СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И МОРФОЛОГИЯ ОРГАНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ КРЕМНЕЗЕМОВ В КАЧЕСТВЕ ЭФФЕКТИВНЫХ АДСОРБЕНТОВ БИЛИРУБИНА И НОСИТЕЛЕЙ ДОКСОРУБИЦИНА И СУЛЬФАСАЛАЗИНА тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.01, кандидат наук Тимин Александр Сергеевич

• Тимин Александр Сергеевич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Тимин Александр Сергеевич

СОДЕРЖАНИЕ

Список сокращений и условных обозначений

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные принципы формирования ультрадисперсных

кремнеземов и гибридных материалов на их основе

1.2. Золь-гель технология как удобный инструмент

нанотехнологии

1.2.1. Темплатный синтез как эффективный алгоритм направленного получения веществ и материалов под конкретные практиче-

ские задачи

1.2.2. Методы модификации кремнеземов с использованием золь-гель технологии

1.2.3. Иммобилизация белков на поверхность неорганических матриц на основе кремнезема

1.2. Технологии создания и сравнительные характеристики материалов для адсорбции билирубина

1.3. Технологии закрепления лекарственных веществ для последующей их адресной доставки 56 ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 63 2.1. Золь-гель синтез немодифицированных и модифицированных кремнеземов

2.1.1. Прекурсоры

2.1.2. Методика синтеза немодифицированного кремнезема

2.1.3. Методика синтеза органо-модифицированных кремнеземов

2.1.4. Методика синтеза кремнеземов, модифицированных полигуанидинами

2.1.5. Методика синтеза кремнеземов, модифицированных поливинилпирролидоном с последующей иммобилизацией

альбумина

2.2. Методы исследования состава, структурно-морфологических и поверхностных свойств

2.2.1. Элементный анализ

2.2.2. ИК-спектроскопия

2.2.3. Термогравиметрия 72 2.2.4 Низкотемпературная адсорбция/десорбция азота

2.2.5. Растровая (сканирующая) электронная микроскопия

2.2.6. Трансмиссионная электронная микроскопия

2.3. Исследование функциональных свойств синтезируемых материалов

2.3.1. Методика исследования адсорбции билирубина на поверхности немодифицированного и модифицированных кремнеземов

из водных растворов

2.3.2. Методика закрепления доксорубицина и сульфасалазина и исследование процессов их контролируемого рН-высвобождения 82 ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние природы привитой функциональной группы орга-носилана на структурно-морфологические и поверхностные характеристики синтезируемых материалов

3.2. Структурно-морфологические и поверхностные характери-сти материалов с включением природных и синтетических полимеров

3.2.1. Кремнеземы, модифицированные полигуанидинами

3.2.2. Кремнеземы, модифицированные поливинилпирролидоном

с последующей иммобилизацией альбумина

3.3. Сравнительный анализ адсорбционной способности полученных материалов к билирубину из водных растворов

3.3.1. Органо-модифицированные кремнеземы

3.3.2. Кремнеземы, модифицированные поливинилпирролидоном

с последующей иммобилизацией альбумина

3.3.3. Кремнеземы, модифицированные полигуанидинами цу

3.4. Исследование возможности создания эффективных носителей доксорубицина и сульфасалазина на примере кремнеземов, модифицированных полигуанидинами

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРА

Список сокращений и условных обозначений

ТЭОС Тетраэтоксисилан

ОТЭОС Октилтриэтоксисилан

ФТЭОС Фенилтриэтоксисилан

УПТМОС Уринопропилтриметоксисилан

ПВП Поливинилпирролидон

ПАГ Полиакрилатгуанидин

ПМГГХ Полиметакроилоилгуанидин гидрохлорид

БСА Бычий сывороточный альбумин

ИК-спетроскопия Инфракрасная спектроскопия

ЭА Элементный анализ

ТГ Термогравиметрический анализ

ДТА Дифференциальный термогравиметрический анализ

M Молярная масса

БЭТ анализ Метод, предложенный Брунауэром, Эмметом и

Тейлором.

РЭМ Растровая электронная микроскопия

ТЭМ Трансмиссионная электронная микроскопия

УФ-Вид спектро- Электронная спектроскопия в ультрафиолетовой и ви-

скопия димой областях

ЭСП Электронные спектры поглощения

ДМСО Диметилсульфоксид

SiNP Немодифицированный кремнезем

OctSiNP Октил-модифицированный кремнезем

PhSiNP Фенил-модифицированный кремнезем

USiNP Уринопропил-модифицированный кремнезем

SiNP@PAG Кремнезем, модифицированный полиакрилатгуанидином

SiNP@PMCGH Кремнезем, модифицированный полиметакроилоилгуа-

нидин гидрохлоридом

Si-PVP-1 Si-PVP-2 Si-PVP-3 Si-PVP-4

Кремнезем, модифицированный поливинилпирролидо-ном с различным его содержанием

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «СИНТЕЗ, СТРУКТУРА И МОРФОЛОГИЯ ОРГАНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ КРЕМНЕЗЕМОВ В КАЧЕСТВЕ ЭФФЕКТИВНЫХ АДСОРБЕНТОВ БИЛИРУБИНА И НОСИТЕЛЕЙ ДОКСОРУБИЦИНА И СУЛЬФАСАЛАЗИНА»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Важнейшей областью современной неорганической химии является дизайн и синтез новых неорганических веществ и гибридных материалов на их основе. Одним из перспективных направлений является модификация неорганических матриц и каркасов функциональными группами органических веществ, включая разнообразные по структурно-функциональной организации биомолекулы. В этих целях наибольшее распространение получили ультрадисперсные кремнеземы [1]. Такие материалы уже используются в различных адсорбционных процессах, хроматографии, при построении неорганических каркасов для инкапсулирования и иммобилизации биологических объектов. Известные сегодня методы получения гибридных материалов на основе кремнеземов основаны на использовании двух стратегий: «снизу вверх» и «сверху вниз». Одним из эффективных методов является золь-гель технология, позволяющая формировать сочетание нескольких компонентов, которые, взаимодействуя с растущей неорганической матрицей, формируют структуру нового материала [2]. Современная наука «видит» будущее в таком симбиозе и в создании «умных» материалов, совмещающих в себе несколько функций. С точки зрения наук о жизни к важнейшим из них можно отнести высокую селективность распознавания биомолекул, что позволяет создавать биосенсоры, на-ноконтейнеры и др.

Несмотря на достаточно большой имеющийся сегодня массив экспериментальных и теоретических работ в области золь-гель синтеза простых и модифицированных кремнеземов, оригинальные исследования их применения в качестве адсорбентов билирубина и носителей противораковых препаратов единичны. В этой связи практико-ориентированные исследования в области золь-гель синтеза и исследования органо-модифицированных кремнеземов с включением молекул, имеющих различную структуру и центры донорно-акцепторного взаимодействия, является актуальной задачей неорганической химии и смежных с ней областей химической науки.

Цель работы - синтез, изучение структурно-морфологических особенностей, адсорбционных свойств и возможностей использования в качестве носителей противораковых препаратов органо-модифицированных кремнеземов, в том числе с включением функциональных полимеров. Для достижения поставленной цели решались следующие экспериментальные и теоретические задачи:

1) еинтез кремнеземов, модифицированных октил-, фенил- и уринопро-пильными группами;

2) еинтез кремнеземов с включением полигуанидинов, поливинилпирроли-дона и бычьего сывороточного альбумина;

3) изучение структурных, поверхностных и морфологических особенностей полученных материалов во взаимосвязи с их составом и строением;

4) установление закономерностей адсорбции билирубина из водных растворов полученными материалами и поиск наиболее эффективных сорбентов;

5) изучение возможностей закрепления доксорубицина и сульфасалазина на поверхности полимер-модифицированных кремнеземов и их последующего рН-контролируемого высвобождения в индивидуальной форме.

Научная новизна. С использованием золь-гель технологии получены новые гибридные материалы на основе неорганической матрицы кремнезема с включением различных типов полимеров природного и синтетического происхождении: бычьего сывороточного альбумина, поливинилпирролидона и гуа-нидинсодержащих полимеров. Установлено, что поверхностные свойства и морфология конечного материала в значительной степени определяется типом закрепленного («включенного») полимера или органосилана. Полученные кремнеземы были применены в качестве сорбентов для адсорбции билирубина - высокотоксичного пигмента и маркера функции печени из водных растворов. Показано, что иммобилизация биополимеров в неорганическую матрицу кремнезема приводит к значительному увеличению сорбционной способности по отношению к билирубину в сравнении с индивидуальным кремнеземом. Впервые модифицированные полигуанидинами кремнеземы «еоге^е11»-структуры использованы в качестве носителей для противораковых препаратов - доксору-

бицина и сульфасалазина. Показаны возможности рН-контролируемого высвобождения лекарств с поверхности полимер-модифицированных кремнеземов. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования синтезированных материалов на основе кремнезема в качестве эффективных сорбентов для эффективной утилизации билирубина, а также в создании новых технологий систем адресной доставки лекарственных веществ.

Теоретическая и практическая значимость. Разработанные технологии иммобилизации белковых молекул и синтетических полимеров в золь-гель синтезе открывают перспективу создания новых биосовместимых материалов на основе неорганических матриц в качестве перспективных сорбентов и носителей лекарственных препаратов, обладающих высокой связывающей способностью к билирубину, доксорубицину и сульфасалазину. Выявлены закономерности в области влияния используемого модификатора на структурно-морфологические свойства конечного материала, что вносит несомненный вклад в область современной неорганической химии и материаловедения. Проведенные исследования по адсорбции билирубина из его водных растворов позволяют рекомендовать используемые подходы для производства новых высокоэффективных гемосорбентов и их применения в системах очистки плазмы крови. Полученные данные по закреплению доксорубицина и сульфасалазина позволяют развить и дополнить существующие представления о системах доставки лекарственных препаратов. Эти результаты могут найти применение при разработке новых молекулярных систем (наносистем) адресной доставки лекарственных препаратов.

Методология и методы диссертационного исследования. Для обоснования выбранной методологии исследования автором использовались научные труды отечественных и зарубежных ученых в области золь-гель технологии, физико-химических свойств наноматериалов на основе ультрадисперсных кремнеземов, адсорбционных свойств гибридных материалов на основе модифицированного кремнезема с включением различных функциональных групп, в том числе биосовместимых полимеров. Методологической основой исследова-

ния выступали общенаучные и специальные методы, такие как эксперимент, анализ, синтез, сравнение и математическое моделирование.

Методы исследования выбирались исходя из поставленных задач и включали: сканирующую (растровую) и трансмиссионную микроскопию, термогравиметрию, ИК-спектроскопию, элементный анализ, низкотемпературную адсорбцию/десорбцию азота, электронную спектроскопию поглощения и др.

