Синтез и противовирусная активность некоторых производных моно-, сескви- и дитерпеноидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.16, кандидат наук Яровая, Ольга Ивановна

• Яровая, Ольга Ивановна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Яровая, Ольга Ивановна

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. Введение 4

2. Противовирусные свойства соединений терпенового ряда и производных на их основе (Литературный обзор) 13

2.1. Введение 13

2.2. Противовирусная активность суммарных экстрактов растений 17

2.3. Монотерпеноиды как источник противовирусных агентов 19

2.4. Противовирусная активность соединений сесквитерпенового ряда 27

2.5. Противовирусные свойства дитерпеновых соединений и их производных 34

2.6. Противовирусная активность соединений тритерпенового ряда 48

2.7. Мишени противовирусной терапии 62

2.8. Механизм действия противовирусных агентов на основе терпеноидов 66

2.9. Заключение 70

3. Обсуждение результатов 71

3.1. Синтез библиотек соединений 73

3.1.1. Химические модификации монотерпенодов 73

3.1.1.1. Химические модификации (+)-камфоры 75

3.1.1.1.1. Синтез иминопроизводных камфоры 76

3.1.1.1.2. Синтез димерных производных камфоры 82

3.1.1.1.3. Модификации иминоспирта 88

3.1.1.2. Химические модификации борнеола и борниламина 94

3.1.1.2.1. Синтез алифатических ^гетероциклических производных (-)-борнеола 95

3.1.1.2.2. Синтез гетероароматических производных (-)-борнеола 98

3.1.1.2.3. Химические модификации изоборнеола и борниламина 103

3.1.1.3. Получение четвертичных аммонийных солей на основе камфоры и борнеола 105

3.1.1.4. Синтез производных а-труксиловой кислоты, содержащих природный фрагмент борнильной структуры 107

3.1.1.5. Взаимодействие (+)-камфоры и (+)-фенхона с о-замещенными анилинами 111

3.1.1.6. Химические модификации (+)-камфорной кислоты 117

3.1.1.7. Химические модификации гидразона камфоры 123

3.1.2. Химические модификации соединений сесквитерпенового ряда -гумулена, кариофиллена и изокариофиллена 126

3.1.3. Синтезы на основе соединений дитерпенового ряда 132

3.1.3.1. Кислотно-катализируемые реакции изоцемброла 132

3.1.3.2. Синтезы соединений на основе дегидроабиетиламина 135

3.1.3.2.1. Получение аммониевых солей дегидроабиетиламина 136

3.1.3.2.2. Получение гетероциклических производных дегироабиетиламина 138

3.1.3.2.3. Получение мочевин и тиомочевин на основе дегидроабиетиламина 142

3.2. Изучение связи структуры синтезированных соединений с их противовирусной активностью 144

3.2.1. Активность против вирусов гриппа 144

3.2.1.1. Противовирусная активность иминопроизводных (+)-камфоры 147

3.2.1.2. Противовирусная активность производных борнеола, изоборнеола и борниламина 156

3.2.1.3. Активность против вирусов гриппа четвертичных аммонийных солей на основе монотерпенов, производных камфорной кислоты и гидразона камфоры 158

3.2.1.4. Изучение противовирусной активности соединений, синтезированных на основе сесквитерпеноидов 160

3.2.1.5. Изучение противовирусной активности дитерпеновых производных, синтезированных на основе изоцемброла и дегидроабиетиламина 162

3.2.2. Изучение активности против вируса Марбург 165

3.3. Изучение механизма действия соединений лидеров против вирусов гриппа 173

3.4. Проверка противовирусной активности на животных моделях. 177

3.5. Селекция и изучение вирусных штаммов, резистентных к камфецину 183

3.6. Молекулярное моделирование противовирусной активности камфецина и его аналогов 187

3.7. Разработка аналитических методик количественного определения камфецина в биологических средах 195

3.7.1. Валидация методики определения камфецина в плазме крови методом ГХ/МС 201

3.7.2. Разработка и валидация методики определения камфецина методом ВЭЖХ/МС 206

3.7.2.1. Разработка методики анализа камфецина в крови методом ВЭЖХ/МС 209

3.7.2.2. Валидация методики определения камфецина в плазме крови методом ВЭЖХ/МС 211

3.8. Проведение фармакокинетических исследований камфецина 219

3.9. Поиск метаболитов 221

3.10. Изучение распределения камфецина и его метаболитов по органам 228

3.11. Изучение влияния камфецина на физиологические особенности животных 235

3.11.1. Действие камфецина на поведение мышей в тесте «открытое поле» 235

3.11.2. Влияние камфецина на некоторые гомеостатические параметры системы крови крыс 238

3.11.3. Изучение влияния камфецина на морфофункциональные характеристики почки крыс 244

3.12. Оптимизация метода синтеза камфецина и разработка технологического процесса 251

4. Экспериментальная часть 253

5. Выводы 376

6. Список литературы 378

7. Приложение. 423

1. Введение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и противовирусная активность некоторых производных моно-, сескви- и дитерпеноидов»

Актуальность темы и степень ее разработанности

Поиск новых противовирусных агентов является одним из приоритетных направлений исследований в современной медицинской химии, что обусловлено распространением широкого спектра вирусных инфекций и появлением новых опасных вирусных болезней, вызываемыми патогенными штаммами, такими, например, как вирусы гриппа А НШ1, Н3№, Н5Ш. Так, несмотря на десятилетия напряженной борьбы с применением как фармацевтических, так и нефармацевтических методов, каждый год сезонный грипп продолжает вызывать эпидемии по всему миру. Основополагающие процессы эволюционной динамики вирусов сезонного гриппа находятся под пристальным вниманием ученых -вирусологов, однако, когда и как появляются новые штаммы вируса остается в большей мере непредсказуемым. Вирусы сезонного гриппа заражают 5-15% популяции людей каждый год, что в результате приводит к ~500 000 смертей в мире. Ежегодное повторение сезонных эпидемий связывают с непрекращающейся эволюцией вирусов сезонного гриппа. Она позволяет уходить от активного иммунного ответа как естественного, связанного с перенесенной инфекцией, так и искусственного, вызванного вакцинацией. В последние годы требования к препаратам для профилактики и лечения гриппа и ОРЗ в существенной мере пересмотрены. По мнению специалистов, в первую очередь эти препараты должны быть специфическими ингибиторами вирусной репликации, то есть непосредственно действовать на вирус. Проблема эффективной профилактики и лечения вирусных инфекций далека от окончательного решения, что связано с высокой контагиозностью и скоростью распространения возбудителей, изменчивостью антигенных свойств вирусов, часто смешанным характером инфекции, быстро развивающейся резистентностью к препаратам, развитием вторичного иммунодефицита, специфичностью большинства средств лечения.

Инновационным подходом в разработке новых противовирусных агентов является использование доступных растительных метаболитов в качестве исходных структурных блоков для синтеза библиотек производных и изучения зависимости структура - противовирусная активность. К числу природных соединений, перспективных в качестве основы для создания новых противовирусных агентов, в первую очередь относятся соединения терпенового ряда. Как в нашей стране, так и за рубежом, значительные усилия в синтезе соединений, обладающих активностью против различных вирусов были сконцентрированы на соединениях тритерпенового ряда, в то время как доступные соединения моно-, сескви- и дитерпенового ряда были обделены вниманием. Молекулярные механизмы противовирусной активности соединений на основе вышеупомянутых терпеноидов ранее практически не были изучены и

исследования зависимости структура - противовирусная активность в мире практически не проводились. Для систематических исследований зависимости структура - активность предпочтительно наличие библиотек структурно близких соединений, поскольку только в таком случае можно с большой степенью достоверности проводить анализ и выявлять ключевые фармакофорные группы. Это, в свою очередь, вызывает необходимость разработать синтетические подходы, позволяющие получать библиотеки веществ доступными методами и с приемлемыми выходами. Идеальный противовирусный агент должен быть специфичным, подавлять репродукцию вируса в зараженных клетках; защищать от вируса незараженные клетки; легко всасываться из пищеварительного тракта; не приводить к токсичным метаболитам и не оказывать побочного действия. Разработка новых высокоэффективных противовирусных средств, кроме безусловного доказательства специфического действия агента (in vitro и in vivo), включает в себя изучение механизма действия и выявление молекулярных мишеней; разработку и валидацию аналитических методик определения действующего вещества в биологических средах; изучение фармакокинетики и выявление ключевых метаболитов; всестороннее изучение влияния агента на различные физиологические аспекты с использованием животных моделей; кроме того, важными моментами является оптимизация метода синтеза и масштабирование.

