tselutin, K. Comparison of cryoprotectants and methods of cryopreservation of fowl spermatozoa / K. Tselutin, F. Seigneurin, E. Blesbois // Poultry Science. — 1999. — v. 78. — P. 586-590.
184. Vajta, G. Improving cryopreservation systems / G. Vajta, M. Kuwayama // Theriogenology. - 2006. - V. 65(1). - P. 236-244.
185. Valcarce, D.G. Analysis of DNA damage after human sperm cryopreservation in genes crucial for fertilization and early embryo development / D.G. Valcarce, F. Carton-Garcia, M.F. Riesco [et al.] // Andrology. - 2013. - V. 1.
- P. 723-730. doi: 10,1111 / j.2047-2927.2013.00116.x.
186. Varadi, E. Methods for cryopreservation of guinea fowl sperm / E. Varadi, B. Vegi, K. Liptoi, J. Barna // PLoS ONE. - 2013. - V. 8(4). - P. e62759. doi: 10.1371/journal.pone.0062759.
187. Vilagran, I. Comparative analysis of boar seminal plasma proteome from different freezability ejaculates and identification of Fibronectin 1 as sperm freezability marker / I. Vilagran, M. Yeste, S. Sancho [et al.] // Andrology. - 2015.
- V. 3(2). - P. 345-356. doi: 10.1111/andr.12009.
188. Vilagran, I. Triosephosphate isomerase (TPI) and epididymal secretory glutathione peroxidase (GPX5) are markers for boar sperm quality / I. Vilagran, M. Castillo-Martín, N. Prieto-Martínez [et al.] // Animal Reproduction Science. - 2016. V. 65. - P. 22-30. doi: 10.1016/j.anireprosci.2015.12.001.
189. Wagner, H. Role of reactive oxygen species in male infertility: An updated review of literature. / H. Wagner, J.W. Cheng, E.Y. Ko // Arab Journal of Urology. - 2018. - V. 16(1). - P. 35-43. doi: 10.1016/j.aju.2017.11.001.
190. Wakayama, S. Healthy offspring from freeze-dried mouse spermatozoa held on the International Space Station for 9 months / S. Wakayama, Y. Kamada, K. Yamanaka [et al.] // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2017. - V. 14(23). - P. 5988-5993. doi:10.1073/pnas.1701425114.
191. Wakayama, T. Development of normal mice from oocytes injected with freeze-dried spermatozoa / T. Wakayama, R. Yanagimachi // Nature Biotechnology.
- 1998. - V. 16. - P. 639-641. doi: 10.1038/nbt0798-639.
192. Watson, P.F. The causes of reduced fertility with cryopreserved semen / P.F. Watson // Animal Reproduction Science.2000. - V.60-61. - P. 481-492. doi: 10.1016/s0378-4320(00)00099-3.
193. Wildt, D. Genome Resource Banking for Wildlife Research, Management, and Conservation / D. Wildt // ILAR Journal. - 2000. - V. 41(4). - P. 228-234. doi: org/10.1093/ilar.41.4.228.
194. Wishart, G.J. Regulation of the length of the fertile period in the domestic fowl by numbers of oviducal spermatozoa, as reflected by those trapped in laid eggs / G.L. Wishart // Journal of Reproduction and Fertility. - 1987. - V. 80. -P. 493-498.
195. Woelders, H. Animal genetic resources conservation in the Netherlands and Europe: poultry perspective / H. Woelders // Poultry Science. - 2006. - V. 85.
- P. 216-222.
196. Wu, Y. Microelements in seminal and serum plasma are associated with fresh semen quality in Yorkshire boars / Y. Wu, L. Guo, Z. Liu [et al.] //
Theriogenology. - 2019. - V. 132. - P. 88-94. doi: 10.1016/j.theriogenology.2019.04.002.
197. Xi, M.D. Disaccharide combinations and the expression of enolase3 and plasma membrane Ca2+ ATPase isoform in sturgeon sperm cryopreservation / M.D. Xi, P. Li, H. Du [et al.] // Reproduction in Domestic Animals. - 2018. - V. 53(2). - P. 472-483. doi: 10.1111/rda.13134.
