Синтез противоопухолевых сульфамидов гетероциклического ряда тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Крымов Степан Константинович

• Крымов Степан Константинович
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Крымов Степан Константинович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сульфонамиды с противоопухолевой активностью

1.1. Ингибиторы КА на основе гетероциклических сульфонамидов

1.1.1. Тиадиазол-2-сульфонамиды

1.1.2. Пиридинсульфонамиды

1.1.3. Тиофен-2-сульфонамиды

1.1.4. Индолсульфонамиды

1.2. Гетероциклические сульфонамиды, ингибирующие ВЯАБ

1.2.1. Производные 7-азаиндола

1.2.2. Производные 4-аминонафтола-1

1.2.3. Производные Р-карболина

1.3. Гетероциклические сульфонамиды, ингибирующие Р13К

1.4. Гетероциклические сульфонамиды, ингибирующие фарнезил-трансферазу

1.5. Гетероциклические сульфонамиды, ингибирующие SHP2

1.6. Гетероциклические сульфонамиды, ингибирующие протеасомную систему

1.6.1. Ингибиторы протеасомы СТ-Ь на основе 4-аминонафтола

1.7. Гетероциклические ацилсульфонамиды, активирующие апоптоз

1.8. Гетероциклические ацилсульфонамиды с антипролиферативной активностью

1.9. Гетероциклические сульфонилмочевины с антипролиферативной активностью

1.10. Хиноксалинсульфонамиды с антипролиферативной активностью

1.11. Хинолинсульфонамиды с антипролиферативной активностью

1.12. Пиридинсульфонамиды - антагонисты эндотелин-А-рецептора

1.13. Сульфонамиды 6-метил-#7-(пиримидин-2-ил)бензол-1,3-диамина с антипролиферативной активностью

1.14. Бензопиридотиадиазепины, ингибирующие полимеризацию тубулина

1.15. Изохинолин-4-сульфонамид, ингибирующий Са2+/СаМ киназу II

1.16. Индолинсульфонамиды, ингибирующие Ьс1-2

1.17. Сульфонилгидразоны 3-нитро-2#-хромена с антипролиферативной активностью 45 ГЛАВА 2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

2.1. Синтез гетероциклических сульфонамидов

2.1.1. Дизайн и синтез 1-ацилиндолин-5-сульфонамидов

2.1.2. Дизайн и синтез производных индол-5-сульфонамида

2.1.3. Дизайн и синтез 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов

2.1.4. Дизайн и синтез изатин-5- и -7-сульфонамидов, модифицированных по первому и третьему положению

2.1.5. Дизайн и синтез халконсульфонамидов

2.2. Биологические свойства синтезированных соединений

2.2.1. Биологическая активность индолин-5-сульфонамидов

2.2.2. Биологическая активность индол-5-сульфонамидов

2.2.3. Биологическая активность изатин-5-сульфонамидов

2.2.4. Биологическая активность производных изатин-5- и -7-сульфонамидов

2.2.5. Биологическая активность халконсульфонамидов

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Список сокращений

ДМСО -диметилсульфоксид ДМФА - диметилформамид КА - карбоангидраза

МЛУ - множественная лекарственная устойчивость

ТГФ - тетрагидрофуран

ТФУ - трифторуксусная кислота

ВЯАБ - цитозольная серин/треониновая протеинкиназа CDI - карбонилдиимидазол DCM - дихлорметан

DDQ - 2,3-дихлор-5,6-дициано-1,4-бензохинон DMADMF - #,#-диметилформамид диметил ацетал DMAP - ЖД-диметиламинопиридин DIPEA - диизопропилэтиламин

EDC - #-этил-Л"-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

НОВ^ 1-гидроксибензотриазол

LDA - диизопропиламид лития

NCS - #-хлорсукцинимид

Ру - пиридин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез противоопухолевых сульфамидов гетероциклического ряда»

ВВЕДЕНИЕ1

Актуальность темы. Солидные злокачественные новообразования, имеющие гипоксические области составляют группу наиболее агрессивных онкологических заболеваний [1]. Гипоксические опухолевые клетки имеют механизмы адаптации для получения преимущества над клетками организма-хозяина [2]. Одним из таких преимуществ является сниженный внеклеточный pH (pHe) в микроокружении опухоли [3]. Сниженный pHe вызывает гибель неадаптированных клеток хозяина, а также ускоряет разрушение внеклеточного матрикса, создавая возможность для дальнейшей инвазии и пролиферации опухолевых клеток [4, 5]. Поддержание внутриклеточного щелочного pH (pHi) и кислого pHe обеспечивает целый ряд транспортеров и ферментов как на внешней, так и на внутренней стороне мембраны неопластических клеток. За процесс накопления избыточных протонов на внешней стороне мембраны опухолевых клеток ответственны ферменты карбоангидраза IX (КА IX) и карбоангидраза XII (КА XII) [6]. Гены обоих ферментов содержат в промоторных участках последовательность HRE (hypoxia responsive element) для связывания транскрипционного комплекса HIF-1a, что объясняет усиление их экспрессии в условиях гипоксии [7]. КА IX имеет селективную экспрессию в опухолях и обнаружена в клетках молочной железы, кишки, почек, легкого и др. [8]. Наличие иона Zn2+ в активном центре КА IX и КА XII обеспечивает эффективный катализ гидратации углекислого газа с образованием протона и гидрокарбонат-иона.

Сульфонамидная группа является ключевым структурным фрагментом синтетических препаратов для лечения многих патологических состояний, включая инфекции, онкологию, диабет, глаукому и воспаление [9]. Например, пазопаниб одобрен для лечения почечно-клеточной карциномы, а также сарком мягких тканей. Ацетазоламид является представителем класса сульфонамидных препаратов, применяемых в качестве мочегонных и противоглаукомных средств [10].

I

NH2 Пазопаниб Ацетазоламид

Рисунок 1. Сульфонамиды, используемые в клинической практике

1 Введение, обзор литературы и обсуждение результатов имеют независимую нумерацию химических соединений, схем и рисунков.

Высокая биологическая активность сульфонамидов связана с множеством способов их взаимодействия с биологическими мишенями. За счет наличия атомов кислорода и ионизруемой группы сульфонамидный остаток способен образовывать водородные связи с активными центрами ферментов [11]. Также сульфонамидная группа является биоизостером карбоксильной, амидной и фосфатной групп — важных фрагментов в функциональных биомолекулах [12]. Кроме того, сульфонамиды способны образовывать комплексы с ионами Си2+, Со2+, №2+ и Zn2+. За счет образования координационных связей с ионом Zn2+ сульфонамиды являются эффективными ингибиторами семейства КА [13]. В частности механизм действия ацетазоламида основан на ингибировании КА I и КА II [14]. Синтез и изучение новых гетероциклических сульфонамидов позволит получить новые данные о связи структура-активность в ряду ингибиторов опухоль-ассоциированных КА IX и КА XII, а также привести к открытию соединений с улучшенными противоопухолевыми свойствами.

Степень разработанности научной тематики. Основным направлением поиска новых ингибиторов КА IX является исследование биологических свойств соединений на основе пара-аминобензолсульфонамида. Исследование ингибирующих свойств гетероциклических сульфонамидов в отношении КА IX является менее изученным направлением: большая часть работ посвящена сульфонамидам на основе пятичленных гетероциклов, таких как тиофен и тиадиазол. Антипролиферативные и КА-ингибирующие свойства незамещенных сульфонамидов индолина, индола, изатина и халконсульфонамидов не описаны в литературе.

Целями исследования ставились дизайн и синтез новых гетероциклических сульфонамидов для получения данных о связи структура-активность. Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:

- направленная структурная разработка ингибиторов КА IX путем оценки взаимодействий гетероциклических сульфонамидов с предполагаемой мишенью методом молекулярного докинга.

- синтез производных индолин-5-сульфонамидов, изатин-5-(7)-сульфонамидов и халконсульфонамидов.

- доказательство строения синтезированных сульфонамидов с помощью физико-химических методов анализа.

- тестирование ингибирующей активности сульфонамидов в отношении изоформ КА человека, включая опухоль-ассоцированные КА IX и XII.

- скрининг антипролиферативных свойств синтезированных сульфонамидов на панели опухолевых клеток, в том числе клеток с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ).

Научная новизна. 1. Методом молекулярного моделирования продемонстрировано связывание сульфонамидов на основе индолина, изатина и халкона с ионом 2и2+ и аминокислотными остатками в активном центре КА IX.

2. Синтезированы ранее неописанные 1-ацилиндолин-5-сульфонамиды.

3. Разработаны схемы синтеза новых 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов.

4. Разработан метод получения изатин-7-сульфонамидов.

5. Впервые продемонстрирована возможность использования 2-оксо-2-фенилэтансульфонамидов в качестве метиленовой компоненты в конденсации Кневенагеля для получения халконсульфонамидов.

6. Показано, что индолин- и изатинсульфонамиды в наномолярных концентрациях ингибируют опухоль-ассоцированные КА IX и КА XII.

7. 1-Замещенные изатинсульфонамиды и производные халконсульфонамида ингибируют рост опухолевых клеток, в том числе с МЛУ, в низких микромолярных концентрациях; выявлены ключевые закономерности влияния структуры на антипролиферативную активность синтезированных сульфонамидов.

Теоретическая и практическая значимость. Разработаны методы синтеза ранее неизвестных сульфонамидов гетероциклического ряда. Данные о биологической активности синтезированных сульфонамидов и модели связывания с мишенями будут способствовать развитию направленного поиска новых противоопухолевых кандидатов, ингибирующих КА IX, XII. На основе структур соединений-лидеров могут быть получены новые производные для углубленного исследования их противоопухолевых свойств.

Методология и методы диссертационного исследования. При выполнении диссертационной работы использовались методы органического синтеза, биоорганической и медицинской химии. Новые методики получения целевых соединений изложены достаточно подробно для возможности их воспроизведения.