Таким образом, проблема синтеза новых биологически активных веществ и создания на их основе новых лекарственных средств для лечения и профилактики вирусных инфекций является одной из важнейших задач современной органической, биоорганической и медицинской химии. Цель и задачи.

Цель настоящего диссертационного исследования состоит в разработке и реализации стратегии синтеза библиотек новых соединений на основе доступных соединений терпенового ряда, обладающих противовирусной активностью; выявление соединений лидеров и изучение взаимосвязи между химической структурой и физиологической активностью; изучение механизма их противовирусного действия; установление молекулярных мишеней; биологическое и физиологическое (in vitro и in vivo) тестирование синтезированных соединений на предмет изучения особенностей их влияния на живые организмы. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1) синтез новых производных моно-, сескви- и дитерпеновых соединений с использованием литературных методик, модифицирование литературных методик для получения новых соединений, разработка новых методов синтеза;

2) разработка синтетических методов модификации функциональных групп каркасных бициклических монотерпеноидов камфоры, борнеола и их аналогов, позволяющих

синтезировать библиотеки органических соединений, имеющих в своем остове как природный конформационно ограниченный фрагмент, так и дополнительную фармакофорную группу;

3) разработка методов селективной химической модификации отдельных представителей сесквитерпенового ряда моно- и бициклического строения с целью получения соединений, имеющих каркасные остовы природного происхождения;

4) поиск и разработка новых методов химической модификации дитерпеновых соединений -изоцемброла и дегидроабиетиламина;

5) подробное изучение связи синтезированных агентов с проявляемой противовирусной активностью, выявление закономерностей и ключевых структурных блоков, отвечающих за целевую активность;

6) выявление стадии вирусной репликации гриппа, на которой проявляют противовирусную активность соединения-лидеры, что в свою очередь, позволяет делать предположения о механизме действия;

7) исследование лиганд-рецепторного взаимодействия наиболее активного агента против вируса гриппа с использованием современных методов компьютерного молекулярного моделирования;

8) разработка и валидация аналитических методик определения ключевого соединения лидера (продукта реакции камфоры и аминоэтанола); выявление метаболитов и изучение распределения действующего вещества и его метаболитов в органах животных;

9) изучение физиологических особенностей влияния наиболее активного соединения против гриппа на поведение животных в тесте «открытое поле», изучение физико-химических показателей крови животных и влияние на морфофункциональные характеристики почек животных;

10) оптимизация и масштабирование метода синтеза ключевого соединения лидера. Научная новизна.

В результате проведенного исследования нами впервые синтезирована и описана широкая библиотека иминопроизводных на основе камфоры. Разработан эффективный метод синтеза оснований Шиффа с использованием принципа «зеленой химии», позволяющий проводить реакции без растворителя и минимизировать стадии очистки целевых соединений. Разработаны синтетические подходы, позволяющие получать соединения, содержащие два фрагмента каркасного природного остова и линкеры разной длины, жесткости и имеющие дополнительные функциональные группы. Проведены всесторонние модификации продукта взаимодействия камфоры и аминоэтанола, включающие стереоселективное окисление и восстановление иминогруппы, получение простых и сложных эфиров, введение насыщенных К-гетероциклов в остов и получение триазольных производных.

Синтезированы библиотеки сложноэфирных производных борнеола, имеющих в своем остове алифатические азотсодержащие гетероциклы, отделенные от бициклического остова линкерами разной длины и описан синтез соединений, содержащих ароматические гетероциклические фрагменты. С целью выявления влияния типа линкера, описаны подходы к синтезу производных борниламина.

Впервые показана возможность образования бензимидазольных, бензоксазольных и бензтиазольных производных взаимодействием каркасных кетонов камфоры и фенхона с орто-замещенными ароматическими аминами. Разработаны эффективные методы синтеза новых полициклических соединений на основе камфорной кислоты. Впервые синтезированы производные труксиловой кислоты, содержащие в своем остове фрагменты бициклических монотерпеноидов. Предложен новый метод синтеза гетероциклических производных гидразона камфоры.

На примере превращений моно и бициклических сесквитерпенов - гумулена, кариофиллена и изокариофиллена, показана возможность использования условий реакции Риттера в синтезе полициклических соединений, остов которых имеет природное происхождение. Усовершенствован метод выделения дитерпенового спирта изоцемброла из живицы кедра, разработан способ синтеза трициклических эфиров на основе изоцемброла с использованием гетерогенного кислотного катализатора. Впервые описаны гетероциклические производные доступного природного амина - дегидроабиетиламина. Изучено влияние противоиона в солях дегидроабиетиламмония на проявление биологической активности.

Впервые подробно изучено влияние структуры синтезированных соединений на активность агентов против вирусов гриппа, определены ключевые фармакофорные фрагменты, ответственные за проявляемую активность. Выявлено соединение лидер - продукт взаимодействия камфоры и аминоэтанола, названный нами «камфецин».

Впервые показана и подтверждена высокая активность против вируса Марбург сложноэфирных производных (-)-борнеола, содержащих насыщенный К-гетероциклический фрагмент.

Проведено молекулярное моделирование противовирусной активности камфецина и его аналогов к выбранным молекулярным мишеням вируса гриппа, проведено сравнение с известными лигандами; показано изменение энергии белкового комплекса поверхностного белка вируса гриппа - гемагглютинина в камфецин-резистентном штамме вируса гриппа А И1Ш.

Разработаны и валидированы аналитические методики определения камфецина в плазме и крови животных с использованием методов ГХ/МС и ВЭЖХ/МС, изучены фармакокинетические параметры при пероральном и внутривенном введении. Проведен поиск

и установление строения метаболитов камфецина, изучено распределение данного соединения и его метаболитов по органам животных при пероральном введении. С использованием животных моделей проведено подробное изучение физиологических особенностей влияния камфецина на поведение животных, изучены физико-химические показатели крови и влияние на морфофункциональные характеристики почек крыс. Практическая значимость.

Работа была поддержана Государственным контрактом №14411.2049999.19.085 «Доклинические исследования противовирусного лекарственного средства на основе иминопроизводного природного монотерпеноида», проведенным в рамках государственной программы «Развитие фармацевтической и медицинской промышленности Российской Федерации на период до 2020 года и дальнейшую перспективу». В рамках работы над указанным государственным контрактом было проведено масштабирование синтеза ключевой субстанции и наработано необходимое для доклинических исследований количество камфецина. Была проведена разработка методов выделения действующего вещества из биологических сред и валидированы соответствующие методики. Исследован фармакокинетический профиль действующего вещества и подготовлены нормативные документы по лабораторному регламенту. Проведено исследование стабильности субстанции.

В результате диссертационного исследования разработаны новые методы синтеза большого набора хиральных соединений на основе бициклических монотерпеноидов каркасного строения, сесквитерпенов моно- и бициклического строения и дегидроабиеиламина, многие из которых представляют интерес для фармакологических исследований. Разработаны аналитические методики определения фармакологически важных соединений на основе терпеноидов в цельной крови с использованием «метода сухих пятен», что значительно облегчает стадии пробоподготовки.

На часть практически важных результатов получены патентные свидетельства (7 патентов и 1 заявка на патент).

Методология и методы диссертационного исследования.

Методология исследования построена в соотвествии с классическими принципами медицинской химии. Данная методология включает в себя выбор исходных объектов для химической модификации; синтез библиотек соединений; тестирование синтезированных агентов с использованием in vitro и in vivo моделей; выявление соединений лидеров и изучение механизма действия высокоэффективных агентов; изучение фармакокинетических параметров и метаболизма действующего вещества. Для достижения цели и решения поставленных задач был осуществлен комплексный подход к синтезу производных терпеновых соединений с использованием классических и современных методов органической химии; использованы

современные физико-химические методы анализа для установления структуры синтезированных соединений. В работе использован широкий набор методик, используемых в вирусологии и современные методы компьютерного моделирования. Цитотоксические свойства химических соединений изучены при помощи метилтетразолиевого теста, активность против вируса гриппа активность оценена in vitro в культуре клеток MDCK и in vivo - в опытах на животных на модели летальной гриппозной пневмонии. Основные положения, выносимые на защиту:

• Обнаружен новый класс соединений, являющихся эффективными ингибиторами вирусов гриппа - иминопроизводных на основе (+)-камфоры. Проведено подробное изучение связи структуры соединений с проявляемой противовирусной активностью.