198. Yeste, M. Sperm cryopreservation update: Cryodamage, markers, and factors affecting the sperm freezability in pigs / Yeste M. // Theriogenology. — 2016. - V. 85(1). — P. 47-64. doi: 10.1016/j.theriogenology.2015.09.047.
199. Yildiz, C. Influence of sugar supplementation of the extender on motility, viability and acrosomal integrity of dog spermatozoa during freezing / C. Yildiz, A. Kaya, M. Aksoy, T. Tekeli // Theriogenology. - 2000. - V. 54(4). - P. 579-585. doi: 10.1016/S0093-691X(00)00373-3.
200. Yong, K.W. Review of non-permeating cryoprotectants as supplements for vitrification of mammalian tissues / K.W. Yong, L. Laouar, J.A.W. Elliott, N.M. Jomha // Cryobiology. — 2020. — V. 96. — P. 1-11.
201. Zaniboni, L. Pellet cryopreservation for chicken semen: Effects of sperm working concentration, cryoprotectant concentration, and equilibration time during in vitro processing / L. Zaniboni, C. Cassinelli, M.G. Mangiagalli [et al.] // Theriogenology. - 2014. - V. 82(2). - P. 251-258.
202. Zanon, A. Identificazione e salvaguardia genetica delle razze avicole italiane / A. Zanon, A. Sabbioni // Annali della Facolta di Medicina Veterinaria di Parma. - 2001. - V. 21. - P. 117-134.
203. Zhang, W. The encapsulation and intracellular delivery of trehalose using a thermally responsive nanocapsule / W. Zhang, J. Rong, Q. Wang, X. He // Nanotechnology. - 2009. - V. 20(27). - P. 275101. doi: 10.1088/09574484/20/27/275101.
Приложение 1
Таблица 1. Показатели оплодотворенности яиц (%), полученные при искусственном осеменении кур заморожено/оттаянным семенем петухов при использовании различной концентрации трегалозы в составе разбавителя для криоконсервации.
Среда Кол-во яиц, шт. Оплодотворенность яиц, %
день опыта за период
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 15 20 25
ЛКС 130 79,0 100,0 100,0 90,0 86,0 91,0 100,0 100,0 100,0 86,0 20,0 0,0 79,0а
ТгеЫО 131 82,0 100,0 100,0 90,0 100,0 100,0 92,0 100,0 100,0 92,0 55,0 0,0 82,0
ТгеЪ20 139 86,0 100,0 92,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 50,0 15,0 86,0Ь
дни осеменений х х х х переживаемость сперматозоидов в половых путях кур
аЬ
р <0,05 (по критерию М
анна-Уитни)
семенем петухов при использовании различной концентрации мальтозы в составе разбавителя для криоконсервации.
Среда Кол Оплодотворенность яиц, %
-во день опыта за
яиц, период
шт. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 15 20 25
ЛКС 83 33,3 77,8 62,5 77,8 100,0 83,3 85,7 80,0 85,7 100,0 75,0 50,0 40,0 0,0 74,7а
Ма110 81 77,8 90,0 75,0 100,0 100,0 100,0 100,0 87,5 100,0 100,0 100,0 62,5 60,0 0,0 92,6ь
Ма120 75 100,0 100,0 20, 86,3с
57,1 100,0 75,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 60,0 0
дни переживаемость в
осеме х х х х половых путях
нений кур
аь, ьс и ас р <0,05 (по критерию Манна-Уитни)
Таблица 3. Средние показатели качества нативного семени, полученного от петухов (Gallus domesticus) породы русская белая (n =10, M±SEM)
№ петуха Объем эякулята, мл Общая подвижность, % Прогрессивная подвижность, %
1 0,54±0,03 82,88±2,50 70,07±3,52
2 0,36±0,06 79,43±5,30 64,37±6,21
3 0,05±0,05 83,93±1,27 70,12±1,82
4 0,45±0,07 83,93±1,05 70,90±0,54
5 0,60±0,04 78,25±5,39 63,26±5,78
6 0,46±0,02 81,35±2,41 67,49±2,10
7 0,73±0,07 81,15±1,17 66,22±1,23
8 0,54±0,04 82,85±2,44 67,34±1,02
9 0,36±0,04 81,45±1,48 63,95±2,49
10 0,39±0,07 82,83±2,18 67,19±3,01