Выделение и очистка полученных продуктов была осуществлена методами экстракции, переосаждения, хроматографии и перекристаллизации. Доказательство строения промежуточных и конечных соединений проведено с помощью методов физико-химического анализа: спектроскопии ЯМР (1H, 13С), масс-спектрометрии высокого разрешения (HRMS ESI), ИК-спектроскопии и рентгеноструктурного анализа (РСА). Оценка чистоты всех целевых соединений проводилась методом ВЭЖХ.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. In silico модели взаимодействия новых сульфонамидов с активным центром КА IX.

2. Синтез серии 1-ацилиндолин-5-сульфонамидов.

3. Синтез 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов и их производных.

4. Разработанная схема получения ранее неизвестных изатин-7-сульфонамидов.

5. Предложенные схемы получения ранее неизвестных халконсульфонамидов.

6. Данные о связи структура-активность для полученных сульфонамидов в отношении 4 изоформ карбоангидраз человека, включая опухоль-ассоцированные КА IX и XII, а также цитозольных КА I и КА II.

7. Данные о связи структура-антипролиферативная активность для синтезированных сульфонамидов.

Степень достоверности. Достоверность полученных результатов обеспечена тщательным подбором условий реализации экспериментов, разработанными воспроизводимыми методиками и применением общепринятых физико-химических методов определения строения органических соединений (1Н, 13С ЯМР-спектроскопией, масс-спектрометрией высокого разрешения), РСА и их индивидуальности (ВЭЖХ анализ).

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены и обсуждены на 10 конференциях, из которых наиболее значимыми являются: «Молекулярные и Биологические аспекты Химии, Фармацевтики и Фармакологии» (Нижний Новгород, 2020), «Весенняя школа-конференция ХимРар по медицинской химии» (Химки, 2021), «Первая всероссийская школа для молодых ученых по медицинской химии» (Новосибирск, 2021), «Марковниковские чтения» (Сочи, 2022), «Марковниковские чтения» (Домбай, 2023).

Публикации. По результатам диссертационной работы опубликованы 4 научные статьи в журналах, индексируемых базами данных Web of science, Scopus и входящих в перечень ВАК, и 10 тезисов докладов.

Личный вклад автора. Для достижения поставленной цели научного исследования автором проведены анализ литературы, докинг структур в активный центр КА IX, синтезы целевых химических соединений, установлено их строение, выполнена интерпретация и описание полученных результатов, сформулированы цели, задачи и выводы диссертационной работы, подготовлены научные публикации и представлены доклады по теме диссертации на конференциях различного уровня.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность сотрудникам, принимавшим участие в исследовании физико-химических и биологических свойств полученных соединений: к.б.н. Лысенковой Л.Н., к.х.н. Иванову И.В., к.х.н. Соловьевой С.Е., Малютиной Н.М., д.х.н. Королеву А.М., к.х.н. Деженковой Л.Г. (НИИНА им Г.Ф. Гаузе), д.х.н. Корлюкову А.А. (ИНЭОС РАН), к.б.н. Щербакову А.М., Сальниковой Д.И. (РОНЦ им. Н.Н. Блохина), проф. Супурану К.Т. (Universita di Firenze).

Отдельные этапы работы выполнены при финансовой поддержке грантов РНФ № 20-13-00402 и № 20-13-00402-П.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Сульфонамиды с противоопухолевой активностью

Современные исследования в области метаболизма злокачественных новообразований демонстрируют, что ацидоз является не просто пассивным результатом фенотипических адаптаций опухолевых клеток, а представляет собой отличительную особенность опухоли, отвечающую за прогрессирование заболевания [15]. Ацидоз микроокружения опухоли приводит к прогрессированию заболевания, в частности, к локальной инвазии и метастатическому распространению [16, 17].

На сегодняшний день известно два основных метаболических процесса, ведущих к накоплению избыточных протонов в опухолевых образованиях - это анаэробное окисление глюкозы (с образованием лактата и протона), и работа мембранных карбоангидраз (КА) IX и КА XII, эффективно катализирующих реакцию гидратации углекислого газа (образующегося из ацетил коэнзима А) с образованием гидрокарбонат-иона и протона. Предположительно, основной причиной сниженного pH в микроокружении опухоли является гидратация углекислого газа, легко диффундирующего из клетки за счет пассивной диффузии [18, 19]. Данная теория опухолевого ацидоза впервые была подтверждена E. Svastova и коллегами, которые продемонстрировали роль КА IX в поддержании кислого внеклеточного pH [20].

Наиболее значимым результатом в области поиска ингибиторов опухоль-ассоциированных КА IX и XII является разработка серии мочевин-замещенных сульфонамидов. Лабораторией C.T. Supuran обнаружен 4-(3-(4-фторфенил)уреидо)бензолсульфонамид (1, SLC-0111, рис. 1), селективно ингибирующий КА IX со значением K = 45.1 нМ [21].

Исследование противоопухолевой активности SLC-0111 in vivo на ксенотрансплантатах опухолей молочной железы 4T1 и MDA-MB-231 LM2-4Luc+, экспрессирующих КА IX, показало, что применение SLC-0111 в дозе 38 мг/кг приводило к

Н Н 1

SLC-0111

Рисунок 1. Структура высокоактивного ингибитора КА IX

снижению объема основной опухоли на 45%, а также приводило к полному исчезновению метастаз в легких [22].

Углубленные доклинические испытания противоопухолевого потенциала SLC-0111, как адъювантного средства для терапии опухолей с экспрессией КА IX, показали перспективность его применения для лечения неопластических заболеваний с гиперэкспрессией КА IX. В частности, SLC-0111 в комбинации с различными химиотерапевтическими препаратами продемонстрировал противоопухолевую и антиметастатическую активность на ксенотрансплантатах аденокарциномы протоков поджелудочной железы, трижды негативной опухоли молочной железы, глиобластомы и плоскоклеточной карциномы головы и шеи [23-25].

По результатам первой фазы клинических испытаний препарат SLC-0111 был допущен к проведению второй фазы [26]. Установлено, что SLC-0111 безопасен для пациентов с солидными опухолями на поздних стадиях.

Для направленного поиска новых ингибиторов КА IX применяются два основных подхода. Первый состоит в изучении ингибирующего профиля новых соединений, содержащих цинк-связывающую группу. Второй подход основан на введении новых боковых (линкерных) фрагментов в молекулу высокоактивного ингибитора КА IX, например, SLC-0111.

После выявления опухоль-ассоцированной КА IX C.T. Supuran и A. Scozzafava провели исследование противоопухолевого потенциала сульфонамидов тиадиазола, ингибирующих активность КА [27].

Противоопухолевая активность ингибиторов КА на основе тиадиазола была проанализирована в отношении широкой панели опухолевых клеток молочной железы, легкого, толстой кишки, ЦНС и лейкемии. Соединение-лидер, 5-(3-(3,4-дихлорофенил)уреидо)-1,3,4-тиадиазол-2-сульфонамид (2, рис. 2) показало активность в отношении клеток опухолей молочной железы, легкого и лейкемии с IC50 = 20 мкМ.

1.1. Ингибиторы КА на основе гетероциклических сульфонамидов

1.1.1. Тиадиазол-2-сульфонамиды

CI

О О

2

Рисунок 2. Структура ингибитора КА на основе тиадиазол-2-сульфонамида

По результатам тестирования антипролиферативной активности авторы предположили, что исследуемые сульфонамиды ингибируют работу изоферментов КА, экспрессируемых в опухолевых клетках, таких как КА IX, XII. Ввиду недавнего обнаружения роли данных изоформ в онкологических заболеваниях, скрининг потенциальных ингибиторов в отношении КА IX, XII не был доступен. Однако полученные данные указали на перспективность развития направления по поиску сульфонамидов с противоопухолевой активностью.

Исследования Z. Brzozowski и соавторов показали, что производные пиридин-3-сульфонамида 3-4 (рис. 3) могут ингибировать работу как цитозольных КА I и II, так и трансмембранных опухолевых КА IX и XII [28, 29]. Сульфонамиды пиридина продемонстрировали высокую активность в отношении КЛ IX, а также во многих случаях обладают селективным действием, выраженным отношением констант ингибирования КЛ

В рамках поиска пиридин-3-сульфонамидов, селективно ингибирующих работу КА IX, были найдены производные 5, содержащие фрагменты пиперазина, пиразола и триазола в 4 положении пиридинового гетероцикла [30].

Серия пиридин-3-сульфонамидов 5 была протестирована на ингибирующую активность в отношении опухоль-ассоциированных КЛ IX и XII и двух широкоэкспрессируемых КЛ I и КЛ II. Эффективность ингибирования КЛ IX сильно зависит от природы заместителя в 4 положении пиридин-3-сульфонамидов 5. Среди изучаемых пиридин-3-сульфонамидов наиболее активным ингибитором КЛ IX оказался 4-гидразинопиридин-3-сульфонамид (5а) со значением константы ингибирования 10.1 нМ (рис. 4).

1.1.2. Пиридинсульфонамиды

II / КЛ IX.

Рисунок 3. Структуры ингибиторов КА IX на основе пиридина

ын2 ын

С1

5а 802ЫН2

5Ь 802ЫН2

Рисунок 4. Структура высокоактивных ингибиторов КА IX на основе пиридин-3-

сульфонамида

Тестирование антипролиферативной активности показало, что наиболее чувствительны к пиридин-3-сульфонамидам клеточные линии меланомы (SK-MEL-5), рака молочной железы (T-47D), рака яичников (OVCAR-4) и лейкемии (К-562). Наибольшую активность показало производное 5Ь, подавляющее рост опухолевых клеток на 65-89% при концентрации 10 мкМ (рис. 4).

М. Bozdag и соавторы сообщили о разработке нового ингибитора КА IX 6 на основе приидин-2-сульфонамида, содержащего сульфонилмочевинный фрагмент (рис. 5)

По результатам исследования на 11 изоформах КА человека найдено, что новый сульфонамид 6 в наномолярных концентрациях ингибирует опухоль-ассоциированные изоформы КА IX и XII (Кх = 6.8 и 9.8 нМ), а также ряд изоформ локализованных в цитозоле клеток, КА II, VII и XIII (К 21-38 нМ). Для исследования молекулярного взаимодействия между КА II и производным пиридин-2-сульфонамида 6 авторами проведены рентгеноструктурные исследования комплекса фермент-ингибитор.

