Систематика и видовая диагностика мономорфных бабочек-голубянок подрода Agrodiaetus (Lepidoptera, Lycaenidae) на основе анализа молекулярных маркеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.05, кандидат наук Вишневская Мария Сергеевна

• Вишневская Мария Сергеевна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Вишневская Мария Сергеевна

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Цель и задачи

Научная новизна

Теоретическое и практическое значение работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту:

Апробация результатов

Публикации

Структура и объём работы

Благодарности

ГЛАВА 1 ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА МОНОМОРФНЫХ ВИДОВ ИЗ ЛИНИИ

POLYOMMA TUS ADMETUS

1.1 Изучение комплекса, основанное на анализе морфологии бабочек

1.2 Изучение комплекса, основанное на исследовании хромосом

1.3 Изучение комплекса, основанное на исследовании молекулярных маркеров

1.4 Видовая диагностика при помощи митохондриальных ДНК-баркодов

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

2.1 Материал

2.2 Методы

2.2.1 Анализ рисунка крыльев

2.2.2. Анализ кариотипов

2.2.3 Пробоподготовка

2.2.3.1 Выделение ДНК

2.2.3.2 Амплифиация ДНК

2.2.3.2.1 Полимеразная цепная реакция фрагмента гена COI

2.2.3.2.2 Полимеразная цепная реакция фрагмента ITS2

2.2.3.3 Визуализация результатов выделения ДНК и ПЦР

2.2.3.4 Очистка продуктов ПЦР

2.2.3 Филогенетический анализ

2.2.3.1 Особенности выравниваний

2.2.3.2 Методы и программы для построения филогенетических реконструкций

2.2.3.3 Медианная сеть гаплотипов

ГЛАВА 3 МОРФОЛОГИЯ ИМАГО: ТИПЫ КРЫЛОВОГО РИСУНКА

ГЛАВА 4 АНАЛИЗ ХРОМОСОМНОГО РАЗНООБРАЗИЯ

Хромосомные числа у представителей комплекса мономорфных видов

ГЛАВА 5 АНАЛИЗ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ

5.1 Анализ филогенетических реконструкций

5.2 Анализ медианной сети

ГЛАВА 6 ВИДОВАЯ ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ДЕЛИМИТАЦИЯ ВИДОВ И КЛАССИФИКАЦИЯ ГРУППЫ

6.1 Картирование морфологических данных на молекулярную филогению

6.2 Картирование хромосомных данных на молекулярную филогению

6.3. Видоспецифичность фрагмента COI

6.4 Анализ молекулярных и хромосомных кластеров, обнаруженных в симпатрии

6.5 Анализ молекулярных и хромосомных кластеров, обнаруженных в аллопатрии

6.6 Возможность альтернативных классификаций

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Дополнительные филогенетические деревья

ПРИЛОЖЕНИЕ 2 Описания видов, выявленных в ходе исследования

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Систематика и видовая диагностика мономорфных бабочек-голубянок подрода Agrodiaetus (Lepidoptera, Lycaenidae) на основе анализа молекулярных маркеров»

Актуальность темы исследования

Polyommatus Latreille, 1804 - род голубянок (Lepidoptera, Lycaenidae), входящий в трибу Polyommatini, Swainson, 1827 подсемейства Polyommatinae, Swainson, 1827. Этот род входит в так называемую секцию Polyommatus ("Polyommatus section"), выделенную Элиотом (Eliot, 1973) и включающую около 460 видов, имеющих сходную структуру строения гениталий самцов, в частности удлиненные вальвы. Состав и объём рода Polyommatus всегда были предметом дискуссий (Жданко, 1983, 2004; Hesselbarth et al., 1995). Начиная с работы Форстера (Forster, 1938), трибу Polyommatini стали дробить на большое число родов, и появилась тенденция рассматривать род Polyommatus в узком смысле, наряду с другими родами, образующими секцию Polyommatus (Eliot, 1973; Жданко, 1983, 2004). Позднее появились работы, в которых авторы стремились включить в один род максимальное число видов. Примером такого подхода могут служить работы Горбунова (Gorbunov, 2001) или Скотта (Scott, 1986), в которых все голарктические виды секции Polyommatus объединены в один большой род Plebejus. Другие авторы объединяли все голарктические виды в два рода -Plebejus и Polyommatus (Tshikolovets et al., 2012), в три рода Chilades, Plebejus и Polyommatus (Жданко, 1983; Hesselbarth et al., 1995), или в четыре рода - Chilades, Plebejus, Aricia и Polyommatus (Kudrna, 2002). В результате представителей таких групп, как Aricia, Eumedonia, Albulina, Agriades и Vacciniina, иногда включают в ранге подродов в род Plebejus (Hesselbarth et al, 1995), а иногда (Жданко, 1983) - в род Polyommatus (Talavera et al, 2013a). Оба подхода - как дробительский, предложенный Форстером (Forster, 1938), так и противоположный, имеющий тенденцию к чрезмерному объединению (Gorbunov, 2001; Scott, 1986), создают неинформативную классификацию, которая не отражает эволюционных взаимоотношений между членами секции (Talavera et al., 2013a).