На защиту выносятся: результаты исследования структуры, поверхности и морфологии органо-модифицированных кремнеземов; данные о влиянии природы привитых функциональных групп на морфологию и поверхностные характеристики полученных материалов; результаты термического и элементного анализа органо-модифицированных кремнеземов; результаты по использованию поливинилпироллидона для улучшения удельной связывающей способности материала по отношению к бычьему сывороточному альбумину; изученные возможности применения полученных гибридных материалов основе ультрадисперсного кремнезема для адсорбции билирубина в статическом и динамическом режимах; применение кремнеземов, модифицированных полигуа-нидинами в медицине и фармакологии для эффективного закрепления доксору-бицина и сульфасалазина с последующим pH-контролируемым высвобождением.

Степень достоверности. Достоверность результатов обеспечена использованием комплекса надежных инструментальных методов, реализованных на базе научно-исследовательских центров России, Италии и Швейцарии, статистической оценкой погрешностей измерений и расчетов, воспроизводимостью экспериментальных данных, а также хорошим согласованием отдельных результатов настоящей работы с известными данными отечественных и зарубежных авторов.

Связь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена в рамках тематического плана НИР кафедры неорганической химии Ивановского государственного химико-технологического университета. Разделы работы и отдельные ее этапы выполнены при поддержке стипендии Прези-

дента РФ для стажировки и обучения за рубежом (приказ Минобрнауки от 28.05. 2014 № 595), гранта Президента РФ для молодых российских ученых -кандидатов наук (проект № МК-287.2014.3) и РФФИ (проект № 12-03-31309).

Вклад автора. Подбор и анализ научной литературы по теме диссертации, экспериментальная часть работы и обработка полученных результатов выполнены лично автором. Стратегия и тактика исследований, планирование работы на всех ее этапах, обсуждение полученных результатов, формулирование выводов и написание публикаций выполнены совместно с научным руководителем Румянцевым Е.В.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на XIX Менделевской съезде по общей и прикладной химии (Волгоград 2011), Международной Пироговской научной медицинской конференции (Москва 2012), 2-й и 3-й конференций стран СНГ «Золь-гель синтез и исследование неорганических соединений, гибридных функциональных материалов и дисперсных систем» (Севастополь 2012, Суздаль 2014), IV Международной конференции Российского химического общества им. Д.И. Менделеева, посвященной 80-летию со дня рождения П.Д. Саркисова, Международной научной конференции «Современные проблемы химии» (Киев 2013), VIII Международной научной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации. Кристаллизация как форма самоорганизации вещества» (Иваново 2014), X Международной научно-практической конференции «Новые полимерные композиционные материалы» (Нальчик 2014) и др.

Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 7 статьях в журналах из перечня ВАК Российской Федерации и тезисах 10 докладов, опубликованных в трудах научных конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 1 43 страницах, содержит 9 таблиц, 69 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, включающей основыне итоги работы и перспективы дальнейшего исследования, списка цитируемой литературы (193 источников).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Основные принципы формирования ультрадисперсных кремнеземов и гибридных материалов на их основе

Знания структуры и свойств материалов приводят к созданию принципиально новых продуктов. Использование классических подходов для синтеза материалов является недостаточным для нововведений в области современной неорганической химии и материаловедения [3, 4]. Эти нововведения могут быть достигнуты путем создания принципиально новых методик синтеза, либо в результате применения комбинированного подхода, когда в схеме синтеза одновременно задействуются несколько компонентов с известными свойствами. Последний принцип как нельзя лучше подходит для получения широкого ассортимента продукции, повышая его безопасность и снижая стоимость производства. Рассматривая современные тенденции в области материаловедения, можно выделить кремнезем как один из наиболее перспективных компонентов для получения композиционных материалов с новыми свойствами. Главным достоинством кремнезема является возможность его применения для синтеза материалов в широком интервале заданных структурных характеристик при использовании достаточно простых технологических приемов. Благодаря тому, что кремнезем легко встраивается в любую схему синтеза, он может выступать в качестве основного компонента для последующей его модификации различными функциональными производными. Кроме того, среди других достоинств кремнезема следует выделить его интертность (химическую и биологическую безвредность), термическую устойчивость, взрыво- и пожаробезопасность. Путем изменения условий и методик синтеза можно получать кремнеземы с различной морфологией: от наночастиц до пористых мембран, расширяя тем самым сферы применения таких материалов. В современной литературе описано множество традиционных методов получения материалов на основе кремнезема [5 - 7]. Все эти методы можно разделить на две большие группы по типу фор-

мирования наноструктур: подход «сверху-вниз» и подход «снизу-вверх» (рис. 1.1). Подход «сверху-вниз» характеризуется ростом наночастиц или их сборкой из отдельных атомов. Методы, относящиеся к группе «снизу вверх», основаны на «дроблении» крупных частиц до наноразмеров. Следует отметить, что данные методы являются классическим и также подходят для получения других материалов.

Физические методы:

- фотолитография

-лазерно-лучевая обработки

- механические методы (измельчение, шлифование]

< Стратегия «Свеху-вниз»

0.1hm Ihm 10 hm 100 hm 1 мкм 10 мкм 100 мкм 1мм 1см 10 см

Стратегия «Снизу-Вверх»

Химические методы:

- золь-гель синтез -самосборка

- синтеза в нанореакторах

Рис. 1.1. Методы получения наноматериалов на основе кремнезема.

Одним из типичных методов синтеза «сверху-вниз» подхода является механическое воздействие - измельчение материала до ультра- или нанодисперс-ного состояния [8]. Механическое перемалывание до наноразмерных частиц является достаточно энергозатратным методом и требует подготовительных манипуляций: выбор размера перемалывающих молов, скорость их вращения, а также время дробления. Одним из таких примеров механического воздействия на аморфный кремнезем описан в работе [8], в результате такого воздействия были получены наночастицы кремнезема от 10 до 30 нм. Другим методом «сверху-вниз» подхода является фотолитография [9]. Данный метод используется для создания компьютерных чипов. Он основан на использовании тонкой

силиконовой подложки толщиной 1 мкм, на который помещается монослоем фоторезистор. Под воздействием светового облучения происходит электрохимическая реакция, в результате которой на поверхности подложки образуется определенный рисунок нанометрового размера.

Среди методов «снизу-вверх» стоит выделить химическое окисление/восстановление. Первый такой метод для синтеза кремнезема был предложен в 1992 г. [9]. Синтез основан на химическом восстановлении SiQ4 или HSiQ3 в присутствии силицида калия в тетрагидрофуране в среде инертного азота. Также в качестве восстановителей в ряде работ использовали Li[AlH4]. Кроме окисления/восстановления для получения ультрадисперсного кремнезема используется пиролиз, основанный на термическом разложении силана. Одним из примеров такого синтеза представлен в работе [10], где были получены сферические наночастицы кремнезема размером 13 - 40 нм путем термического разложения силана при температуре 793 - 893 K и давлении 290 тор. Наиболее популярным из всех выше перечисленных методов является золь-гель метод, который более подробно будет рассмотрен в следующем разделе.

Одним из достоинств кремнезема, как уже упоминалось, является возможность модификации его поверхности, что сопровождается морфологическими и структурными изменениями. Такая функционализация дает существенные преимущества по сравнению с немодифицированным, придавая новые свойства у таких материалов. Модифицированные кремнеземы обладают химической индивидуальностью привитого соединения и свойствами кремнезема как твердого тела. Самым распространенным способом модификации поверхности кремнезема является химическая функционализация. В результате такой обработки на поверхности кремнезема формируются различные функциональные группы, которые впоследствии могут связываться с другими компонентами, формируя структуру гибридного материала. Процесс функционализации, как правило, зависит от типа используемых кремнеземов. Традиционно ультрадисперсные материалы на основе кремнезема подразделяют на пористые (мезо-пористые) и непористые [11]. Мезопористые материалы на основе кремнезема

представляют собой пористые наночастицы или пленки с размером пор в пределах от 2 до 50 нм. Непористый кремнезем представляет собой сферические неполые наночастицы с отсутствием пор. В случае пористых кремнеземов модификация с использованием других компонентов осуществляется непосредственно в порах кремнезема, тогда как в непористом кремнеземе модификация проходит на его поверхности. Среди известных методов модификации кремнезема наиболее известен метод полимерной иммобилизации. Данный метод функционализации отличается относительной дешевизной и позволяет получать материалы с различной морфологией и физико-химическими свойствами путем подбора соответствующих полимеров. Так, в работе [12] показан синтез наночастиц кремнезема с иммобилизацией полиэтиленгликоля и полиакрила-мида. В другой работе [13] описан метод получения гибридного материала на основе наночастиц кремнезема с включением поли-(оксиэтилен метакрилата) и поли-(стиролсульфоновой кислоты). В дальнейшем такие гибридные материалы находят широкое применение в медицине в качестве фильтрующих и адсорбирующих материалов, биосенсоров на определенные вещества и ферменты, электрохимических сенсоров и т. д. В ряде работ показана принципиальная возможность использования гибридных материалов в качестве биокерамических имплантантов для устранения дефектов тела, а также перспективных носителей лекарственных препаратов в системах доставки лекарств, высокоэффективных катализаторов с развитой удельной поверхностью [12].

Помимо иммобилизации полимеров в матрицу кремнезема также разработаны методики, основанные на модификации кремнезема металлическими наночастицами. В данном случае иммобилизация наночастиц возможна, как на поверхности кремнезема, где он выступает в качестве основного ядра, так и внутри кремнезема, где он будет выступать в качестве защитной пленки. При этом возможно также использование комбинированного подхода, т.е. иммобилизация наночастиц как снаружи, так и внутри кремнезема (рис. 1.2.)

Нан о частицы на поверхности кремнезема

Гибридный материал ( нан о частицы внутри □ на поверхности кремнезема)

Наночастпыы.

инкапсулированные внутрь кремнезема

Рис. 1.2. Иллюстрация различной модификации кремнезема с включением наночастиц.

Полученные материалы на основе кремнезема с включением металлических наночастиц находят широкое применение в медицине. В частности, кремнеземы с наночастицами золота используются для уничтожения паразитов, свзязывания с антителам, диагностики и лечения злокачественных опухолей. В ряде других работ описаны методы получения кремнеземов с включением наночастиц серебра, которые служат в качестве антимикробных агентов против ряда грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий [14].

Повышенный интерес исследователей к гибридным нанообъектам на основе кремнезема и наночастиц металлов вызван в первую очередь появлением так называемых «квантовых размерных эффектов». Такие эффекты влияют на изменение физических свойств конечного материала. Особое место среди них занимают магнитные свойства. Анализируя литературные данные можно сказать, что проведение химических реакций в растворах представляет собой один из наиболее удобных путей получения магнитных частиц на основе кремнезема [15]. В данном случае синтез основан на комбинированном подходе, в основе которого лежит золь-гель метод с одновременным гидролизом смеси хлоридов железа (II) и (III) в соотношении 1 к 2, с помощью раствора аммиака [15]. В данном случае матрица кремнезема стабилизирует образующиеся в процессе гидролиза наночастицы Fe3O4, предотвращая их коагуляцию в растворе. Это

особенно важно, так как размер получаемых наночастиц влияет на магнитные свойства конечного материала (рис. 1.3).

