Синтез полимерсодержащих сорбентов и их использование для одностадийного выделения ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Простякова, Анна Игоревна

• Простякова, Анна Игоревна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Простякова, Анна Игоревна

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Методы выделения и очистки нуклеиновых кислот

1.2 Твердофазная экстракция НК

1.2.1 Коммерческие сорбенты для выделения НК

1.2.2 Автоматические устройства для выделения и очистки НК

1.2.3 Одностадийное выделение ДНК

1.3 Композиционные сорбенты

1.3.1 Выбор носителя

1.3.2 Основные подходы к модифицированию поверхности кремнезема полимерами

1.3.3 Выбор полимерного модификатора

1.4 фторсодержащие полимеры, как модификаторы для получения композиционных сорбентов

1.4.1 Физико-химические свойства фторполимеров

1.4.2 Преимущества фторполимерсодержащих композиционных сорбентов

1.4.3 Способы получения фторполимерсодержащих покрытий

1.4.4 Сорбционые свойства фторполимерсодержащих композиционных сорбентов

1.5 полианилин как альтернативный модификатор для получения композиционных сорбентов

1.5.1 Формы полианилина и их взаимопревращения

1.5.2 Получение полианилина

1.5.3 Формирование покрытий ПАНИ

1.5.4 Сорбционные свойства ПАНИ-содержащих сорбентов

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 2 .РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

2.1 Композиционные фторполимерсодержащие сорбенты, полученные методом озон-инициированной полимеризации

2.1.1 Активация макропористого стекла озоном

2.1.2 Полимеризация тетрафторэтилена на поверхности озонированного кремнезема

2.1.3 Морфологические характеристики ПТФЭ-содержащих композиционных материалов

2.1.4 Сорбционные свойства ПТФЭ-содержащих композиционных материалов

2.2 Композиционные полианилинсодержащие сорбенты

2.2.1 Морфологические характеристики ПАНИ-модифицированных сорбентов

2.2.2 Сорбционные свойства ПАНИ-модифицированых сорбентов

2.2.3 Применение методики одностадийного выделения ДНК на ФП-ПАНИ-содержащих сорбентах в лабораторном анализе

2.2.4 Выделение ДНК из растительной ткани при детекции фитопатогенов

2.2.5 Одностадийное выделение ДНК из крови

2.2.6 Выделение ДНК из клинического материала для определения

возбудителей заболеваний методом ПЦР

ВЫВОДЫ

ГЛАВА 3.ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Материалы и методы

3.2 Получение ПТФЭ-содержащих композиционных сорбентов методом озон-индуцированной полимеризации

3.2.1 Озонирование кремнезема

3.2.2 Модификация озонированного кремнезема сополимерами тетрафторэтилена в режиме пост-полимеризации

3.2.3 Модификация озонированного кремнезема сополимерами тетрафторэтилена в режиме одновременного введения мономеров,

3.3 Получение композиционного сорбента, последовательно модифицированного фторопластом и полианилином (ФП-ПАНИ-сорбент)

3.3.1 Нанесение фторопласта на поверхность кремнезема методом «кастинг»

3.3.2 Полимеризации анилина на поверхности модифицированного фторопластом кремнезема

3.4 Одностадийное выделение ДНК картриджным методом

3.4.1 Картриджный метод одностадийного выделения ДНК

3.4.2 Выделение ДНК из клеточной культуры Agrobacterium tumefaciens С58. ИЗ

3.4.3 Выделение ДНК из растительной ткани с помощью полученных сорбентов

3.4.4 Очистка ПЦР-продукта

3.4.5 Выделение ДНК из клинических образцов биоматериала

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез полимерсодержащих сорбентов и их использование для одностадийного выделения ДНК»

ВВЕДЕНИЕ

Современная биотехнология является одной из наиболее бурно развивающихся научных дисциплин, причем в ее развитии можно выделить несколько основных направлений, таких как химическая, биологическая и медицинская биотехнология. Классическая биотехнология, основанная на достижениях микробиологии, биохимии и химической инженерии, может быть определена как дисциплина, занимающаяся «промышленным производством товаров и услуг при участии живых организмов, биологических систем и процессов» [1]. Однако в связи с развитием технологии рекомбинантных ДНК, открытой в конце XX в., сущность биотехнологии радикально изменилась. Ранее биотехнологический процесс включал три ключевых этапа, а именно: обработку (подготовку) сырья с целью его эффективного использования в качестве источника питательных веществ для микроорганизма-мишени, ферментацию и биотрансформацию с целью получения нужного метаболита и очистку конечного продукта (вещества) от компонентов среды и клеточной массы. Поэтому основной целью исследований в данной области являлось повышение эффективности каждого этапа, а также поиск микроорганизмов, используя которые можно получить необходимые вещества (антибиотики, пищевые добавки и т.д.). Технология рекомбинантных ДНК открыла возможность напрямую оптимизировать этап биотрансформации, т.е. не просто проводить селекцию высокопродуктивных штаммов, а создавать новые микроорганизмы и эукариотические клетки, в больших количествах производящие необходимые низкомолекулярные вещества и биомакромолекулы. Стало возможным использовать растения и животные в качестве «биореакторов» для производства новых генных продуктов, которые невозможно получить методами селекции или мутагенеза. Таким образом, на стыке биотехнологии и технологии рекомбинантных ДНК возникла молекулярная биотехнология - новая дисциплина, разрабатывающая методы создания живых систем с новыми функциями и возможностями и основанная на комплексном применении методов молекулярной

и клеточной биологии, микробиологии, генетики, биохимии и химической инженерии [2].

С развитием молекулярной биотехнологии, благодаря эффективным и быстродействующим методам выделения конкретных генов и их введения в организм нового хозяина (микроорганизма, растения или животного), стало возможным существенно повысить урожайность сельскохозяйственных культур (за счет создания растений, устойчивых к воздействию патогенов и условий окружающей среды), создавать новые породы животных с улучшенными наследуемыми признаками, повысить эффективность переработки отходов, загрязняющих окружающую среду, а главное, проводить точную диагностику, профилактику и лечение многих инфекционных и генетических заболеваний методами генной терапии. Появилась возможность не только создавать «биологические реакторы», трансгенных животных, генно-модифицированные растения, но и проводить генетическую паспортизацию - полное исследование и анализ генотипа человека, проводимое, например, сразу после рождения, для определения предрасположенности к различным заболеваниям, возможных аллергических реакций, и даже склонности к определенным видам деятельности. Генетическая паспортизация позволяет прогнозировать и уменьшать риски сердечнососудистых и онкологических заболеваний, исследовать и предотвращать нейродегенеративные заболевания и процессы старения, анализировать нейрофизиологические особенности личности на молекулярном уровне.

