Синтез, структура и свойства карбонатзамещённых гидроксиапатитов для создания резорбируемых биоматериалов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.01, кандидат химических наук Климашина, Елена Сергеевна

• Климашина, Елена Сергеевна
• кандидат химических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат химических наук Климашина, Елена Сергеевна

1. введение.

2. обзор литературы.

2.1. Строение и свойства костной ткани.

2.2. Искусственные материалы для замены костной ткани.

2.3. Биологическая роль карбонат-ионов и ионов натрия.

2.4. Кристаллохимия апатитов.

2.5. Методы синтеза гидроксиапатита.

2.5.1. Твердофазный синтез гидроксиапатита.

2.5.2. Осаждение гидроксиапатита в водных растворах.

2.5.3. Гидротермальный синтез.

2.5.4. Получение гидроксиапатита гидролизом ортофосфатов кальция.

2.6. Методы синтеза карбонатзамещенного гидроксиапатита.

2.6.1. Растворные методы.

2.6.2. Механохимический метод.

2.6.3. Гидротермальный синтез.

2.6.4. Методы твердофазного синтеза карбонатгидроксиапатита.

2.7. Механизмы гетеровалентного замещения при образовании карбонатапатита.

2.8. Компактные биоматериалы на основе фосфатов кальция.

2.8.1. Калъцийфосфатная керамика.

2.8.2. Гидроксиапатитовая керамика.

2.8.3. Стеклокерамические материалы.

2.8.4. Покрытия из гидроксиапатита на металлах.

2.8.5. Композиты гидроксиапатит/полимер.

2.8.6. Цементы на основе фосфатов кальция.

2.9. Виды спекания.

2.9.1. Метод твердофазного спекания.

2.9.2. Метод жидкофазного спекания.

2.10. Оценка биоактивности материалов на основе ГА.

2.11. Влияние пористости и размера частиц на биорезорбцию.

2.12. Механизм образования костной ткани на поверхности имплантата.

2.13. Выводы из анализа литературы.

3. экспериментальная часть.

3.1. Получение материалов.

3.1.1. Синтез ГА и КГА методом осаждения из водного раствора.

3.1.2. Синтез карбонатгидроксиапатита твердофазным методом.

3.1.3. Синтез фосфатного стекла.

3.1.4. Получение композитов.

3.2. Методы исследования образцов.

3.2.1. Рентгенографические исследования.

3.2.2. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ).

3.2.3. Растровая электронная микроскопия (РЭМ).

3.2.4. Определение распределения частиц по размерам.

3.2.5. Инфракрасная спектроскопия (ИК).

3.2.6. Атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно-связанной плазмой (АЭС ИСП).

3.2.7. Рентгеноспектральный микроанализ состава образцов и их стехиометрии (РСМА).

3.2.8. Термогравиметрический (ТГ) и дифференциальный термический анализ (ДТА).

3.2.9. Ионометриярастворов.

3.2.10. Метод капиллярной адсорбции азота (БЭТ).

3.2. II. Количественное определение Р методом кислотно-основного титрования молибдофосфата хинолина.

3.2.12. Количественное определение Са методом прямого комплексонометрического титрования

3.2.13. Гравиметрический анализ.

3.2.14. Количественное определение Ыа и Са методом пламенной атомно-абсорбционной спектроскопии (ААС).

3.2.15. Волюмометрический метод определения карбонатов.

3.2.16. Механические испытания.

3.2.17. Исследование КГА методами радиоспектроскопии (ЭПР, ДЭЯР, ЯМР).

3.2.18. Биомиметическое тестирование in vitro.

3.2.19. Исследование цитотоксичности: МТТ-тест.

3.2.19.1. Подготовка материалов.

3.2.19.2. Приготовление культуры эмбриональных фибробластов человека HF.

3.2.19.3. Процедура проведения МТТ-теста.

3.2.19.4. Оценка морфологии и жизнеспособности клеток.

3.2.20. Исследование влияния порошков КГА на монослой эмбриональных фибробластов человека

3.3. Оценка ошибок экспериментальных данных.

4. результаты и их обсуждение.

4.1. Фазовый состав синтезированных образцов.

4.2. Содержание С032"-анионов.

4.3. Распределение С032*-анионов по неэквивалентным позициям А- и Б-типа.

4.3.1. ИК-спектроскопия.

4.3.2. ЯМР-спектроскопия.

4.3.3. Термогравиметрический анализ.