О)

"В Е

с о '5 га

N

*5 Ф С О) го

(С) т

•6000 -3000 0 3000

АррМес) Р1е1с1 (Ое)

6000

Рис. 1.3. Наночастицы пористого кремнезема с включением Ее304 (а,б), демонстрация супермагнитных свойств полученных магнитных частиц (с,д) [15].

Такой же принцип иммобилизации нанообъектов в неорганическую матрицу кремнезема используется для включения флуоресцентных нанокристаллов или красителей. Длина волны максимума флуоресценции зависит от размера ядра нанокристалла. В настоящее время уже разработаны методики синтеза фотостабильных нанокристаллов, но широкое распределение частиц по размерам ограничивает их использование в качестве флуоресцентных меток. Другим недостатком является высокая токсичность входящих в состав нанокристаллов ионов. В связи с этим возникает актуальная проблема создания специальных защитных оболочек для стабилизации нанокристаллов и увеличения флуоресцентного эффекта. Наиболее близким по совокупности существующих мате-

риалов является кремнезем. В работе [16] предложен наиболее эффективный способ получения флуоресцентного гибридного материала на основе биодегра-дируемых наночастиц кремнезема. Помимо нанокисталлов для модификации кремнезема используют флуоресцентные красители. К примеру, в работах [17] для получения флуоресцентных наночастиц кремнезема использовали изотио-цианаты родамина и флюоресцеина. Благодаря данной модификации полученные наночастицы кремнезема способны флуоресцировать на различных длинах волн: ^тах = 390 нм для кумарина, Атах = 515 нм для флюоресцеина и Атах = 590 нм для родамина Б (рис. 1.4). Более того, было показано, что квантовый выход таких частиц составлет более чем 56 %, что позволяет рекомендовать данные частицы в качестве эффективных флуоросенсоров для диагностики и терапии различных патологий.

(а) (б) (с)

\ VИ \</ шН

Рис. 1.4. Фотолюминесцентные спектры и фотографии наночастиц кремнезема с включением флюоресцентных краситеоей (а - кумарин, б - флюоресцеин, с - родамин) [17].

На основе приведенного анализа публикаций можно сделать вывод, что использование традиционных подходов получения ульрадисперсных частиц кремнезема является уже не столь актуальным для практического применения. Поэтому для большинства применений наибольшая эффективность достигается при создании методик получения нанокомпозитных гибридных материалов, со-

16

держащих более двух функциональных компонентов, обладающих рядом свойств. Следует отметить, что ввиду отсутствия теоретической базы в области получения гибридных материалов перспективным направлением в современном материаловедении являются исследования, направленные на решения фундаментальной задачи - выявления закономерностей формирования морфологических структур кремнезема после его модификации, нахождения взаимосвязей типов получаемых структур гибридных материалов с их функциональными свойствами. Такие исследования в дальнейшем помогут разработать способы предварительной функционализации кремнезема с необходимыми свойствами.

1.1.1. Золь-гель технология как удобный инструмент нанотехнологии

Золь-гель метод - это совокупность стадий, включающих приготовление раствора прекурсора, последовательный перевод его сначала в золь, а затем в гель за счет процессов гидролиза и конденсации, с последующим высушиванием и термообработкой продукта [18, 19]. Однако, в последнее время этот термин часто используется для обозначения процессов, в которых отсутствует одна из этих стадий. При кажущейся простоте и универсальности этой схемы свойства оксидного материала оказываются чрезвычайно чувствительными к условиям процесса на всех его этапах. Обычно золь-гель метод включает в себя формирование металооксополимерных цепей - золя или геля из растворимых полигидроксокомплексов, образовавшихся в результате гидролиза металлоор-ганических комплексных или неорганических соединений. Образующиеся гид-ратированные оксиды обладают высокой химической активностью. Их дегидратация происходит при весьма низких температурах, иногда непосредственно в процессе гидролиза, и сопровождается образованием кристаллических или аморфных оксидов с малым размером частиц (й < 10 нм) и развитой поверхностью.

Получение наноматериалов из органосиликатов и алкоголятов металлов в золь-гель технологии известно уже достаточно давно [20]. Этот метод имеет

ряд преимуществ по сравнению с другими, в первую очередь, потому что прекурсоры, которые используются в синтезе, являются жидкостями и могут смешиваться с различными химическими компонентами, в ходе синтеза образовывать твердые структуры в виде пленок или порошков с различной морфологией. Золь-гель процесс является достаточно простым примером самоорганизации систем. Полученные с помощью данной технологии наноструктуры можно использовать в качестве темплатов для создания материалов с самой различной морфологией: пористой, монолитной и др.

Универсальными прекурсорами в золь-гель технологии являются алкого-ляты металлов. В настоящее время известны алкоголяты всех переходных элементов. Эти соединения чрезвычайно реакционноспособны по отношению к нуклеофильным частицам. Основным достоинством алкоголятов является то, что в результате гидролиза не образуется никаких посторонних ионов, а молекулы спиртов могут быть легко удалены путем промывания или термической обработкой. Чаще всего в золь-гель синтезе применяют тетраэтилортосиликат или тетраэтоксисилан (ТЭОС) и тетраметилортосиликат или тетраметоксисилан (ТМОС), которые смешиваются с водой и растворителем (чаще всего метанолом или этанолом) в определенных мольных соотношениях для формирования гомогенизированного раствора. Наиболее полно процессы гидролиза и поликонденсации изучены именно для данных типов прекурсоров. Информация о реакционной способности для алкоголятов переходных металлов оказывается гораздо более скудной вследствие их высокой химической активности. Как правило, в литературе проводят сравнение алкоголятов металлов и кремния. Основные различия между этими соединениями заключаются в следующем:

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тимин Александр Сергеевич, 2015 год

о V //

/ "К // \\

о

-о— БЬЯ—СН2-Б—

1 2 >—К

о

// \\

БН-белок

0

1

-о—БЬЯ—СН2-Б—Бч

I 2 \

о

белок

Рис. 1.32. Схема иммобилизации БН-белка через с 2-2'-дипропилдисульфид инициатор [114].

Известны методы ковалентной иммобилизации белков без использования инициаторов. Группа исследователей разработали одностадийный метод иммобилизации белка путем простого инкубирования его в течение 3 часов в фосфатном буфере (pH 8) вместе с аминомодифицированным кремнеземом в присутствии основания Шиффа [114]. В другой работе получен наноструктуиро-ванный кремнезем с привитыми на его поверхности аминогруппами. В дальнейшем с помощью аминогрупп на поверхности кремнезема ковалентно иммо-билизирована биомолекула №5-азидо-2-нитробензоилоксисукцинимид (АНБ-N0^, которая в свою очередь образует прочную ковалентную связь с антителами lgG [115]. Схема синтеза представлена ниже (рис. 1.33):

ж.

.о

-он -он -он

он + н5с2о—$г

ос2н5 ос2н5

-о

о

ос2н

2н5

о2ы

+

2

о

ют—ют-

—о

ос2н5

-ют9

о

N

—о.

—о-"

Рис. 1.33. Схема ковалентной иммобилизации lgG антитела на поверхности кремнезема [115].

Иммобилизация белка также возможна через глутаровый альдегид посредством образования амидной связи между карбоксильной группой глутаро-вого альдегида на поверхности наночастицы кремнезема и амино группы lgG антитела.

/ 4

/с Ч

н

н

а1

/Ч/Ч/с

\

н н

Магнитные частицы

Глутаровый альдегид

Магнитные частицы с активированнои глутаровым альдегидом поверхностью

Лиганд с доступным

амином (напр.. 1дО

Магнитные частицы с лигандом. иммобилизованным через амидную связь

Рис. 1.34. Иммобилизация lgG молекул на поверхность магнитной наночастицы с активированной глутаровым альдегидом поверхностью.

+

Таким образом, ковалентная иммобилизация обеспечивает прочное связывание белковых структур с поверхностью кремнезема, предотвращая или минимизируя десорбцию белков с поверхности кремнезема. При разработке методов ковалентной сшивки белковых структур с неорганическими матрицами нужно исходить из соответствующих целей использования материала. Методы нековалентной иммобилизации позволяют связывать белок непрочно с последующим его высвобождением при изменении условий среды. Такие материалы используются в качестве гетерогенных биокатализаторов, тогда как в случае же более прочного связывания белковых структур они применяются в адсорбционных процессах или наноконтейнерных технологиях для эффективного закрепления лекарственного средства с сохранением биоактивности. Однако все описанные методики ковалентной иммобилизации достаточно сложны и протекают в несколько стадий, как правило, с использованием органических растворителей, которые могут приводить к частичной или полной денатурации белка. Поэтому интерес исследователей в этой области смещается к разработке более простых одностадийных методов прочной иммобилизации белковых структур в матрицу кремнезема. Наиболее практически удобным методом являяется использование биосовместимых полимеров, которые могут прочно связываться с белками. В данной работе были исследованы основные аспекты иммобилизации альбумина в матрицу кремнезема с использованием поливинилпирролидо-на в качестве биосовместимого модификатора.

1.3. Основные принципы технологий создания материалов для адсорбции билирубина

Билирубин - это желчный пигмент, который относится к представителям семейства олигопироллов, большинство из которых имеют яркую окраску. Он является конечным продуктом катаболического распада гемоглобина [116 - 118 ]. В организме человека молекулы билирубина транспортируются в печень в виде макромолекулярного комплекса, связзаного с альбумином, и в

конце выводятся из организма в моче. Появление избыточных количеств билирубина в плазме крови человека свидетельствует о существенных нарушениях деятельности гепатобилиарной системы, что приводит к гепатиту и мозговой дисфункции [119, 120]. Обнаружение гепато- и нейротоксических свойств билирубина привело к потребности поиска путей для безопасного и эффективного удаления его излишков из плазмы крови.

На сегодняшний день существует несколько методов очистки плазмы крови от избыточной концентрации билирубина: плазмаферез, гемодиализ, фотовоздействие и др. Все эти методы имеют ряд недостатков, связанных с их низкой эффективностью и дороговизной проводимых процедур. Сейчас в современной научной литературе большое количество работ посвящено методу гемосорбции, позволяющий эффективно экстрагировать из плазмы крови билирубин и другие токсические вещества [121]. В основе механизма гемосорбции лежат адсорбционные процессы - поглощение и фиксация на гранулах адсорбента билирубина и других токсических веществ [122, 123]. На практике такая установка содержит специальный фильтр или картридж с адсорбентом, через который прогоняют плазму крови человека для детоксикации билирубина.

Уже описано огромное количество методов синтеза гемосорбентов, которые можно разделить на две группы: селективные и неселективные. В качестве неселективных сорбентов применяются активированные угли и ионообменные смолы [124, 125]. Использование таких типов сорбентов ограничено их низкой селективностью по отношению к билирубину. Сейчас идут разработки по созданию селективных гемосорбентов, позволяющих целенаправленно и избирательно удалять из крови билирубин. При этом многие селективные сорбен-

Соо- соо-

ты не нашли широкого применения в силу их высокой стоимости получения, поэтому помимо их эффективности следует учитывать простоту и доступность метода получения такого сорбента. Как правило, выделяют две основные стратегии получения селективных сорбентов для утилизации билирубина:

1) синтез пористых сорбентов с определенным размером пор и значением удельной поверхности;

2) синтез сорбента с последующей постмодификацей его поверхности различными функциональными группами для селективного связывания с билирубином.