В лабораторной диагностике инфекционных заболеваний, наряду с традиционными микробиологическими и иммунологическими методами, широко применяются новые подходы, основанные на использовании молекулярно-генетических технологий. Применение этих методов не только в научных целях, но и в практической лабораторной диагностике во многом стало возможным благодаря разработке в середине 80-х годов XX в. процесса искусственного многократного копирования ДНК и дальнейшему стремительному развитию этой технологии, в настоящее время известной как полимеразная цепная реакция

(ПЦР). ПЦР сделала рутинным анализ специфических полинуклеотидных последовательностей микроорганизмов, растений, животных и человека. Универсальность, высокая чувствительность и относительная простота исполнения сделали метод ПЦР незаменимым для прямого обнаружения и идентификации возбудителей заболеваний [3], молекулярного типирования и исследования свойств патогенных микроорганизмов [4], анализа мутаций, связанных с генетическими заболеваниями у человека, идентификации личности

[5].

Однако, наряду со многими преимуществами ПЦР-диагностики (возможность определения некультивируемых видов бактерий, таких как Mycobacterium leprae, Treponema pallidum и многих видов вирусов, например, вируса папилломы человека и гепатита С) серьезную проблему представляет выбор конкретных методов подготовки клинических образцов к исследованию. В настоящее время не существует универсальных подходов к выделению ДНК" разных видов микроорганизмов из различных источников. Быстрые методы подготовки проб, предусматривающие возможность автоматизации, не всегда обеспечивают требуемый уровень чувствительности. С другой стороны, многоэтапные методики, позволяющие очистить и сконцентрировать ДНК (РНК) для ПЦР-анализа, оказываются трудоемкими и могут увеличивать риск контаминации образцов.

Таким образом, высокий уровень развития биомедицинского направления биотехнологии определяет актуальность разработки новых эффективных материалов и методов выделения и очистки нуклеиновых кислот, из различных источников (бактериальные и клеточные лизаты, кровь, клинические образцы тканей человека). При этом, кроме сохранения функциональной активности выделенных соединений (в т.ч. при хранении), особое внимание обращается на такой важный фактор, как время, затрачиваемое на очистку и выделения биополимеров; необходимо также оценивать и возможность масштабирования и автоматизации процесса выделения.

Для решения данной проблемы в настоящей работе были разработаны новые композиционные сорбенты на основе макропористых твердых носителей, модифицированных нанослоями функционализованных полимеров, в частности, фторсодержащими полимерами и полианилинами, продемонстрирована высокая эффективность применения полученных материалов как в пробоподготовке при одностадийном выделении ДНК из различных источников для непосредственного использования в ПЦР-анализе, так и при использовании в лабораторной практике для получения и очистки синтетических нуклеиновых кислот.

ГЛАВА 1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1 Методы выделения и очистки нуклеиновых кислот

Разработка эффективных способов выделения и очистки нуклеиновых кислот во многих случаях явилась существенной предпосылкой прогресса биотехнологии, поскольку степень очистки выделяемого образца нуклеиновой кислоты во многом определяет эффективность того или иного протокола исследования.

В настоящее время процедура очистки/выделения НК представлена достаточно широким спектром разнообразных методик, который включает в себя как относительно простые и распространенные коммерчески доступные методики, так и сложные многостадийные схемы. Однако все они базируются на основных физико-химических процессах разделения веществ, представленных в таблице 1.

Таблица 1 - Методы выделения/очистки биополимеров.

Принцип действия Соответствующие методики выделения биополимеров

Экстракция.

Разделение смесей жидкостей или растворенных веществ путем избирательного растворения отдельных компонентов в особых растворителях. Искомое вещество должно преимущественно растворятся в растворителе (экстрагенте), чем в среде. Фенол-хлороформная экстракция нуклеиновых кислот [6]

Осаждение.

Осаждение физическое - за счет нагревания, охлаждения, концентрирования или разбавления - т. е. в результате изменения агрегатного состояния вещества при переходе исходной системы в неустойчивое состояние. Осаждение химическое - за счет образования нерастворимых соединений в результате добавления органических или неорганических веществ. Препаративное ультрацентрифугирование ДНК в градиенте плотности хлорида цезия [7] Переосаждение ДНК в спиртах [8, 9, 10] Осаждение белков сульфатом аммония, сульфатом декстрана [11]

Адсорбция.

Частный случай экстракции. Концентрирование целевого вещества на границе раздела адсорбент-жидкость. Адсорбент может быть как жидким, так и твердым. Очистка ДНК на магнитных частицах [12] Очистка белков и пептидов "Ва1сЬ"-методом на магнитных частицах [13] Очистка нуклеиновых кислот методами адсорбции на поверхности пористых кремнеземов и стеклянных микросфер. [14, 15, 16]

Хроматография.

Метод разделения смесей веществ или частиц, основанный на различиях в скоростях их Разнообразные варианты хроматографии белков и нуклеиновых кислот [17]

перемещения в системе несмешивающихся и движущихся относительно друг друга фаз.

Разделение в двух водных полимерных фазах.

Метод разделения клеток, микроорганизмов, макромолекул биополимеров и т.д. в смеси водных растворов полимеров (двухфазная водная система), например в смеси 5% раствора декстрана и 3,5% раствора полиэтиленгликоля [18]. Разделение, очистка и концентрирование биомолекул, клеточных органелл, мембран и клеток [20]

Как правило, на практике, для достижения необходимой чистоты образца или более тонкого разделения смеси биополимеров исследователю приходится использовать многостадийные протоколы, которые сочетают в себе несколько методов (например, щелочная экстракция плазмидной ДНК с последующей адсорбцией на стеклянных гранулах [19]). В первую очередь это касается случаев выделения нуклеиновых кислот при использовании прямых методов анализа (без применения культивирования микроорганизмов на искусственных средах), в частности методами ПЦР, из проб, полученных из окружающей среды или из клинических образцов, для проведения идентификации патогенных микроорганизмов [20, 21].

Конечно, встречаются случаи, когда в исследуемых образцах концентрация примесей достаточно низкая и не влияет на проведение ПЦР [22], или количество исследуемого материала изначально настолько мало (например, при анализе

единичных клеток или бактерий, сконцентрированных имунномагнитным разделением), что любой метод пробоподготовки влечет за собой потерю нуклеиновой кислоты [23]. В таких случаях исследуемый образец предварительно разбавляют для снижения концентрации загрязняющих примесей ниже определенного порога [24]. Однако, большинство проб из окружающей среды или клинические образцы содержат значительное количество примесей (например, хаотропные соли, полисахариды [25]), которые взаимодействуют как с ДНК, так и с ферментами, используемыми для амплификации ДНК (таблица 2), поэтому на первом этапе такого исследования необходимо проводить эффективную очистку и выделение ДНК.

Таблица 2 - Источники ДНК для прямых методов анализа.