В полученной модели РСА ингибитор связывается с ионом цинка в активном центре через депротонированный атом азота сульфонамидной группы (рис. 6). Кроме того, ингибитор 6 образует водородные связи с остатками ТЫ*199, которые дополнительно стабилизируют комплекс фермент-ингибитор. Таким образом, комплекс иона цинка с сульфонамидной группы и остатками His94, His96 и His119 имеет геометрию слегка искаженного тетраэдра.

[31].

вОзЫИг

Рисунок 5. Структура ингибитора КА IX на основе пиридин-2-сульфонамида

Рисунок 6. РСА комплекса пиридин-2-сульфонамида и КАII

Результаты РСА свидетельствуют, что ингибитор расположен в активном центре КА, координируясь сульфонамидной группой с ионом 2п2+. В то время как тозильный фрагмент ингибитора находится в гидрофобном кармане, образованном остатками РИе131, Уа1135, Leu198 и Рго202, образуя п-взаимодействие с ароматическим кольцом РИе131 (рис.

Профессором М.Ю. Красавиным и соавторами в ходе изучения бензолсульфонамидов [32-34], содержащих в своей структуре различные гетероциклические фрагменты получены наномолярные ингибиторы КА II и IX на основе 4-(1,2,4-оксадиазол-5-ил)бензолсульфонамида 7 [35]. Для создания новых селективных ингибиторов КА IX и установления связи структура-активность проведена биоизостерная модификация с заменой фенильного ядра в структуре ингибитора 7 на тиофеновый фрагмент. В результате биоизостерной модификации синтезирована серия производных тиофен-2-сульфонамида 8 (рис. 7) [36].

Для получения дополнительных сведений о влиянии положения оксодиазольного заместителя на ингибирующие свойства авторами синтезирован ряд изомерных производных 9 (рис. 8).

6).

1.1.3. Тиофен-2-сульфонамиды

Рисунок 7. Разработка ингибитора КА IX на основе тифоен-2-сульфонамида

с

nh2

r

Рисунок 8. Структура ингибиторов КА IX на основе 4-(1,2,4-оксадиазол-3-ил)-

тиофен-2-сульфонамиды

По результатам тестирования установлено, что синтезированные тиофен-2-сульфонамиды 8 и 9 ингибируют КА IX в субнаномолярном диапазоне концентраций, превосходя в 10 и более раз ранее описанные производные бензолсульфонамда 7. По результатам тестирования методом остановленного потока выявлено, что наиболее активным ингибитором КА IX является производное 8а (К = 0.089 нМ), содержащее циклопропановый заместитель в третьем положении оксадиазольного кольца (рис. 9).

В рамках поиска новых ингибиторов КА IX J. Ivanova и соавторы разработали тиофен-2-сульфонамиды, содержащие тиобензильные фрагменты [37]. Согласно предположению авторов, введение тиобензильных фрагментов в положение 5 тиофен-2-сульфонамида 10 (рис. 10) способствует пространственной гибкости ингибитора в активном центре КА, и в результате может обеспечивать селективность к целевой КА IX.

Рисунок 10. Общая структура ингибиторов КА IX на основе тиофен-2-сульфонамида

Синтезированные тиофен-2-сульфонамиды 10 были исследованы в качестве ингибиторов четырех изоформ КА. Цитозольная КА I была наименее восприимчива к действию данных сульфонамидов со значением К = 0.7-4.3 мкМ. Для цитозольной КА II, а также опухоль-ассоциированных КА IX и XII К находились в субнаномолярном и наномолярном диапазоне. Например, соединение 10а (рис. 11), обладая селективным действием, ингибировало КА IX при 0.94 нМ.

N'0 8а

Рисунок 9. Структура ингибитора КА IX на основе тифоен-2-сульфонамида

10

10а

Рисунок 11. Соединение-лидер на основе 5-тиобензилтиофен-2-сульфонамида

Для получения сведений об ингибирующем потенциале сульфонамидов индола в отношении КА IX О. Guzel и соавторами были синтезированы замещенные гидразиды 3-фенилиндол-2-карбоновой кислоты, содержащие сульфонамидную группу в 5 положении гетероцикла (схема 1) [38]. На первой стадии синтеза исходный сульфаниламид 11 был диазотирован с образованием соли диазония 12. Реакция соли диазония 12 с этил 2-бензилацетоацетатом 13 вела к образованию промежуточного фенилгидразона 14, который был циклизован в индол 15 кипячением в соляной кислоте. Кипячение этилового эфира индол-2-карбоновой кислоты 15 с гидразин гидратом в этаноле давало соответствующий гидразид 16.

Индол-5-сульфонамиды 16 ингибировали работу КА IX в диапазоне 59-102 нМ. Узкий диапазон значений К не позволили выявить явных закономерностей в зависимости структура-активность. Вместе с тем, замещенные производные были более эффективными ингибиторами, чем производное не имеющее заместителей в фенильном кольце. Наибольшую активность показало 4-хлорфенильное производное 16а (Кт = 59 нМ, рис. 12).

Схема 1

^^ НЫ—1\1Н2 о

16 н

я

С1

н21\

16а

ны-ын2

Рисунок 12. Структура ингибитора КА IX на основе гидразида индол-5-

сульфонамида

Известно, что молекулы, несущие заряд, плохо проникают внутрь клеток. Поэтому кватернизованные соли пиридиния рассматриваются в качестве селективных ингибиторов трансмембранных КА IX и XII, активный центр которых расположен на внешней стороне мембраны. Для синтеза новых ингибиторов КА IX по реакции Байера-Пикара О. Guzel и соавторы синтезировали новые кватернизованные производные пиридина 18 на основе гидразидов индол-5-сульфонамида [39]. В частности, кипячением в метаноле гидразидов 16 с перхлоратом 2,4,6-триметилпирилия 17 получен ряд пиридиниевых солей 18 (схема 2).

Представленные в данном исследовании соли пиридина на основе индол-5-сульфонамида, ингибировали КА IX в диапазоне 8,1-49,6 нМ. Для ряда производных, например 18а (рис. 13), & составили менее 10 нМ, превосходя по данному показателю более чем в 5 раз обнаруженный ранее лидер 16а.

На основе сведений о высокой КА активности производных индола P. Singh и соавторы разработали новые ингибиторы КА на основе индол-3-сульфонамида. В структуре 19 индол-3-сульфонамид отвечает за связывание с ионом Zn2+, а хинолин или пиридин, связанный через амидный линкер выполняют функцию липофильного фрагмента [40]. Синтез целевых соединений на основе 5-аминоиндол-3-сульфонамида представлен на схеме 3. На первой стадии синтеза 5-нитроиндол (20) в присутствии гидрида натрия алкилировали метил- или этилиодидами. Сульфохлорированием индола 21 хлорсульфоновой кислотой получен ^-алкил-5-нитроиндол-3-сульфонил хлорид 22. Далее обработкой водным раствором аммиака был получен соответствующий сульфонамид 23. На следующей стадии осуществлялось восстановление нитрогруппы

Схема 2

R

юа

Рисунок 13. Ингибитор КА IX на основе индол-5-сульфонамида

порошком железа в присутствии уксусной кислоты с образованием 5-аминоиндол-3-сульфонамида 24. На заключительной стадии соединение 24 ацилировали карбоновыми кислотами пиридина и хинолина в присутствии EDC и HOBt, с получением серии целевых соединений 19.

Схема 3

Методом остановленного потока индол-3-сульфонамиды 19 были исследованы на ингибирующую активность в отношении опухоль-ассоциированных КА IX и XII, а также цитозольных КA I и II. Было найдено, что наибольшей активностью обладает производное 2-арил-4-хинолин карбоновой кислоты 19а (рис. 14), ингибирующее работу КA IX при 1.4 мкМ. Высокие концентрации ингибирования целевой КA IX указывают на необходимость продолжения поиска новых ингибиторов на основе индолсульфонамидов.

Рисунок 14. Структура ингибитора КА IX на основе индол-3-сульфонамида

По причине высокой базальной активности киназа BRAF играет центральную роль в сигнальном пути МАРК [41]. Сигнальный путь МАРК через тирозинкиназные рецепторы вызывает экспрессию генов, участвующих в пролиферации и выживаемости опухолевых клеток [42, 43]. Серин/треониновая киназа BRAF кодируется одноименным протоонкогеном, мутации которого встречаются в половине случаев меланомы, опухолях щитовидной железы, яичника, легкого и молочной железы [44]. 90 % мутаций BRAF приходится на мутации в киназном домене с точечной заменой валина на глутамат (BRAFV600E) [42, 45].

К настоящему времени разработан ряд ингибиторов BRAF для лечения меланомы. Например, вемурафениб (25, PLX4032, рис. 15) - АТФ-конкурентный ингибитор BRAF на основе азаиндола, который проявляет селективность в отношении BRAFV600E. Вемурафениб значительно улучшил прогноз для пациентов с поздней стадией метастатической меланомы.

Рисунок 15. Структура вемурафениба

Ряд экспериментов показал, что сульфонамидная группа является ключевым фармакофором ингибиторов BRAFV600E. Рентгеноструктурный анализ комплексов ингибитор-белок, а также модели взаимодействий продемонстрировали, что атом азота арилсульфонамидного фрагмента в депротонированной форме образует ключевую водородную связь с NH группой основной цепи Asp-594. Данное взаимодействие было обнаружено для сульфонамидных групп PLX47208, PLX4032 и других ингибиторов. Наконец, ион аммония Lys-483 находится в непосредственной близости от аниона сульфонамида и может образовывать водородную связь с одним из атомов кислорода сульфонамидной группы, тогда как другой атом кислорода образует водородную связь с Phe-595 [46].