Первой попыткой разобраться в систематике секции Polyommatus при помощи молекулярных маркеров была работа Вилы с соавторами (Vila et al., 2011), посвящённая таксонам Нового Света. Вторая крупная работа по всем родам секции была сделана Талаверой с соавторами (Talavera et al., 2013a). Основываясь на молекулярных данных, а именно на анализе девяти генов, эти авторы подтвердили представление о монофилии секции Polyommatus, предложили рассматривать секцию в качестве подтрибы Polyommatina, выделили в составе подтрибы 32 рода и установили, какие подроды входят в состав рода Polyommatus (Talavera et al., 2013a).

Представители рода Polyommatus встречаются только в Палеарктике. По последним данным (Talavera et al., 2013a) род Polyommatus включает в себя шесть подродов, если в качестве подродов принимать клады, возраст которых, определенный по молекулярным данным с использованием концепции молекулярных часов, не превышает четырёх миллионов лет: Agrodiaetus Hübner, 1822, Bryna Evans, 1912, Meleageria De Sagarra, 1925, Plebicula Higgins, 1969, Sublysandra Kogak, 1977 и Thersitesia Kogak et Seven, 1998.

Подрод Agrodiaetus является обособленной монофилетической линией в роде Polyommatus (Talavera et al., 2013a). До 2013 года (Talavera et al., 2013a) таксономическое положение Agrodiaetus оставалось под вопросом: одни авторы, основываясь на строении гениталий самцов, считали его самостоятельным родом (Жданко, 2004), другие - подродом рода Polyommatus (Eckweiler, Häuser, 1997).

Бабочки подрода Agrodiaetus имеют небольшие размеры, размах их крыльев находится в пределах от 1.9 до 3.6 см. Представители подрода могут быть диморфными (крылья самцов и самок окрашены в разный цвет: у самок - в коричневый, у самцов - в синий, реже в оранжевый или серый цвет) или мономорфными (крылья самцов и самок окрашены одинаково в коричневый цвет). Апоморфией подрода Agrodiaetus является наличие белой продольной полосы на исподе заднего крыла; однако у некоторых видов и популяций

наблюдается вторичная редукция этой полосы или полное её отсутствие (Eckweiler, Bozano, 2016).

Согласно оценкам, основанным на молекулярных данных, подрод Agrodiaetus возник примерно три миллиона лет назад (Kandul et al., 2004) и быстро распространился в Западной Палеарктике (Kandul et al., 2007). Подрод насчитывает 120 видов (Eckweiler, Bozano, 2016), для многих из которых характерны точечные ареалы (Vila et al., 2010).