• Выявлено соединение-лидер - продукт взаимодействия камфоры и аминоэтанола, на моделях in vitro и in vivo показан широкий спектр противовирусной активности.

• Впервые описана библиотека производных на основе (-)-борнеола, содержащих гетероциклические фрагменты; изучено влияние фармакофорных структурных блоков, длины и типа линкера на проявляемую противовирусную активность.

• Разработаны эффективные методы синтеза насыщенных N-содержащих гетероциклов на основе гидразона камфоры.

• Впервые описан синтез производных труксиловой кислоты, содержащей фрагменты бициклических монотерпеноидов.

• Показана возможность синтеза азотсодержащих полициклических соединений на основе камфорной кислоты, выявлен агент, проявляющий широкий спектр активности против вирусов гриппа.

• Показана высокая активность против вирусов гриппа у полициклических ацетамидов, синтезированных нами на основе сесквитерпеноидов - гумулена, кариофиллена и изокариофиллена в условиях реакции Риттера.

• Проведено молекулярное моделирование противовирусной активности камфецина и его аналогов ионному каналу М2 и гемагглютинину, показано изменение энергии белкового комплекса поверхностного белка вируса гриппа в камфецин-резистентных штаммах.

• С использованием псевдовирусной системы обнаружен новый класс эффективных ингибиторов филовирусов - сложноэфирных производных борнеола; активность подтверждена на «живом» вирусе Марбург.

• Разработаны и валидированы эффективные методики определения камфецина в плазме и крови животных, показано, что нижний предел определения действующего вещества в цельной крови методом ВЭЖХ/МС достигает 1.5 нг/мл.

• Показано, что основными метаболитами камфецина являются соответствующий глюкоронид, кислота и сульфат камфецина, изучено распределение камфецина и его метаболитов в органах животных. Апробация работы.

Результаты исследований были представлены и докладывались в виде устных докладов на следующих конференциях: The 5th Korea-Russia Bio Joint Forum on the Natural Products Industrialization and Application. Gangneung, Rep. of Korea, (2013); Междисциплинарный Симпозиум по Медицинской, Органической и Биологической химии. Крым, Новый свет (2014); 33rd Annual Meeting of American Society for Virology, Fort Collins, USA (2014); Sibirian winter conference "Current Topics in Organic Chemistry", Шерегеш, Россия (2015); 3rd International Conference on Pharmaceutical Sciences, Tbilisi, Georgia (2015); Вторая Российская конференция по медицинской химии MedChem-2015, Novosibirsk, Russia (2015); Междисциплинарный симпозиум по медицинской, органической и биологической химии, Крым, Новый свет (2015); Dombay organic conference cluster DOCC, Домбай, Россия (2016); I Всероссийская молодежная школа-конференция «Успехи синтеза и комплексообразования». Москва, Россия (2016); Кластер конференций по органической химии "0ргХим-2016", Санкт-Петербург, Россия (2016); The Tenth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure/Systems Biology, Новосибирск, Россия (2016); Третий Междисциплинарный Симпозиум по Медицинской, Органической и Биологической Химии и Фармацевтике МОБИ-ХимФарма 2017 (2017); Всероссийская научная конференция «Современные проблемы органической химии», Новосибирск, Россия (2017); Объединённая международная конференция по органической химии, Байкальские чтения-2017, Иркутск, Россия (2017); XX молодёжная школа-конференция по органической химии, Казань, Россия, (2017); 3rd Russian Conference on Medical Chemistry, Казань, Россия (2017); Всероссийской молодежной научной школе-конференции "Актуальные проблемы органической химии" (2018) и в виде стендовых докладов на следующих конференциях: Options for the Control of Influenza, Cape Town, South Africa, (2013); International Congress og Heterocyclic Chemistry "KOST-2015", Москва, Россия, (2015); International Conference on Medicinal Chemistry RICT 2016, Кайен, Франция (2016); Международная конференция «Химическая биология», посвященная 90-летию Академика Кнорре, Новосибирск, Россия, (2016); 17th International Congress of Virology, IUMS Congress 2017, Singapore, (2017); 7th Asia Oceania Mass Spectrometry Conference, Singapore, (2017).

Настоящая работа является частью программы по изучению синтетических трансформаций низкомолекулярных растительных метаболитов как научной основы создания лекарственных препаратов для медицины, сформированной и развиваемой в отделе медицинской химии НИОХ СО РАН. Работа выполнялась в соответствии с планом научно-

исследовательских работ НИОХ СО РАН программы фундаментальных научных исследований государственных академий наук (ПФНИ ГАН, 2013-2020), приоритетное направление V-48 «Фундаментальные физико-химические исследования механизмов физиологических процессов и создание на их основе фармакологических веществ и лекарственных форм для лечения и профилактики социально значимых заболеваний».

Работа проводилась при поддержке гранта РФФИ № 15-03-00193 «Молекулярный дизайн, синтез и изучение противовирусной активности производных каркасных терпеноидов - нового класса агентов против вируса гриппа», гранта РФФИ № 18-03-00271 «Каркасные терпеноиды в синтезе новых ингибиторов вирусов, вызывающих геморрагическую лихорадку с почечным синдромом» и гранта РНФ № 15-13-00017 «Создание новых препаратов для борьбы с резистентными штаммами вируса гриппа путем направленных трансформаций природных терпеноидов». В указанных грантах РФФИ соискатель являлся руководителем, в гранте РНФ одним из основных исполнителей.

Автор выражает благодарность всем, с кем было связано появление настоящей диссертации. Прежде всего, автор глубоко благодарен научному консультанту профессору Нариману Фаридовичу Салахутдинову - мудрому Учителю, под руководством и при поддержке которого не только было выполнено данное исследование, но и сформировано научное мировоззрение автора. Искреннюю благодарность автор выражает к.х.н. Соколовой А.С., аспирантам Ковалевой К.С. и Чернышову В.В. за активное участие в экспериментальной работе и плодотворные научные дискуссии, к.х.н. Рогачеву А.Д. за совместное проведение аналитических работ. Автор благодарна к.х.н. Шернюкову А.В. и к.х.н. Корчагиной Д.В. за помощь в установлении строения ряда полученных соединений с помощью ЯМР-спектроскопии, д.х.н. Гатилову Ю.В. и Рыбаловой Т.В. за проведение рентгеноструктурного анализа, Комаровой Н.И. за помощь в проведении анализов методом ВЭЖХ. Автор благодарна коллегам за проведение противовирусных исследований синтезированных соединений: коллективу исследователей под руководством к.б.н. Зарубаева В.В. из Санкт-Петербургского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера и к.б.н. Штро А.А. из Института гриппа г. Санкт-Петербурга; проф. Покровскому А.Г., к.б.н. Черезису С.А. и асп. Кононовой А.А. из Новосибирского государственного университета; коллективу вирусологов из ГНЦ «Вектор» -к.б.н. Пьянкову О.В. и к.б.н. Зайковской А.А.. Автор благодарит сотрудников Уфимского института химии Уфимского федерального исследовательского центра РАН к.х.н. Борисевич С.С. и д.х.н. Хурсан С.Л. за совместно проведенные компьютерные рассчеты; сотрудников кафедры физиологии НГУ д.б.н., проф. Лавриненко В.А. и к.б.н. Бабину А.В. за совместно проведённые исследования действия противовирусных агентов с использованием животных

моделей. Автор выражает благодарность за сотрудничество коллективу исследователей из ИНЭОС, г. Москва под руководством д.х.н., проф. Бреля В.К. за совместную работу по химической модификации камфецина. Искреннюю благодарность автор выражает сотрудникам ООО «Инновационные Фармацевтические Разработки» (Ифар) г. Томска и лично руководителю Хазанову В.А. Автор выражает благодарность сотрудникам НИОХ СО РАН к.х.н. Нефедову А.А., Бизяеву В.Л., сотрудникам лаборатории фармакологических исследований д.б.н., проф. Толстиковой Т.Г. и к.х.н. Хвостову М.В, к.х.н. Баеву Д.С. и к.х.н. Анькову С.В. Структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, обсуждения полученных результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы и приложения. Литературный обзор посвящен современным данным о противовирусной активности соединений терпенового ряда и агентов на их основе с обсуждением механизма действия агентов. Обсуждение результатов разделено на синтетическую часть работы, изучение связи структуры соединений с проявляемой активностью, обсуждению биологических испытаний по изучению механизма противовирусного действия, аналитического раздела и обсуждения результатов действия камфецина на физиологические факторы животных. Работа изложена на 426 страницах машинописного текста, содержит 56 схем, 177 рисунков, 30 таблиц, списка цитируемой литературы (490 литературных источников) и приложения.