Фармацевтической компанией Plexxikon были разработаны ингибиторы BRAF нового поколения, которые подавляют рост клеток с мутантными BRAF, не активируя путь MAPK [47]. Синтезированные аналоги вемурафениба были протестированы на их способность индуцирования изменения фосфорилироваиня ERK1/2 (T202/Y204, pERK), способности ингибирования BRAFV600E, а также подавления опухолевых клеток IPC-298, A375, COLO829 и HCT116. В результате многоэтапной оптимизации структуры были обнаружены PLX8394 (26) и PLX7904 (27) (рис.16). Данные сульфамиды ингибируют BRAFV600E при 3.8 и 4.2 нМ in vitro, а также ингибируют pERK в клетках A375 при 3.5 и 16.0 нМ.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Крымов Степан Константинович, 2024 год

b - - -

Ингибитор КА IX (1) F F

Рисунок 7. Молекулярная гибридизация активатора апоптоза 2 (16) и ингибитора КА IX для разработки новых ингибиторов КА IX на основе производных изатин-5-

сульфонамида 17

Для предварительной оценки перспектив молекулярной гибридизации для поиска новых ингибиторов КА IX был проведен докинг прототипа 1 и его изатинового аналога 17 в центр связывания КА IX (PDB 5sz5, рис. 8).

Рисунок 8. Моделирование связывания аминоиндансульфонамида 1 (зеленый) и изатинового аналога 17 (оранжевый) с активным центром КА IX

Результаты докинга показали сходство конформаций лигандов 1 и 17 в комплексе с КА IX. Сульфонамидные группы индана 1 и изатина 17 (в виде сульфонамидатных анионов) взаимодействуют с ионом Zn2+ в активном центре фермента; кроме того, гидрофобные части молекул образуют Ван-дер-Ваальсовы взаимодействия с Ьеи 198, который является гидрофобной частью активного центра КА IX. Таким образом, результаты докинга указывают на перспективность использования изатин-5-сульфонамидного каркаса для получения новых противоопухолевых активаторов апоптоза с КА-ингибирующими свойствами. Не смотря на то, что разработанные ингибиторы изатина 17 несколько уступают прототипному ингибтору 1 по параметру энергии связывания (ДGыnd) (таблица 2), найденное значение для ингибитора 17 указывает на перспективность изатинсульфонамидной структуры в качестве ингибиторов КА IX.

Таблица 2. Оценка энергии связывания ДGыnd для лучших конформаций комплексов сульфонамидов 1, 17 с КА IX ^В 5SZ5).

Для оценки эффективности подхода молекулярной гибридизации были синтезированы и исследованы биологические свойства ряда 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов 17 (рис. 8). Ключевым соединением для применения дивергентной схемы получения серии 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов является изатин-5-сульфонамид (18, схема 7). На первом этапе синтетической работы была предпринята попытка синтеза

Соединения

ДGbind (ккал/моль)

1

-9.5 -9.3

17

этого производного из незамещенного изатина (19) реакцией сульфохлорирования, с последующей обработкой сульфохлорида аммиаком. Однако действие на изатин хлорсульфоновой кислоты приводит к гем-дихлорпроизводному 20, обработка которого аммиаком в ТГФ дает сульфонамид 21 с низким выходом. Дальнейший гидролиз соединения 21 в присутствии ацетата натрия в уксусной кислоте приводит к целевому изатин-5-сульфонамиду (18) с умеренным выходом. Низкий суммарный выход сульфонамида 18 по трехстадийной схеме показал необходимость поиска более эффективного альтернативного метода его синтеза.

Схема 7

Альтернативным подходом к получению изатин-5-сульфонамида (18) является гетероциклизация изатинового ядра, уже имеющего в пятом положении сульфонамидную группу. Среди известных методов получения изатинов был выбран метод Зандмейера ввиду возможности его применения при наличии электроноакцепторных заместителей в структуре исходных анилинов [118]. На первой стадии сульфаниламид (22) конденсировали с хлоральгидратом и гидрохлоридом гидроксиламина в присутствии серной кислоты и сульфата натрия с образованием соответствующего а-изонитрозоацетанилида 23, на второй стадии - соединение 23 циклизовали в концентрированной серной кислоте при 90 °С в изатин-5-сульфонамид (18), который очищали с помощью колоночной хроматографии.

На следующем этапе были исследованы возможности модификации изатин-5-сульфонамида (18) с помощью реакции алкилирования бензилхлоридами. Первоначальные попытки проведения реакций бензилирования в ацетонитриле в присутствии поташа при нагревании приводили к образованию смеси ди- и триалкил производных с низким выходом (< 15%). Проведение реакций при комнатной температуре не позволило выделить целевой 1-бензилизатин-5-сульфонамида. Замена поташа на

карбонат цезия не приводила к образованию желаемого продукта. Проведение дополнительных экспериментов по подбору оптимального растворителя для алкилирования бензилхлоридом изатина (18) по атому азота гетероцикла показало, что использование ДМФА или ДМАА и безводного поташа в качестве основания приводит к целевому #-бензильному производному с хорошим выходом (61%). Оптимизированная методика была успешно применена для получения серии 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов 17. Так, алкилирование изатин-5-сульфонамида (18) различными алкилгалогенидами в присутствии трех эквивалентов карбоната калия в ДМФА приводит к образованию 1-замещенных-изатин-5-сульфонамидов 17а-и с выходами 32-74% (схема 8).

Схема 8

17И 171 17к 171 17т 17п

Анализ спектра ЯМР соединения 17а подтвердил его строение: в спектре отсутствует сигнал КН-группы изатина, характерного для исходного изатин-5-сульфонамиде 18 со значением химического сдвига 11.36 м.д. Кроме того, наличие незамещенной сульфонамидной группы в соединениях 17а подтверждается синглетным сигналом фрагмента КН со значениями химического сдвига 7.38 м.д (рис. 9).

Рисунок 9. Спектр ЯМР 1Н 1-бензилизатин-5-сульфонамида (17а)

Для изучения влияния замещения сульфонамидной группы изатин-5-сульфонамида на антипролиферативные свойства изучались подходы к синтезу ди- и трибензильного производного изатина 18. Найдено, что алкилирование изатин-5-сульфонамида 18 двумя эквивалентами бензилхлорида в ацетонитриле в присутствии поташа при 50 °С приводит к дибензильному производному изатина 24, а при добавлении дополнительного эквивалента бензилхлорида и поташа получено трибензильное производное 25 (схема 9).

Схема 9

Строение сульфонамидов 24 и 25 подтверждено физико-химическими методами анализа. Так, спектр ЯМР 1Н дибензильного производного 24 содержит характеристические сигналы, соответствующие приписываемой структуре (рис. 10).

Рисунок 10. Спектр ЯМР 1Н дизамещенного изатин-5-сульфонамида 24

Триплетный сигнал со значением химического сдвига 8.19 м.д. соответствует КН группе сульфонамида, а дублет со значением 3.97 м.д. метиленовой группе при сульфонамидном атоме азота. Эти данные согласуются с ранее опубликованными сведениями о строении родственных соединений [119].

2.1.4. Дизайн и синтез изатин-5- и -7-сульфонамидов, модифицированных по первому

и третьему положению

Предварительный скрининг антипролиферативных свойств изатина 17k продемонстрировал его способность к подавлению роста опухолевых клеток. Поэтому для выяснения влияния отдельных структурных фрагментов изатин-5-сульфонамидов 17 на антипролиферативную активность и действие на КА были исследованы возможности модификации 1-(2,4-дихлорбензил)-изатин-5-сульфонамида - сульфонамидного

аналога активатора апоптоза 2.

Согласно данным литературы, сочетание в структуре ингибитора КА IX, как гидрофобных, так и гидрофильных заместителей, может значительно увеличивать ингибирующую активность сульфонамидов [120]. Для дальнейшей модификации структуры изатинсульфонамида (схема 8) было выбрано положение 3 изатина, что объясняется дополнительной возможностью образования водородных или Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий с боковыми цепями аминокислотной последовательности для более эффективного ингибирования КА IX при сохранении способности к взаимодействию сульфонамидной группы с цинк-связывающей областью. Таким образом, для изучения влияния природы заместителя при С3 атоме углерода изатин-5-сульфонамида на ингибирующую активность методом молекулярного моделирования были исследованы производные 26a-c (рис. 11), содержащие гидрофильные фрагменты, такие как оксим (26a) и иминогуанидин (26Ь), а также липофильный фрагмент фенилгидразона (26^.

Рисунок 11. Структуры новых потенциальных ингибиторов КА IX 26a-c на основе

изатин-5-сульфонамида 17к

Известно, что встраивание сульфонамидных производных в активный центр КА IX происходит, главным образом, за счёт координационных взаимодействий N-центрированного аниона сульфонамидной группы с ионом Zn2+ [121]. Поэтому для изучения влияния заместителей в положении 3 изатин-5-сульфонамида 17к на способность связывания с КА IX было проведено молекулярное моделирование связывания соединений 26а-с с активным центром КА IX (рис. 3). Согласно результатам докинга, изатин-5-сульфонамиды 26а-с, содержащие различные заместители в положении 3, на первый взгляд, связываются с КА IX схожим образом: ионизированная сульфонамидная группа соединений 26а-с образует координационную связь с ионом Zn2+, а также формирует водородную связь между атомом кислорода сульфонамидной группы и остатком ТЫ*199 (рис. 12).

Рисунок 12. Докинг производных изатин-5-сульфонамидов 26а (оранжевый), 26Ь (зеленый), 26с (фиолетовый) в активный центр КА IX.

Более того, лиганды 26а и 26Ь образовывали ряд отличительных взаимодействий, например, изатиновое ядро оксима 26а имело неполярные СН-п взаимодействия с гидрофобным остатком Leu198, а бензильный фрагмент иминогуанидина 26Ь с остатком Рю202. Оценка величины энергий связывания (ДGыnd, таблица 3), полученных для производных 26а,Ь указывает на высокий ингибирующий потенциал этого класса соединения для целевой КА IX.

Таблица 3. Оценка энергии связывания Авьта для лучших конформаций комплексов сульфонамидов 17к, 26а-е, 27а с КАIX ^В 5SZ5).