Подрод Agrodiaetus всегда привлекал внимание исследователей-систематиков (например, de Lesse, 1960a,b; Häuser, Eckweiler, 1997; Oliver et al., 1999; Carbonell, 2000, 2001; Dantchenko, 2000; ten Hagen, Eckweiler, 2001; Schurian, ten Hagen, 2003; Skala, 2001; Lukhtanov, Dantchenko, 2002a,b; Kandul et al., 2002, 2004, 2007; Wiemers, 2003; Vila et al., 2010; Talavera et al., 2013a; Eckweiler, Bozano, 2016). Несмотря на это, подрод нельзя назвать хорошо изученным в таксономическом отношении. Это связано в первую очередь со сложностью идентификации видов в силу наличия морфологически сходных таксонов. Различия в окраске и рисунке крыла между большинством видов Agrodiaetus незначительны (Eckweiler, Bozano, 2016), а структура гениталий самцов за редким исключением (Coutsis, 1985, 1986) одинакова у большинства видов. В последней сводке по голубянкам Эквайлера и Бозано представлены изображения генитального аппарата представителей всех видов Agrodiaaetus (Eckweiler, Bozano, 2016). Несложно заметить, что различия в строении гениталий практически отсутствуют. Поэтому для решения проблем таксономии и идентификации видов Agrodiaetus широко используются хромосомные (de Lesse, 1960a,b; Lukhtanov, 1989) и молекулярные маркеры (Wiemers, 2003; Kandul et al., 2004, 2007; Lukhtanov et al., 2005; Stradomsky, Fomina, 2013), или их комбинация (Lukhtanov et al., 2006, 2014, 2015a; Lukhtanov, Tikhonov, 2015; Shapoval, Lukhtanov, 2015a,b; Vila et al., 2010). Использование хромосомных маркеров считается эффективным, так как кариотипы большинства видов специфичны, а в целом гаплоидное число хромосом в пределах подрода варьирует от n = 10 у P.

caeruleus (Staudinger, 1871) до n = 134 у P. shahrami (Skala, 2001) (Lukhtanov, Dantchenko, 2002a; Lukhtanov et al., 2005).

В начале двадцать первого века на основе молекулярных исследований было установлено, что подрод Agrodiaetus состоит из двенадцати клад (рис. 1) (Kandul et al., 2002, 2004, 2007; Wiemers, 2003).

Особый интерес для нашего исследования представляют две клады. Это клады, объединяющие виды, близкие к (1) P. admetus и к (2) P. dolus. Эти две клады близкородственны и на филогенетических реконструкциях образуют одну монофилетическую линию (Kandul, 2004) - линию Polyommatus admetus. Почти у всех видов этой линии самцы и самки окрашены одинаково в коричневый цвет (Lukhtanov et al., 2003). В состав клады P. admetus входят только мономорфные виды: P. admetus, P. demavendi, P. khorasanensis. P. nephohiptamenos, P. ripartii, P. pseudorjabovi, P. yeranyani. Клада P. dolus включает как мономорфные - P. alcestis, P. eriwanensis, P. interjectus, P. dantchenkoi, P. humedasae, P. aroaniensis, P. orphicus, P. timfristos, P. fabressei, P. violetae, P. valiabadi, P. rjabovianus, так и диморфные виды - P. dolus, P. fulgens, P. menalcas (у этих видов крылья самцов окрашены в голубовато-серый цвет). Мономорфные виды этих двух клад являются настоящим камнем преткновения в таксономии подрода Agrodiaetus (Przybylowicz et al., 2014), и именно эти виды, то есть все представители клады admetus и представители клады dolus (за исключением P. dolus, P. fulgens и P. menalcas) - являются объектом изучения данной диссертационной работы. Эти виды объединяются в так называемый комплекс мономорфных видов подрода Agrodiaetus. Большинство из них имеют локальные ареалы, сконцентрированные на Пиренейском полуострове, Балканском полуострове и западной Азии (в Передней и Средней Азии и на Кавказе).

Представители мономорфного комплекса в основном изучены с территории Западной Европы. Так, Вила с соавторами в 2010 году, используя молекулярные и хромосомные данные, детально исследовали европейские виды, распространённые к западу от 17-го меридиана (Vila et al., 2010). В 2013 году

вышла работа Динки с соавторами, посвящённая изучению популяций вида P. ripartii, обитающих на территории Западной Европы (Dinca et al., 2013). Гораздо менее изученными остаются представители подрода Agrodiaetus, обитающие восточнее: на территории Балканского полуострова и в Передней Азии. Особенно это касается исследований, основанных на применении молекулярных данных. В ГенБанке (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) можно найти небольшое число нуклеотидных последовательностей гена COI и некодирующего спейсера ITS2 для таксонов, обитающих на территории Балканского полуострова и в Передней Азии (Wiemers, 2003; Wiemers et al., 2007, 2009, 2010; Dinca et al., 2013; Lukhtanov et al., 2009, 2015a; Vila et al., 2010; Przybylowicz et al., 2014), однако, этих данных явно недостаточно для решения имеющихся в группе таксономических проблем.