4.3.4. Механизм замещения согласно данным химического анализа.

4.4. Микроструктура КГА по данным электронной микроскопии.

4.5. Конкуренция между С032' и Ж)3"за А-позиции в структуре КГА.

4.6. Реальная структура КГА.

4.6.1. Строение КГА по данным рентгеновской дифракции.

4.7. Термическая устойчивость карбонатгидроксиапатитов.

4.8. Растворение КГА в модельных средах in vitro.

4.8.1. Исследование растворимости карбонатгидроксиапатитов в слабощелочной среде.

4.8.2. Исследование растворимости карбонатгидроксиапатитов в слабокислой среде.

4.8.3. Поведение образцов КГА в модельных средах SBF.

4.9. Биологические испытания порошков КГА in vitro.

4.9.1. Биологические испытания КГА: МП— тест.

4.9.2. Биологические испытания КГА: долгосрочное сокулыпивирование с фибробластами человека

4.10. Консолидация КГА.

4.10.1. Получение керамики КГА спеканием в токе СО2.

4.10.2. Получение композитов КГА/фосфатное стекло методом горячего прессования.

4.10.3. Получение композита КГА/полимер.

5. выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез, структура и свойства карбонатзамещённых гидроксиапатитов для создания резорбируемых биоматериалов»

Одним из важных направлений современного неорганического материаловедения является разработка биоматериалов на основе фосфатов кальция. Синтетический гидроксиапатит Саю(Р04)б(0Н)2 (ГА) — широко распространенный материал, применяемый в медицине для лечения поврежденных костных тканей благодаря химическому и фазовому подобию неорганической составляющей костной ткани.

Со времени первых попыток использования фосфатов кальция в медицине концепция применения биоматериалов претерпела серьезные изменения. На первый план вышел так называемый регенерационный подход, в рамках которого акцент делается на замещении биоматериала нативной растущей костью, а материалу отводят роль (активного) источника необходимых для построения костной ткани элементов, лишь первоначально осуществляющего опорную функцию. В настоящее время считается, что материалы на основе гидроксиапатита имеют следующие недостатки: низкая скорость биорезорбции in vivo, слабое стимулирующее воздействие на рост новой костной ткани (остеоиндукция), низкая трещиностойкость (К\с) и малая усталостная прочность в физиологических условиях. Однако регенерационный подход требует от современных биоматериалов, прежде всего, ускорения процесса срастания и замены имплантата новой костной тканью и остеостимулирующего действия материала имплантата, в то время как механические нагрузки во время лечения можно исключить.

Одним из известных способов повышения резорбируемости керамики на основе ГА является переход к химическому модифицированию гидроксиапатита. Известно, что в качестве изоморфных примесей в кристаллическую решетку ГА могут входить различные катионы и анионы. По медико-биологическим причинам круг возможных допантов ограничен. С кристаллохимической точки зрения замена катиона или аниона эффективна для изменения энергии решетки кристалла (и, следовательно, изменения произведения растворимости) и кислотно-основных свойств поверхности (т.е. кинетики процесса растворения). Другой способ улучшения биологических характеристик материала заключается в переходе к двухфазным материалам, содержащим более растворимые по сравнению с ГА фосфаты кальция, в частности, трикальциевый фосфат Саз(Р04)2 (ТКФ).

Явным недостатком данного метода является различие в скоростях локальной резорбции.

Следует отметить, что проблему биоинтеграции отчасти решает переход к пористой

ГА-керамике, однако низкий уровень растворимости материала (ПР(ГА) = 10"118 М18) остаётся серьёзным препятствием на пути внедрения подобных материалов в 4 медицинскую практику. Растворение ГА происходит лишь в кислой среде, создаваемой локально остеокластами в зоне активной резорбции кости (т.е. в области досягаемости материала BMU-комплексами (англ. Basic Modeling Unit), содержащими остеокласты, а также в области надкостницы). Пассивной резорбции (т.е. в нейтральной или слабощелочной межтканевой жидкости) ГА не наблюдается. Он окружается фиброзной капсулой соединительной ткани и остается в организме в компактном виде, приводя к ряду негативных долгосрочных последствий. Ожидается, что «идеальный имплантат» должен постепенно растворяться в среде организма (и в идеале выполнять при этом свои опорные функции), а на его месте образовываться новая костная ткань. Очевидно, что резорбтивная функция биоматериала имеет крайне важное значение для успешной интеграции материала в организм [1].