ВС1 1/СП2 1'/СП2 2/СП2 2'/СП2 3/СП2 3'/СП2 4/СП2 4'/СП2
мг/мл Глицерол 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Фруктоза 2,23 2,24 0,48 0,45 0,03 0,04 0,00 0,00
Глюкоза 0,11 0,13 0,02 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,04 0,04 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Мальтоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Трегалоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
X мг/мл 2,38 2,41 0,51 0,48 0,04 0,04 0,00 0,00
% от Глицерол 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 1,0 7,8 9,5
Фруктоза 93,6 92,9 93,2 93,5 89,9 92,1 45,9 47,0
Глюкоза 93,6 92,9 93,2 93,5 89,9 92,1 45,9 47,0
Инозитол 4,6 5,4 4,4 4,1 5,0 3,3 23,7 22,3
Мальтоза 1,8 1,8 2,3 2,4 4,2 3,6 22,6 14,2
Трегалоза 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 1'/СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов
ВС2 1/СП2 1'/СП2 2/СП2 2'/СП2 3/СП2 3'/СП2 4/СП2 4'/СП2
мг/м л Глицерол 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Фруктоза 2,25 2,25 0,91 0,45 0,04 0,04 0,00 0,00
Глюкоза 0,11 0,13 0,04 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,04 0,04 0,02 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00
Мальтоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Трегалоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Хмг/мл 2,40 2,43 0,97 0,49 0,04 0,04 0,00 0,00
% от Глицерол 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0 1,0 7,7 9,3
Фруктоза 93,5 92,8 93,2 93,4 89,8 92,1 45,7 47,0
Глюкоза 93,5 92,8 93,2 93,4 89,8 92,1 45,7 47,0
Инозитол 4,7 5,4 4,5 4,1 5,0 3,3 23,7 22,4
Мальтоза 1,8 1,8 2,4 2,4 4,2 3,6 22,8 14,4
Трегалоза 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 17СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов
ВС1 5/СП2 5'/СП2 6/СП2 6'/СП2 7/СП2 77СП2 8/СП2 8'/СП2
мг/мл Глицерол 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Фруктоза 1,96 0,25 0,24 0,02 0,01 0,01 0,02 0,00
Глюкоза 0,17 0,01 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,04 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Мальтоза 1,62 0,17 0,20 0,02 0,02 0,00 0,00 0,00
Трегалоз а 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
X мг/мл 3,40 3,80 0,44 0,45 0,04 0,04 0,02 0,03
% от Глицерол 0,0 0,0 0,2 1,0 1,1 5,1 3,4 9,5
Фруктоза 51,7 56,1 52,1 42,1 38,6 50,3 72,6 47,0
Глюкоза 51,7 56,1 52,1 42,1 38,6 50,3 72,6 47,0
Инозитол 4,6 3,1 3,3 5,0 6,5 4,6 2,9 22,3
Мальтоза 1,0 1,5 1,3 3,3 5,3 8,7 8,2 14,2
Трегалоз а 42,8 39,3 43,1 48,5 48,4 28,3 9,9 0,0
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 1'/СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов
ВС2 5/СП2 5'/СП2 6/СП2 6'/СП2 7/СП2 77СП2 8/СП2 8'/СП2
мг/м л Глицерол 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Фруктоза 0,41 0,25 0,24 0,02 0,01 0,01 0,02 0,00
Глюкоза 0,02 0,01 0,02 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,01 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Мальтоза 0,28 0,17 0,19 0,02 0,02 0,00 0,00 0,00
Трегалоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Хмг/мл 3,81 0,72 0,44 0,46 0,04 0,04 0,02 0,03
% от Глицерол 0,0 0,0 0,2 1,0 1,1 5,1 3,4 9,3
Фруктоза 56,3 56,3 52,3 42,3 38,8 50,4 72,7 47,0
Глюкоза 56,3 56,3 52,3 42,3 38,8 50,4 72,7 47,0
Инозитол 3,2 3,2 3,4 5,1 6,6 4,7 2,9 22,4
Мальтоза 1,5 1,5 1,3 3,3 5,4 8,8 8,3 14,4
Трегалоза 39,1 39,1 42,8 48,3 48,2 28,1 9,8 0,0