В основе первого подхода лежит развитие темплатных методов синтеза пористых адсорбентов с высоким значением удельной поверхности и размером пор, удовлетворяющим размерам адсорбируемых молекул. Так с использованием темплатного метода [126] синтезировано три типа мезопористых кремнеземов: SBA-15, ^Г-б и MCM-41 для применения их в адсорбции билирубина из его водных растворов. Результаты исследования свидетельствуют о том, что степень адсорбции билирубина определяется типом пористой поверхности и уменьшается в ряду MCM-41 > ЫГ-6 > SBA-15. Установлено, что чем меньше размер пор, тем выше адсорбция билирубина. Темплатный метод синтеза кремнезема типа MCM-41 позволяет получать поры с размером ~ 2.6 нм, что отлично подходит для фиксации молекул билирубина в порах данного типа кремнезема. Кроме мезопористых кремнеземов в ряде работ описано методы получения углеродных нанотрубок с высокой удельной поверхностью для селективной адсорбции билирубина. Определенный размер и форма нанопоры в структуре углеродных нанотрубок позволяет пропускать только молекулы билирубина в физиологически смоделированной системе, содержащей также альбумины. Несмотря на простоту и дешевизну получения таких пористых адсорбентов на основе кремнезема, эффективность таких материалов может быть недостаточной в связи со сложностью получения однородных пор с одинаковой формой и размером. К тому же физическая адсорбция в мезопорах может сопровождаться частичной десорбцией билирубина в процессе проведения гемосорб-

ционной процедуры. Поэтому второй подход, основанный на постмодификации, является более эффективным, так как заключается в функционализации поверхности адсорбента функциональными группами или фрагментами, способных к селективному связыванию с билирубином посредством ковалентных, ионных и водородных связей, хотя синтез таких гемосорбентов более экономически затратный. В качестве основного компонента для функционализации выступает как и в первом случае кремнезем и углеродные нанотрубки. В случае кремнезема используют постмодификацию его поверхности засчет закрепления функциональных -СООН, КН2 и -СОКИ групп, что, как было отмечено в работе [127] приводит к значительному увеличению адсорбционной способности по отношению к билирубину. Молекула билирубина имеет две карбоксильные группы, которые при диссоциации в водном растворе образуют карбокси-анионы, формируя фиксируемый отрицательный заряд при рН 7.4. Напротив, -КН2 и -СОКИ группы в водном растворе будут протонироваться, придавая положительный заряд кремнезему, обеспечивая прочное связывание с карбоксильными группами билирубина благодаря электростатическому взаимодействию. Один из примеров такой модификации описан в работе [128], где поверхность сорбента изменена добавками амина: 1.6 - гексаметилендиамина и полиэтилен имина, что приводит к значительному снижению концентрации билирубина в испытуемых растворах по сравнению с немодифицированным сорбентом. Помимо кремнеземов для постмодификации в ряде работ предложены адсорбенты на основе нанокристаллического оксида титана (ТЮ2), поверхность которого, также, как и у кремнезема, легко функционализировать благодаря наличию -ОН групп [129 - 131].

Недостатком данных типов селективных адсорбентов, описанных выше, является их токсичность. В связи с этим поиск альтернативных биосовместимых гемосорбентов с высокой селективностью по отношению к билирубину становится актуальной задачей. Установлено, что применение биологически активных полимеров для синтеза адсорбентов значительно понижает их степень токсичности. Полимерные адсорбенты с высокой удельной поверхностью

характеризуются более быстрой кинетикой достижения адсорбционного равновесия и более высокой связывающей способностью по сравнению с неорганическими адсорбентами [132, 133]. В одной работе в качестве полимерного сорбента использовали поли-(глицидилметакрилат). Результаты исследования показали перспективность использования такого полимера для эффективной адсорбции билирубина и низкой его токсичностью. В другой работе показано практическое использование полимерных ионообменных синтетических волокон для селективной адсорбции билирубина [134] посредством электростатического взаимодействия моно- и дианионной форм билирубина с данными типом волокн. Установлено, что полиакриламидные частицы и поли-(стирол-дивинил-бензиден) тоже могут выступать в качестве полимерных адсорбентов для утилизации билирубина [135]. Кроме синтетических полимеров в качестве гемо-сорбентов используют природные белки, которые способны связываться с молекулами билирубина, образуя прочный межмолекулярный комплекс [136]. Применение таких сорбентов ограничено их нестабильностью и чувствительности к условиям хранения и повторному использованию, так как четвиртичная структура используемых белков может разрушаться от различных воздействий внешних условий: температуры, рН среды раствора и т. д.

Другим перспективным методом получения биосовместимых адсорбентов является синтез гибридных сорбентов, содержащих в своей структуре как органический, так и неорганический фрагменты. В качестве неорганических матриц выступают, как правило, пористые кремнеземы, графены и т.д. В работе [137] синтезирован гибридный адсорбент на основе аминокремнезема с включением альбумина. Благодаря альбумину удалось значительно повысить адсорбционную способность к билирубину без повреждения четвертичной структуры белка и сохранением его биологической активности для повторной гемосорбции. Также, с целью сохранения биосовестимости и понижения токсичности гемосорбента, в недавно опубликованной работе [138] описан синтез гибридного материала, где в качестве неорганической матрицы выступает гра-фен с последующей иммобилизацией хитозана. Хитозан является высокомоле-

кулярным соединением (полимером) с функциональными аминогруппами, которые протонируются в водном растворе и связываются с анионами билирубина посредством электростатических взаимодействий. К тому же наличие хито-зана значительно понижает токсичность графена и делает его более биосовместимым по отношению к организму человека. В целом показано, что природа биосовместимых полимеров в синтезе гибридных сорбентов определяет адсорбционную способность материала. Для создания гибридных сорбентов необходимо руководствоваться следующими принципами:

1) выбор экономически оправданных способов синтеза сорбентов,

2) использование низкотоксичных материалов,

3) подбор биосовместимых полимеров с высокой связывающей способностью по отношению к билирубину,

4) неоднократное их использование в гемосорбции.

Исходя из данных постулатов, мы можем сделать вывод, что выбор кремнезема в качестве основного компонента для создание гибридного сорбента является подходящим. Более того, в работе были использованы специальные полимеры на основе полигуанидинов, поливинилпирролидона и альбумина, обладающих биосовместимостью, а также их высокая реакционная способность открывает перспективу создания новых биматричных композиционных сорбентов, обладающих высокой селективностью по отношению к билирубину. Более того, используемый синтез является экономически целесообразным, так как не требует сложных манипуляций и предварительных стадий подготовки.

1.4. Технологии закрепления лекарственных веществ для последующей их адресной доставки

За прошедший период исследователи опробовали множество простых и сложных решений для лечения и профилактики онкологических заболеваний. Одними из наиболее распространенных методов являются фото- и химиотерапия [139 - 141]. Но возникает актуальная проблема разработки подходов дос-

тавки лекарственного препарата к раковым клеткам и применение простого механизма высвобождения лекарства при контакте с раковыми клетками. Идея направленной доставки лекарств имеет уже столетнюю историю, но реальное воплощение этой идеи в жизнь началась сравнительно недавно. Сейчас одним из перспективных подходов направленной доставки лекарственных препаратов является разработка и создания технологий эффективного закрепления лекарственного средства [142 - 144]. Данный подход базируется на использовании переносчиков лекарственных форм - специальных контейнеров или оболочек. В качестве носителей используются наночастицы, на поверхности которых могут размещаться лекарственные формы, или наноконтейнеры, когда лекарство размещено внутри частицы. Успех внедрения таких технологий зависит от глубины исследования поведения наночастицы в организме и молекулярных механизмов взаимодействия наночастиц с биологически активными соединениями и системами организма, поэтому выявление механизмов образования, доставки и разрушения комплекса «наночастица - лекарственный препарат» является основой новых технологий в инновационной биомедицине и фармакологии [145, 146].

Большое количество публикаций посвящено синтезу наночастикц с влю-чением лекарств на основе неорганической матрицы кремнезема [147 - 150]. Механизм закрепления лекарственных веществ на наночастицы кремнезема основан на создании в силикатной матрице пор определенного размера, сравнимых с размером загружаемого лекарства. Для этого часто используют темплат-ные методы синтеза. Например, в работе [151] опубликованы результаты исследования по синтезу полых мезопористых наночастиц кремнезема как эффективных контейнеров для загрузки доксорубицина, являющимся модельным лекарственным препаратом. Было установлено, что загрузка и высвобождение доксорубицина контролируется размером пор в наночастицах кремнезема: больший размер пор увеличивает степень высвобождения доксорубицина (рис. 1.35).

Для закрепления лекарственных препаратов на поверхность наночастиц кремнезема используют модифицированные кремнеземы с различными функциональными группами. Благодаря химической модификации поверхности наночастиц кремнезема удается существенно повысить степень закрепления лекарственного препарата.

#

HMSNsl

ф

HMSNs2

Роге

ТТТ

сххх

. Diffusion

♦

Роге expansion

Роге

DiffusioA- J .. tJ

-

I

♦

Further porc expansion

г

Pore

..,' Diffusion, ...

У

HMSNsЗ -

Рис. 1.35. Схема, демонстрирующая влияние размера мезопор на высвобождение доксоруби-цина; (а) модель полой наночастицы мезопористого кремнезема; картинки электронного микроскопа наночастиц кремнезема с различным размером пор: 3.2 нм (б); 6.4 нм (с); 12.6 нм (д) [151].

Так в работе [152] были получены наночастицы кремнезема с привитыми на поверхности карбоксильными, метилфосфатными и фенильными группами. Фосфатные группы на поверхности кремнезема характеризуются большей электроотрицательностью чем гидроксильные группы обычного кремнезема [153] (значение зета-потенциала обычного кремнезема составляло -20 мВ при рН 7.4, тогда как значение зета-потенциала фосфат-модифицированного кремнезема было - 28 мВ). Таким образом, более электроотрицательные заряженные фосфатные группы позволяют закрепить большее количество молекул док-сорубицина (рКа = 8.2). Такой же эффект обнаружен и в случае карбоксильных

групп, которые легче депротонируются чем -ОН группы, повышая степень закрепления лекарства - доксорубицина.

Несмотря на обилие публикаций по системам доставки лекарств к клеткам на основе неорганических матриц кремнезема, более приоритетным направлением в разработке средств целевой доставки лекарств следует считать биологические или полимерные наноконтейнеры [154, 155]. Наиболее известными из используемых полимерных контейнеров являются молекулы цикло-декстринов и каликсаренов. Также большое количество работ посвящено использованию сополимера на основе полиэтиленгликоля и полиметакрилата [156]. Для создания биополимерных контейнеров используют также природные белковые нанокапсулы с биосовместимыми полимерными оболочками. Одним из примеров таких контейнеров описан в работе [157], где были получены дек-стран-хитозановые наночастицы с включением альбумина для эффективной загрузки доксорубицина. Схема синтеза представлена на рис. 1.36. Синтез основан на электростатическом взаимодействии между положительно заряженными частицами хитозана и отрицательно заряженными группами альбумина, которые образуют вместе прочный электростатический комплекс, формируя в итоге сферические наночастицы.