Содержание ингибирующих примесей в образцах Метод выделения НК Трудности при выделении

Воздух

Малое количество, источником являются, в основном, частицы пыли Центрифугирование, фильтрация [26] Необходимость переводить микроорганизмы в жидкую среду

Жидкость

В зависимости от природы растворителя/жидкой фазы - хаотропные соли, кислоты. Центрифугирование, фильтрация, адсорбция на носителях, электрофорез [27] В большинстве случаев гетерогенность пробы.

Почва

Органические полимеры, гуминовые Ионно-обменная хроматография, Гетерогенность пробы, прочное

кислоты и ионы. адсорбция на носителях, осаждение в градиенте плотности [28] связывание микроорганизмов с частицами примесей. Присутствие мощных ингибиторов ПЦР. Большое количество мертвых клеток, что снижает эффективность лизиса.

Экскременты

Протеазы, нуклеазы и полисахариды. Адсорбция на носителях или осаждение в градиенте плотности [29] Высокая концентрация ингибиторов ПЦР

Растительные и животные ткани, кровь

Гем и соответствующие производные, хлорофиллы, белки, ионные комплексы, протеазы, полисахариды и др. Механическая и/или ферментативная дезинтеграция в сочетании с адсорбцией на носителях, фенол-хлороформная экстракция [30] Высокая гетерогенность пробы, присутствие мощных ингибиторов ПЦР (гем, хлорофиллы)

Приведенные в таблице примеры лишь отчасти отражают разнообразие применяемых в данной области подходов, многие из которых, ввиду многостадийности, не подходят для широкого применения, зачастую требуя специальных навыков от исследователя и отнимая достаточно много времени, что не обеспечивает возможности обрабатывать одновременно большое количество образцов. Как видно из таблицы 2, в большинстве применяемых методов

осуществляется принцип выделения НК, основанный на адсорбции выделяемого компонента на поверхности различных носителей - твердофазная экстракция РЖ.

1.2 Твердофазная экстракция НК

Открытие в 1978 г Фогелыптайном и Гиллеспи [31] способности ДНК сорбироваться на стеклянных микросферах в концентрированном растворе соли Nal (рисунок 1) положило начало развитию нового относительно быстрого метода выделения и очистки нуклеиновых кислот - твердофазной экстракции нуклеиновых кислот (solid-phase nucleic acid extraction).

Стоит отметить, что единого мнения по поводу механизма процесса

взаимодействия ДНК с силикой до сих пор, а существует несколько точек зрения.

Согласно первой точке зрения [32] основным механизм взаимодействия ДНК и кремнезема является образование водородных связей между водой и молекулами НК. Подобные выводы были сделаны после выявления зависимости между количеством адсорбированной ДНК и диаметром пор носителя. Предполагается, что сорбция происходит за счет взаимодействия гидратных оболочек образованных поверхностью поры и молекул ДНК. Авторы подчеркивают, что ДНК лишь частично включается в поры, а основная часть молекул находится на поверхности. В данной теории не ясным остаётся роль хаотропных солей, присутствующих в растворе. Вследствие этого наиболее вероятным механизмом сорбции представляется второй [33], который заключается в том, что сорбция ДНК на кремнеземе происходит за счёт образования катионных мостиков между силанольными группами, расположенными на поверхности носителя и фосфатными группами ДНК. При рН 6-8 поверхность кремнезема отрицательно заряжена, как и фосфатные группы ДНК и из-за электростатического отталкивания взаимодействие между ними невозможно. Однако при добавлении хаотропной соли отрицательный заряд экранируется. В таких условиях молекулы НК сорбируются на поверхности кремнезема за счет ван-дер-ваальсовых взаимодействий.

катионный

Н20

ДНК

?У

у

~0"Ма+0"Р~0"

О-

^ ДеЗОЕСЖрЕООЗ»

-0'Н+

ч

-О'Н^

-о-нх

хаотропная соль

-О-Ыа^О-Р-О"

!

о

Рисунок 1 - Сорбция ДНК на поверхности кремнеземного носителя в присутствии

хаотропной соли.

Последующие работы в этом направлении [16, 19, 34] показали, что присутствие любой хаотропной соли (гуанидин гидрохлорид, гуанидин изоцианат и др.) в высокой концентрации способствует образованию водородных связей между молекулами ДНК и поверхностью кремнеземного носителя (стеклянные шарики, стеклянное волокно, силикагель, кремнезем, диатомитовая земля и т. д.), а изменяя ионную силу буферного раствора, можно десорбировать ДНК с поверхности носителя.

Таким образом, методика очистки и выделения нуклеиновых кислот свелась к четырем ключевым этапам:

1. Лизис материала, из которого выделяют НК.

2. Адсорбция НК на носителе.

3. Отмывка носителя от посторонних примесей (как правило, несколько раз).

4. Элюирование НК с поверхности носителя.

Несомненные преимущества данной методики (по сравнению с классическим вариантом выделения и очистки НК - фенол-хлороформной экстракцией), а

именно сравнительно малое время, затрачиваемое на выделение Ж, а также отсутствие необходимости использовать высокочистые органические растворители (некоторые из которых следует перегонять непосредственно перед началом эксперимента), стимулировали стремительное развитие данного направления.

Важно отметить, что существенный прогресс в данной области был достигнут благодаря созданию нового формата «фильтров» для очистки биологического материала - небольших пластиковых картриджей (рисунок 2), помещенных в центрифужную пробирку-приемник [35].

Рисунок 2 - Мини-картридж для фильтрации под действием центрифужных сил (патент US4683058).

Такой картридж, упакованный высокоселективным сорбентом (мембраной) с развитой площадью поверхности, по сути, стал новым типом хроматографической миниколонки. Пропускание элюента через такую миниколонку может осуществляться за счет самотека (gravity-flow columns), принудительно, например, с помощью поршня или благодаря центрифугированию (spin-columns), и в результате подключения к вакуумной системе (рисунок 3).

Рисунок 3 - Современная мини-колонка QiaPrep spin-column компании Qiagen

(Германия) (А) и пример ее использования в наборах (Б) (www.qiagen.com).

Именно практическая реализация сочетания картриджного варианта хроматографии и твердофазной экстракции в едином конструкционном элементе легла в основу разработки наиболее простых и универсальных протоколов выделения НК, принятых многими биотехнологическими компаниями в качестве основы при создании общедоступных лабораторных наборов (китов) для выделения НК, которые позволяют быстро и эффективно проводить выделение и очистку различных типов НК.

1.2.1 Коммерческие сорбенты для выделения НК

Разнообразие продукции в области коммерческих наборов для выделения и очистки НК на сегодняшнем рынке представлено несколькими сотнями наименований, которые, на первый взгляд, мало чем отличаются друг от друга (традиционно, в набор входит адсорбционный материал или готовая колонка, упакованная адсорбционным материалом, и несколько буферных растворов для отмывки и элюции НК). Единственным ключевым отличием таких наборов является природа самого носителя, поверхность которого, так или иначе, взаимодействует с молекулами ДНК. В качестве сорбента может применяться материал на основе кремнезема, диатомиты, анион-обменные смолы, магнитные частицы, мембраны и т. д. Ниже кратко рассмотрены наиболее часто

встречающиеся наполнители, применяемые в системах для выделения и очистки нуклеиновых кислот.