Соединение Авьта, (ккал/моль)

17к 26а 26Ь 26е 27а 1

-9.2 -9.3 -9.2 -9.0 -9.1 -9.5

Опубликованные ранее работы по поиску ингибиторов опухоль-ассоциированных карбоангидраз свидетельствуют, что перемещение сульфонамидной группы в изатиновом ядре значительно изменяет ингибирующую активность таких производных в отношении КА IX и XII [122, 123]. Кроме того, в литературе отсутствуют сведения о синтезе и изучении биологической активности изатин-7-сульфонамидов, поэтому для изучения влияния положения сульфонамидной группы в ядре изатина был разработан оригинальный подход к синтезу 1-(2,4-дихлорбензил)-изатин-7-сульфонамида (27а, рис.

Рисунок 13. Структура потенциального ингибитора КА IX 27а на основе изатин-7-

сульфонамида

Для оценки влияния положения сульфонамидной группы в ядре изатина на характер связывания с КА IX дополнительно был проведен докинг соединения 27а в активный центр КА IX (рис. 14) и оценена энергия связывания Авьта, таблица 3. Полученная модель свидетельствует о сохранении координационного взаимодействия между анионом сульфонамида и ионом Zn2+, а также водородной связи между атомом кислорода сульфонамидной группы и КН-группой остатка ТЫ*199. Кроме того, изатиновое ядро сульфонамида 27а, аналогично лиганду 26Ь, дает дополнительный вклад в энергию связывания СН-п взаимодействия с гидрофобным остатком Leu198.

13).

о

Рисунок 14. Докинг производного изатин-7-сульфонамидов 27а в активный центр КАIX

Таким образом, на основе данных моделирования взаимодействия с КА IX новых производных изатинсульфонамида 26а-с, 27 был запланирован их синтез. Найдено, что 1-(2,4-дихлобензил)изатин-5-сульфонамид (17к) легко вступает в реакцию нуклеофильного присоединения с различными #-нуклеофилами при кипячении в метаноле в присутствии каталитических количеств соляной кислоты с образованием целевых производных 26а-с (схема 10). Для лучшей растворимости производное аминогуанидина 26Ь было переведено в солевую форму действием хлороводорода в метаноле.

Схема 10

Для выявления роли заместителя при атоме азота гетероцикла изатина в биологических свойствах производных 26а-с, а также характере их связывания с КА, целесобразен синтез их ^-незамещенного аналога. Из изатин-5-сульфонамида (18) реакцией с фенилгидразином получен фенилгидразон 28 с хорошим выходом (схема 11).

Схема 11

Из литературы известно, что присоединение ^-нуклеофилов к карбонильной группе изатинов, преимущественно, приводит к Z-изомерам, что объясняется образованием водородной связи между атомом кислорода карбоксамидной группы и NH-или СН-фрагментом нуклеофила [118].

Синтез Зандмейера ранее был успешно использован для получения изатин-5-сульфонамидов 17. Поэтому была изучена возможность применения данного метода для синтеза изатин-7-сульфонамида 27а и родственных соединений. На основе опыта, полученного при реализации схем синтеза изатин-5-сульфонамида (18) и его производного 17 (схемы 7, 8) был сделан вывод о необходимости защиты сульфонамидной группы для повышения выхода продуктов реакций циклизации орто-нитрозоацетанилида и бензилирования изатинсульфонамида. Ключевым требованием к защитной группе ставилась устойчивость к водной и кислой среде при нагревании. На основе синтетического опыта, полученного при синтезе производных индол-5-сульфонамидов, а также данных литературы было найдено, что ^-формамидиновая защита сульфонамидов устойчива в концентрированной серной кислоте и гидролизуется лишь при длительном кипячении с концентрированной соляной кислотой в метаноле [124]. На основе этих данных для получения изатин-7-сульфонамидов методом Зандмейера в качестве исходного анилина был выбран 2-нитробензолсульфохлорид (29, схема 12).

Схема 12

На первой стадии коммерчески доступный оршо-нитробензолсульфохлорид (29) действием водного раствора аммиака в ТГФ был превращен в сульфонамид 30 (схема 12).

Установку формамидиновой защитной группы на орто-нитрофенилсульфонамид (30) проводили действием диметилацеталя диметилформамида в ДМФА при 0 °С с получением формамидина 31. Восстановление нитро-группы производного 31 железом в присутствии ацетата аммония в смеси изопропанол-вода с высоким выходом приводит к ключевому для синтеза изатина ^'-((2-аминофенил)сульфонил)-Д^ диметилформимидамиду (32). Конденсацией анилина 32 c хлоральгидратом при кипячении с гидроксиламином и сульфатом натрия в присутствии серной кислоты с умеренным выходом получен изонитрозоацетанилид 33. Последующая внутримолекулярная циклизация аддукта 33 в серной кислоте позволила получить целевой формамидин изатин-7-сульфонамида (34) с приемлемым выходом. Алкилирование 3,4-дихлорбензилхлоридом изатина 34 в присутствии поташа и каталитических количеств иодида калия в ацетонитриле при нагревании дает N-((1-бензил-изатин-7-ил)сульфонил)-Д^диметилформимидамид 35a. Гидролиз защитной формамидиновой группы соединений 35a в кислой среде позволил получить с высокими выходами целевые изатин-7-сульфонамид 27а (схема 12). На основе предварительных сведений о высокой антипролиферативной активности производного изатин-5-сульфонамида 17r, аналогично соединению 27а из промежуточного формамидина 35b был синтезирован 1-(4-((трифторметил)тио)бензил)изатин-7-сульфонамид (27b).

С целью дальнейшего изучения и поиска взаимосвязей структура-активность в ряду изатина, были синтезированы производные изатин-7-сульфонамида 27а, модифицированные по положению 3 гетероцикла. Как и в случае изатин-5-сульфонамида 17k (схема 10), сульфонамид 27a реагирует с N-нуклеофилами при нагревании в метаноле, давая оксим 36a и иминогуанидин 36b с хорошим выходом (схема 13). Действием раствора HCl в метаноле аминогуанидин 36b был трансформирован в его водорастворимое производное в виде гидрохлорида.

Схема 13

Аналогично ^-бензилзамещенным производным 35а,Ь (схема 12), гидролизом формамидина 34 при нагревании с концентрированной соляной кислотой в метаноле был получен изатин-7-сульфонамид (37) с хорошим выходом (схема 14).

Схема 14

2.1.5. Дизайн и синтез халконсульфонамидов

Среди препаратов, одобренных для лечения в США, более 40 образуют ковалентное взаимодействие с белком-мишенью [125]. В сравнении с нековалентными взаимодействиями, ковалентное ингибирование мишени способно повысить эффективность, селективность, и продолжительность действия препаратов [125, 126]. Кроме того, ковалентные ингибиторы позволяют преодолевать механизмы резистентности при мутациях центра связывания, не влияющих на целевой аминокислотный остаток или доступ к центру связывания [127, 128]. Несмотря на эти преимущества, ковалентные ингибиторы могут проявлять высокую токсичность из-за нецелевых взаимодействий [129, 130].

Разработка ковалентных ингибиторов требует создания и оптимизации фрагментов молекул, образующих как ковалентные, так и нековалентные селективные взаимодействия с мишенью [130]. Успешные результаты клинических испытаний препаратов (афатиниб и осимертиниб) с ковалентным механизмом действия указывают на перспективность данного направления медицинской химии в области создания противоопухолевых препаратов [131, 132].

Мишенями для большинства применяемых ковалентных ингибиторов являются нуклеофильные аминокислотные остатки. Так, цистеин является наиболее частой мишенью из-за его низкого содержания в протеоме и высокой реакционной способности [133, 134]. Недавно опубликованный анализ показывает, что среди применяемых ковалентных ингибиторов 36% образуют связь с остатком цистеина, остальные ингибиторы взаимодействуют с остатками лизина (17%), серина (15%), тирозина (8%), треонина (6%), гистидина (5%) и др [135].

Ковалентные ингибиторы можно разделить на два подкласса в зависимости от того, является ли образование их аддуктов с белками-мишенями обратимым. Обратимые ковалентные ингибиторы связываются со своей мишенью и впоследствии диссоциируют от нее со скоростью, превышающей цикл жизни белка [136]. В структурах обратимых ингибиторов за образование ковалентной связи ответственны такие электрофильные

65

центры как альдегидные группы, кетоны, а-кетоамиды, а-кетогетероциклы, карбонитрилы и производные борной кислоты. Бортезомиб и иксазомиб (рис. 15) являются примерами обратимых ковалентных ингибиторов, применяемых для лечения онкологических заболеваний.

Необратимые ковалентные ингибиторы образуют аддукты со своими белковыми мишенями, которые диссоциируют от белка со скоростью значительно превышающим Т1/2 жизненного цикла белка [136]. Такие соединения, многие из которых являются ингибиторами киназ, часто содержат реакционные центры, состоящие из более жестких электрофилов, например, эпоксидов, а-галогенкетонов, ацилоксиметилкетонов, азиридинов, винилсульфонов, активированных ацетиленов и различных акцепторов Михаэля, в том числе акриламидов [137]. Преимуществом а,Р-ненасыщенного карбоксамидного фрагмента является относительно слабые электрофильные свойства, требующие близости к нуклеофильной мишени для образования связи. Это открывает возможность для создания высокоселективных и малотоксичных ковалентных ингибиторов.

Представленный на рис. 16 противоопухолевый препарат эксеместан является необратимым ковалентным ингибитором ароматазы. Клинические испытания эксеместана доказали его эффективность для лечения эстроген положительных опухолей молочной железы [138, 139]. В отличие от обратимых и конкурентных ингибиторов ароматазы, эксеместан образует ковалентную связь с ферментом, что приводит к длительному и необратимому ингибированию активности ароматазы [140, 141]. Высокая противоопухолевая эффективность эксеместана и других ковалентных ингибиторов указывает на ковалентных ингибиторов для лечения неопластических заболеваний [142].