Рис. 1.36. Схема образования декстран-хитозановой наночастицы с включением альбумина.

Сравнительно недавно в области разработки наноконтейнеров интерес исследователей смещается на проектирование так называемых «интеллектуаль-

ных» наноконтейнеров. Такие наноконтейнеры способны закреплять большое количество лекарства при одних условиях и показывать максимальное высвобождение лекарства при доставке его непосредственно к области, где лекарство будет взаимодейтсвовать селективно только с поверхностью определенной клетки. Особый интерес в этой области представляют собой применение биосовместимых полиэлектролитов [158]. Ионные свойства таких полиэлектролитов, которые меняют заряд полимерной цепи в зависимости от значения рН среды, позволяют использовать их для эффективной загрузки доксорубицина с последующим его высвобождением. Механизм действия таких полиэлектролитов заключается в том, что при одном значении рН они способны закреплять максимальное количество лекарственного препарата, затем попадая внутрь организма и проникая в раковую клетку, где другое значение рН, происходит высвобождение данного лекарства. К сожалению, в настоящее время известно относительно мало полиэлектролитов, имеющих реальный практический интерес для медицинского применения. К примеру, в ряде работ описаны методы получения наноконтейнеров на основе мезопористого кремнезема и полиэлектролита акриловой кислоты. Были получены контейнеры также на освное кремнезема, но модифицированного полиэтилегликолем с гидразиновыми группами. Гидразин позволяет связывать большее количество доксорубицина и контролировать его высвобождение путем изменения рН среды (рис. 1.37).

Исследования, проведенные в лаборатории «Высокомолекулярных соединений» Кабардино-Балкарского Государственного Университета им. Бербе-кова (руководитель лаборатории С.Ю. Хаширова) в области синтеза новых гуа-нидинсодержащих полиэлектролитов и нанокомпозитов на их основе, показали, что данные соединения являются перспективными кандидатами для создания «интеллектуальных» полимерных систем. Они обладают способностью к самоорганизации, нетоксичны и обладают собственной биологической активностью по отношению к грамм-положительным и грамм-отрицательным микробным клеткам [161]. Полученные данные свидетельствуют в пользу предположения о том, что они могут быть участниками молекулярных механизмов, осуществ-

ляющих запуск каскадов важнейших биологических событий в живом организме. Благодаря богатым конформационным возможностям синтезированных макромолекул, они способны к самосборке и молекулярному распознаванию [162].

Рис. 1.37. Модификация мезопористого кремнезема полиакриловой кислотой (а); модификация поверхности наночастицы кремнезема полиэтиленгликолем (ПЭГ) и гидразином и илюстрация влияния гидразиновых групп (КН2) на степень закрепления доксорубицина (б) [159, 160].

Цвиттер-ионное строение, наличие активных функциональных карбоксильных и аминных групп придает полученным полимерам высокие комплек-сообразующие способности и открывает возможность получения комплексов и супрамолекулярных ансамблей с широким кругом органических и неорганических ионов и молекул, в том числе различными антителами, липидами и другими биомолекулами [163]. Однако в литературе практически нет информации о применении полигуанидинов для разработок бисовместимых наноконтейнеров в системах переноса различных лекарственных препаратов путем их нанокап-сулирования с возможностю контроля высвобождения оптимальной дозы лекарства. В связи с этим разработка новых наноконтейнеров с применением по-лигуанидинов с последующим исследованием молекулярных механизмов обра-

зования, природы возникающих химических сил и межмолекулярных взаимодействий полигуанидинов, а также выявление механизма эффективной загрузки лекарства является актуальной мультидисциплинарной задачей современной химии и медицины. В данной работе полигуанидины используются для модификации поверхности наночастиц кремнезема. Но следует отметить, что способность гуанидинсодержащих мономеров к радикальной полимеризации открывает возможность использования их для модификации других неорганических и органических материалов.

Глава 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Золь-гель синтез немодифицированных и модифицированных кремнеземов

2.1.1. Прекурсоры

В настоящей работе для золь-гель синтеза использовались соответствующие прекурсоры:

1. Тетраэтоксисилан Si(OC2H5)3 (ТЭОС > 98%) квалификации «ос.ч. 14-5» фирмы ОАО «Экос-1»;

2. Октилтриэтоксисилан CHз(CH2)7Si(OC2H5)з (ОТЭОС > 97.5%, Ым= 276.49 г/моль, 84-85 плотность 0.88 г/мл при 25 ^ );

3. Фенилтриэтоксисилан C6H5Si(OC2H5)3 (ФТЭОС > 98%, Ы^= 240.37 г/моль, 112-113 °С, плотность 0.996 г/мл при 25 °С );

4. Уринопропилтриметоксисилан (CH3O)3Si(CH2)3NHCONH2 (УПТМОС > 97%, Ы^= 222.31 г/моль, 217-250 °С, плотность 1.15 г/мл при 25 ^ )

Структурные формулы используемых кремний содержащего прекурсора и ор-ганосиланов с октил-, фенил- и уринопропил функциональными группами

Тетраэтоксисилан (ТЭОС)

Октилтриэтоксисилан (ОТЭОС)

Фенилтриэтоксисилан (ФТЭОС) Уринопропилтриметоксисилан (УПТМОС)

Для синтеза кремнеземов, модифицированных полимерами, использовались альбумин бычий сывороточный (БСА) квалификации «х.ч.» фирмы «Агат-Мед» (БСА > 96 %, ~ 66 kDa), поливинилпирролидон (ПВП) фирмы «Sigma-Aldrich» США (C6H9NO)n (ПВП, Mw= 10 000 г/моль). Гуанидинсодержащие полимеры: полиакрилат гуанидин (ПАГ) и полиметакрилоилгуанидин гидрохлорид (ПМГГХ) были предоставлены С. Ю. Хашировой, которые синтезированы на кафедре высокомолекулярных соединений Кабардино-Балкарского государственного университета им. Х.М. Бербекова, очищались путем двойной перекристаллизации из водно-ацетоновой смеси с дальнейшей сушкой под вакуумом при 60 °С. Молекулярные массы синтезированных полимеров по данным седиментационного анализа составили ~ 400 000 и ~ 800 000 для ПАГ и ПМГГХ соответственно. Степень очистки кристаллических образцов полимеров контролировалась ИК-спектрометрически в таблетках КВг на ИК-Фурье-спектрофотометре Avatar 360 FT-IR ESP в частотном диапазоне 500-4000 см-1 при комнатной температуре.

Структурные формулы полимеров, используемых в золь-гель синтезе

ПВП

Для исследования адсорбции билирубина из его водных растворов при pH 7.4, регулируемым фосфатным буфером, использовали билирубин квалификации «х.ч.» фирмы «Aldrich» США ^^^^ (> 98%, Mw= 584.66 г/моль). Выбор такого значения pH обусловлен тем, что такая система хорошо моделирует физиологические условия. В качестве модельных лекарств для изучения степени закрепления и последующего pH-высвобождения использовали доксо-рубицин квалификации «х.ч.» С27H25NO11•HQ (> 98%, Мм= 579.98 г/моль) и сульфасалазин квалификации «х.ч.» С18H14N4O5S (> 98%, Мм= 398.39 г/моль) фирмы «Sigma-Aldrich» США. Также для золь-гель синтеза использовались вспомогательные реагенты: этиловый спирт (С2H5OH) квалификации «ч. д. а.», аммиак водный ГОСТ 24147 - 80 W(NH3)=5% и соляная кислота.

2.1.2. Методика синтеза немодифицированного кремнезема

Синтез немодифицированного кремнезема проводили при комнатной температуре в присутствии этилового спирта (С2H5OH) в условиях постоянного перемешивания. Для этого в колбу с магнитной мешалкой помещали 4 г ТЭОС и 1.668 г воды в мольном соотношении 1 к 4. Затем в систему вносили по каплям небольшое количество 5 % раствора аммиака для протекания щелочного гидролиза (pH 8). Синтез проводили при постоянном перемешивании в течение 2 - 3 ч, после чего выключали магнитную мешалку и оставляли систему на двое суток до более полного протекания стадии гидролиза и поликонденсации ТЭ-ОС. Полученный материал отфильтровывали и высушивали в вакуумном шкафу при температуре 95 °С до постоянной массы.

2.1.3. Методика синтеза органо-модифицированных кремнеземов

Для синтеза октил-модифицированного кремнезема использовали ТЭОС и ОТЭОС в мольном соотношении 4:1, 3:1 и 2:1 соответственно. В синтезе [ТЭОС]: [ОТЭОС] = 4:1 мы использовали 6.48 г. ТЭОС и 1.82 г ОТЭОС; к полученной смеси добавляли 20 мл водно-этанольного раствора, содержащего 2.66 г

воды. Полученную смесь сначала интенсивно перемешивали до гомогенизации раствора, потом скорость перемешивания снижали до средней и перемешивали в течение 3 - 4 ч с периодическим добавлением 0.005 мл 5 %-го раствора аммиака до образования коллоидных частиц. Полученный раствор с коллоидными частицами помешали в чашку Петри и оставляли на 3-е суток до более полного протекания гидролиза и поликонденсации. Полученный материал промывали несколько раз в водно-этанольном растворе и высушивали в течение 2-х дней при температуре 95 °С под вакуумом до постоянной массы. Аналогичную последовательность действий осуществлено для других органо-модифицированных кремнеземов с фенил- и уринопропил функциональными группами. В таблице 2.1 представлены количества используемых реагентов для каждого синтеза с варьированием содержания органосилана.

Таблица 2.1. Количество используемых прекурсоров для золь-гель синтеза органо-модифицированных кремнеземов

Тип образца [ТЭОС]:[ОТЭОС] ОТЭОС, г ТЭОС, г

(мольное соотношение)

СС;8ЮТ-1 4:1 1.82 6.48

3:1 2.28 6.08

С^ЮТО 2:1 3.05 5.41

[ТЭОС]:[ФТЭОС] ФТЭОС, г ТЭОС, г

(мольное соотношение)

РЬ8№-1 4:1 1.88 6.48

РЬ8№-2 3:1 2.34 6.08

РЬ8№-3 2:1 3.12 5.04

[ТЭОС]:[УПТМОС] УПТМОС, г ТЭОС, г

(мольное соотношение)

4:1 1.74 6.48

3:1 2.17 6.08

2:1 2.89 5.04

2.1.4. Методика синтеза кремнеземов, модифицированных

полигуанидинами

Синтез кремнеземов, модифицированных полигуанидинами, проводили в соответствии со следующей методикой: 8.57 мл ТЭОС помещали в колбу, снабженную магнитной мешалкой. Затем 10 мл водного раствора, содержащего определенную концентрацию полимера (от 44 до 78 мг/мл) добавляли к ТЭОС и перемешивали до гомогенизации смеси (30 - 40 мин). К полученному однородному раствору капельно добавляли каждые 30 мин 5 %-й раствор аммиака при перемешивании в течение 5 ч. После чего выключали магнитную мешалку и оставляли систему в колбе на 4 дня для более полного протекания гидролиза, а также для процесса «старения» - образование гелеобразной суспензиии. Затем полученный порошок отфильтровывали и высушивали в ваккумном шкафу при температуре 95 °С. Количество исходных реагентов для синтеза модифицированных кремнеземов представлены в табл. 2.2. После высушивания все образцы несколько раз провывали в дистиллированной воде до прекращения процесса вымывания полимера. Процесс вымывания котролировали термогравиметрически. Данная процедура была проведена для удаления слабо связанного полимера с поверхности образующихся наночастиц кремнезема.