2. Противовирусные свойства соединений терпенового ряда и производных на их основе. (Литературный обзор)

2.1. Введение

Как это ни удивительно, но все живое на нашей планете - люди, животные и растения заражены вирусами. Количество обнаруженных видов вирусов растет с каждым годом, и, несмотря на то, что на данный момент уже обнаружено более шести тысяч вирусов, современная вирусология считает, что их существует более ста миллионов1. Вирусы обнаружены почти в каждой экосистеме на Земле, они являются самой многочисленной биологической формой. Вирус (происхождение слова от латинского virus - яд) - неклеточный инфекционный агент, который может воспроизводиться только внутри живых клеток. Вирусы поражают все типы организмов, от растений и животных до бактерий и архей. Существует мнение о том, что вирусы убивают значительную часть клеток, которые они заражают, хотя на самом деле вирусы и их клетки-хозяева могут развиваться в условиях мирного сосуществования . Диапазон структурных и биохимических эффектов, оказываемых вирусом на инфицированную клетку, очень широк. Данные изменения называются цитопатическими эффектами, при этом большинство вирусных инфекций приводят к гибели клеток-хозяев. Причинами гибели могут быть лизис клетки, изменения клеточной мембраны и апоптоз. Часто причиной гибели клетки является подавление её нормальной активности белками вируса, не все из которых входят в состав вирусной частицы. В тоже время некоторые вирусы не вызывают никаких видимых изменений в поражённой клетке. Клетки, в которых вирус находится в латентном состоянии и неактивен, имеют мало признаков инфекции и нормально функционируют; в вирусологии такой процесс называется - персистенция вирусов. Это является причиной хронических инфекций, и вирус при них может никак себя не проявлять многие месяцы или годы. Так часто бывает, например, с вирусом герпеса. Некоторые вирусы, например вирус Эпштейна-Барр, могут вызывать быстрое размножение клеток без появления злокачественности, в то время как другие, такие как папилломавирусы, могут вызвать рак.

В основу классификации вирусов положен тип нуклеиновой кислоты, размер и тип симметрии нуклеокапсида, наличие или отсутствие внешней оболочки. Вирусы, принадлежащие к одному семейству, обладают сходным типом генома и сходными морфологическими характеристиками. При делении вирусов на роды учитывают их эпидемиологические и биологические особенности, а также степень гомологии нуклеотидных последовательностей. Каждый вирус человека имеет общепринятое название, связанное с его

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Яровая, Ольга Ивановна, 2018 год

литературе .

Несмотря на относительную доступность изоцемброла, свойства данного соединения изучены недостаточно. Исследованы реакции изомеризации данного спирта в муравьиной кислоте, приводящие к образованию би- и трициклических соединений343, эпоксидирование надкислотами344 и гидроксилирование345. Авторами работы346 проведено эффективное эпоксидирование соединения данного сесквитерпеноида действием t-BuOOH в присутствии

VO(acac)2 и изучены дальнейшие превращения полученного эпоксипроизводного. Окислением

а 347

изоцемброла хлорхроматом пиридиния получены сопряженные еноны .

Успешно реализованная при изучении гумулена, кариофиллена, изокариофиллена и их эпоксипроизводных, методика синтеза производных в условиях реакции Риттера, в случае растворения изоцемброла в указанных условиях дает сложную смесь продуктов, разделить которую не предоставляется возможным. Нами были изучены реакции указанного дитерпенового соединения с аллиловым и метиловым спиртами на глине К-10. Показано, что добавление изоцемброла в систему аллиловый спирт-глина приводит к образованию в качестве основного соединения межмолекулярного продукта - аллилового эфира изоцемброла (344) (схема 52). Следует отметить, что реакция проводилась без растворителя, добавление хлористого метилена в систему значительно увеличивает количество продуктов изомеризации. Так, если вносить изоцемброл в систему хлористый метилен - аллиловый спирт - глина, основным продуктом является соединение (345) образующееся в результате внутримолекулярной циклизации и последующего взаимодействия с аллиловым спиртом; кроме того, идет образование смеси цембренов.

Взаимодействие изоцемброла с метиловым спиртом, катализируемое глиной, приводит к образованию продуктов (346) и (347) в соотношении 1:1. Данные продукты являются результатом внутримолекулярных циклизаций исходного дитерпенового соединения с дальнейшим улавливанием катионов молекулами спирта. Соединения с аналогичными типами остовов были ранее получены при проведении реакции изомеризации изоцемброла в

356

муравьиной кислоте .

Попытки ввести в реакцию с изоцембролом другие спирты, такие как этиловый, изобутиловый и бензиловый не привели к образованию межмолекулярных продуктов. Растворение изоцемброла в хлористом метилене на глине приводит к сложной смеси продуктов изомеризации, разделить которую нам также не удалось.

Условия реакции:

(a) глина К 10, CH2=CH-CH2OH.

(b) глина К 10, Ш202, CH2=CH-CH2OH.

(c) глина К 10, Ш202, CHзOH.

При рассмотрении спектров ЯМР соединений (345-347) обращает на себя внимание тот

1 13

факт, что как в спектрах ЯМР Н, так и в спектрах ЯМР С химические сдвиги сигналов

12

метильных групп у атома С близки между собой, что свидетельствует об одинаковой

13

ориентации их во всех трех случаях. Сравнение спектров ЯМР 13С соединений (346-347) с

12

опубликованными в литературе спектрами пар эпимерных по атому С12 оксипроизводных соединений (346) и (347) позволило приписать указанным метильным группам аксиальную

ориентацию, так как именно в таком положении наблюдается сходство их химических сдвигов.

20

Отметим, что для оксипроизводных соединений (346) и (347) химические сдвиги С Н3-группы в аксиальном положении составляют ~ 22.4 м.д., а в случае их экваториального положения химические сдвиги имеют величину ~ 29.2 м.д. Пространственное расположение других заместителей в соединениях (345-347) приписано по аналогии с описанными в работе356 родственными структурами.

3.1.3.2. Синтезы соединений на основе дегидроабиетиламина.

Следующим объектом химических модификаций в данной работе являлся дегидроабиетиламин (ДГААм) - производное дегидроабиетиновой кислоты (ДАК) (рис. 77), содержащейся в живицах хвойных растений относящихся к родам Pinus, Picea, Abies и Larix.

348

Особенно высоким содержанием ДАК (71 %) отличается живица ели Picea obovata . Рисунок 77.

! Н i Н

^nh2 \юон

(+)-дегидроабиетиламин (+)-дегидроабиетиновая кислота

(ДГААм) (ДАК)

В англоязычной литературе дегидроабиетиламин известен под названием «лиламин» и

включен в список соединений, являющийся важными строительными блоками в медицинской

химии349. Азометины (основания Шиффа), полученные на основе дегидроабиетиламина и

производных бензальдегида проявляют бактерицидную активность в отношении

350

Staphylococcus aureus, Bacillus subtilus, Escherichia coli. . В последние годы было обнаружено, что гидрохлорид дегидроабиетиламина проявляет высокую цитотоксичность на ряде раковых

351

клеток . Было показано, что ДГААм показывает высокую ингибирующую эффективность избирательно уничтожать клетки меланомы путем уменьшения уровня клеточной

352

пролиферации и увеличения апоптоза . Цитотоксический эффект и механизм апоптоза производного, полученного из ДГААм и п-трифторметилбензальдегида изучен на клетках

353

карциномы SMMC-7721. Амиды на основе ДГААмина проявляют выраженную цитотоксическую активность354, изучена активность производных дегидроабиетиламина в качестве ингибиторов ацетилхолинэстеразы355.

Анализ литературных данных по химическим превращениям ДГААмина показал, что ранее были описаны разнообразные амиды и иминопроизводные, получены производные, содержащие заместители в ароматическом кольце. Однако ранее в литературе не были описаны синтезы гетероциклических производных на основе первичной амино группы.