Цель и задачи

Целью работы было исследование морфологического, хромосомного и молекулярного разнообразия в комплексе мономорфных видов голубянок P. admetus с территории Балканского полуострова, Ирана и Азербайджана, таксономическая интерпретация полученных данных, и изучение возможности видовой идентификации с помощью молекулярных маркеров и морфологических признаков.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) изучение разнообразия крылового рисунка и выявление тех его элементов, которые можно потенциально использовать для делимитации видов и популяций (наличие/редукция/отсутствие белой продольной полосы на исподе заднего крыла, наличие или отсутствие белого штриха на исподе переднего крыла);

2) анализ всех имеющихся в литературе данных по кариотипам; картирование хромосомных данных на молекулярные деревья и анализ того, насколько

кластеры особей, выделяемых по кариотипам, конгруэнтны кластерам, выделяемым на основании молекулярных маркеров;

3) получение и анализ молекулярных данных; выявление митохондриальных гаплогрупп и молекулярных эволюционных линий в пределах комплекса, анализ родственных связей между популяциями, хромосомными расами и видами, основанный на методах молекулярной филогенетики (построение деревьев и сетей);

4) тестирование гипотезы о том, что симпатрично обитающие хромосомные расы представляют собой репродуктивно изолированные биологические виды;

5) таксономическая интерпретация обнаруженного морфологического, хромосомного и молекулярного разнообразия в рамках концепций биологического и филогенетического вида;

6) оценка применимости коротких молекулярных меток (ДНК-баркодов) для видовой диагностики.

Научная новизна

Впервые детально изучена фауна комплекса мономорфных видов подрода Agrodiaetus Балканского полуострова, Ирана и Азербайджана.

Впервые получены нуклеотидные последовательности по участку гена COI и ядерному маркеру ITS2 для таксонов подрода Agrodiaetus, обитающих на территории Балканского полуострова, Азербайджана и Ирана. Эти данные позволили реконструировать филогенетические отношения в группе Polyommatus (Agrodiaetus) admetus.

При помощи анализа молекулярных и хромосомных маркеров обнаружены виды-двойники: P. pseudorjabovi/P. rjabovianus/P. valiabadi, P. timfristos/P.

aroaniensis и P. admetus/P. yeranyani. Уточнены ареалы некоторых таксонов и описаны два новых для науки вида и один подвид.

Впервые особенности окраски крыльев представлены в виде семи типов, соответствующих определённым таксонам Agrodiaetus.

Теоретическое и практическое значение работы

Результаты, полученные в ходе работы, вносят вклад в изучение систематики, филогении и распространения представителей комплекса Polyommatus admetus.

Полученные молекулярные данные значительно дополняют накопленные ранее данные по нуклеотидным последовательностям участка гена COI, а также ядерной некодирующей последовательности ITS2. Эти данные, а также данные по кариотипам, картированные на полученную филогению комплекса, могут быть впоследствии использованы для разработки системы всего семейства Lycaenidae.

Бабочки подрода Agrodiaetus являются модельным объектом в исследованиях по изучению механизмов видообразования и разработки методов изучения биологического разнообразия, поэтому изучение таксономии группы опосредованно может быть полезным для решения общих вопросов эволюционной биологии. Разработанные с использованием этой группы методы делимитации видов, в частности с использованием молекулярных и хромосомных маркеров, могут быть использованы как прототипы для анализа биологического разнообразия других групп животных и растений. Некоторые виды подрода Agrodiaetus имеют точечные ареалы, и потенциально являются объектами охраны.

Материалы работы могут быть также использованы в образовательных курсах на кафедрах энтомологии и зоологии беспозвоночных различных вузов.

Методология и методы исследования

В данной работе для осуществления поставленных задач были использованы современные методы молекулярной биологии, такие как выделение ДНК, ПЦР со специфичными праймерами по фрагменту гена COI и ядерной последовательности ITS2, очистка проб для секвенирования и секвенирование. Для филогенетического анализа полученных последовательностей были использованы специальные программы, позволяющие производить выравнивание последовательностей, построение филогенетических деревьев и сетей.