1.2.1.1 Кремнеземные материалы

Наиболее распространенным матрицами, используемыми в большинстве наборов в качестве сорбентов, являются кремнеземы. В качестве кремнеземного носителя могут выступать силикагель, кремнезем, стеклянные частицы и микроволокно, стеклянная пыль, полученная размолом стеклянного волокна, или смесь силикагеля со стеклянным носителем [34].

Принцип очистки нуклеиновых кислот на кремнеземных сорбентах основан на сродстве отрицательно заряженной макромолекулы ДНК к положительно заряженной поверхности кремнезема в присутствии хаотропной соли [32].

Первым коммерческим продуктом для широкой лабораторной практики, содержащим кремнеземный материал в качестве носителя, стали наборы серии Wizard® Plus Minipreps DNA Purification System, предложенные компанией Promega [36, 37]. Разработчики предложили переносить отдельно приготовленную смесь клеточного лизата, кремнеземного сорбента и раствора хаотропной соли (хлорид гуанидина или тиоционат гуанидина) в небольшие пластиковые колонки (Promega Wizard™ mini-columns), затем проводилась отмывка от примесей, что позволило избежать потерь НК при многократной декантации на данном этапе, а также полностью удалить остатки промывочного буфера. Элюирование ДНК с носителя также значительно упростилось: на колонку наносили необходимое количество воды или ТЭ-буфера и инкубировали колонку при комнатной температуре 1-2 мин. Затем колонку вставляли в чистую микроцентрифужную пробирку и центрифугировали на максимальной скорости в течение 1 мин или подключали к вакуумной системе. Пробирку с полученным раствором очищенной ДНК в воде (или ТЭ-буфере ) можно было хранить при температуре от 4° до -20°С в течение некоторого времени.

В качестве альтернативного варианта, этой же компанией были разработаны наборы Wizard® Plus SV Minipreps DNA Purification System, которые включали

колонки, упакованные кремнеземсодержащей мембраной [38]. Главное преимущество данного набора заключалось в возможности непосредственно наносить готовый лизат на мембрану, а не смешивать его с сорбентом предварительно, с последующим переносом в картридж (как было заявлено в вышеописанном изобретении [35-36]). Кроме того, мембранный формат оказался более удачным с технологической точки зрения, т. к. в этом случае нет необходимости отвешивать точное количество сорбента для упаковки колонки, отсутствует риск рассыпания сорбента.

Аналогичные наборы с кремнеземсодержащими материалами были предложены также рядом других фирм. Так, компания Qiagen в качестве кремнеземного носителя использует кремнеземсодержащие мембраны (наборы QIAamp Kits, QIAprep Kits, QIAquick DNA Cleanup Kits), компания Roche использует в качестве носителя стеклянное микроволокно (наборы серии High Pure kits) и кремнеземные частицы (Agarose Gel DNA Extraction Kit).

1.2.1.2 Диатомитовая земля

Диатомитовая земля, известная так же, как кизельгур или диатомит, представляет собой горную породу, состоящую на 80% из оксида кремния [39].

Сорбция ДНК на диатомите в присутствии хаотропной соли происходит по такому же механизму, как и в случае кремнеземных сорбентов. Промывка сорбента со связанной ДНК осуществляется спирто-содержащим буфером, а элюирование - низкосолевым ТЭ-буфером или водой.

1.2.1.3 Анионобменные смолы на основе кремнезема

В 1983 г. М. Колпан запатентовал анионобменную смолу [40], полученную на основе силикагеля, последовательно модифицированного у-глицидилоксипропилтриметоксисиланом и ^^диэтилэтанолом. Описанный в этом же патенте хроматографический процесс с использованием разработанного ДЭАЭ-сорбента отличался от заявленных ранее хроматографических методик

разделения НК универсальностью применения (отсутствовали ограничения по молекулярной массе НК), коротким периодом и высоким разрешением разделения, высокой загрузочной емкостью.

Год спустя после заявки описанного патента М. Колпан организовал компанию Qiagen, а уже в 1986 г. была выпушена первая серия наборов для очистки и выделения плазмидной ДНК (QIAGEN Plasmid Purification Kit), основанная на использовании анионобменной смолы, запатентованной М. Колпаном (впоследствии получившая название QIAGEN Anion-Exchange Resin®), которая позволила сократить время выделения плазмидной ДНК с 3 дней до 2 часов [41].

Преимуществом QIAGEN Resin® по сравнению с другими анион-обменными смолами является высокая плотность заряда на поверхности сорбента, которая достигается благодаря использованию макропористого силикагеля с размером частиц порядка 100 мкм в качестве носителя. Большая площадь поверхности носителя позволяет проводить прививку ДЭАЭ с высокой плотностью распределения заряда по поверхности (рис. 4).

Сорбция ДНК ДЭАЭ-сорбентом происходит за счет взаимодействия отрицательно-заряженных фосфатных групп в молекуле ДНК и положительно-заряженных групп ДЭАЭ на поверхности носителя (рисунок 4) в присутствии низкосолевого (0.1М) буфера с нейтральным значением pH. Отмывку примесей проводят среднесолевыми буферными растворами, а элюцию ДНК - буферным раствором с высокой концентрацией соли [42].

QIAGEN Resin

NJAsI/AJASI/

S* St W Si

OH

OH

ДЭАЭ

si

ch, СИ, NH

с н, CHj

I I CH,

CHt

1

C+i,

i

IttJ ТМП

CHg CHa

I I ch, cha

SA

ш,си;

о-сн,си,

о-сн,сн,

ДЭАЭ (диэтиламиноэтанол)

OCHOHMKt

Химическая структура ДНК

Рисунок 4 - Химическая структура ДЭАЭ-групп на поверхности анионобменной смолы QIAGEN Resin (А), с которыми взаимодействуют отрицательно-заряженных группы в молекуле ДНК (Б) hvww.aiagen.com).

1.2.1.4 Магнитные частицы.

Магнитные или парамагнитные частицы обычно представляют собой неорганический магнит, модифицированный различными функциональными полимерами, обладающими сродством кНКв определенных условиях [43, 44, 45]. Методика очистки и выделения Ж с помощью наборов с магнитными частицами не отличается от аналогичных протоколов с использованием кремнеземов или анионобменных смол и реализуется по классической схеме: связывание-отмывка-

элюция.

На сегодняшний день магнитное разделение является одним из самых простых и быстрых способов реализации процесса твердофазной экстракции ДНК. Коммерческие наборы, в которых используется данный механизм выделения Ж, представлены, в основном, двумя вариантами протоколов выделения.