Рисунок 15. Противоопухолевые препараты с ковалентным обратимым

механизмом действия

Рисунок 16. Эксеместан - противоопухолевый ковалентный ингибитор ароматазы; ксантогумол - халкон с антипролиферативной активностью; противоопухолевый сульфонамид I с антиэстрогеновой активностью

Халконы - акцепторы Михаэля природного происхождения с антипролиферативной активностью [143, 144]. Производные халкона, например ксантогумол (рис. 16), ковалентно ингибируют мишени опухолевых клеток, например, 1кВ-киназу [145] и тиоредоксин-редуктазу [146], а также обладают антиэстрогеновым эффектом [147, 148].

В дополнение к противоопухолевой активности гетероциклических сульфонамидов, представленных в обзоре литературы, сульфонамиды оксабицикло[2.2.1]гептена (I, рис. 16) обладают антиэстрогенной активностью [149-151] с наномолярным антипролиферативным действием в отношении клеток опухолей молочной железы.

Для поиска новых сульфонамидов с антипролиферативной активностью были разработаны халконы, содержащие сульфонамидную группу в винилкетоновом фрагменте в качестве новых соединений с антиэстрогеновой активностью. В рамках диссертационной работы была изучена возможность использования 2-оксо-2-фенилэтансульфонамида 38 в качестве метиленовой компоненты в реакции Кневенагеля для получения халконсульфонамидов 39 (рис. 17). Халконсульфонамиды — малоизученный класс соединений, который может обладать множественным действием на опухолевые клетки в том числе за счет наличия электрофильного центра, а также сульфонамидной группы способной ингибировать КА IX.

Рисунок 17. Разработка ковалентных и КА IX ингибиторов на основе

халконсульфонамидов 39

Для предварительной оценки КА-ингибирующего потенциала халконсульфонамиды 39, содержащие фенил- и индол-3-илметиледеновые фрагменты, были докированы в активный центр мишени (рис. 18). Соединения 39 образуют координационные связи с ионом Zn2+ в виде сульфонамидат анионов. Кроме того, оба лиганда за счет атомов кислорода сульфонамидной и кетоновой групп образуют водородные связи с боковой цепью аминокислотных остатков Gln 92 и Thr 199, а также образуют СН-п взаимодействия с остатком His 94.

Рисунок 18. Докинг производных 2-фенил-2-осксоэтансульфонамида, содержащих бензилиденовые (зеленый) и индол-3-илметиледеновые (оранжевый) фрагменты в

активный центр КА IX

Исходным для синтеза серии халконсульфонамидов 39 является метансульфонилхлорид, обработка которого трет-бутиламином приводит к сульфонамиду 40 (схема 15). Последующей конденсацией сульфонамида 40 с бензальдегидом в присутствии диизопропиламида лития (LDA) в безводном ТГФ при -78 °С с хорошим выходом получен аддукт 41 [152].

Схема 15

На следующей стадии окислением по методу Джонса из Р-гидроксисульфонамидного производного 41 раствором оксида хрома (VI) в присутствии разбавленной серной кислоты в ацетоне, с высоким выходом синтезирован кетон 38 (схема 16) [153].

Схема 16

Для получения целевых сульфонамидов 39 были подобраны и оптимизированы условия конденсации Кневенагеля 2-оксоэтансульфонамида 38 с ароматическими альдегидами. Установлено, что наибольший выход аддукта конденсации 42а достигнут при проведении реакции с избытком ацетата пиперидина в толуоле при 70 °С. Стоит отметить, что в найденных условиях происходит селективное образование одного из E/Z-изомеров. Конденсация по активированной метиленовой группе бензоилметансульфонамида (38) с арен- или гетероаренкарбальдегидами в подобранных условиях получены 3-оксо-1-пропен-2-сульфонамиды 42а^ с приемлемыми выходами (схема 17). Расщепление трет-бутильной группы аддуктов 42а^ действием ТФУ в дихлорметане давало целевые сульфонамиды 39а-е, g с высокими выходами. Следует отметить, что при удалении трет-бутильной защитной группы с 1-Я-индольного производного 42f побочные реакции димеризации и полимеризации приводят к снижению выхода (43%) целевого сульфонамида 39Г Структуры всех производных были подтверждены физико-химическими методами, включая масс-спектрометрию высокого разрешения, ЯМР спектроскопию 1Н и 13С; чистота целевых соединений 39а^ (>95%) подтверждена методом ВЭЖХ.

схема 17

ЯМР 1Н и 13С спектры не позволяют определить конфигурацию синтезированного изомера целевого соединения 39а. Поэтому единственным методом установления пространственной структуры соединений 39а является рентгено-структурный анализ. Проведение РСА показало, что синтезированный 3-оксо-1,3-дифенилпроп-1-ен-2-сульфонамид (39а) является Е-изомером (рис. 19)2.

Рисунок 19. Пространственная структура соединения 39а

Для анализа влияния (гетеро)арилметилиденовго фрагмента на антипролиферативную активность производных синтезирован незамещенный 2-фенил-2-оксоэтансульфонамид 43 (схема 18).

Схема 18

Структуры полученных сульфонамидов (схемы 1-20) доказаны набором физико-химических методов, включая масс-спектрометрию высокого разрешения и1Ни 13С ЯМР спектроскопию; чистота целевых соединений (>95%) подтверждена данными ВЭЖХ анализа.

2.2. Биологические свойства синтезированных соединений

Скрининг антипролиферативной активности синтезированных сульфонамидов был проведён методом MTT-теста в отношении аденокарцином молочной железы (MCF-7, MDA-MB231) в условиях нормоксии (21% О2) и гипоксии (1% О2) в сравнении с Доксорубицином (DOX) в лаборатории онкопротеомики НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина (зав. лабораторией онкопротеомики, к.б.н. Щербаков А.М.). Антипролферативная активность соединений на клетках промиелоцитарного лейкоза человека К562 и карциномы толстой кишки НСТ116 и их сублиний с МЛУ (К562/4 и НСТ116р53КО) была изучена в ФГБНУ НИИНА им. Г.Ф. Гаузе (к.х.н. Деженкова Л.Г.).

2.2.1. Биологическая активность индолин-5-сульфонамидов

На сегодняшний день известно 12 изоформ КА человека, которые содержат катион Zn2+ в активном центре и катализируют гидратацию диоксида углерода (CO2) с образованием бикарбоната (HCO3") и протона (H+). Помимо многих физиологически важных функций (например, дыхания, гомеостаза pH и секреции электролитов), активность и экспрессия некоторых изоформ КА приводит к развитию патологических состояний; например, КА I и КА II вносят вклад в патогенез и развитие потери зрения у пациентов с диабетом и глаукомой [154, 155]. Кроме того, экспрессия изоформ I и II наблюдалась при различных типах гематологических злокачественных новообразований, а также опухолях толстой и прямой кишки [156, 157].

КА IX и КА XII, индуцируемые гипоксией (отличительная черта клеток солидных опухолей), экспрессируются в результате повышения уровня транскрипционного фактора HIF. Эти изоформы КА способствуют инвазии, миграции и устойчивости опухолевых клеток к клинически используемым противоопухолевым препаратам [6, 8, 14].

Синтезированные индолин-5-сульфонамиды 2a-u, 8, 9 были исследованы на ингибирующую активность в отношении четырех изоформ КА методом остановленного потока [158] 3. Данные о константах ингибирования индолин-5-сульфонамидов 2a-u, 8, 9 представлены в таблице 4.

Таблица 4. Константы ингибирования (К1) изоформ карбоангидраз (КА I, II, IX и XII) для индолин-5-сульфонамидов (2а-и, 8, 9), ацетазоламида (AAZ) и индана 1 в качестве препаратов сравнения

Соединение

2а

2Ь

2с

2d

2е

2f

2ё

2Ъ

21

2]

2к

R

КА I

79.0

88.3

К (пМ)а

КА II

5.4

65.9 5.6

242.1 66.2

350.1 54.0

220.1 36.1

67.7 9.2

КА IX

> 10

мкМ

> 10

мкМ

> 10

мкМ

> 10

мкМ

> 10

мкМ

> 10

мкМ

КАХИ

258.5

> 10 мкМ

9.5 2246.9 >10 мкМ

268.1 9.1 1330.2 41.3

52.2 3.4 1297.5 126.7

303.9 31.3 141.2 111.7

57.0

56.0

93.9

110.0

77.7 9.3 173.0 >10 мкМ

21

2т

2п

20

2р 2q

2г

2s

21 2и

AAZ

71.5

49.0

71.4

60.5

64.0

42.2

60.9

51.6

67.0

41.0

71.7

250

4.0

3.0

9.3

5.0

7.1

3.5

1.8

3.0

2.5

12.1

203.2

> 10

мкМ

1990.1

12.5 2394.3

176.7

132.8

> 10

мкМ

2290.5

25.7

112.5

103.0

91.0

> 10

83.4 4.5 119.6

мкМ

42.2 2109.4 198.1

пЛ.

147.3

88.1

176.8 > 10 мкМ

222.6 >10 мкМ

> 10 мкМ

136.6

5.7

8

9

1

НЫ

770

490

3.5

О

Г

Значения KI представлены на основе трех независимых экспериментов.

Большинство производных индолин-5-сульфонамида эффективно ингибируют КА I при концентрации ниже 100 нМ. Стоит отметить, что в ряду производных индолин-5-сульфонамида наиболее активными оказались амиды 2-тиофенкарбоновой кислоты 2г, 3,4,5-триметоксибензойной кислоты 2т, а также ^-бензильное производное 8.

Индолин-5-сульфонамиды демонстрируют наивысшую активность в отношении КА II. В частности, 17 соединений ингибируют КA II при концентрациях ниже 10 нМ. Среди них стоит отметить производное циклогексанкарбоновой кислоты 2и, ингибирующий КA II при 1.8 нМ концентрации. Помимо этого, высокой активностью обладают амид пентафторбензойной кислоты 2е = 3.0 нМ) и 2-метилиндолиновый аналог 9 (^ = 2.5 нМ).