Положения, выносимые на защиту:

1. Морфологические признаки не могут быть использованы для диагностики таксонов (за исключением P. admetus, который характеризуется уникальным типом прикраевого рисунка крыльев), так как их состояния либо одинаковы у разных видов, либо не фиксированы внутри видов.

2. Несмотря на большое значение признаков кариотипа в систематике группы, хромосомные числа не являются универсальным признаком для дифференциации видов, так как одинаковые хромосомные числа могут либо возникать независимо в разных группах, либо быть симплезиоморфиями.

3. Несмотря на слабый уровень дифференциации, ДНК-баркоды пригодны для видовой диагностики в комплексе Polyommatus admetus.

4. Polyommatus valiabadi sensu auctorum является триплетом видов, состоящим из P. rjabovianus, P. pseudorjabovi и P. valiabadi sensu stricto. Эти виды в значительной степени различаются по хромосомным числам и ДНК-баркодам.

5. Polyommatus admetus sensu auctorum является сборным видом. Он представлен P. admetus sensu stricto, обитающим на территории Европы и Турции, и P. yeranyani, обитающим на территории Армении и Азербайджана.

Апробация результатов

Результаты работы были представлены на восьми конференциях, шесть из которых являются международными: 12-я Международная Пущинская школа-конференция молодых учёных «Биология - наука 21 века», Россия, Москва, Пущино, 10-14 ноября 2008; Международная конференция «Кариосистематика беспозвоночных животных KARYO V», Россия, Новосибирск, 16-20 августа 2010; 14 съезд Русского энтомологического общества, Россия, Санкт-Петербург, 27 августа - 1 сентября 2012; 7th International Conference on the Biology of Butterflies, Finland, Turku, 11-14 August 2014; Международная конференция «Хромосома 2015», Россия, Новосибирск, 24-28 августа 2015; VI международная конференция по кариосистематике беспозвоночных животных, Россия, Саратов, 27-30 августа 2016; Всероссийская конференция «50 лет ВОГиС: успехи и перспективы», Россия, Москва, 8-10 ноября 2016; 15 съезд Русского энтомологического общества, Россия, Новосибирск, 31 июля - 7 августа 2017; а также результаты были представлены в виде короткого сообщения на практическом курсе по R-программированию в Испании в 2015 году: "The use of Phylogenies in the Study of Macroevolution", Spain, Barcelona, 28 September-2 October 2015.

Публикации

1) Vishnevskaya, M.S. Karyosystematics and molecular taxonomy of the anomalous blue butterflies (Lepidoptera, Lycaenidae) from the Balkan Peninsula / M.S. Vishnevskaya, A.F. Saifitdinova, V.A. Lukhtanov // Comparative Cytogenetics. -2016. - Vol. 10 (5) - 85p.

2) Lukhtanov, V.A. Detecting cryptic species in sympatry and allopatry: analysis of hidden diversity in Polyommatus (Agrodiaetus) butterflies (Lepidoptera: Lycaenidae) / V.A. Lukhtanov, A.V. Dantchenko, M.S. Vishnevskaya, A.F. Saiftdinova // Biological Journal of the Linnean Society. - 2015. - Vol. 116. - Pp. 468-485.

3) Лухтанов, В. А. Булавоусые чешуекрылые (Ьер1ёор1ега, КИора1осега) Западного Алтая / В.А. Лухтанов, М.С. Вишневская, А.В. Волынкин, Р.В. Яковлев // Энтомологическое обозрение. - 2007. - 86 (2): 347-369.