Один из вариантов предложен компанией Promega в наборах Wizard® MagneSil® Plasmid Purification System [46]. Частицы, обладающие магнитным зарядом, легко фиксируются в реакционном сосуде с помощью приложенного магнитного поля (магнита), что позволяет проводить стадии отмывки и элюции в одной пробирке без потерь носителя, не используя при этом специальных колонок (спин-колонок) или вакуумной системы.

Второй вариант протокола реализуется в наборах компании Qiagen серии QIAsymphony DNA Kits [47]. В набор входят одноразовые магнитные стержни (рисунок 5) и специальные пробирки с буферными растворами. Магнитный стержень, вставленный в футляр, погружают в пробирку с буфером №1, содержащим магнитные частицы (этап 1), в результате чего частицы налипают на стержень. Затем магнитный стержень с футляром вынимают из пробирки и переносят в пробирку с буфером №2 (этап 2). На заключительном этапе магнитный стержень достают из футляра, а частицы переходят в объем.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Простякова, Анна Игоревна

105 ВЫВОДЫ

1. Разработаны новые технологичные способы получения ПТФЭ-содержащих сорбентов с различной полярностью поверхности и сорбентов, последовательно модифицированных нанослоями фторопласта и полианилина.

2. С помощью указанных способов получена серия сорбентов на основе пористого кремнезема с равномерным устойчивым полимерным нанопокрытием, что подтверждено данными сканирующей зондовой микроскопии, ртутной порометрии и оптической спектроскопии.

3. Впервые установлено, что благодаря введению в состав фторполимерной фазы дополнительных функциональных групп различной полярности, полученные ПТФЭ-содержащие сорбенты позволяют проводить одностадийное разделение НК по ряду параметров (ДНК/РНК, мол.масса, вторичная структура).

4. Показано, что ФП-ПАНИ-сорбент может использоваться при выделении ДНК из любых источников, при этом полученная ДНК характеризуется чистотой необходимой для ПЦР.

5. Продемонстрировано, что полученный ФП-ПАНИ-сорбент может успешно использоваться для очистки ПЦР-фрагментов от компонентов реакционной смеси (7ад-полимеразы, дНТФ, праймеров и зондов).

6. Показано, что разработанные методы одностадийного выделения бактериальной и вирусной ДНК с применением ФП-ПАНИ-сорбента из клинических образцов различного происхождения (урогенитальные мазки, плазма, кровь, мокрота) более эффективны по ряду параметров (чуствительность детекции, количество стадий и время проведения пробоподготовки) по сравнению с используемыми в настоящее время протоколами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Простякова, Анна Игоревна, 2013 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1.Манаков М.Н., Победимский Д.Г. Теоретические основы технологии микробиологических производств.// 1990г. —М., Агропромиздат

2.Кузьмина Н.А. Основы биотехнологии: учебное пособие для студентов биологического факультета//URL: http://www.biotechnolog.ru

3.Маккреди Б.Дж., Чимера Д.А., Обнаружение и идентификация патогенных микроорганизмов молекулярными методами. IIМолекулярная клиническая диагностика. Методы. — 1999 — М. Мир. с.496-506.

4.Ridly A.M. Genomic Fingerprinting by Application of rep-PCR.//Molecular bacteriology. Protocols and Clinical Applications. - 1998 - Totowa: Humana Press. p.103- 117.

5.Лопухов Л.В., Эйдельштейн M.B. Полимеразная цепная реакция в клинической микробиологической диагностике // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. —2000. — Т. 2. -№3. С. 96-106.

6. Chomczynski P., Sacchi N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem - 1986 — 162. p. 156-159.

7. Carr S.M., Griffiths O.M. Preparative density-gradient ultracentrifugation of DNA I/Biochem Genet - 1987- 25. p. 385-390.

8. Zeugin JA, Hartley JL. Ethanol Precipitation of DNA// Focus - 1985 -7 (4).p. 1-2.

9. Crouse J, Amorese D. Ethanol Precipitation: Ammonium Acetate as an Alternative to Sodium Acetate //Focus - 1987 - 9 (2). p. 3-5.

10. Paithankar K.R. and Prasad K.S. Precipitation of DNA by polyethylene glycol and ethanol. //Nucleic Acids Res. - 1991 - 19. p. 1346 -1352

11. Janson J-S, Ryden L. Protein Purification, High Resolution Methods and Applications. 2nd edition. // Willey Inc. - 1998

12. Lehmann U. et al. Droplet-based DNA purification in a magnetic lab-on-a-chip. // Angew. Chem.- 2006 - Int. Edn 45. p. 3062-3067

13. Safarik I, Safarikova M. Magnetic techniques for the isolation and purification of proteins and peptides.// BioMagn. Res. Technol. - 2004 - 2:7. p. 1-17

14. Boom R, Sol С J, Salimans MM, Jansen CL, Wertheim-van Dillen PM, van der Noordaa J. Rapid and simple method for purification of nucleic acids. HJ. Clin. Microbiol. - 1990 - 28(3). p. 495-503

15. Cady, et al. Nucleic acid purification using microfabricated silicon structures.// Biosensors and Bioelectronics — 2003 — 19. p. 59-66.

16. Tian et al. Evaluation of Silica Resins for Direct and Efficient Extration of DNA from Complex Biological Matrices in a Miniaturized YormaX.HAnalytical Biochemistry - 2000 - 283, p. 175-191

17. Остерман JT.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот ИМ. -Наука- 1985.

18. Albertson P.-A. Partion of cell and macromoleculs. Separation and purification of biomolecules, cell organelles, membranes and cell in aqueous polymer two-phase systems and their use in biochemical analysis and biotechnology. Third Edition. // J. Wiley&Sons - 1986 - ISBN: 0-471-82820-3

19. Marko M.A. et al. A procedure for the large-scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder.HAnal. Biochem -1982-121. p. 382-387.

20. Greenfield L. and White T. J. Sample preparation methods.// Diagnostic Molecular Microbiology: Principles and Applications - 1993 - American Society

of Microbiology, Washington, p. 122-137.

21. Rogers C. and Burgoyne L. Bacterial typing: storing and processing of stabilized reference bacteria for polymerase chain reaction without preparing

DNA- an example of an automatable procedure. IIAnal. Biochem - 1997 - 247. p. 223227.

22. Abu Al-Soud, W. and Radstrom, P. Capacity of nine thermostable DNA polymerases to mediate DNA amplification in the presence of PCR-inhibiting

samples // Appl. Environ. Microbiol. - 1998 - 64. p. 3748-3753

23. Tengs, T., Dahlberg, O. J., Shalchian-Tabrizi, K., et al. Phylogenetic analyses indicate that the 19rhexanoyloxy-fucoxanthin-containing dinoflagellates have tertiary plastids of haptophyte origin I/Mol. Biol. Evol. - 2000 -17.p. 718-729.