Таким образом, скорость регенерации кости зависит от нескольких факторов, таких как пористость, состав, растворимость и присутствие некоторых элементов, которые выходят в ходе резорбции керамического материала, облегчая регенерацию кости, проводимую остеобластами. Поэтому в настоящей работе подход к контролю скорости резорбции базируется на идее использования анионного и катионного замещения ГА. В качестве основного объекта исследования был выбран гидроксиапатит, модифицированный карбонат-ионом и ионом натрия, с различными степенями замещения - карбонатгидроксиапатит (КГ А). Следует отметить, что интерес к КГ А, как к остеозамещающему материалу, не спадает. Это связано также и с более общей перспективой использования карбонатсодержащих биоматериалов. Увеличение содержание карбонат-иона приводит как к увеличению растворимости материала (и, следовательно, к увеличению резорбции), так и к активному воздействию на энергетику остеосинтеза вследствие снижения содержания кислорода, поскольку процессы дыхания в костной ткани анаэробны (гликолиз) [2].

Для замещения костных дефектов биорезорбируемые материалы могут применяться в форме гранул, паст, а также пористой керамики [1]. Последнее направление является наиболее перспективным, так как в данном случае материал будет являться не только источником "строительного материала" для роста костной ткани, но и позволит всей кости выдерживать определенную механическую нагрузку, что значительно снизит вероятность деградации костной ткани.

Однако, метод обычного твердофазного спекания неприменим по отношению к карбонатгидроксиапатиту (как и к другим карбонатсодержащим биоматериалам), так как он разлагается с выделением СОг при высокой температуре. Выходом из данной ситуации 5 является использование метода жидкофазного спекания при значительно более низкой температуре в присутствии легкоплавкой биосовместимой добавки, что позволит свести к минимуму потери СОг при получении материала. В качестве альтернативного метода консолидации следует рассматривать формирование композита КГА/(термопластичный) полимер.

Целью настоящей работы является разработка основ направленного синтеза порошков КГА с заданным составом и структурой для создания компактных резорбируемых биоматериалов нового поколения, предназначенных для замены костной ткани человека. Подобные материалы должны первоначально играть роль опорного и направляющего элемента, и, следовательно, обладать достаточной прочностью и способствовать росту костной ткани, а в дальнейшем - растворяться (резорбироваться) в межтканевой жидкости организма с заданной скоростью. Фундаментальной проблемой, поставленной в работе, явился поиск взаимосвязи состав — (реальная) структура -функциональные свойства многокомпонентных фаз переменного состава с ионным типом химической связи, содержащих гетеровалентную лабильную примесь. Представителем таких фаз выступают фосфаты кальция со структурой апатита.

Для достижения указанной цели в работе решали следующие задачи:

1) разработка способов получения КГА с заданным уровнем содержания карбонат-иона;

2) установление корреляции между степенью замещения и характером распределения карбонат-иона между 2-мя энергетически неэквивалентными позициями структуры ГА;

3) выявление характера искажения кристаллической решетки, вызываемого примесным анионом;

4) установление корреляции между характером распределения карбонат-иона, параметрами реальной структуры (размером кристаллитов, микродеформациями решетки) нанокристаллов и растворимостью КГА в модельных средах;

5) получение биорезорбируемых материалов на основе порошков КГА и подготовка их к биологическим испытаниям.

Научная новизна работы состоит в следующих положениях:

1) комплексом физико-химических методов анализа (среди которых ИК- и радиоспектроскопия) установлено, что при увеличении содержания карбонат-иона происходит следующая последовательность замещения: встраивание карбонат-иона в канальные позиции вместо гидроксид-ионов (А-тип замещения) и далее замещение в позициях ортофосфатных ионов (Б-тип);

2) методами радиоспектроскопии впервые показано, что при низких степенях

•у замещения возможна конкуренция между СОз " и N03" ионами за позиции замещения А-типа в структуре ГА;

3) впервые отмечены две особенности микроморфологии КГА кристаллов, полученных осаждением из раствора: морфологическое разнообразие кристаллов в пределах образцов одинакового брутто-состава и мезопористость;

4) предложена модель строения смешанного КГА АБ-типа, позволяющая описать неоднородность состава и морфологии кристаллов;

5) показано, что увеличение содержания СОз2"-ионов и уменьшение температуры синтеза приводит к уменьшению размера кристаллов КГА и росту начальной скорости его растворения и растворимости; разнонаправленное действие факторов размера кристаллов и степени заполнения А-позиций приводит к немонотонному изменению скорости растворения по мере увеличения содержания СОз2"-ионов.