4) Волынкин, А.В. Беспозвоночные животные Тигирекского заповедника (аннотированный список видов) / А.В. Волынкин, Л.А. Триликаускас, Р.Т-О. Багиров, М.В. Бурмистров, А.М. Бывальцев, С.В. Василенко, М.С. Вишневская, Ю.Н. Данилов, А.Ю. Дудко, Р.Ю. Дудко, А.А. Кнышов, О.В. Косова, Д.В. Костров, Т.М. Кругова, Р.О. Кузнецова, Д.В. Кузменкин, А.А. Легалов, А.Л. Львовский, А. А. Намятова, С.В. Недошивина, Ю.Е. Перунов, А.В. Рещиков, С.Ю. Синев, В.В. Соловаров, З.И. Тюмасева, И.А. Удалов, П.Я. Устюжанин, Р.В. Филимонов, С.Э. Чернышев, С.В. Чеснокова, С. Д. Шейкин, М.В. Щербаков, Л.В. Яныгина // БиотаТигирекского заповедника. Труды Тигирекского заповедника. -2011. - 4: 165-226.

Всего по материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе три статьи в изданиях из перечня ВАК.

Структура и объём работы

Работа состоит из введения, 6 глав, заключения, выводов, списка литературы и 2 приложений. Основная часть изложена на 129 страницах и содержит 7 таблиц и 24 рисунка. Список литературы включает 149 наименований, из которых 9 на русском языке и 140 на других языках. Приложения содержат дополнительные филогенетические реконструкции (6 иллюстраций) и видовые описания (с одной иллюстрацией).

Благодарности

В первую очередь хочу поблагодарить моего научного руководителя В. А. Лухтанова за руководство проектом, ценные советы в выполнении работы и за

предоставленный материал, а также А.Ф. Сайфитдинову за помощь в освоении методов молекулярной биологии и руководство проектом в лаборатории. Я благодарна сотрудникам РЦ «Хромас», на базе которого проводилось исследование: А.В. Радаеву, И.В. Егияну, М.Д. Воронцову, М.Р. Кулешину; сотрудникам лаборатории «Структуры и функции хромосом» - Е.Р. Гагинской, С.А. Галкиной, Е.И. Кошель, А.Г. Дёмину - за консультацию в вопросах филогенетики. Также хочу поблагодарить А.П. Галкина - заведующего лабораторией генетики животных СПбГУ, где проходили первые этапы экспериментальной части исследования, за предоставленную возможность работы, и А.Э. Машарского и РЦ «Развитие молекулярных и клеточных технологий» за подготовленные сиквенсы. Отдельно хотелось бы выразить благодарность А.В. Данченко, Н.А. Шаповалу, Е.А. Паженковой, С.В. Недошивиной и А.В. Барабанову - за собранный материал.

В заключении, я хочу поблагодарить моего мужа - Пантелеева Юрия Юрьевича - за моральную поддержку на протяжении всей подготовки диссертационного исследования.

Исследования проводились при финансовой поддержке со стороны Российского фонда фундаментальных исследований (гранты РФФИ 18-04-00263а и РФФИ 15-29-02533_офи_м) и Российского научного фонда (грант РНФ 14-1400541).

ГЛАВА 1 ИСТОРИЯ ИЗУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА МОНОМОРФНЫХ ВИДОВ ИЗ ЛИНИИ POL YOMMA TUS ADMETUS

1.1 Изучение комплекса, основанное на анализе морфологии бабочек

Изучение комплекса берёт своё начало с описания Эспером в 1783 году таксона P.[apilio] Pl.[ebejus] Rur.[alis] Argus admetus (Esper, 1783) (сейчас Polyommatus admetus). Вид был описан из Венгрии (граница с Сербией). Polyommatus admetus является единственным видом в комплексе, который не представляет проблем с определением, так как морфологически он хорошо отличается (на исподе заднего крыла нет белой полосы и есть субмаргинальный рисунок). Спустя почти пятьдесят лет из Испании был описан второй таксон из комплекса - Lycaena Ripartii (Freyer, 1830) (сейчас таксон известен, как Polyommatus ripartii). Итак, к 1901 году, к выходу в свет крупной обобщающей сводки по чешуекрылым палеарктической фауны (Staudinger, Rebel, 1901), из комплекса мономорфных видов было известно всего два таксона, которые в сводке рассматривались как вариации одного вида Lycaena admetus (Staudinger, Rebel, 1901).