Таблица 2.2. Количество исходных реагентов, используемых для золь-гель синтеза полимер модифицированных кремнеземов

Тип образца ТЭОС, мл Н20, мл С Сполимера, Время выдержки

мг/мл

8ЮТ@рла-1 8.57 10 45 4 дня

8ЮТ@РАО-2 8.57 10 56 4 дня

8ЮТ@РАО-3 8.57 10 77 4 дня

8ЮТ@Рмсан-1 8.57 10 46 4 дня

8ЮТ@РМСОН-2 8.57 10 57 4 дня

8ют@рмсан-з 8.57 10 78 4 дня

2.1.5. Методика синтеза кремнеземов, модифицированных поливинилпирролидоном с последующей иммобилизацией альбумина

Данную методику синтеза можно разделить на 2 стадии: 1) включение ПВП еще на стадии золь-гель синтеза; 2) иммобилизация альбумина адсорбционным путем.

В золь-гель синтезе ПВП модифицированного кремнезема использовали кислотно-основный катализ. Для этого 8 г ТЭОС смешивали с 20 мл этанола, содержащий 2.8 г водного раствора с определенным содержанием ПВП ( от 0.08 до 0.24 г). Полученную смесь перемешивали в течение 30 мин с добавлением раствора соляной кислоты до рН 4. Затем по каплям добавляли 5 %-й раствор аммиака каждые 30 мин в течение 3 - 4 ч до образования желеобразной субстанции. Полученный продукт перемещали в чашку Петри и отстаивали в течение 3-х дней, затем промывали несколько раз и высушили под вакуумом при температуре 95 °С в течение 3 дней.

Стадия иммобилизации альбумина заключалась в следующем: 10 мл водного раствора БСА (4 мг/мл) инкубировали с 125 мг ПВП модифицированного кремезема в течение 4 ч. После чего частицы кремнезема отделяли от водной фазы центрифугированием и высушивали в течение дня под вакуумом. Концентрацию БСА до и после центрифугирования определяли спектрофотометриче-ски на длине волны 280 нм (БСА в280 = 41 000). Количество исходных реагентов для данного золь-гель синтеза представлены в табл. 2.3.

Таблица 2.3. Количество и соотношение исходных реагентов для золь-гель синтеза ПВП-модифицированного кремнезема с включением альбумина

Тип Массовое соотношение ис- Количество Концентрация Время

образца ходных реагентов ПВП, г БСА, мг/мл выдержки

Si-PVP-1 ТЭ0С:ПВП:C2H50H:H20 = 8:0.08:21:2.8 0.08 4 3 дня

Si-PVP-2 ТЭ0С:ПВП:C2H50H:H20 = 8:0.1:21:2.8 0.12 4 3 дня

Si-PVP-3 ТЭ0С:ПВП:C2H50H:H20 = 8:0.16:21:2.8 0.16 4 3 дня

Si-PVP-4 ТЭ0С:ПВП:C2H50H:H20 = 8:0.24:21:2.8 0.24 4 3 дня

2.2. Методы исследования состава, структурно-морфологических и поверхностных свойств синтезируемых материалов

2.2.1. Элементный анализ

Содержание углерода, водорода и азота, входящих в состав полимеров, которые использовали в золь-гель синтезе для модификации матрицы кремнезема, определяли на приборе CHNS Elemental Analyzer Flash 1112. Данный анализатор предназначен для одновременного определения массовой доли углерода, водорода, азота и серы, содержащихся в наших полимер модифицированных кремнеземах. Методика выполнений эксперимента представлена в [164]. Стадии выполнения эксперимента заключаются в следующем.

Навеску образца (20 мг) помещают в специальную ячейку. Предварительно систему промывают инертным газом - гелием (скорость подачи 120

-5

см /мин.). Затем вместе с гелием вводят определенную порцию кислорода 10

-5

см , очищенного от азота, углерода и влаги, чтобы это не вносило погрешность в полученные результаты. Исследуемый образец сбрасывается в реакционную

кварцевую ячейку при температуре 1000 °С, где протекает экзотермическая ре-

66

акция образования оксидов азота и углерода (II, IV), водорода. Вместе с инертным газом-носителем смесь газообразных продуктов сгорания, проходя через поверхность катализатора (Сг203), поглащается оксидом кобальта (II, III) на серебре (Co304/Ag). После этого избыток кислорода, оксиды азота и углерода (IV) вместе с гелием поступают в восстановительную трубку, заполненную чистой проволочной медью, где при температуре 750 °С поглощается кислород, а оксиды азота восстанавливаются до молекулярного азота. Далее смесь газов (СО2, N2 и Н2О) проходит через адсорбционную ловушку для влаги, заполненную ан-гидроном (Mg(Cl04)2), и подается в газохроматографическую колонку, заполненную адсорбентом - сополимерами стирола и дивинилбензола (Porapak QS). При температуре 60 °С смесь разделяется на компоненты, выходящие в следующем порядке: молекулярный азот, оксид углерода (IV). Сигналы, индикаторные для каждого компонента газовой смеси, генерируются детектором (по теплопроводности), обрабатываются с помощью компьютерной программы Eager 200 и выдаются на мониторе компьютера в виде хроматограммы, а значения интегральных интенсивностей пиков, соответствующих N2 или СО2, распечатываются на бумаге. Так как интегральная интенсивность пика на хромато-грамме зависит от условий проведения анализа, предварительно перед каждой партией исследуемых проб трижды проводят градуировку прибора с использованием стандартных образцов. Кроме того, на хроматограмме трижды контролируют интенсивность "шумов", возникающих при сжигании пустой капсулы ("холостой" опыт).

Содержание гуанидинсодержащих полимеров в силикатной матрице определяли по результатам элементного анализа, исходя из массовой доли азота в исследуемом образце. Общая формула для расчета степени иммобилизации полимера в матрицу кремнезема имеет вид:

W - W

Степень иммобилизации (GY, %) = —-- х100 ,

W0

где W1 и W0 массы образцов до и после иммобилизации полимера соответственно. Содержание гуанидин содержащих полимеров в силикатной мат-

рице определяли по результатам элементного анализа из массовой доли азота в

исследуемом образце. Вывод уравнения представлен ниже.

Общая формула для расчета степени иммобилизации полимера в матрицу

кремнезема:

Ж - ж

Степень иммобилизации (GY, %) = —-- х100, где ^ и Ж0 массы образцов до

и после иммобилизации полимера соответственно.

Известно, что массовая доля элемента в образце рассчитывается по формуле:

= Mn4v х10° (%), где mN масса азота в кремнеземе, модифицированном гуа-

нидинсодержащими полимерами (Wj).

Так как в структурной формуле полигуанидинов содержится 3 атома азота, то уравнение для расчета массы полимера имеет следующий вид:

1 mN 'Mpolymer

m =_•_

polymer

3 Mn , где mN масса азота в образце, Mpoiymer и MN молярная масса полимера и атомный вес азота соответственно.

Таким образом, подставляя в первое уравнение последние два, мы получаем

общую формулу для расчета степени иммобилизации полигуанидинов, исходя

из массовой доли азота в исследуемом образце:

W - W m , Степень иммобилизации (GY, %) = =-

W W - m

'' 0 '' 1 mpolymer

1 ш MPolymer /

-2 N /М

Степень иммобилизации (GY, %) = —-^—х 100

1 -1 ■ Mp°'y™r/

3 N /М

N

где а>м %-ое содержание азота в образце ; Мро1утег и Мм молярная масса полимера и атомный вес азота в полимерной цепи.

Конечное уравнение для расчета степень иммобилизации поливинилпир-ролидона имеет следующий вид:

Степень иммобилизации (GY, %) w(N) 'M ( PVP V M (N) х10о,

v 7 (1 - w( N ) • M (PVP )/ M ( N ))

где w(N) содержание азота в исследуемом образце ; M(PVP) и M(N) молярная масса поливинилпирролидона и атомный вес азота в полимерной цепи соответственно.

2.2.2. ИК-спектрокопия

Для получения ИК-спектров синтезированных порошков были приготовлены образцы в виде таблеток, спрессованных из смеси бромида калия квалификации «х.ч.» и 0.1 - 0.2 % исследуемого материала. ИК-спектры регистрировали на ИК-Фурье-спектрофотометре Avatar 360 FT-IRESP в частотном диапазоне 400-4000 см-1 при комнатной температуре. Точность определения длины волны ± 0.5 см-1. Концентрация образцов подбиралась так, чтобы коэффициент пропускания наиболее интенсивной полосы составлял не менее 10 %.

2.2.3. Термогравиметрия

Исследования термической стабильности образцов проводили на дерива-тографе STA 449 F3 Jupiter (Netzsch, Германия) в статической атмосфере аргона, в неизотермическом режиме со скоростью нагрева 10 град/мин, в интервале 21 ^ 900 °С. Точность определения температуры ± 0.5°С, точность измерения массы образца ± 0.2 мг. Регистрируемые прибором сигналы (Т - кривая изменения температуры, ТГ - кривая изменения массы образца под действием температуры во времени, ДТГ - дифференциальная кривая скорости изменения массы, ДТА - кривая дифференциально-термического анализа образца) обрабатывались с помощью программного комплекса «NETZSCH Proteus».

Содержание вводимых в ходе золь-гель синтеза полимеров определяли по формуле:

Степень иммобилизации (%)

AWinitial - AWfinal

х100 ,

v 7 AWfinal

где AWinitial and A Wfmal это убыль массы образца до и после термической деструкции полимеров.