Практическая значимость работы обусловлена: 1) разработкой методики оценки содержания карбонат-иона и его распределения по неэквивалентным позициям решетки ГА с помощью ИК-спектроскопии, 2) разработкой метода консолидации КГА порошка с использованием приема горячего прессования с термопластичной добавкой на основе Ыа-Са-фосфатного стекла при температурах не выше 500 °С, что позволяет сохранить содержание карбонат-иона в консолидированном КГА; 3) полученные, в работе резорбируемые неорганические материалы на основе КГА являются биосовместимыми и могут применяться в работах по тканевой инженерии.

Личный вклад автора в представляемую работу состоит в: критическом обзоре имеющихся литературных данных относительно взаимосвязи условий синтеза, состава и свойств КГА; синтезе всех использованных в работе составов и приготовлении образцов для исследований; самостоятельном проведении электронной микроскопии, ИК-спектроскопии, рентгенографического исследования, ионометрии и химического анализа; анализе и обработке экспериментальных данных, обобщении и систематизации результатов.

Настоящая работа является частью систематических исследований биоматериалов, проводимых на Факультете наук о материалах МГУ и кафедре неорганической химии

Химического факультета МГУ в рамках приоритетной научной темы «Создание новых типов функциональных материалов». Работа была выполнена в лаборатории 7

Заключение диссертации по теме «Неорганическая химия», Климашина, Елена Сергеевна

5. Выводы

1. Повышение температуры синтеза с 20 до 80 °С приводит к увеличению содержания

-у

СОз ' в КГА с 3,9 до 13,6 мае. %, при этом степень замещения Са на Ыа пренебрежимо мала. Для анализа распределения СОз2" по неэквивалентным позициям замещения в структуре ГА разработана и апробирована методика количественной оценки степени заполнения позиций, основанная на использовании ИК-спектроскопии. Совокупность данных позволяет утверждать, что происходит преимущественное заполнение А-позиций в каналах структуры ГА при малом содержании СОз " (менее 5 мае. %), увеличение содержания карбонат-ионов приводит к замещению РО4 "-анионов (Б-позиции), что сопровождается заметным сжатием кристаллической решетки КГА.

2. Предложена трехпараметрическая модель строения смешанного КГА АБ-типа, которая допускает неоднородность состава кристаллов КГА при заданном брутто-составе раствора при синтезе. Это соображение положено в основу трактовки морфологического разнообразия кристаллов КГА в пределах образца одного брутго-состава. Показано, что исследованные в работе апатиты являются мезопористыми телами с размерами пор не более 10 нм, в которых может быть инкапсулирован содержащий токсичные >Юз"-ионы маточный раствор.

3. Исследования КГА методами ИК- и радиоспектроскопии указывают на возможность изоморфного замещения >Юз"-ионами позиций в каналах апатитной структуры и конкуренцию между N03" и С03 " за позиции А-типа. При высоких содержаниях карбонат-иона внедрение нитратного иона в решетку КГА пренебрежимо мало. Поэтому использование радиоспектроскопии представляется практически важным для оценки токсичности наногидроксиапатита, синтезируемого для медико-биологических целей, а также для разработки приемов очистки апатита от токсичных примесей.

4. С увеличением содержания СО32" наблюдается немонотонное увеличение скорости растворения КГА как в кислой среде (рН ~ 5), так и в средах близких к нейтральным (рН ~ 7,4). Установлено два значимых фактора, влияющих на скорость растворения КГА - размер кристаллов ГА и степень заполнения позиций

А-типа. Разнонаправленное действие указанных факторов при увеличении л содержания СОз " обуславливает немонотонное изменение скорости растворения.

5. Для получения компактного материала на основе КГА (с относительной плотностью до 90 %) методом «горячего» прессования в качестве термопластичной матрицы предложено фосфатное стекло. Показана практическая возможность получения композита КГ А/стекло с прочностью на сжатие до 25 МПа при температурах не выше 500 °С, в котором сохраняется уровень содержания карбонат-ионов, соответствующий исходному порошку КГА.