Ситуация с выявлением таксономического разнообразия в пределах мономорфного комплекса почти не менялась на протяжении первой половины 20-го века. В 1938 году выходит работа Форстера (Forster, 1938), которая становится большим шагом на пути изучения палеарктических голубянок трибы Polyommatini. В этой работе внутри рода Polyommatus Форстер выделяет подрод Agrodiaetus, насчитывающий 25 видов. Однако комплекс мономорфных таксонов представлен всё теми же двумя таксонами, хотя их ранг повышен до видового: P. admetus и P. ripertii (синоним P. ripartii).

Выявление таксономической структуры в комплексе происходило медленно, так как классическая, основанная на морфологии, систематика не позволяла выявлять новые таксоны, реально существующие в природе. В 1960

году на основании анализа признаков крылового рисунка из Азербайджана был описан ещё один вид комплекса - P. rjabovi (Forster, 1960). Он, как и P. admetus, имеет явные морфологические отличия: крупные глазки на исподе передних и задних крыльев и широкую белую обводку этих глазков.

Помимо трех видов, названных выше, в подроде Agrodiaetus на основании изучения морфологии бабочек были описаны еще четыре вида, которых долгое время относили к мономорфному комплексу: P. mithridates (Staudinger, 1878), P. ardschira (Brandt, 1938), P. peilei (Bethune-Baker, 1921) и P. luna (Eckweiler, 2002) (de Lesse, 1960b; Hesselbarth et al., 1995; Bálint, Johnson, 1997; Bálint, 1999; Eckweiler, Hauser, 1997). Сейчас эти виды не рассматриваются в рамках линии P. admetus, так как по молекулярным данным они относятся к другим кладам (Kandul et al., 2007). Кроме того, два вида из четырёх не являются мономорфными: P. mithridates, ранее отмеченный де Лессом, как стоящий особняком (de Lesse, 1960a), имеет голубые чешуйки на крыльях. Самцы P. peilei имеют оранжевую окраску крыльев (в то время как коричневая окраска характерна только для самок). По последним данным этот вид имеет гибридное происхождение - родительскими видами для него являются P. morgani и P. karindus (Lukhtanov et al., 2015).

1.2 Изучение комплекса, основанное на исследовании хромосом

Настоящий прорыв в изучении систематики комплекса и всего подрода Agrodiaetus осуществил французский исследователь де Лесс. В середине двадцатого столетия он выпустил ряд работ, посвящённых анализу кариотипов у голубянок подрода Agrodiaetus. В отличие от «классической» музейной работы Форстера, подход де Лесса основывался на предположении о репродуктивной изоляции таксонов и популяций с разным числом хромосом (de Lesse, 1960a).

Де Лесс разделяет Agrodiaetus на две группы (de Lesse, 1960a), основываясь на окраске крыльев и наличии или отсутствии андрокониального поля на крыльях

у самцов. Таким образом, он выделяет группу P. damon (без андрокониальных полей и с всегда голубой окраской самцов), и группу P. ripartii (у самцов есть андрокониальные поля). По поводу окраски крыльев в группе P. ripartii де Лесс отмечает, что самцы могут быть окрашены в коричневый цвет, как самки, или иметь голубоватую или беловатую окраску крыльев.

Де Лесс открыл существенные различия в хромосомных числах в разных изученных выборках, собранных в Европе и Передней Азии, и на основании этого выделил несколько новых видов, различающихся по кариотипам. Так, он обнаружил, что P. admetus состоит из двух разных видов - P. admetus s.str. (n=78-80) и P. fabressei (n=90), а вид P. ripartii - из четырёх - P. ripartii s.str. (n=90), P. demavendi (n=70), P. alcestis (n=20-21) и P. interjectus (n=29-32) (хромосомные числа в скобках в этом абзаце указаны в соответствии с работами де Лесса (de Lesse, 1960a,b)).