24. Grevelding, C. G., Kampkotter, A., Hollmann, M., Schafer, U., and Kunz, W. Direct PCR on fruitflies and blood flukes without prior DNA isolation //Nucleic Acids Res-1996- 24. p. 4100-4101.

25. Monteiro, L., Bonnemaison, D., Vekris, A., et al. Complex polysaccharides as PCR inhibitors in feces: Helicobacter pylori model HJ. Clin. Microbiol. - 1997 -35.p. 995-998.

26. Alvarez, A. J., Buttner, M. P., and Stetzenbach, L. D. (1995) PCR for bioaerosol monitoring: sensitivity and environmental interference.// Appl. Environ. Microbiol. -1995- 61, p. 3639-3644.

27. Cheng, J., Sheldon, E. L., Wu, L., et al. Preparation and hybridization analysis of DNA/RNA from E. coli on microfabricated bioelectronic chips.// Nat.

Biotechnol - 1998 - 16,p. 541-546.

28. Watson, R. J. and Blackwell, B. Purification and characterization of a common soil component which inhibits the polymerase chain reaction.// Can. J. Microbiol. -2000 - 46, p. 633-642.

29. Monteiro, L., Gras, N., Vidal, R., Cabrita, J., and Megraud, F. Detection of Helicobacter pylori DNA in human feces by PCR: DNA stability and removal of inhibitors. HJ. Microbiol. Methods - 2001 - 45. p. 89-94.

30. Sambrook, J., and Rüssel, D. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York - 2000.

31. Vogelstein B., Gillespie D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose // Proc. Natl. Acad. Sei. USA -1979- 76, p. 615-619

32. Fujiwara M., Yamamoto F., Okamoto K., Shiokawa K., Nomura R. Adsorption of duplex DNA on mesoporous silicas: possibility of inclusion of DNA into their mesopores // Anal Chem. - 2005 - 77 (24), p. 8138-8145.

33. Rother D., Sen Т., East D., Bruce I. J. Silica and its surface modification by alkoxysilanes in nanomedicine // Nanomedicine - 2011 - 6(2), p. 281-300

34. Melzak K.A., Sherwood C.S., Turner R.F.B., Haynes C.A. Driving forces for DNA adsorption to silica in perchlorate solutions// Journal of Colloid and Interface Science -1996-181 , pp. 635-644

35. Lyman G.F., Mathus G. Filter for centrifuge tube. // Патент № US4683058, Cos tar corporation -1987

36. Padhye V.V, York C., Burkiewiez A. Nucleic acid purification on silica gel and glass mixture. // Патент № US 5658548, Promega Corporation -1997

31. Padhye V.V, York C., Burkiewiez A. Nucleic acid purification on silica gel and glass mixture. // Патент № US 5808041, Promega Corporation — 1998

38. Ekenberg S.J. Improved filtration system and method. // Патент № AU7301718, Promega Corporation -1998

39. Little M.C. Process for the purification of DNA on diatomaceous earth. // Патент № US 5075430, BioRad Laboratories - 1991

40. Colpan M., Riesner D. Chromatographic method for isolating macromolecules// Патент № W08303363 - 1983

41.12 Years of QIAGEN Plasmid Kits.// Qiagen News - 1998 -1, p. 11- 12.

42. QIAGEN Genomic DNA Handbook. // QIAGEN Inc. - 2001

43. Davies M.J, I. Taylor J.I., Sachsinger N., Bruce I.J. Isolation of Plasmid DNA Using Magnetite as a Solid-Phase Adsorbent.// Analytical biochemistry - 1998 - 262, 92 - 94.

44. Smith C.E., York C.E. Methods of isolating biological target materials using silica magnetic particles.// Патент № US 6027945, Promega Corporation - 2000

45. Nargessi R.D. Magnetic isolation and purification of nucleic acids. //Патент № US 6855499, Cortex Biochem. Inc. - 2005.

46. Wizard® MagneSil® Plasmid Purification System. // Promega Corporation. Technical bulletin. Part #TB286 - 2009.

47. QIAsymphony DNA Handbook. // QIAGENInc. - 2010

48. B.B. Сабуров, M.P. Муйдинов, C.A. Гурьянов, А.Д. Катаев, С.И.Туркин, В.П. Зубов. Перфторполимерсодержащие кремнеземные сорбенты и их применение в обращенно-фазовой хроматографии биологически-активных веществ. ИЖ.физ. химия - 1991 - 65, № 10, с. 2692-2698

49. Капустин Д.В., Сабуров В.В., Завада JI.JL, Евстратов А.В., Барсамян Г.Б. Композиционные фторсодержащие сорбенты для выделения и очистки биополимеров ИБиоорган. Химия — 1998 — 24, 11. с.868-876.

50. Kapustin D.V, Yagudaeva Е. Yu., Muydinov M.R., Yaroshevskaja E.M., Plobner L., Leiser R.-M., Brem G. New Polymer-Coated materials for One-Step Separation of Nucleic Acids.// Frontiers in DNA Research, Corey R. Woods., ed. Nova Science Publishers, USA. - 2006. p. 113-136.

51. Cuatrecasas P., Anfinsen C.P. Affinity Chromatography. Chapter 31 in Methods in Enzymology. // Academic Press - 1971 - p. 345-378.

52. Айлер P. Химия кремнезема: Пер с англ. под ред. Прянишникова ИМ.: Мир- 1982

53. Robert Doering, Yoshio Nishi. Handbook of Semiconductor Manufacturing Technology. // CRC Press. - 2007 - ISBN 1574446754.

54. Beck J. S., Vartuli J. C., Roth W. J., Leonowicz M. E. et al. A new family of mesoporous molecular sieves prepared with liquid crystal templates //Journal of the American Chemical Society. - 1992 - 114. p. 1083-10843

55. Zhuravlev L. T. The surface chemistry of amorphous silica. //Colloids Surf. A. Physicochem. Eng. Aspects — 2000 -173 p. 1-38

56. Kellum G. E., Smith R. C. Determination of water, silanol, and strained siloxane on silica surfaces. 11 Anal. Chem, -1967 - 39. p. 341-345

57. Hesselink F. Th. On the density distribution of segments of adsorbed macromolecules: The effect of dangling tails // Journal of Colloid and Interface Science. - 1975 - 50 - 3. p. 606-608

58. Bogacheva Ye.K., El'tekov Yu.A. Effect of temperature on the kinetics and equilibria of the adsorption of polystyrene on macroporous silica gels //Polymer Science U.S.S.R.- 1974- 16 - 3. p. 714-720

59. Молодкина JI.M., Мчедлишвили Б.В. Очистка вируса гриппа на полимерно-модифицированном стекле.//Этиология и специфическая профилактика гриппа. — 1979 - Л. С. 92-95,

60. Darling Т., Albert J., Russel P. et al Rapid purification of RNA timus virus and proteins by high-perfomance steric exlusion chromatography on porous glass bead columns HJ. Chromatogr. - 1977-131. p. 383-390