6. Полученные в работе КГА являются биосовместимыми и могут применяться в работах по тканевой инженерии. МТТ-тест на культуре клеток фибробластов человека показал, что данные материалы не являются цитотоксичными и не содержат компонентов, негативно влияющих на адгезию, распластывание, пролиферативную активность и жизнеспособность клеток. При долгосрочном сокультивировании порошки КГА проявляют высокую адгезивную способность к клеткам типа фибробластов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Климашина, Елена Сергеевна, 2011 год

1. Bohner М., Resorbable biomaterials as bone graft substitutes. // Materials Today, 2010.13(1-2): p. 24-30.

2. Торбенко Н.Г., Карсавина В.А., Функциональная биохимия костной ткани. //1977.472 с.

3. Doremus R.H., Review: Bioceramics. //J. Mater. Sci., 1992. 27: p. 285-297.

4. Stevens M.M., Biomaterials for bone tissue engineering. // Materials Today, 2008. 11(5): p. 1825.

5. Hench L.L., Bioceramics. //i. Am. Ceram. Soc., 1998.81(7): p. 1705.

6. Kokubo Т., Kim H.M., Kawashita M., Novel bioactive materials with different mechanical properties. //Biomaterials, 2003. 24: p. 2161-2175.

7. Эппле M., Биоматериалы и биоминерализация. // Перевод с немецкого под ред. В.Ф. Пичугина, Ю.П. Шаркеева, И.А. Хлусова, 2007. Томск: издательство "Ветер": р. 137.

8. Durucan С., Brown P.W., a-Tricalcium phosphate hydrolysis to hydroxyapatite at and near physiological temperature. // Journal of materials science: materials in medicine, 2000. 11: p. 365-371.

9. Ginebra M., et al., Modeling of Hydrolysis of a-Tricalcium Phosphate, //km. Ceram.Soc., 1999. 82(10): p. 2808-2812.

10. Bohner M., Calcium ortophosphates in medicine: from ceramics to calcium phosphate cements. //Injury Int J Care Injured, 2000(31): p. 37-47.

11. Dorozhkin S.V., Epple M., Biological and medical significance of calcium phosphates. // Angew. Chem. Int. Ed., 2002.41: p. 3130.

12. Баринов C.M., Комлев B.C., Биокерамика на основе фосфатов кальция. // М.: Наука, 2005: р. 204.

13. Kannan S., Lemos A.F., Ferreira J.M.F., Synthesis and Mechanical Performance of Biological-like Hydroxyapatites.//С hem. Mater., 2006.18(8): p. 2186-2181.

14. Скальный А.В., Рудаков И.А., Биоэлементы в медицине. // Мир, 2004: р. 272.

15. Бингам Ф.Т., Коста М., Эйхенбергер Э., eds. Некоторые вопросы токсичности ионов металлов: Пер. с англ., ed. А.З. X. Зигель. 1993, М.: Мир. 368.

16. Везер В., Фосфор и его соединения. //1962: р. 407.17.' Орловский В.П., Ионов С.П., Изоморфное замещение иона гидроксила на галогениды в гидроксиапатите и энергия связи этих ионов в Са-каналах. // Неорг. химии, 1995. 40(12): р. 1961-1965.

17. Gibson I.R., Best S.M., Bonfield W., Chemical characterization of silicon substituted hydroxyapatite. // Biomed Mater Res., 1999.44: p. 422-428.

18. Arcos D., Rodryguez-Carvajal J., Vallet-Regy M., Silicon Incorporation in Hydroxylapatite Obtained by Controlled Crystallization. //Chem. Mater., 2004.16: p. 2300-2308.

19. Botelho C.M., et al., Structural analysis of Si-substituted hydroxyapatite: zeta potential and X-ray photoelectron spectroscopy. // journal of materias science: materials in medicine, 2002. 13: p. 1123-1127.

20. Leventouri Т., Bunaciu C.E., Perdikatsis V., Neutron powder diffraction studies of silicon-substituted hydroxyapatite. // Biomaterials, 2003.24: p. 4205-4211.

21. Balas F., Perez-Pariente J., Vallet-Regy M., In vitro bioactivity of silicon-substituted hydroxyapatites. // Biomed Mater Res., 2003. 66A: p. 364-375.

22. Boyer L., Caprena J., Lacout J.L., Synthesis of phosphate-silicate apatites at atmospheric pressure. //Solid State Ionics, 1997.95: p. 121.

23. Porter A.E., Best S.M., Bonfield W., Ultrastructural comparison of hydroxyapatite and silicon-substituted hydroxyapatite for biomedical applications. // Biomed Mater Res., 2004. 68A: p. 133 -141.25.