Нами были проведены два основных направления химических модификаций указанного дитерпенового амина. С целью изучения влияния противоиона на биологическую активность солей ДГААмина, был синтезирован набор солей данного дитерпеноида, кроме того, были проведены химические модификации первичной аминогруппы с целью получения не описанных ранее гетероциклических производных.

356

3.1.3.2.1. Получение аммониевых солей дегидроабиетиламина

Интерес к получению аммониевых солей органических соединений обусловлен высокой биологической активностью, выявленной у различных представителей этого класса

357

соединений . Перевод изучаемого биологически активного соединения в ионную форму приводит к изменению физико-химических характеристик, в первую очередь растворимости, данного производного358. Известно, что ряд лекарственных соединений представляют собой водорастворимые «фармацевтические соли» состоящие из фармакологически активного иона и фармацевтически приемлемого противоиона359. Так, например, авторами работы изучены ионные производные бетулина и изучены их цитотоксические свойства на разных линиях

360 361

раковых клеток и противовирусная активность .

В качестве противоионов нами были выбраны карбоновые кислоты различного строения: алифатическая карбоновая кислота - вальпроевая (348а), коричная кислота (348Ь) и ее природные аналоги - кофейная (348с) и феруловая (348d); ароматические (348e, 3481), сульфоароматическая (348g) и гетероароматичекие кислоты (348И, 3481). Кроме того, получены соли ДГААмина природных кислот - дегидроабиетиновой кислоты (348]), дезоксихолиевой кислоты (348к), бетулоновой (3481), урсоловой (348т) и глицирретовой кислоты (348п). Природные кислоты, используемые нами, обладают широким спектром биологической активности. Так, показана противогрибковая362, противогерпетическая363 и противовоспалительная364 активность дегидроабиетиновой кислоты (348]). Дезоксихолиевая кислота (348к) является представителем желчных кислот и является иммуностимулятором неспецифической иммунной системы, участвует в естественных процессах заживления

365

воспалений , а так же, как и все желчные кислоты, участвует в поддержании гомеостаза липидов, глюкозы и холестерина. Урсоловая кислота (348т) представляет собой пентациклический тритерпеноид, широко встречающийся в лекарственных растениях и продуктах питания, и обладает множеством биологических эффектов, включая

366,367 0

противоопухолевую, противовирусную и антиоксидантную активность . В результате нами получен набор солей ДГААмина (349а-п), структуры солей изображены на схеме 53. Также для сравнения биологической активности описанных нами солей был получен уже известный гидрохлорид дегидроабиетиламина (350).

н

4nh2

(+)-дегидроабиетиламин (ДГААм)

+ R-COOH 348(а-п)

NH3 R-COO 349(а-п)

соон

348а 348b

СООН соон

соон

но но

соон

348с

соон

но

соон

соон

348d

СООН

348j

348к

3481

348т

СООН

348п

Условия реакции:

(a) HCl, диэтиловый эфир;

(b) RCOOH, CHCI3, (метод AB).

Образование аммониевых солей подтверждено методом ИК спектроскопии. В ИК спектрах солей (349а-п) отсутствует линия свободной гидроксильной группы, наблюдаемая в спектрах свободных кислот, что является доказательством образования соответствующей соли. В ЯМР спектрах 1Н наблюдается сдвиг сигналов протонов находящихся в а-положении от амино группы дегидроабиетиламина в слабое поле.

368

3.1.3.2.2. Получение гетероциклических производных дегироабиетиламина

Следующим направлением химических модификаций изучаемого нами дитерпенового амина было синтез азотсодержащих гетероциклов на основе первичной аминогруппы дегидроабиетиламина. Для получения алифатических пяти, шести, и семичленных азотистых гетероциклов проводилась реакция алкилирования первичных аминов алифатическими дигалогеналканами различного строения. Было показано, что при взаимодействии дегидроабиетиламина с 1,4-дииодбутаном образуется соединение (351), содержащее пирролидиновый фрагмент; при взаимодействии с 1,5-дибромпентаном - соединение (352), содержащее пиперидиновый фрагмент; реакция первичного амина с бис-(2-бромэтиловым) эфиром приводит к образованию соединения (353), содержащего морфолиновый фрагмент; взаимодействие с 1,6-дибромгексаном - к агенту (354), содержащему азепановый гетероцикл. Реакции проходят при кипячении в ацетонитриле с добавлением углекислого калия (схема 54). По данным ГХ/МС спустя 5-6 часов кипячения в реакционной смеси не наблюдается исходного амина, конверсия является полной. Выход продукта существенно снижается после очистки колоночной хроматографией. Механизм получения азотсодержащих насыщенных гетероциклических фрагментов включает в себя последовательное нуклеофильное замещение двух атомов галогена, в результате которого происходит гетероциклизация по атому азота дегидроабиетиламина. Нами было показано, что проведение реакции с использованием микроволновой активации при температуре 110оС позволяет существенно сократить время реакции - с 4-5 часов до 1 часа. Отсутствие димерных производных было показано методом ТСХ и хромато-масс спектроскопии.

Фармакологически важным классом гетероциклических соединений являются соединения, содержащие алифатические К-гетероциклы, имеющие в цикле кроме атома азота, другие гетероатомы. Методы синтеза диоксо- и дитиоазепанов появились сравнительно недавно. Ряд различных К-замещенных 1,5,3-диоксазепанов был получен путем конденсации первичных аминов, избытка параформальдегида и этиленгликоля с азеотропной отгонкой воды369. Производные оксазепана обладают обезболивающим, жаропонижающим, болеутоляющим, противораковым370, и фунгицидным371 действием. Насыщенные сера - и азотсодержащие гетероциклы привлекают интерес как мультидентатные лиганды и биологически активные вещества. Циклотиометилирование первичных аминов и гидразинов с 1,2-этандитиолом и формальдегидом является эффективным методом синтеза пяти-, шести-, и восьмичленных тиоазогетероциклов. Семичленные гетероциклы синтезированы путем трехкомпонентной конденсации этан-1,2-дитиола с формальдегидом и различными

372 „ и

алифатическими и ароматическими аминами372. В настоящее время данный класс соединений

вызывает интерес исследователей в связи с широким спектром возможностей для их применения. Нами для получения 1,5,3-дитиоазепанового фрагмента была применена реакция конденсации формальдегида, 1,2-этандитиола и дегидроабиетиламина. Реакция проводилась при перемешивании в хлороформе с добавлением 5-10 мольных процентов катализатора 8т(Ы03)3*6Н20 с образованием соединения (355) (схема 54.). Также было показана возможность проведения реакции с использованием каталитических количеств СоС12. Для получения 1,5,3-диоксоазепанового производного была проведена трехкомпонентная конденсация дегидроабиетиламина, этиленгликоля и формальдегида, катализируемая нитратом самария. Получение 1,5,3-диоксоазепанового гетероцикла на первичной аминогруппе ДГААмина было зафиксировано методом ГХ\МС, однако выделить в чистом виде данное соединение нам не удалось, во время очистки происходит деструкция указанного гетероциклического производного.

Кроме того, нами впервые был получен 1,5,3-оксатиазепановый фрагмент на основе первичной аминогруппы дегидроабиетиламина. Методика синтеза данных семичленных гетероциклических соединений и особенности установления строения данного класса веществ

373

были впервые разработаны нами . Реакция ДГААм, 2-меркаптоэтанола и формальдегида проводилась в хлороформе при комнатной температуре в присутствии 5-10 мольных процентов нитрата самария. Соединение (356) выделено в индивидуальном виде, структура подтверждена

1 13

Н и С ЯМР спектроскопии.

По аналогии с синтезом алифатических пяти, шести, и семичленных азотистых гетероциклов реакцией первичных аминов с алифатическими дигалогеналканами, ожидалось, что взаимодействие а,а'-дибром-орто-ксилола с дегидроабиетиламином в тех же условиях (кипячении в ацетонитриле) будет приводить к образованию соединения, содержащего изоиндолиновый фрагмент. Однако, нами в качество основного продукта, наблюдалось образование агента, имеющее молекулярный пик М+ 385 и, возможно, содержащего изоиндольный цикл. Выделить в индивидуальном виде из реакционной смеси производное с изоиндольным фрагментом нам не удалось, продукт был неустойчивым и при хроматографии

374

происходит деструкция. Проведение данной реакции в условиях, предложенных в работе , привело, в качестве основного продукта, к соединению (357), содержащему изоиндолиноновый фрагмент.