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 1'/СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов
ВС1 9/СП2 9'/СП2 10/СП2 10'/СП2 11/СП2 П7СП2 12/СП2 127СП2
мг/м л Глицерол 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Фруктоза 2,33 0,24 0,22 0,02 0,02 0,00 0,00 0,00
Глюкоза 0,38 0,03 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,04 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Мальтоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Трегалоза 1,25 0,15 0,17 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00
X мг/мл 4,03 4,00 0,43 0,41 0,06 0,06 0,01 0,01
% от Глицерол 0,0 0,1 0,2 0,6 0,5 5,2 4,2 9,5
Фруктоза 58,2 56,8 52,7 42,5 43,3 33,2 34,3 47,0
Глюкоза 58,2 56,8 52,7 42,5 43,3 33,2 34,3 47,0
Инозитол 9,5 6,4 3,2 3,3 2,7 4,7 5,2 22,3
Мальтоза 1,0 1,3 2,3 2,9 2,2 6,1 7,0 14,2
Трегалоза 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 1'/СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов
ВС2 9/СП2 97СП2 10/СП2 10'/СП2 11/СП2 11'/СП2 12/СП2 127СП2
мг/мл Глицерол 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Фруктоза 2,35 0,24 0,22 0,02 0,02 0,00 0,00 0,00
Глюкоза 0,38 0,03 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,04 0,01 0,01 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Мальтоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Трегалоза 1,25 0,15 0,17 0,03 0,03 0,00 0,00 0,00
Хмг/мл 4,05 4,02 0,43 0,41 0,06 0,06 0,01 0,01
% от X Глицерол 0,0 0,1 0,2 0,6 0,5 5,1 4,1 9,3
Фруктоза 58,4 57,0 52,9 42,7 43,6 33,4 34,4 47,0
Глюкоза 58,4 57,0 52,9 42,7 43,6 33,4 34,4 47,0
Инозитол 9,5 6,4 3,2 3,3 2,7 4,7 5,3 22,4
Мальтоза 1,1 1,3 2,4 2,9 2,3 6,2 7,1 14,4
Трегалоза 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 1'/СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов.
ВС1 13/СП2 13'/СП2 14/СП2 147СП2 15/СП2 157СП2
%СБ Глицерол 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
Фруктоза 0,01 0,01 0,01 0,01 0,00 0,00
Глюкоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,03
Мальтоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Трегалоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01
X %СБ 0,040 0,040 0,042 0,036 0,036 0,054
% от X Глицерол 24,3 23,3 21,1 22,3 16,3 16,0
Фруктоза 13,8 19,7 21,1 16,3 5,3 3,4
Глюкоза 5,6 6,3 0,0 0,0 0,9 1,4
Инозитол 56,3 50,7 55,0 55,2 63,5 65,7
Мальтоза 0,0 0,0 2,7 6,1 0,0 0,0
Трегалоза 0,0 0,0 0,0 0,0 14,0 13,5
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 1'/СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов
ВС2 13/СП2 137СП2 14/СП2 14'/СП2 15/СП2 15'/СП2
% СБ Глицерол 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01
Фруктоза 0,01 0,01 0,01 0,01 0,00 0,00
Глюкоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Инозитол 0,02 0,02 0,02 0,02 0,03 0,04
Мальтоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Трегалоза 0,00 0,00 0,00 0,00 0,01 0,01
S %СБ 0,04 0,04 0,04 0,04 0,04 0,05
% от S Глицерол 23,9 22,9 20,7 21,9 16,0 15,7
Фруктоза 13,8 19,7 21,1 16,3 5,3 3,3
Глюкоза 5,6 6,4 0,0 0,0 0,9 1,4
Инозитол 56,8 51,1 55,5 55,7 64,0 66,2
Мальтоза 0,0 0,0 2,7 6,1 0,0 0,0
Трегалоза 0,0 0,0 0,0 0,0 13,8 13,3
Примечание: СП2 - номер опыта; ВС1 и ВС2 - это две повторности стандартной смеси углеводов, по которым проводили идентификацию и расчет; 1/СП2 и 1'/СП2 - две повторности варианта опыта; %СБ - % от сухой биомассы сперматозоидов.