В отношении КА IX индолин-5-сульфонамиды действуют в широком диапазоне концентраций. Производные с 3-хлорфенильным 2£ тиофеновым 2г и циклопентильным остатком 28^ являются наиболее активными ингибиторами КA IX со значениями ^ около 100 нМ. Эти соединения более чем в 100 раз превосходят группу наименее активных производных, что свидетельствует о высокой значимости структуры липофильного ацильного фрагмента для ингибирования КА IX. Кроме того, сравнение значений & индана 1 с аналогом на основе индолина 2е для КА IX показывает, что аминоиндановое ядро является предпочтительным для ингибирования КA IX. Таким образом, ингибирующая активность 1-ацилиндолин-5-сульфонамидов 2а-и в отношении КА IX существенно зависит от строения ацильного фрагмента и заметно усиливается при наличии 3-хлорбензоильного фрагмента.

1-Ацилированные индолин-5-сульфаниламиды 2d,g,h являются наиболее активными ингибиторами КА XII. Примечательно, что для индолин-5-сульфонамидов введение бензоильной группы (2а) по сравнению с менее полярным бензильным фрагментом (8) приводит к явному усилению активности в отношении КА XII.

Большинство 1-ацилированных индолин-5-сульфонамидов ингибируют КА XII при концентрации около 100 нМ. Основываясь на результатах скрининга ингибирования КА, 3-хлорбензоильное производное 2Г, как одно из наиболее активных соединений в отношении КА IX и КА XII, было выбрано в качестве соединения-лидера для дальнейшего исследования.

Антипролиферативная активность индолин-5-сульфаниламидов была оценена методом МТТ-теста на линии опухолевых клеток MCF7 в условиях нормоксии и гипоксии4. Согласно результатам, представленным в таблице 5, индолин-5-сульфаниламиды 2а-и, 8, 9 проявляют умеренный антипролиферативный эффект. Большинство индолин-5-сульфаниламидов не утрачивают своей активности в условиях гипоксии, что является частой причиной резистентности к противоопухолевым средствам. Результаты МТТ-теста прототипа 1 и индолинового аналога 2е указывают на усиление антипролиферативной активности производного индолина в отношении линии MCF7 в условиях нормоксии и гипоксии. Сравнение значений ГС50 указывает на больший антипролиферативный эффект бензильного производного (8) над бензоильным (2а). Кроме того, величины ГС50 указывают на большую активность индолин-5-сульфонамидного ядра (2е) в сравнении с 2-метил производным (9).

Таблица 5. Антипролиферативная активность (МТТ тест, ГС50, цМ) производных индолин-5-сульфонамидов 2а-и, 8, 9 и прототипа 1 в отношении линий MCF7 в нормоксии и гипоксии.

Соединение

MCF7 ICsoa

ИГСб

нормоксия гипоксия

2a >50 36.9 ±3.5 -

2b >50 >50 -

2c 40.6 ±3.8 32.7 ±2.8 1.2

2d >50 35.9 ±3.4 -

2e 29.9 ±2.7 20.2 ±2.0 1.5

2f 24.5 ± 1.9 12.9 ± 1.2 1.9

2g 36.5 ±3.3 24.2 ±2.1 1.5

2h 35.2 ±3.5 48.7 ±4.5 0.7

21 >50 43.6 ±4.0 -

2] 46.2 ±3.6 >50 -

2к >50 >50 -

21 37.0 ±3.0 >50 -

2т 29.6 ±2.2 36.7 ±3.2 0.8

2п 18.4 ± 1.6 >50 -

2о 43.7 ±3.7 39.5 ±3.4 1.1

2р 48.8 ±4.4 39.9 ±3.5 1.2

2q >50 >50 -

2г 47.7 ±3.8 39.1 ±3.9 1.2

28 >50 >50 -

21 38.0 ±3.5 36.0±3.3 1.1

2и 37.1 ±3.5 39.2 ±3.4 0.9

8 23.6 ±2.2 34.8 ±3.2 0,68

9 35.6 ±2.0 >50 -

1 >50 >50

аЗначения ГС50 представлены на основе трех независимых экспериментов; бИндекс гипоксической селективности, ИГС = (ГС50, нормоксия)/(IC50, гипоксия); Нормоксия: 21% О2; Гипоксия: 1% О2.

Таким образом, среди протестированных индолин-5-сульфонамидов ингибитор КА IX 2f проявляет наибольшую активность в отношении клеток MCF7 в условиях гипоксии (ГС50 = 12.9 мкМ), и наибольший ИГС = 2.

2.2.2. Биологическая активность индол-5-сульфонамидов

Скрининг антипролиферативной активности синтезированных индол-5-сульфонамидов 14а-с, 15 был проведён методом МТТ-теста в отношении рака молочной железы (MCF-7) в условиях нормоксии (21% О2) и гипоксии (1% О2)5. В качестве препарата сравнения использовался 1-бензилиндолил-3-карбинол (Вп13С). Значения цитотоксической активности (Ю50, мкМ) синтезированных сульфонамидов индола и препарата сравнения приведены в таблице 6.

Таблица 6. Антипролиферативная активность (МТТ тест, Ю50, цМ) производных индол-5-сульфонамидов 14а-с, 15 и прототипа Вп13С в отношении линий MCF7 в нормоксии и гипоксии.

Соединение

14a

14b

14c

15

Структура

MCF7 IC50, цМа

Нормоксия Гипоксия

>50

>50

>50

>50

25.3

34.5

>50

>50

0

ОН

BnI3C

0.05 ±0.004 0.195 ±0.02

О

1

ны

>50

>50

О

Г

Г Р

аЗначения 1С50 представлены на основе трех независимых экспериментов.

Обнаружено, что синтезированные сульфонамиды на основе индола обладают низкой антипролиферативной активностью в отношении клеток рака молочной железы MCF7 как в условии нормоксии, так и гипоксии. Стоит отметить, что синтезированные 1-бензил-3-(гидроксиметил)индол-5-сульфонамиды 14а и 14Ь не ингибируют рост клеток MCF7 в условиях нормоксии и гипоксии при концентрациях ниже 50 мкМ, в отличие от их аналога BnI3C. Так, среди протестированных соединений (таблица 6) только производное 14с показало умеренную активность для клеток MCF7 со значениями Ю50 = 25.3 и 34.5 мкМ в нормоксии и гипоксии соответственно. Изучение цитотоксических свойств водорастворимого индол-5-сульфонамида 15 выявило, что это производное также не ингибирует пролиферацию (Ю50 >50 мкМ).

КА-ингибиторная активность серии изатин-5-сульфонамидов 17а-и в сравнении с ацетазоламидом (ЛЛ2) и прототипным ингибитором 1 была изучена в отношении четырёх карбоангидраз человека (КЛ I, II, IX, XII) кинетическим методом остановленного потока (таблица 7)6 [158].

2.2.3. Биологическая активность изатин-5-сульфонамидов

Таблица 7. Константы ингибирования (К1) изоформ карбоангидраз (КА I, II, IX и XII) инзатин-5-сульфонамидами 17а-и, 18 ацетазоламидом (AAZ) и инданом 1 в качестве препаратов сравнения

К^иМ)а

Соединение И

18 17а

17Ь

17с 17d

17е

17f

17g

КА I КА II КА IX КА XII

Н 256.2 8.4 1459 61.6

80.4 4.2 1529 14.3

61.5 8.2 1114.1 38.3

72.1 15.5 2526.4 >10мкМ

55.4 4.5 240.3 115.1

39.5 3.5 1324.8 79.5

17Ъ

46.8 5.4 1031.6 70.6

53.7 4.8 194.9 13.2

78.3 4.4 259.5 46.6

Таблица 7. Продолжение. 171

17]

17к

171

17т

17п

17о

17р

17Ц

55.3 4.2 292.0 41.4

12.6 4.5 204.3 65.6

77.1 7.1 162.5 43.5

70.0 4.4 1459 61.2

64.8 4.8 276.4 41.7

68.0 5.8 243.8 >10мкМ

СР3 84.03 7.9 811.2 86.3

8.6 5.4 210.9 > 10 мкМ

274.1 4.9 1032 108.2

17г

СР, 78.0 20.5 1772.5 >10 мкМ

171

17и

\ >-N02 516.7 24.9 2040 95.7

85.1 5.2 1812.4 57.8

^—212.1 8.09 1677 128.8

AAZ

250 12.1 25.7

5.7

ны

1

с 770 490 3.5

НТ

аЗначения К1 представлены на основе трех независимых экспериментов.

Большинство производных изатин-5-сульфонамида 17а-и продемонстрировали приемлемый ингибирующий потенциал в отношении всех четырех изоформ, подавляя активность карбоангидраз в наномолярных концентрациях (таблица 7).

Данные, приведенные в таблице 4 свидетельствуют, что большинство 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов 17Ь^, 178 и 17и благодаря наличию гидрофобных заместителей являются более активными ингибиторами СА I по сравнению с исходным изатин-5-сульфонамидом 17а. Кроме того, фенильные производные с метиленовым (17Ь) или этиленовым линкером (17и) обладают более высокой активностью по сравнению с производным пиколина (17у). Для производных 17к и 17q наблюдалось увеличение активности в 6 и 10 раз соответственно относительно ^-незамещенного производного 17Ь. Выявлено, что замена атома галогена в фенильном ядре производных 17Ь—|, 171-р, 128 и 12и на метокси- или нитрогруппы (17г,^у) приводит к потере ингибирующей активности.

Найдено, что КА II оказалась наиболее чувствительной изоформой к затин-5-сульфонамидам. Так, для соединений 17а-и величина К1 варьировалась от 3.5 до 24.9 нМ. Кроме того, 17 соединений превзошли препарат сравнения AAZ. Согласно полученным данным, бензильная группа (17Ь) более благоприятна для ингибирования, чем пиколиновая (17у) и фенилэтильная группы (17и). В результате варьирования заместителей в бензильном кольце, было обнаружено, что наиболее эффективным ингибитором КА II является 4,6-дифторбензильное производное (171). Следует отметить, что среди монофторсодержащих соединений 17с-е наличие в пара-положении атома фтора (производное 17е) было наиболее благоприятным. Однако соединения с трифторметильным фрагментом показали обратную тенденцию, т.е. пара-замещенное

производное 17р было менее активно, чем мета-производное 17о. Интересно, что последние два наблюдения согласуются с данными для I и IX изоформ.