Для выявления влияния типа гетероциклического фрагмента на проявляемую активность, нами был синтезировано соединение с пиррольным циклом. Простым и удобным в реализации методом синтеза пирролов является реакция Клаузона-Кааса. В данной реакции N замещенные пирролы образуются в результате конденсации первичных алифатических или ароматических аминов и 2,5-диметокситетрагидрофурана в присутствии кислотного

катализатора. Как правило, в этих целях используется уксусная кислота. Проведение реакции ДГААм с 2,5-диметокситетрагидрофураном в уксусной кислоте приводит к образованию ожидаемого продукта (358), но сопровождается сильным осмолением реакционной смеси. Для уменьшения осмоления и упрощения извлечения чистого продукта, нами использовалась методика с применением монтмориллонитовой глины К-10 в качестве катализатора. Проведение данного превращения без растворителя с использованием К-10 и при нагревании до 100°С позволило провести реакцию менее чем за 30 минут с образованием соединения (358). Схема 54.

а, Ь, с, с1, е

п 351-358

£ Н \

N—4 357 (с!)

a) На1-(СН2)п-На1, (Вг-(СН2)2-0-(СН2)2-Вг - для 353), К2СО3, CHзCN, (метод X).

b) SHCH2CH2SH, СН2=0, Sm(NOз)з.6H2O, СНС13.

c) 8НСН2СН20Н, СН2=0, 8ш(К03)3'6Н20, СНС13. ё) а,а'-дибром-орто-ксилол, КаОН, диоксан.

е) 2,5-диметокситетрагидрофуран, глина К-10.

Следует особо обратить внимание на соединение (357), содержащее изоиндолиноновый фрагмент. Примеров получения изоиндолинонов в одну стадию из первичного амина и а,а'-дибром-орто-ксилола в литературе нами найдено не было. Существуют разные методы синтеза данного класса соединений. Наиболее простым и эффективным способом получения этого класса соединений является селективное моновосстановление легко доступных фталимидов.

375

Фталимиды восстанавливают водородом на катализаторах под давлением , с использованием

376

стехиометрического количества олова или цинка , с применением полиметилгидросилоксана с

377

каталитическим количеством ионов фтора377. Другим подходом к получению изоиндолинонового фрагмента является окисление изоиндолинов. Известно электрохимическое окисление изоиндолинов в пиридине378. Данный метод не является селективным и приводит к образованию изоиндолинонов в смеси с фталимидами.

Для реакции ДГААм и а,а'-дибром-орто-ксилола нами был предложен механизм, включающий изначально образование изоиндолинового фрагмента и последующее его окисление в реакционной смеси. Для подтверждения данной гипотезы были проведены модельные реакции бензиламина с дигалогенидом в различных условиях. Было показано, что в отсутствии окислителя в системе идет образование изоиндолинового и изоиндольного фрагментов, а при добавлении различных окислителей в реакционной смеси происходит образование кислородсодержащих продуктов - изоиндолинонов и фталимидов. Исходя из полученных данных, можно предположить, что изоиндолиноновое соединение (357) образуется в процессе окисления перекисями, образующимися из диоксана. Эту версию подтверждает и тот факт, что доля продукта (357) в реакционной смеси увеличивается при длительном стоянии, а при дополнительной очистке диоксана от перекисей на А1203 продукта не наблюдается.

Строение полученного изоиндолинона (357) было полностью подтверждено по данным

1 13

анализов ЯМР 1Н, 13С и хромато-масс спектроскопии. Так, в спектрах ЯМР наблюдаются характерные сигналы для изоиндолинонового заместителя: в ЯМР 1Н проявляются протоны при атоме углерода С(27) в виде АВ-дублетов (5= 4.45 и

4.49, 21=16.8) и наблюдаются 4 сигнала

13

несимметричной ароматической системы. В ЯМР С наблюдается сигнал С(20) при 169.94 м.д. соответствующий амидной карбонильной группе.

3.1.3.2.3. Получение мочевин и тиомочевин на основе дегидроабиетиламина

Введение в молекулу природного происхождения фрагмента мочевины или тиомочевины в современной медицинской химии привлекает внимание многих исследователей. Это обусловлено легкостью проведения реакции первичных аминов с изоцианатами или изотиоцинатами, устойчивостью мочевин\тиомочевин и возможностью дальнейшей химической модификации данного структурного фрагмента. Нами по описанной в литературе методике получен набор соединений, имеющих указанные структурные блоки. Так, реакцией алифатических изоцианатов с ДГААмином получены агенты (359) и (360), реакцией с ароматическими изоцианатами соединения (361) и (362). Выделены и описаны тиомочевины (363-366). Схема 55.

а,Ь

^МН

359-366

Б

363 (Ь)

Условия реакции: а) Я^=С=0, СНС1з, (метод ВС);

1ЧН

^мн э 4

364 (Ь)

1ЧН

Ут

365 (Ь)

^мн

366 (Ь)

/ >

Ь) Я^=С=8, СНС13, (метод ВС).

Подводя итог представленной главе, можно сделать вывод, что нам удалось синтезировать набор производных дегидроабиетиламина, включающий в себя библиотеку производных, содержащих ^гетероциклический фрагмент и соединения - мочевины и тиомочевины дегидроабиетиламина. Как и описанные в предыдущих разделах соединения, производные данного дитерпенового амина были в дальнейшем протестированы в качестве ингибиторов вирусов гриппа.

3.2. Изучение связи структуры синтезированных соединений с их

противовирусной активностью 3.2.1. Активность против вирусов гриппа

Основной целью представленной работы является выявление новых агентов, проявляющих противовирусную активность. При этом особое внимание было нами уделено поиску соединений, проявляющих вирусингибирующую активность в отношении вируса гриппа. Лечение и профилактика гриппа - заболевания, способного создать чрезвычайные эпидемические ситуации, является одной из самых актуальных медицинских и социально-экономических проблем. По данным Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ), ежегодно во время эпидемий гриппа и подобных ему заболеваний в мире болеют до 5 млн., а

379

умирают до 500 тыс. человек . Высокая инфекционность, постоянная мутация вируса-возбудителя, являющаяся результатом антигенного дрейфа или реассортации (обмена) генов, приводят к появлению новых подтипов вируса, против которых у людей нет иммунитета. По этой причине возникают пандемии, сопровождающиеся резким повышением заболеваемости и высокой смертностью.

Существует три типа сезонного гриппа — А, В и С. Вирусы гриппа типа А подразделяются на подтипы, в соответствии с сочетаниями 2 видов белков вируса (Н и К), расположенных на поверхности вируса. Среди многих подтипов вирусов гриппа А в настоящее время среди людей циркулируют подтипы гриппа А(НШ1) и А(Н3№). Эпидемиологическая ситуация по гриппу в России своевременно отражается на сайте НИИ гриппа380. Циркулирующий вирус гриппа А (НШ1) обозначается также как A(H1N1)pdm09, поскольку он вызвал пандемию 2009 г. и впоследствии сменил вирус сезонного гриппа А(НШ1), циркулировавший до 2009 года. Важно, что пандемии вызывали лишь вирусы гриппа типа А.

В настоящее время для профилактики и терапии гриппозной инфекции доступны препараты, обладающие различным механизмом действия. Международно признанными этиотропными противогриппозными препаратами являются химические соединения двух групп

381

- производные адамантана (амантадин и его аналог в России - ремантадин)381 и ингибиторы

382

вирусной нейраминидазы - осельтамивир (Тамифлю) и занамивир (Реленца) . В США и Японии разработаны еще два ингибитора нейраминидазы - перамивир (Рапиакта) для

внутривенного использования383, и ланинамивир (Инавир) - для ингаляционного384. В России ни перамивир, ни ланинамивир не сертифицированы. Фавипиравир (Т-705) представляет собой нуклеозидный аналог широкого спектра противовирусной активности. Он ингибирует полимеразный комплекс вируса и индуцирует летальный мутагенез в вирусном геноме, снижая

таким образом инфекционность вирусного потомства. Фавипиравир допущен для лечения гриппозной инфекции в Японии385. Умифеновир (арбидол), ингибитор слияния вирусной и лизосомальной мембран, был разработан в России и недавно одобрен для лечения гриппа в Китае386. Кроме того, в России разработан оригинальный противовирусный препарат широкого спектра действия - триазаверин387. Противовирусный препарат дейтифорин, имеющий каркасную структуру, как и адамантановые препараты, применялся в России ранее, однако сейчас выведен с рынка, в связи с не высокой эффективностью.