семени петухов и выводов, основанных на эмпирических наблюдениях в ходе экспериментов.
№ п/п Пробоподготовка Кол -во исп ыта ний Технологический режим лиофилизации Результаты Выявленные недостатки технологического режима
1 п=20 5 Режим: - предварительное охлаждение конденсора до температуры не менее -40,0°С; - достижение режима рабочего вакуума после охлаждения конденсора ~ 20-30 мин. - размещение проб в сушильной камере при комнатной температуре; - продолжительность процесса сушки 2,5 часа Показатели подвижности семени после лиофилизации в зависимости от объема пробы 50 мкл - 1-2 шт. подвижных сперматозоидов 100 мкл - подвижность отсутствовала. «Закипание» жидкого азота в условиях вакуума с последующим переходом в кристаллическое состояние, очевидно, оказывает дополнительное повреждающее воздействие.
Выводы: необходимо удалить максимальное количество жидкости из образцов семени до криоконсервации, чтобы сократить время сушки и снизить количество внешних кристаллов способных вызвать необратимые повреждения мембран сперматозоидов; рассчитать время удаления азота из сушильной камеры и вычислить динамику температуры проб для оправления времени наступления критической температуры в пробе; провести контроль этапов сушки по временным периодам 30 мин, 1 час, 1 час 30 мин.
№ п/п Пробоподготовка Кол -во исп ыта ний Технологический режим лиофилизации Результаты Выявленные недостатки технологического режима
2 Образцы семени разводили 1: 1 разбавителями для криоконсервации семени петухов (ЛКС-1, ЛКС-Т10, ЛКС-ГК5). Образцы формировали объемом 1 мл. После этапа экспонирования при 5°С в течение 40 мин семя центрифугировали 3 тыс. об./мин в течение 10 мин. Осадочную жидкость удаляли, конечный объем центрифугата составлял от 200 мкл до 300 мкл. Затем вносили ДМА в концентрации 6% от конечного объема пробы, далее экспонировали в течение 1 мин при 5°С. 10 Режим: - предварительное охлаждение конденсора до температуры не менее -40,0°С; - достижение режима рабочего вакуума после охлаждения конденсора ~ 20-30 мин. - пенициллиновые флаконы с пробами размещали в термоизолирующем материале с хладагентами в виде дополнительных флаконов с жидким азотом; время сохранения отрицательной температуры в пробах увеличили до 40 мин. Показатели подвижности семени после лиофилизации контролировали в зависимости от времени процесса сушки: 30 мин - сохранность общей подвижности (ОП) сперматозоидов до 20%; 1 час - ОП сперматозоидов 12%-15% 1 час 30 мин - лимиты ОП сперматозоидов составляли от единичных до 10% При увеличении объема жидкого азота в дополнительных пенициллиновых флаконов время достижения выросло до 45 мин, что увеличивает время сушки. За 1 час сушки содержание влаги в пробе снизилось лишь на 33%.
№ п/п Пробоподготовка Кол -во исп ыта ний Технологический режим лиофилизации Результаты Выявленные недостатки технологического режима
После чего с помощью пипетки семя наносили тонким слоем на стенки пенициллиновых флаконов. п=20 Общая подвижность нативного семени составляла не менее 70%, заморожено/оттаянного семени не менее 30%.
Выводы: необходимо заменить использование жидкого азота в качестве хладагента на материал, способный длительное время поддерживать необходимые параметры низких температур, т.е. не выше -50°С в течение первого часа сушки; снизить время достижения рабочего вакуума должно составлять не более 15 мин; снизить стартовую температуру конденсора до -70°С; образцы, замороженные с использованием разбавителя ЛКС-Т10, показали лучшие результаты по сохранению ОП по сравнению с использование сред ЛКС-1 и ЛКС-ГК5; определить варианты разбавителя для регидратации семени.