61. Жигис Л.С., Решетов П.Д., Копьев В.П., Ермакова Т.Г., Татарова Л.А. Полимерно-модифицированный кремнеземный сорбент для хроматографической очистки вирусных суспензий Неб. III Всесоюзная конференция. Водорастворимые полимеры и их применение. Тезисы докладов, с. 173

62. Адсорбция из растворов на поверхности твердых тел, под ред. Г. Парфита и К. Рочестера // М., Мир - 1986

63. Rivera, Z.S., Kennedy, J.F. High-Performance Liquid Chromatography of Biopolymers and Biooligomers (book reviews) // Chemistry and Industry — 1989

64. Kataev A.D., Saburov V.V., Reznikova O.A., Kapustin D.V., Zubov V.P. Polytrifluorostyrene-coated silica as a packing for column liquid chromatography //Journal of a Chromatography A - 1994 — 660 - 1. p. 131 — 136

65. Липатов Ю.С., Сергеева Л.М. Адсорбция полимеров // Киев, Наукова думка, 1972

66. Ivanov A. E., Saburov V. V., Zubov V. P. Polymer-Coated Adsorbents for the Separation of Biopolymers and Particles // Advances in Polymer Science - 1992 - 104. p. 135- 175

67. Meiller F., Bonnebat C., Deleuil M. Modified porous bodies// Патент US398439 - 1976

68. Espiard P., Revillon A., Guyot A., Mark J.E. Nucleation of emulsion polymerization in the presence of small silica particles HPolymer Latexes — 1992 — 24. p. 387-404

69. Платэ H.A., Прокопенко В.В., Каргин В.А. Полимеризация некоторых мономеров при диспергировании неорганических веществ // Высокомолекулярные соединения — 1959 —Т. 1 — 11. с.1713-1720

70. Каргин В.А, Платэ Н.А., Литвинов И.А., Шибаев В.П., Лурье Е.Г. Процессы полимеризации и прививки на свежеобразованных поверхностях неорганических веществ // Высокомолекулярные соединения - 1961 - Т. 3 - 7. с. 1091-1099

71. Ворошилова О.И., Киселев А.В., Никитин Ю.С. Синтез и исследование кремнеземных носителей с поверхностью, модифицированной у-аминопропильными группами IIКоллоидный журнал — 1980 — XLII. — 2. с. 223-229

72. Яблокова Н. В. Радикальная полимеризация стирола на поверхности аэросила, инициируемая привитым винилтри-(трет-бутилперокси)силаном //Высокомолекуляр. соединения. Сер. Б, — 1985 - 27 — 7.с. 553 — 557

73. Hayashi S., Takeuchi Y., Eguchi M., Iida Т., Tsubokawa N. Graft Polymerization of Vinyl Monomers Initiated by Peroxycarbonate Groups Introduced onto Silica Surface by Michael Addition // Journal of Applied Polymer Science - 1999 - 71. p. 1491-1497

74. Kosaka Y., Yokohama M.U., Hashimoto Т., Fukano K. High-energy radiation induced polymerization on a chromatographic solid support // US Patent № 4045353 -1977

75. Richey T, Iwata H, Oowaki H, Uchida E, Matsuda S, Ikada Y. Surface modification of polyethylene balloon catheters for local drug delivery // Biomaterials -2000-21. p. 1057-1065

76. Hermanson G.T. Bioconjugate techniques. // New York, Academic Press -

1996

11. Лисичкин Г.В. Химия привитых поверхностных соединений ИМ., ФИЗМАТЛИТ- 2003.

78. Паншин Ю.А., Малкевич С.Г., Дунаевская Ц.С. Фторопласты.ПХимия -

1978

79. Фторполимеры. Под ред. Л. Уолла, пер. с англ.// Мир — 1975

80. Hjerten S, Hellman U. Chromatographic desalting, deprotoinization and concentration of nucleic acids on columns of polytetrafluorineethylene// J. Chromatography A. - 1978 - 159. p. 47-55.

81. Kataev A.D., Saburov V.V., Reznikova O.A., Kapustin D.V., Zubov V.P. Polytrifluorostyrene-coated silica as s packing for column liquid-chromatography //J. Chromatography A. - 1994 - 660 - 1,2. p. 131-136

82.William D.W., Kabra P.M. Extended life for blood serum analysis columns using dual zone chromatographic materials//Anal. Chem. - 1990 - 62. p. 807-810

83. Billiet H.A., Schoenmakers P.J., de Galan L. Retention and selectivity characteristics of a non-polar perfluorinated stationary phase for liquid chromatography//./. Chromatography A. - 1981 - 218. p. 443-454.

84. Ecking W., Trung В., Radelia R., Gross U. Group separation of alkyl-substituted aromatic hydrocarbons by high-performance liquid chromatography using perfluorocarbon modified silica gel// Chromatographia - 1982 - 16. p. 178-182.

85.Berensden K.A., Pikaart K. A., de Galan L., Olieman C. (Heptafluorodecyl)dimethylsilyl bonded phase for reversed-phase liquid chromatography// Analitical Chemistry - 1986 - 52. p. 1990 - 1993.

86. Kobes R.K., Eveleigh T.W., Arentzen R. A novel fluorocarbon-based immobilization technology// Trends in biotechnology - 1989 - 7.p. 101

87. De Miguel I., Roueche A. , Betbeder D. Separation of dipalmitoyl phosphatidyl choline, cholesterol and their degradation products by high-performance liquid chromatography on a perfluorinated stationary bonded phase. // J. Chromatogr. A -1999-840. p. 31-38.

88. Monde T, Kamiusuki T, Kuroda T, Mikumo K, Ohkawa T, Fukube H. HighPerformance Liquid-Chromatographic Separation of Phenols on a Fluorocarbon-Bonded Silica Gel Column // J. Chromatogr A - 1996 - 722. p.273-280

89. Zubov V.P., Plobner L., Kapoustine D.V., Balayan H., Muidinov M.R., Brem G., Leiser R.-M. Sorbent material having a covalently attached perfluorinated surface with functional groups. // Patent № W02004041428 - 2004

90. Zubov V. P., Kapustin D. V., Generalova A. N., Yagudaeva E. Yu., Vikhrov A. A., Sizova S. V., Muidinov M. R. Modification of Solids with Polymer Nanolayers as a Process for Manufacture of Novel Biomaterials. // Polymer Science, Ser. A. — 2007 — 49, 12. p. 1247-1264.