Рисунок 78.

МН2 НС1 мн

(IV Н0ЛЙ^

римантадин амантадин

1ЧН2 НС1 дейтифорин

НО ОН рибавирин

озельтамивир

НМ^МН2

занамивир

ОН

НО—°

но' "Г°'\\

Н1УГ _

1чн

ланинамивир

НМ

НМ^ ^ч/Ч.иОН

т

мн

>

перамивир

ОН

НО

У

НС1

!Г

N0,

фавиправир умифеновир триазаверин

Недостатком препаратов как первой, так и второй группы является способность вируса быстро вырабатывать устойчивость. С середины 90-х годов, например, отмечен рост доли ремантадин-устойчивых вирусов, и на сегодняшний день практически все изоляты вируса

388

гриппа устойчивы к препаратам адамантанового ряда - амантадину и ремантадину . То же было отмечено в пределах подтипа сезонного гриппа А(ШШ), когда за полтора года (с ноября 2007 по март 2009 г.) уровень устойчивости к осельтамивиру вырос с 0% до 100% во всех регионах земного шара389. Осельтамивир-устойчивые штаммы отмечены также среди изолятов высокопатогенных вирусов гриппа птиц Н5Ш390 и Н7№391, а кроме того, описаны случаи формирования лекарственно-устойчивых вариантов вируса непосредственно в процессе

терапии пациентов

С учетом всего перечисленного, разработка новых эффективных противовирусных препаратов с возможно более широким спектром активности и иным механизмом действия являлась и остается одной из первостепенных задач медицинской химии и вирусологии.

Практически все синтезированные в представленной работе соединения были протестированы в отношении ингибирования вирусов гриппа. На первом этапе экспериментов биологические свойства синтезированных соединений были изучены по стандартной методике. В ходе экспериментов была оценена цитотоксичность веществ (CC50, мкмоль) и их способность ингибировать репродукцию модельного вируса гриппа (IC50, мкмоль). Важной характеристикой биологической активности исследуемых соединений является терапевтический индекс или индекс селективности (SI). Терапевтический индекс это соотношение между количеством вещества, которая вызывает повреждение половины здоровых клеток (CC50), и дозировкой, которая необходима для достижения определенного уровня активности действия данного вещества (IC50). Это соотношение отражает эффективность и безопасность исследуемого соединения. Принято считать, что соединения, терапевтический индекс которых превышает 8, проявляют изучаемую активность393. Исследования противовирусной активности синтезированных нами агентов были проведены коллективом исследователей под руководством к.б.н. Зарубаева В.В. в Санкт-Петербургском НИИ Гриппа и институте Пастера. Полученные данные систематизированы в таблице 1 приложения.

Следует отметить, что прямое сопоставление величин индексов селективности для соединений разных структурных типов, как правило, не имеет особого смысла, так как они могут обладать принципиально разными фармакокинетическими свойствами при переходе к экспериментам in vivo, и при определении перспективных для дальнейших исследований соединений нужно выбирать наиболее активные соединения каждого структурного типа, индекс селективности которых превышает 8.

Противовирусная активность синтезированных веществ изучалась на модели гриппозной инфекции клеток MDCK, вызванной штаммом вирусом гриппа A/Puerto Rico/8/34 или штаммом A/California/07/09 (H1N1)pdm09, резистентным к противовирусным препаратам адамантанового типа - амантадину и ремантадину. Данные по противовирусной активности препаратов сравнения - ремантадину, амантадину, дейтифорину и рибавирину также приведены в таблице 1 приложения. В данном разделе будет проведено исследование связи структуры синтезированных соединений с проявляемой противовирусной активностью.

3.2.1.1. Противовирусная активность иминопроизводных (+)-

камфоры394'395'396'397'398

Значительное внимание при выполнении данной работы было уделено синтезу и изучению активности против вирусов гриппа производных (+)-камфоры. Как уже было упомянуто выше, проводить изучение связи структуры синтезированных соединений с проявляемой ими активностью важно в рамках структурно подобных классов. В связи с этим, данный анализ проводится по группам описанных в данной работе соединений.

Активность соединений (119-129) была изучена нами в отношении двух штаммов вируса гриппа A/California/07/09 (H1N1)pdm09 (Cal) и A/Puerto Rico/8/34 (PR). Среди алифатических иминов на основе камфоры подавляющее количество соединений проявляет вирусингибирующую активность в концентрациях от 1.4 до 30 мкмоль, в отличие от исходной камфоры. В тоже время, цитотоксичность изученных нами соединений меняется значительно. Показано, что увеличение длины алифатической цепочки в общем случае, приводит к увеличению токсичности соединения. Шесть из 11 синтезированных веществ проявляют противовирусную активность выше, чем препараты сравнения, при этом два из них, имины камфоры с пропильным (119) и бутильным (120) алифатическим фрагментом, проявляют особенно высокую вирусингибирующую активность при низкой цитотоксичности (рис. 79). Можно считать, что данные соединения заслуживают особого внимания и являются соединениями-лидерами в данном классе веществ. Из пары соединений, содержащих циклический насыщенный фрагмент, вещество с циклопропильным заместителем не проявило активности вовсе, а соединение (129) с циклогексильным фрагментом имеет выраженную активность особенно в отношении штамма A/Puerto Rico/8/34. Рисунок 79.

СС50 2590 1С50 19.7 (Cal) S1131

IC50 4.1 (PR) SI 632

СС50 2415 IC50 7.7 (Cal) SI 312

IC50 5.8 (PR) SI 417

CC50 801 IC50 7.7 (Cal) S1104

IC50 12.2 (PR) SI 66

CC50 234 IC50I.4 (Cal) S1171

IC50 4.8 (PR) SI 49

CC50 1287 IC50 55.4 (Cal) SI 23

IC5015.5 (PR) SI 83

Соединения, синтез которых описан на схемах 12 и 19 - агенты, имеющие в своем остове борнановый остов, иминогруппу и дополнительный кислородсодержащий фрагмент -спиртовую (130-132), простую эфирную (133), (183) или сложноэфирную (184), (185) группу протестированы нами в отношении штамма вируса гриппа A/Califomia/07/09 (H1N1)pdm09. Среди данных соединений особое внимание заслуживают иминоспирты (130-132). Наибольшую активность при минимальной токсичности проявил продукт взаимодействия (+)-камфоры и аминоэтанола - соединение (130) (рис. 80). Индекс селективности данного соединения более 500 и превышает таковой у препаратов сравнения каркасного типа в сто и более раз. Высокую активность также проявили агенты, в которых спиртовая группа отделена от борнанового остова более длинной, чем у соединения (130) алифатической цепочкой. Так, индекс селективности соединений (131) и (132) составляет 357 и 113 соответственно. Вещества, содержащие эфирные терминальные фрагменты (183) и (133) также могут рассматриваться как перспективные противовирусные агенты.

Рисунок 80. 130

СС50 2564 СС50 2392 СС5о 2109 СС50 1435 СС502242

1С50 5.1 1С5о 6.7 1С50 18.6 1С5023 1С50 17.5

Э1503 357 ЭШЗ в! 61 81128

Важным моментом, на наш взгляд, является тот факт, что соединения, в которых нами была проведена химическая модификация иминогруппы, становятся либо менее активными в отношении данных вирусов, либо просто нестабильными при хранении, что значительно затрудняет исследование биологической активности. Так, в связи с высокой лабильностью, протестировать активность спиро-оксазаридинов (187) и (188) не предоставляется возможным. Активность аминоспирта (140) значительно ниже таковой чем у соединения (130), аминоспирты (141-142) проявляют достаточно высокую активность, однако токсичность указанных соединений превосходит таковую у невосстановленных иминов (131-132) (рис. 81).

140

СС50 2 5 38 IC50 83 SI 30

141

СС50312 IC50 9.5 SI 33

142

СС50 305 IC50 9.5 SI 21

Среди синтезированных нами иминов камфоры, содержащих первичную (134) и вторичную аминогруппу (135-138) (схема 12), наибольшую вирусингибирующую активность и низкую токсичность проявили агенты (136) и (137) (рис. 82). Иминоамин (134) является высокоэффективным ингибитором указанного штамма вируса гриппа, однако его токсичность также достаточно высока, что соответственно значительно снижает терапевтический индекс этого соединения. Увеличение длины алифатических заместителей у третичного атома азота повышает токсичность агентов (137) и (138). Рисунок 82.