3 Образцы семени разводили 1: 1 разбавителем для криоконсервации семени петухов ЛКС-Т10. Образцы формировали объемом 1 мл. 16 Режим: - предварительное охлаждение конденсора до температуры -70,0°С; - достижение режима рабочего вакуума после охлаждения конденсора ~15 мин. Показатели подвижности семени после лиофилизации и регидратации контролировали с помощью визуализирующей Не удалось получить высокой повторяемости результатов опытов по подвижности, а также по степени высушивания проб (визуально
№ п/п Пробоподготовка Кол -во исп ыта ний Технологический режим лиофилизации Результаты Выявленные недостатки технологического режима
После этапа экспонирования при 5°С в течение 40 мин семя центрифугировали 3 тыс. об./мин в течение 10 мин. Осадочную жидкость удаляли, конечный объем центрифугата составлял от 200 мкл до 300 мкл. Затем вносили ДМА в концентрации 6% от конечного объема пробы, далее экспонировали в течение 1 мин при 5°С. После чего с помощью пипетки семя наносили тонким слоем на стенки пенициллиновых флаконов. Общая подвижность нативного семени составляла не менее 70%, - пенициллиновые флаконы с пробами размещали в термоизолирующем материале с хладагентами в виде дополнительных флаконов, с металлическими, шариками, предварительно охлажденными в жидком азоте; стартовая температура пробы составляла не менее -150°С, после окончания цикла сушки 1,5 часа не менее -35°С. - регидратацию семени проводили разбавителями: ЛКС-ГК5 и ЛКС-1 системы (цифровая система ввода БАБЬЕЯ асА1300, микроскоп Мойс ВА410Е х200, х400). После 1,5 часа сушки общая подвижность сперматозоидов с использованием обоих разбавителей составляла от 0% до 19%. Достоверной разницы не выявлено. Поврежденность мембран оценивали с помощью окрашивания красителем эозин-нигрозин; количество неповрежденных клеток составляло не более 0,1% определялась неоднородность лиофилизата). Не удается получить равномерно распределенный слой семени на стенках стеклянных флаконов перед замораживанием, что влияет на равномерность высушивания пробы. Высокая степень поврежденности мембран сперматозоидов.
№ п/п Пробоподготовка Кол -во исп ыта ний Технологический режим лиофилизации Результаты Выявленные недостатки технологического режима
заморожено/оттаянного семени не менее 30%. п=20
Выводы: возможными причинами высокой поврежденности мембран могут являться: при процессе центрифугирования, возможно, снижается влияние компонента среды для замораживания - трегалозы, т.к. наибольшая ее часть удаляется после центрифугирования с надосадочной жидкостью, таким образом, необходимо внести раствор с концентрированной трегалозой в центрифугат; недостаточно пролонгирована низкая температура на пробе, т.е. необходимо разработать схему, позволяющую сохранять температуру на пробе в течение не менее 1,5 часов не выше -50°С; найти решение для получения равномерно распределенного слоя семени на поверхности стеклянного флакона; необходимо контролировать поврежденность хроматина сперматозоидов и оценить возможную взаимосвязь между поврежденностью хроматина и поврежденностью мембран сперматозоидов; провести оценку функциональной полноценности лиофилизированного семени после регидратации
4 Образцы семени разводили 1:1 разбавителем для криоконсервации семени петухов ЛКС-Т10. Образцы формировали объемом 1 мл. После этапа экспонирования при 5°С в течение 40 мин семя центрифугировали 3 тыс. 2 Режим: - предварительное охлаждение конденсора до температуры -70,0°С; - достижение режима рабочего вакуума после охлаждения конденсора ~13-14 мин. - пенициллиновые флаконы с пробами размещали в термоизолирующем материале с хладагентами в виде Показатели подвижности семени после лиофилизации и регидратации контролировали с помощью визуализирующей системы (цифровая система ввода БАБЬЕЯ асА1300, Необходимо большее количество образцов в опыте и экспериментов для подтверждения достигнутых результатов; разработать метод равномерного нанесения подготовленного семени на стеклянные
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.