91. Муйдинов M.P. Озониды перфторолефинов - новый класс инициаторов полимеризации // Рос.хим.ж. — 2002 — 46— З.с. 72-76

92. Heicklen J. The Reaction of Ozone with Perfluoroolefins // J. Phys. Chem. -1966- 70-2. p. 477-480

93. Kiryukhin D. P., Barkalov I. M., Ismoilov I. L. Initiation of Low-Temperature Polymerization with Hexafluoropropylene Ozonide // Russian Journal of Applied Chemistry - 2001 - 74- 4. p. 704-705

94. Kiryukhin D. P., Barkalov I. M., Ismoilov I. L. Cryoozonolysis of Some Perfluoroolefins and Use of Perfluoro Ozonides as Polymerization Initiators // Russian Journal of Applied Chemistry - 2001 - 74-10. p. 1740-1743.

95. Barsamyan G., Sokolov V. Surface Fluorination of Polymers Using Xenon Difluoride // Fluoropolymers I: Synthesis Topics in Applied Chemistry - 2002 - II. P. 223-240

96. Zubov V. P., Stavrova S. D., Chikhacheva I. P., Prudnikova O. A., Fedorova G. A., Barsamyan G. В., Sokolov V. B. Modification of Polyethylene Films with Xenon Difluoride in Solution // Russian Journal of Applied Chemistry - 1998 - 71- 5. p. 875 -879

97. Kapustin D.V., Zavada L.L., Barsamjan G.B., Ponomarev N.N., Leiser R.-M., Plobner L., Yaroshevskaya E.M., Zubov V.P. New hydrophobic polymer comprising fluorine moites. // Patent № W00041807 - 2000.

98. Glodek J, Milka P, Krest I, Keusgen M. Derivatization of fluorinated polymers and their potential use for the construction of biosensors // Sens Actuators В - 2002 -83. p. 82-89

99. Li J.M., Singh M.J., Nelson P.R., Hendricks G.M., Itani M., Rohrer M.J., et al. Immobilization of human thrombomodulin to expanded polytetrafluoroethylene // J Surg Res - 2002 - 105.p. 200 - 208.

100. Stejskal J. Dendrimers, Assemblies, Nanocomposites //MML Series, ed. by Arshady R and Guyot A. 5. Citus Book - 2002

101. Капустин Д.В., Ягудаева Е.Ю., Завада JI.Jl., Жигис Л.С., Зубов В.П., Ярошевская Е.М., Плобнер Л., Лайзер Р-М., Брем Г. Композиционный полианилин содержащий кремнеземный сорбент для выделения ДНК// Биоорганическая химия — 2003 — 29 — 3. с.310 — 315.

102.Stejskal J. Polyaniline. Preparation of a conducting polymer (IUPAC Technical Report) // Pure Appl. Chem. - 2002 - 74 - 5. p. 857-867

103. Stejskal J, Sapurina I, Trchova M and Konyushenko E, Oxidation of aniline: Polyaniline granules, nanotubes, and oligoaniline microspheres IIMacromolecules -2008-41. p. 3530- 3536

104. Gospodinova N, Terlemezyan L. Conducting polymers prepared by oxidative polymerization: polyaniline // Prog Polym Sci - 1998 - 23. p. 1443-1484

105. Mathew R, Mattes B.R. and Espe M.P. A solid state NMR characterization of cross-linked polyaniline powder // Synth Met - 2002 - 131. p. 141-147

106. Liu X.X., Zhang L, Li Y-B et al. Electrosynthesis of Polyaniline/Si02 Composite at high pH in the Absence of Extra Supporting Electrolyte //Polym Bull -2006-57. p. 825-832

107. Trchova M, Konushenko E.N., Stejskal J et al. Evolution of Polyaniline Nanotubes: The Oxidation of Aniline in Water HJ Phys Chem B - 2006 - 110. p. 94619468

108. Ciric-Marjanovic G., Konyushenko E.N. Chemical oxidative polymerization of anilinium sulfate versus aniline: Theory and experiment //Synthetic Metals - 2008 -158-5. p. 200-211

109. Sumedh P. Surwade, Vineet Dua and et al. Oligoaniline intermediates in the aniline-peroxydisulfate system. // Synthetic Metals - 2009 - 159 - 5-6. p. 445-455

110. Sapurina I, Stejskal J, Review. The mechanism of the oxidative polymerization of aniline and formation of supramolecular polianilin structures. //Polym Int. - 2008 -57. p. 1295-1325

111. Guizado-Rodriguez M., Lôpez-Tejeda M., Escalante J., Guerrero-Alvarez J.A., Nicho M.E. Photosensitive polyaniline colloidal particles prepared by enzymatic polymerization using the azopolymer DMA-co-AZAAm as stabilizer //Materials Chemistry and Physics - 2010 - 124 - 1. p. 389-394

112. Zheng L., Li J. Platinum-polyaniline nanofilms synthesized at a liquidliquid interface with enhanced conductivity //Journal of Electroanalytical Chemistry — 2005 — 577-1.p. 137-144

113. Morrin A., Wilbeer F., Ngamna O., Moulton S.E., Killard A.J., Wallace G.C., Smyth M.R. Novel biosensor fabrication methodology based on processable conducting polyaniline nanoparticles // Electrochemistry Communications — 2005 -7 — 3.p. 317-322

(4й

114. Wang Y., Jing X. Formation of Polyaniline Nanofibers: A Morphological Study IIJ. Phys. Chem. В - 2008 - 112. p. 1157-1162

115. Travain S.A., de Souza N.C., Balogh D.T., Giacometti J.A. Study of the growth process of in situ polyaniline deposited films // J. Colloid Interface Sci. - 2007 -316. p.292-297

116. Zubov V. P., Kapustin D. V., Generalova A. N., Yagudaeva E. Yu., Vikhrov A. A., Sizova S.V., Muidinov M. R. Modification of Solids with Polymer Nanolayers as a Process for Manufacture of Novel Biomaterials// Polymer Science, Ser. A - 2007 - 49

- 12. p. 1247-1264

117. Муйдинов M.P., Сабуров В.В., Туркин С.И., Зубов В.П., Баркалов И.П., Овчинников Ю.А., Гольданский В.И. Способ получения модифицированного кренезема.// Описание изобретения к авторскому свидетельству SU 1839325 А1.

118. Nozaki К. Iodometric Method of Analysis for Organic Peroxides // Industrial and Engineering Chemistry-Analytical Edition - 1946 - 18 - 9, p. 583.

119. A.B. Abell, K.L. Willis and D.A. Lange. Mercury Intrusion Porosimetry and Image Analysis of Cement-Based Materials. // Journal of Colloid and Interface Science

- 1999-211. p. 39-44

120. Паписов И.М. Матричная полимеризация и другие матричные и псевдоматричные процессы как путь получения композиционных материалов // Высокомолекулярные соединения. Б. — 1997 -39 — 3, с. 562 — 574

121. Yagudaeva Е. Yu., Bukina Ya. A., Prostyakova А. I. Zubov V. P., Tverskoy V. A., Kapustin D. V. Oxidative polymerization of aniline on the surface of silica in the presence of poly(sulfonic acids) as a method of preparing efficient biosorbents. // Polymer science series A - 2009 — 51 — 6, p. 675-682