2.2.4. Низкотемпературная адсорбция/десорбция азота

Метод адсорбционных данных для построения изотерм адсорбции основан на измерении количества газа, удаленного из газовой фазы при адсорбции. Полученные данные были обработаны с помощью программного обеспечения Micromeretics с математическим описанием теории BJH и BET. BET - метод математического описания физической адсорбции, основанный на теории полимолекулярной (многослойной) адсорбции. Метод предложен Брунауэром, Эм-метом и Тейлором. В нем используются следующие допущения: поверхность адсорбента однородна; взаимодействие адсорбент-адсорбат сильнее, чем ад-сорбат-адсорбат; взаимодействие адсорбированных молекул учитывается только в направлении, перпендикулярном поверхности, и рассматривается как конденсация. Линейная форма изотермы адсорбции (уравнения БЭТ) имеет вид

где рУр8 — отношение давления в системе к давлению конденсации, а;— величина адсорбции, ат— объем монослоя на поверхности адсорбента, Сг- — отношение констант адсорбционного равновесия в первом слое и константы конденсации. Основной практической целью применения метода БЭТ является нахождение площади поверхности пористого твердого тела. Для этого получают экспериментальную зависимость адсорбции а от давления р/р8 при постоянной температуре (изотерма адсорбции), после чего по уравнению БЭТ вычисляют величину ат и, затем, число молекул в монослое. Зная площадку, занимаемую одной молекулой, можно рассчитать суммарную площадь поверхности адсор-

бента любой формы и пористости. Зная удельный вес материала порошка (р) и определив удельную поверхность порошка (8уд), а также предполагая сферическую форму частиц, можно оценить их средний диаметр по формуле: D = 6 / (8уд* р). При этом следует иметь в виду, что такой расчет основан на допущениях о сферической форме частиц и об отсутствии пористости. Во многих случаях метод может дать заниженную оценку среднего диаметра частиц. Принято считать, что метод БЭТ можно использовать для определения площади поверхности с точностью 5-10 % в интервале значений относительного давления (pi/ps) 0,05-0,35. Для более детального анализа пористой структуры твердого тела (вычисление доли пор различного диаметра в общей пористой структуре) по изотермам адсорбции используют дополнительные расчетные модели (например, метод BJH). Метод Barrett-Joyner-Halenda (BJH), предложенный в 1951 г., изначально был разработан для относительно широкопористых адсорбентов, обладающих широким распределением пор по размерам. Однако было многократно показано, что он может быть успешно применим практически ко всем типам пористых материалов. В основу модели положено допущение о цилиндрической форме пор и то, что радиус поры равен сумме радиуса Кельвина и толщины адсорбированной на стенке поры пленки. В качестве исходных данных для расчетов по методу BJH используют, как правило, десорбционную ветвь изотермы (хотя использование адсорбционной ветви также возможно) в интервале давлений pi/ps = 0,4-0,967. При таком расчете поры с диаметром более 60 нм не учитываются.

Физические характеристики были получены с помощью метода адсорбции/десорбции азота на анализаторе ASAP 2020 (Micrometrics) при Т = 77 К.

2.2.5. Растровая (сканирующая) электронная микроскопия

Данный метод позволяет получить качественную картинку морфологии и структуры исследуемого образца. Принцип растровой электронной микроскопии (РЭМ) заключается в сканировании участка исследуемого образца узко-

сфокусированным электронным зондом и детектировании возникающих при этом сигналов. Изображение строится синхронно с разверткой зонда на образце таким образом, что каждому положению пучка на поверхности образца соответствует точка (пиксел) на мониторе микроскопа. При взаимодействии электронов пучка с образцом происходит ряд явлений: эмиссия вторичных, отраженных и Оже-электронов, рентгеновское излучение, генерация электронно-дырочных пар и др. Особенности получаемых сигналов напрямую зависят от свойств исследуемых веществ (шероховатость поверхности, однородность состава, проводимость и др.), что позволяет изучать их локальные характеристики. Основные преимущества РЭМ: неразрушающая методика (в общем случае не происходит нарушение структуры поверхности твердого тела), относительная простота подготовки образцов для анализа (по сравнению, например, с просвечивающей микроскопией), экспрессность (малое время, необходимое от момента загрузки образца в камеру до получения изображения), а также широкий спектр анализируемых твердых тел: от металлов и полупроводников, до диэлектриков, порошкообразных и биологических объектов.

Пространственное разрешение сканирующего электронного микроскопа зависит как от диаметра электронного пучка, так и от размера области взаимодействия электронного зонда с образцом. Размер электронного зонда и размер области взаимодействия зонда с образцом намного больше расстояния между атомами мишени. Хотя разрешение растровых электронных микроскопов уступает разрешению просвечивающих микроскопов, они имеют ряд преимуществ, таких как возможность изучения топографии образца, визуализация сравнительно большой области образца, исследование массивных объектов (а не только тонких пленок), набор аналитических методов, позволяющих измерять состав и свойства изучаемого объекта. В зависимости от конкретного прибора и параметров эксперимента, может быть получено разрешение от десятков до доли нанометра.

Исследование образцов полученных немодифицированного и модифицированных кремнеземов проводили на двух сканирующих микроскопах:

1) SEM LEO 1550, Center of MicroNanotechnology (CMI), EPFL;

2) Tescan Mira 3 XM серии MIRA с катодом с полевой эмиссией типа Шотт-ки, ИПСМ РАН, УФА

Описание SEM LEO 1550 и принцип его работы можно найти на сайте университета EPFL (https://cmi.epfl.ch/metrology/LEO 1550.php). Перед проведением эксперимента следует правильно приготовить образцы. Для этого готовилась спиртовая суспензия (5 мл этанола и 20 мг образца). Данная суспензия наносилась монослоем на медную сферическую подложку размером 1 см, после чего ее отсушивали сначала при комнатной температуре, а затем под вакуумом. Полученный образец, нанесенный на медную подложку помещали в камеру

п

электронного микроскопа, вакуумировали под давлением 10- мбар. Затем исследуемый образец загружали на сканирующую ячейку и нажимали кнопку «sample observation, EHT on». Рабочая дистанция между электронной пушкой и поверхностью исследуемого образца составляла 3 - 4 мм. Напряжение подачи электронов составляло 3 - 5 кВ. Сканирование поверхности образца осуществлялось с помощью джостика, который позволяет перемещаться в X, Y направлениях, а также изменять угол поворота. Исследование поверхности образца проводили с использованием двух видов сигнала: 1) InLens (детектор высокого разрешения); 2) SE2 (детектор для топографии). Первый детектор позволяет более детально исследовать поверхность образца, тогда как второй позволяет анализировать морфологию поверхности образца. Для данного прибора скорость сканирования можно варьировать. Для наших образцов скорость сканирования составляла от 1 до З pixel averaging.

(б)

Сканирующий электронный микроскоп

лт

HR SEM - Zeiss Merlin Электронная пушка

Линзы

детектор

\

образец

Рис. 2.1. Сканирующий (растровый) электронный микроскоп (а); принцип сканирования поверхности исследуемого образца (б).

2.2.6. Трансмиссионная электронная микроскопия

В отличие от сканирующего электронного микроскопа трансмиссионный микроскоп обладает большей разрешающей способностью. Благодаря этому такой электронный микроскоп позволяет увидеть и изучить строение отдельных молекул, вирусов, коллоидов. Исследование образцов полученных немодифи-цированного и модифицированных кремнеземов проводили на трансмиссионном электронном микроскопе JEOL 2200FS, EPFL. Описание данного микроскопа и принцип его работы можно найти на сайте университета EPFL (http://cime.epfl.ch/jeol-2200fs). Электронный пучок подавался с напряжением 80 - 200 кВ. Перед проведением эксперимента исследуемый образец наносился на специальную сетку (Рис. 2.3а). Стандартный диаметр сетки - 3.05 мм Для этого готовилась спиртовая суспензия (5 мл этанола и 20 мг образца), которая монослоем наносилась на данную сетку, после чего отсушивали сначала при комнатной температуре, а затем под вакуумом. Затем данная сетка закреплялась на

74

специальном держателе (Рис. 2.36) приспособленый для фиксации сеток с образцов. Этот держатель устанавливается непосредственно в вакуумную среду микроскопа с минимальным увеличением давления между магнитными линзами, куда подается электронный пучок.

Рис. 2.2. Сетка для поддержки образцов (а); держатель для фиксации сеток с образцом (б).

Рис. 2.3. Трансмиссионный электронный микроскоп (а); принцип сканирования поверхности исследуемого образца (б).

2.3. Исследование функциональных свойств синтезируемых материалов

2.3.1. Методика исследования адсорбции билирубина на поверхности немодифицированного и модифицированных кремнеземов из водных растворов

Для изучения процессов адсорбции из водных растворов билирубина использовались электронная спектроскопия поглощения (ЭСП) в видимой и УФ-области. Диапазон длин волн: 350-800 нм. Спектры регистрировали на спектрофотометрах СФ-103 и СФ-104 («Аквилон», Россия), управляемых с ПК при помощи соответствующих программных комплексов.Точность измерений составила ±0.03 по шкале оптической плотности, точность измерения длины волны ±0.05 нм. Исследования проводили в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 2 и 10 мм, помещенных в термостатируемую при 298.15 К ячейку Пелтье.

Водные растворы билирубина готовили путем растворением навески пигмента в 1 мл раствора щелочи (pH 12) с последующим разбавлением в фосфатном буфере (pH 7.4). Для приготовления фосфатного буфера использовали дигидрофосфат натрия ^аН2Р04, «х.ч.», Химмед, Россия), который дважды пе-рекристоллизовывали и высушивали. Точность установления pH буферного раствора контролировали с использованием ионометрического преобразователя и-500 «Аквилон».

Точную концетнрацию хромофора (билирубина) в растворе до и после адсорбции определяли по значению оптической плотности на максимуме поглощения при 438 нм из закона Ламберта - Бугера - Бера: А = е-с-/,

где А - оптическая плотность раствора; е - молярный коэффициент поглощения; с - молярная концентрация адсорбата в воде (моль/л); / - толщина кюветы (светопоглощающего слоя).

Адсорбцию билирубина исследовали в статическом и динамическом режимах. В динамическом режиме 5 мл раствора билирубина инкубировали с 50 мг адсорбента. В определенный момент времени суспензию цетрифугировали и

снимали спектр поглощения аликвоты. Из полученных данных строили кинетические кривые адсорбции билирубина (/(время) = значение адсорбции).

В статическом режиме после определения оптимального времени адсорбции 5 мл раствора с различной концентрацией билирубина инкубировали с 50 мг адсорбента. После достижения адсорбционного равновесия суспензии центрифугировали и одну аликвоту раствора анализировали на спектрофотометре для определения концентрации билирубина после адсорбции.

Количество адсорбированного пигмента (значение адсорбции, Q) определяли по разнице его исходной и остаточной концентрации в растворе:

■о (С0 _ Cads)V ц 4

Q =--MBR

m ,

где С0 - исходная концентрация раствора адсорбата, Cads - концентрация ад-сорбата после установления адсорбционного равновесия, V - объем раствора, m - масса сорбента, Мж-молярная масса билирубина.

Водные растворы билирубина (pH 7.4) до адсорбции

Рис. 2.4. Адсорбция билирубина в стаическом режиме; V = 5 мл; т = 50 мг сорбента, Т = 25 0С.

2.3.2. Методика закрепления доксорубицина и сульфасалазина и исследование процессов их контролируемого рН-высвобождения

В качестве модельных лекарств для закрепления были выбраны доксору-бицин и сульфасалазин. Содержание лекарств в приготовленных растворах определяли по электронным спектрам поглощения на длине волны 360 нм для сульфасалазина и 485 нм для доксорубицина соответственно.