В отношении КЛ IX изатин-5-сульфонамиды показали наименьшую активность среди исследованных изоформ. Для данного фермента введение липофильного фрагмента не оказало явного влияния на ингибирующую активность, о чем свидетельствуют сходные константы ингибирования соединений 17а,Ь. Однако, перфторированный аналог 17h показал заметное увеличение ингибирующей активности по сравнению с обычным бензильным производным 17Ь. Кроме того, наиболее эффективный ингибитор КЛ IX 2,4-дихлорпроизводное 171 проявляет почти в 10 раз большую активность, чем незамещенный изатин 17Ь. Более высокая активность прототипа 1 в отношении КА IX может быть объяснена более гидрофобной природой инданового ядра по сравнению с изатиновым, а также оптимальным расположением амидной группы, участвующей во взаимодействиях с ферментом.

Для КА XII наиболее активным ингибитором оказался 1-(пентафторбензил)-изатин-5-сульфонамид (17^) Следует отметить, что в некоторых случаях введение заместителей приводит к потере активности против КЛ XII (соединения 17d,o,s,q), в то время как они сохраняют активность в отношении I и II изоформ.

Скрининг антипролиферативных свойств 1-замещенных-изатин-5-сульфонамидов 17а-и, был проведен на клетках рака молочной железы человека МСБ7, лейкоза К-562, и резистентной сублинии К-562/4 с гиперэкспрессией Р гликопротеина в условиях нормоксии (таблица 8). В качестве препаратов сравнения использовался активатор апоптоза 2 (16) [117], а также ингибитор КЛ IX на основе индансульфонамида 1 [106]. В таблице 8 приведены результаты тестирования антипролиферативной активности синтезированных соединений7.

Таблица 8. Антипролиферативные свойства изатин-5-сульфонамидов 17а-и, 18, 24, 25 и препаратов сравнения 1 и 16 на клетках рака молочной железы MCF7, лейкоза К-562, и резистентной линии К-562/4 (72 ч роста клеток с соединениями).

1С5о(цМ)а

Соединение _

MCF7 К-562 К-562/4

18 >50 >50 >50

17а 20.1 ±2.0 18. 0± 1. 3 > 50.0

17Ь 8.7 ±0.8 18.0±1.2 20.0±1,8

17с 26.8±2.7 15.5±1.5 50.0±4.2

^ 17.3±1.6 36.0±2.8 > 50.0

17е 26.5±2.7 35.0±3.0 37.0±3.4

17Г 22.7±2.2 17. 0± 1. 3 40.0±3.6

17ё 10.2±1.0 8.0±0.6 >50.0

17h 6.0±0.6 14.0±1.3 50.0±4.0

171 13.3±1.3 11.0±1.0 32.0±2.8

17] 12.8±1.2 14.5±1.4 18.0±1.7

17к 7.8±0.7 8.8±0.8 18.0±1.5

171 6.1±0.6 17. 0± 1. 3 >50.0

17т 4.4±0.4 8.0±0.6 17.0±1.4

17п 8.4±0.7 9.8±0.9 19.8±1.4

17о 8.2±0.8 16.0±1.3 50.0±4.0

17р 12.0±1.2 9.0±0.5 19.8±1.8

17Я 5.1±0.5 9.0±0.9 43.0±3.6

17г 2.6±0.2 4.5±0.3 6.5±0.6

178 >50 >50 > 50

171 31.8±3.2 17.2±1.7 36.0±2.9

17и >50 >50 >50

1 >50 20.0±1.8 48.0±4.7

16 9.2±0.8 12.5±1.2 18.0±1.7

24 30.2±2.4 18,0±2,7 34,0±4,8

25 7.4±0.6 31,0±4,7 50,0±7,0

аЗначения ГС50 представлены на основе трех независимых экспериментов.

По полученным данным об антипролиферативной активности серии 1-замещенных изатин-5-сульфонамидов 17 в отношении клеток МСБ7 в условиях нормоксии проведен анализ связи структура-активность. Среди соединений 17Ь,с^, являющихся соответственно монофторбензил производными изатина, наибольшей активностью обладает соединение 17Ь (ГС50 = 8.7 мкМ), которое в 2-3 раза более активно, чем его аналоги 17сД Аналогичная зависимость наблюдалась для линии К-562; пара-фторпроизводное 17d было наименее активным, в то время как мета- и орто-фторпроизводные 17Ь,с проявляли сравнимую активность. Следует отметить, что в отношении линии К-562/4, экспрессирующей Р-гликопротеин, только соединение 17Ь сохраняет свою активность, а соединения 17с^ ее утрачивают. Однако, сравнение величин ГС50 соединений 17Ь и 17f для линии МСБ7 демонстрирует, что введение дополнительного атома фтора в положение 6 значительно снижает антипролиферативную активность дифторпроизводного 17^ которое имеет сравнимую цитотоксичность с изомерным аналогом 17е. Вместе с тем, 17f более активен чем 17е в отношении линии К-562, но имеет сниженную активность в отношении резистентной сублинии К-562/4. Замена атомов водорода в 17а на атомы фтора в бензольном кольце соединения 17g приводит к увеличению антипролиферативной активности этого производного в отношении линий МСБ7 и К562. Однако производное 17g утрачивает активность в отношении резистентной линии К562/4 с гиперэкспрессией Р-гликопротеина. Среди моно-и дигалогенопроизводных 17^1 на клетках МСБ7 наиболее активными были (4-хлор)- 17h и (3,4-дихлорбензил)-изатин-5-сульфонамиды 171 (ГС50 = 6 и 6.1 мкМ соответственно). На клетках К562 и К562/4 среди производных 17^1 наибольшей активностью обладало производное 17к (ГС50 = 8.8 и 18.0 мкМ). В ряду производных 17т-р, имеющих в своем составе метильную и трифторметильные группы, наиболее активным в отношении трех тестируемых линий оказалось 3,4-диметильное производное 17т (ГС50 = 4.4 мкМ). Наибольшую активность в отношении трех тестируемых линий демонстрирует трифторметилтиопроизводное 17г со значениями ГС50 = 2.6, 4.5 и 6.5 мкМ в отношении линий МСБ7, К562 и К562/4 соответственно. Стоит отметить, что введение нитрогруппы (производное замена фенильного радикала на пиридинильный (производное 17и), а также увеличение длины алкильного спейсера (производное 171) приводят к заметному снижению антипролиферативной активности 1-бензил-изатин-5-сульфонамида (17а).

Таким образом, ряд соединений 17^1,т^,г превосходит препарат сравнения, активатора апоптоза 2 (16) по антипролиферативной активности со значениями ГС50 = 2.66.1 мкМ (МСБ7). Более того, большинство представленных изатин-5-сульфонамидов, оказалось активнее референсного ингибитора КЛ IX индана 1 (ГС50 > 50 мкМ).

Возникновение устойчивости опухолевых клеток к гипоксии описано для многих химиотерапевтических препаратов [159, 160]. Поэтому разработка новых противоопухолевых соединений, сохраняющих свою активность в условиях сниженного содержания кислорода, может значительно улучшить результаты химиотерапии злокачественных заболеваний. По результатам изучения антипролиферативной активности соединений на клетках MCF7 и К562 отобрана серия сульфонамидов 17^к,1,т,п,о^,г с высокой и средней антипролиферативной активностью в условиях нормоксии.

Для этой серии были проведены исследования антипролиферативных свойств в условиях нормоксии и гипоксии на клетках T47D, МОА-МВ-231, а также цитотоксичности в отношении нормального эпителия молочной железы MCF-10A. Кроме того, активность отобранных сульфонамидов оценена на клетках колоректальной аденокарциномы НСТ116 и на резистентной сублинии с делецией р53 НСТ116(-/-) (таблица 9)8.

Таблица 9. Антипролиферативные свойства отобранных изатин-5-сульфонамидов 17 и препаратов сравнения 1 и 16 на клетках опухолей молочной железы МСБ7, Т47Б МБА-МВ-231, толстой кишки НСТ-116, резистентной линии НСТ-116 р53ко и эпителиальных клеток МСБ-10А

1С50(цМ)

Соед МСР7 Т47Б МБА-МВ-231 МОМОА НСТ- НСТ-116

Нормо Гипо Нормо Гипо Нормо Гипо Нормо Гипо 116 р53ко

17Ь 6.0±0.6 4.9±0.3 18.4±1.8 42.5±4.3 22.0±2.2 19.1±2.0 6.9±0.6 6.2±0.5 23.0±3.2 30.0±4.5

17к 7.8±0.7 5.6±0.5 12.0±1.2 21.8±2.2 7.0±0.7 8.4±0.8 N1 N1 17.5±2.4 20.0±3.0

171 6.1±0.6 5.9±0.5 17.1±1.7 >50 21.8±2.1 18.5±1.9 6.6±0.6 7.3±0.7 32.0±4.8 31.0±4.3

17т 4.4±0.4 3.9±0.2 9.4±1.0 11.Ш.1 7.4±0.7 9.4±0.9 6.2±0.5 6.0±0.6 17.0±2.2 15.0±2.3

17п 8.4±0.8 5.9±0.4 6.3±0.6 >50 14.2±1.4 17.6±1.8 N1 N1 17.7±2.1 30.0±4.5

17о 8.2±0.8 5.5±0.4 22.6±2.2 32.6±3.3 27.1±2.7 16.3±1.6 N1 N1 30.0±4.2 34.0±5.1

17Ч 5.1±0.5 4.6±0.4 20.7±2.1 >50 28.4±2.7 40.8±4.1 4.0±0.3 3.2±0.3 27.0±3.8 30.0±3.6

17г 2.6±0.2 3.2±0.3 6.3±0.6 20.3±2.0 6.9±0.7 10.8±1.1 6.4±0.5 8.6±0.7 14.5±2.0 15.0±2.1