Работы де Лесса оказали сильное влияние на дальнейшее развитие исследований группы. Начали появляться работы других авторов, которые также описывали новые виды на основе анализа кариотипов (Brown, Coutsis, 1978; Lukhtanov, 1989; Coutsis, De Prins, 2007; Vila et al., 2010; Vishnevskaya et al., 2016). Однако не всегда исследователям удавалось правильно интерпретировать полученные данные, и в некоторых случаях описания кариотипов содержали ошибки. Так, Браун и Коутсис в 1978 году описывают новый вид P. nephohiptamenos (Brown, Coutsis, 1978), указывая для него гаплоидное число хромосом (n) n=8-10. Впоследствии, спустя почти тридцать лет, Коутсис и де Принс (Coutsis, De Prins, 2007) обнаружили, что указанное число неверно, и в действительности хромосомное число для вида приблизительно равно n=84-88, что в итоге также оказалось не точным, но близким к реальному кариотипу (n=90, Vishnevskaya et al., 2016). В случае с P. nephohiptamenos неправильное определение числа хромосом оказалось в итоге некритичным и никак не повлияло на систематическое положение таксона. Но известны и другие случаи. Например, в 1979 году Баллетто и Тосо описывают новый вид P. galloi (Balletto, Toso, 1979)

на основании того, что подсчет числа хромосом дал значение n=66. Это отличало новый вид от сходных по морфологии P. demavendi (для которого было известно хромосомное число n=70) и P. ripartii (n=90). Однако в 2010 году Вила c соавторами (Vila et al., 2010) демонстрируют, что первое определение числа хромосом для P. galloi было ошибочным, и что в действительности данный таксон характеризуется n=90, как у P. ripartii. В результате, сходство в морфологии и идентичность в кариотипе позволили авторам установить, что P. galloi является подвидом P. ripartii.

На основании анализа кариотипа было описано ещё четыре таксона из комплекса мономорфных видов. В 2002 году Лухтанов и Данченко описали таксон karacetinae в статусе подвида P. alcestis, основываясь на том, что гаплоидное число хромосом у P. alcestis karacetinae (n=19) на две единицы отличалось от такового у P. alcestis alcestis (n=21) (Lukhtanov, Dantchenkoi, 2002a). В 2003 году Лухтанов с соавторами описали с территории Турции новый для науки вид P. dantchenkoi, имеющий в гаплоидном наборе n=40-42 (Lukhtanov et al., 2003). Почти одновременно популяция Agrodiaetus с практически таким же числом хромосом (n=41-42) была обнаружена в Болгарии и описана под названием P. dantchenkoi orphicus (Kolev, 2005). Параллельно в 2005 году Джон Коутсис и Юрате де Принс описали новый вид из Северной Греции - P. eleniae (n=41). Однако статус трёх из них - P. dantchenkoi orphicus, P. eleniae и P. alcestis karacetinae в результате молекулярно-филогенетического анализа был изменён (Vishnevskaya et al., 2016). Подробнее о статусе этих таксонов написано в главах 4 - 6.

Последующие исследования показали, что виды подрода Agrodiaetus демонстрируют самое высокое разнообразие в хромосомных числах в царстве животных (Lukhtanov, 2015). Гаплоидные хромосомные числа у Polyommatus (Agrodiaetus) варьируют от n=10 у P. caeruleus (Staudinger, 1871) до n=134 у P. shahrami (Skala, 2001) (Lukhtanov, Dantchenko, 2002a, Lukhtanov et al., 2005).

Кроме того этот подрод демонстрирует высокий уровень дифференциации кариотипов по размеру хромосом (Lukhtanov, Dantchenko, 2002b).

В подроде Agrodiaetus число хромосом обычно стабильно внутри видов и дифференцировано между видами, поэтому кариотипы обычно представляют надёжный признак для делимитации, описания и идентификации видов (de Lesse 1960a,b; Lukhtanov, Dantchenko, 2002a,b). Тем не менее, существуют исключения, когда кариологические данные не демонстрируют достаточной разрешающей способности для разделения видов. В некоторых случаях явно разные виды (иногда даже представители разных групп видов) имеют одинаковое число хромосом. Например, для вида Polyommatus ripartii де Лесс (de Lesse, 1960a,b) установил гаплоидное число хромосом n=90. Этот вид входит в состав группы P. admetus s.str. Одновременно де Лесс определил хромосомное число для вида P. fabressei, которое также равно n=90. В 2010 году Вила с соавторами определили хромосомное число для P. violetae (Vila et al., 2010), и оно оказалось также n=90. Интересным в этой ситуации является тот факт, что данные виды принадлежат разным группам (P. violetae и P. fabressei входят в состав группы P. dolus), а также и то, что эти виды отличаются морфологически и по исследованным молекулярным маркерам.