Для закрепления лекарств 1 мл 0.5 мг/мл свежеприготовленного раствора доксорубицина смешивали с 3 мл фосфатного буфера (рН 7.4), содержащего 10 мг исследуемого образца. Данную суспензию перемешивали в течение 20 ч при комнатной температуре, после чего центрифугировали и аликвоту раствора анализировали на спектрофотометре для определения точной концентрации доксорубицина. По разнице в спектрах поглощения начального и конечного раствора определяли количество инкапсулированного доксорубицина.

В случае сульфасалазина 75 цМ раствора сульфасалазина, приготовленного по методике, описанной в работе [165], инкубировали с 5 мг адсорбента в течение 20 ч при комнатной температуре. Затем суспензию центрифугировали и полученную аликроту анализировали на спектрофотометре. По разнице в спектрах поглощения начального и конечного раствора определяли количество инкапсулированного сульфасалазина. Кроме того, было исследована адсорбция сульфасалазина в ДМСО для повышения эффективности инкапсулирования лекарства. Для этого 20 мг адсорбента помещали в 2 мл ДМСО с сульфасалази-ном с концентрацией 2 мг/мл на 24 ч. Затем суспензию центрифугировали и полученную аликроту анализировали на спектрофотометре.

Для доксорубицина и сульфасалазина степень закрепление лекарства определяли по следующей формуле:

нач. конц. лекарства-кон. конц. лекарства

При исследовании влияния рН среды на степень закрепления лекарства использовали точно такую же методику, что для доксорубицина и сульфасала-зина в водном растворе, за исключением использования фосфатного буфера. В

данном случае использовали деионизированную воду, а необходимое значение рН среды изменяли путем добавления раствора соляной кислоты или щелочи. Точность установления рН среды контролировали с использованием иономет-рического преобразователя и-500 «Аквилон».

Для исследования рН высвобождения 10 мг высушеного образца с инкапсулированным лекарством смешивали с 6 мл ацетатного буфера (рН 3, 5.1) или фосфатного буфера (рН 7.4) при комнатной температуре. В определенное время 1 мл центрифугированного раствора анализировали на спектрофотометре для определения количества высвободившегося лекарства.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Влияние природы привитой функциональной группы органоси-лана на структурно-морфологические и поверхностные характеристики синтезируемых материалов

Как было показано в разделе 1.1 «Основные принципы формирования ультрадисперсных кремнеземов и гибридных материалов на их основе» органо-модифицированные кремнеземы с различными функциональными группами находят все большое применение в биотехнологии и различных областях медицины. Природа привитой функциональной группы на поверхности кремнезема оказывает существенное влияние на поверхностные свойства материала, обеспечивая дополнительное селективное связывание с различными биомолекулами: белками, ДНК, лекарствами. Зная физико-химические свойства функциональной группы, можно создавать селективные сорбенты или сенсоры на опре-делнный тип биомолекул [166 - 168].

В настоящей работе изучены особенности модификации поверхности кремнезема с использованием октилтриэтоксисилана (ОТЭОС), фенилтриэток-сисилана (ФТЭОС) и 3-уринопропилтриметоксисилана (УПТМОС). Структурные формулы функциональных групп и схема модификации представлены на рис. 3.1.

осн

2Н5

он

......ос2н5 + 4Н20

0С2Н5

я

НзС20^^......0С2Н5 + ЗН2О

0С2Н5

......... + 4С2Н50Н

\

0Н

Н0-

я

^......0Н + 3С2Н50Н

0Н

0Н Н0^Б1........

\

0Н

0Н

Н0-

Я1 = -(СН2)тСНз

я

^ "0Н 0Н

я я

* 1 Vя \ /

я

.Бг

-О

/ ^0Н

V

0Н

я, =

// \\

0 II

С

яз = -(СН^-К^ ЧКН2 Н

ОкгаЛЬНый фрагмент Фенильный фрагмент Уринопропильный фрагмент

Рис. 3.1. Структурные формулы используемых привитых функциональных групп и схема золь-гель модификации.

4

ИК-спектроскопия является весьма информативным методом исследования строения индивидуальных органических соединений. Однако ее применение для анализа гибридных материалов затрудняется существенным перекрыванием полос поглощения функциональных групп. Как следствие, спектральная информация, извлекаемая из ИК-спектров полученных материалов, обычно ограничивается идентификацией основных функциональных групп. В этом случае с использованием ИК-спектроскопии удается выявить частоты, соответствующие валентным и деформационным колебаниям привитых функциональных групп. Ниже представлены ИК-спектры органо-модифицированных кремнеземов, содержащие максимальное количество функциональных групп. ИК-спектры остальных органо-модифицированных материалов не представлены в работе ввиду идентичности валентных и деформационных частот.

В ИК-спектрах октил-модифицированного кремнезема (OctSiNP-3) присутствует четко выраженный пик в области 2989 - 2848 см-1, соответствующий деформационному колебанию C-H в октильных радикалах. Пики при 1432 и 1384 см-1 соответствуют деформационным колебаниям фенильного кольца в случае фенил-модифицированного кремнезема (PhSiNP-3) [170]. Острый пик при 1432 см-1 является комбинацией двух групп: С=С и С - H. Также узкий пик при 700 см-1 соответствует деформационным колебаниям фенил H вне плоскости кольца. В случае уринопропил-модифицированного кремнезема (USiNP-3) наблюдается слабо выраженный пик при 2933 см-1 [170], который соответствует С - H связи, присутствие наиболее интенсивных пиков в области 1672 - 1590 см-1 соответствуют деформационным колебаниям амино- и карбонильных групп (C=O и N-H) [171, 172]. Таким образом, из анализа ИК-спектров можно сделать вывод об успешной модификации поверхности кремнеземов используемыми органосиланами.

Рис. 3.2. ИК-спектры для немодифицированного и органо-модифицированных кремнеземов.

Существенные изменения в морфологии органо-модифицированных материалов выявлены с использованием растровой электронной микроскопии - установлены основные закономерности влияния природы привитых функциональных групп на форму и размер частиц органо-модифицированных кремнеземов.

В процессе золь-гель синтеза в результате гидролиза кремнийсодержащего прекурсора - ТЭОС происходит образование Si-OH связей, которые, взаимодействуя с гидроксильными группами (-OH) органосиланов, обеспечивая кова-лентную модификацию поверхности кремнезема функциональными группами. Процесс формирования коллоидных частиц определяется реакцией гидролиза и сополиконденсацией органосиланов, используемых в золь-гель синтезе [173].

В случае уринопропил-модифицированных кремнеземов образуются универсальные сферические микрометровые частицы (рис. 3.3). Из гистограмм распределения частиц по размерам следует, что с увеличением концетрации вводимого органасилана - УПТМОС, происходит увеличение доли крупных частиц частиц и в результате наблюдается более широкое распределение сферических микрочастиц: USiNP-1 характеризуется частицами от 0.35 до 5.25 мкм со средним размером частиц 2.41 ± 0.3 мкм; для USiNP-2 средний рзмер частиц составляет 3.57 ± 0.4 мкм; для USiNP-3 - 2.43 и 5.13 мкм соответственно. Молекулы УПТМОС содержат реакционноспособные амино- и карбонильные группы, которые могут образовывать дополнительные связи с группами Si-OH, приводя к росту матричной сетки коллоидных частиц , что, в свою очередь, сопровождается укрупнением микрометровых частиц.

РПгИ МАО: 65.7 кх Date^ml^Чy): 02/25/14

35 30 25

о 20

5 15

о

Н 10

ев

5

I

о?6 О6 ъ>ъ ьТ>

размер частиц (мкм)

35 30

25 ==20

г:

« 15

т ® 10 с а

рн 5

0

^ г^

размер частиц (мкм)

а т

о

т с а

Р

О?

&

^ ъ? ър ь? ьР &

размер частиц (мкм)

Рис. 3.3. Изображения (результаты электронной сканирующей микроскопии) уринопропил модифицированных кремнеземов с различным соотношением органосилана: иБ1КР-1 ([ТЭ-ОС]:[УПТМОС] = 4:1), ШЯР-2 ([ТЭОС]:[УПТМОС] = 3:1), ШЮТ-3 ([ТЭОС]:[УПТМОС] = 2:1) с соответствующими гистограммами распределения частиц по размерам.

0

При анализе микрофотографий по результатам электронной сканирующей микроскопии фенил-модифицированных кремнеземов наблюдается существенное различие в морфологии получаенных образцов после золь-гель модификации, используя ФТЭОС (рис. 3.4). Данный материал представляет собой аморфные блоки, размер которых лежит в микрометровой области. В процессе золь-гель синтеза высокая степень гидролиза и поликонденсации ФТЭОС приводит к образованию блочных структур за счет формирования дополнительных п- п сте-кинговых взаимодействий между фенильными группами модифицированного кремнезема [174]. Также стоит отметить, что увеличение концентрации фе-нильных фрагментов приводит к укрупнению блоков, как следует из гистограм распределения частиц по размерам, средний размер блоков для РЬ81МР-1 варьируется в пределах от 1.98 до 4.01 мкм, для РИБ1КР-2 - от 4 до 8 мкм и для РИБ1КР-3 - от 6 до 12 мкм.

Модификация октильными группами в процессе золь-гель синтеза приводит к образованию универсальных сферических наночастиц, размер которых лежит в пределах в пределах от 66 до 253 нм (рис. 3.5). Также, как и в предыдущих случаях, введение октильных фрагментов приводит к укрупнению размеров частиц: Ос181МР-1 имеет средний размер частиц 112 нм, для Ое181МР-2 -149 нм, О^МР-З - 167 нм.

Исследование поверхностных характеристик органо-модифицированных кремнеземов является одним из ключевых факторов в раскрытии механизма адсорбции между адсорбентом и адсорбатом. Для этого с использованием метода низкотемпературной адсорбции/десорбции азота получены изотермы адсорбции/десорбции азота, из них были рассчитаны по ВЕТ и ВШ анализу значения удельной поверхности и пористости исследуемых образцов, что позволило выявить основные закономерности влияния природы привитых функциональных групп на поверхностные свойства полученных материалов. Изотермы адсорбции-десорбции азота для немодифицированного и органо-модифицированных кремнеземов представлены на рис. 3.6.

ЗМ: НЕЭОШТЮМ У/0:19Втт I МКАЗТЕвС ЭМ: НЕБОШТЮМ \IVDi 1.93 тт 1.11 Р!АЗ ТЕ5СА1Ч

ЙЕМ МАЙ: 10.0 кх Ост: ЗЁ 10 |1т 5ЕМ МАй: 40.0 кх Эе1: 5Е 2 рт

Рг1г)1МАй:4.ее кх У1ел' НеЮ: 38,2 мт ИПСМРАН Мп1МАв:1В.7Кх \flew ЛеШ а.54 рт ИПСМ РАН

ев Н О Н

£

70 60 50 40 30 20 10 0

РЬ8ЮТ-1

н

ев Н О

н о ев

Р

35 30 25 20 15 10 5

о