СС50 196 ICso 5.2 si 38

СС50 2252 IC50 52 si42

СС5о 2118 IC50 21 s1100

СС50 8 06 IC50 10 si 81

СС50 346 IC50 26 s113

Далее нами была изучена связь структуры иминопроизводных камфоры, содержащих насыщенный N-гетероцикл, с проявляемой активностью против вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34. Было показано, что наибольшую вирусингибирующую активность проявили соединения (189) и (139), содержащие пирролидиновый и морфолиновый фрагмент (рис. 83). Значительную активность, превышающую препарат сравнения, проявили также соединения (190), (191), (193) и (194). Сравнение биологической активности соединений (190) и(191) показывает, что 4-метил замещенные пиперидиновые производные оказались более токсичными в наших экспериментах. Также можно видеть, что N-этил пиперазиновый фрагмент как увеличивает токсичность, так и снижает активность по сравнению с аналогичным соединением (194). Соединение (192), имеющее спиртовую группу в 4 положении пиперидинового кольца, является нетоксичным и не проявляет вирусингибирующих свойств.

189

190

191

139

СС50 1330 1С50 12.5 Б! 106

СС5о 1145 1С50 26.7 в! 43

СС50 293 1С50 25 Б! 12

СС50 460 1С50 5 в! 91

193

194

195

СС50 1 083 1С50 43 8124

'50

Далее рассмотрим активность в отношении вирусов гриппа соединений, содержащих иминный фрагмент, борнановый остов и ароматическое/гетероароматическое кольцо. Синтезированные нами соединения из этого класса формально можно разделить на три группы: агенты, полученные взаимодействием камфоры с первичными аминами, имеющими ароматическое кольцо (схема 13); соединения, в которых гетероароматический фрагмент разделен от природного остова атомом серы через алифатический линкер (схема 21) и вещества, содержащие 1,2,3 -триазольный цикл, полученные с использованием методов «клик химии» (схемы 22, 23).

Описанное ранее в литературе соединение - продукт взаимодействия камфоры и анилина (143) не проявляет противовирусной активности, также как и его дифторзамещенные аналоги (144) и (145). Пара- и орто-гидрокси-замещенные аналоги (146) и (147) проявляют выраженную активность, однако являются достаточно токсичными агентами (рис. 84). Введение в молекулу бензтиазольного фрагмента также понижает противовирусную активность соединения (148). Продукт взаимодействия (+)-камфоры и 2-пиколиламина агент (150), в отличие от соединения (149), не содержащего ароматический азот, проявляет высокую активность наряду с низкой токсичностью. Наиболее высокий показатель противовирусной активности обнаружен нами у соединения (151) являющегося продуктом взаимодействия исходного монотерпена и 4-метоксибензиламина. Также, крайне высокая активность наряду с низкой токсичностью была нами обнаружена у соединения (154), содержащего две метокси-группы в ароматическом кольце. Важно, что структурно подобные соединения (149) и (153), не имеющие метоксизаместителей в ароматическим кольце проявляют лишь незначительную

противовирусную активность. Агент (152), имеющий дифенилметильный фрагмент является и токсичным и не активным. Рисунок 84.

/^Ч- он

AJ

146 147 150 151

СС50 1 39 СС50 78 СС50 2066 СС50 922 СС50 1530

IC50 5.8 IC5o 4.1 IC60 7.4 IC50 1.9 IC50 8.3

SI24 SI19 SI295 SI485 S1186

Среди синтезированных нами соединений, содержащих гетероароматический фрагмент, соединенный через атом серы с природным камфорным остовом (схема 21), в серии сульфидов несущих бензооксазольный (197), бензотиазольный (198) и бензоимидазольный фрагмент (199) наблюдалось понижение токсичности значений СС50 от 99 до 404 мкмоль. В целом, соединения проявляют активность против вируса гриппа с терапевтическим индексом 20 (рис. 85). Среди пятичленных гетероциклических производных только соединение (200) с 4,5-дигидротиазол-2-тиоловым кольцом обладает умеренно высоким значением SI в связи с низкой токсичностью и выраженной противовирусной активностью. Высокую активность проявили агенты, содержащие пиридиновый (203) и пиримидиновый ароматический гетероцикл (204). Следует отметить, что замещение фрагмента пиридин-2-тиола на пиримидин-2-тиольный радикал в соединении (204) значительно уменьшает токсичность, в то время как противовирусная активность сохраняется на высоком уровне. Рисунок 85.

СС50 99 сс50 358 СС50 404

1С5о 5.2 IC50 19 1С5о 20.5

S119 SI 20 SI 20

200 203

СС50 761 СС50 503 СС5о 1142

|С50 33 |с„ 5.5 lc50 6.2

SI 23 si 91 Sl 183

Синтезированные с использованием методов «клик химии» соединения на основе иминоспирта (130) были проверены в отношении вируса гриппа А H1N1 штамм A/Puerto

Rico/8/34. В целом, можно сказать, что введение триазольного кольца не увеличивает активность описанных нами соединений. Из всех новых агентов, только вещества, содержащие алифатические спиртовые группы в 4 положении триазольного кольца (210), (211), метоксиаминный (213) или морфолиновый фрагменты (214) проявили умеренно выраженную активность против указанного штамма вируса гриппа (рис. 86). Следует отметить, что практически все соединения (за исключением триметилсилильного производного (208)), синтез которых описан на схемах 22 и 23 являются не токсичными агентами в условиях проведённого нами биологического эксперимента269. Рисунок 86.

210 211

СС50 1039 СС50987

1С50 55 ю50 32

эмэ Э131

213

214

С°50 865 СС5о 836

.5°Р 1С50 45

в! 34

в! 18

Рассмотрим далее связь противовирусной активности соединений, имеющих в своем остове два фрагмента природного монотерпеноида со структурой данного класса веществ. Среди так называемых «димерных» соединений, полученных прямым взаимодействием камфоры с диаминами различного строения (схема 14), выраженную активность в отношении вируса гриппа ШШ штамм A/Califomia/07/09 (H1N1)pdm09 проявили соединения, в которых природные фрагменты разделены алифатическими линкерами. Среди пары веществ, разделенных пропильным линкером (155) и (156) более высокая вирусингибирующая активность обнаружена нами у соединения (156), имеющего дополнительную спиртовую группу (рис. 87). Высокая активность нами была выявлена у соединения (157), имеющего шесть CH2 групп между иминокамфорными фрагментами252. Также, достаточно высокие терапевтические индексы были подтверждены нами у соединений (158-160). Вещества, разделенные ароматическими линкерами, активности против вирусов гриппа не проявили вовсе. Важным, на наш взгляд, является тот факт, что восстановленные симметричные диимины - экзо-экзо-диамины (165-167) хоть и проявляют выраженную активность против

вирусов гриппа, становятся значительно токсичнее, что приводит к резкому снижению терапевтического индекса. Рисунок 87.

155

СС50 283 1С50 9.3 в! 30

156

СС50173 !С502 88

157

СС50 1 346 1С50 15 89

158

СС50 1256 1С50 22 в! 55

159

СС50 390 1С50 24 Б! 16

160

СС50 2216 1С50 45 8149

Среди димерных агентов, содержащих два четвертичных атома азота, нами обнаружено пять соединений, терапевтических индекс которых превышает таковые у препаратов сравнения каркасного типа ремантидина и дейтифорина. Так, наибольшую активность в отношении вируса гриппа штамм A/CaHfomia/07/09 (H1N1)pdm09 проявили соединения (172), (174) и (175) (рис. 88). Агенты (173) и (178) имеют достаточно высокий терапевтический индекс за счет низкой токсичности. Синтез и изучение биологической активности данных соединений описано нами в работе Рисунок 88.

,253

172

СС50 1281 1С50 14 в! 87

СС5о 1712 1С50 81 в! 21

СС50 5 52 |С5013 8142

178

СС50 1446 1С50 43 в! 33

Димерные соединения, в которых центральным линкером является остаток от дикарбоновой кислоты (181) и (182) хоть и проявляют умеренную противовирусную активность, являются не устойчивыми и при хранении достаточно быстро осмоляются.

Подводя итог представленному разделу, можно сделать вывод о том, что нам удалось выявить новый класс высокоэффективных агентов против вирусов гриппа - иминопроизводных камфоры. При этом было показано, что для проявления высокой противовирусной активности, необходимо наличие в соединении каркасного бицикло-[2.2.1]гептанового фрагмента, иминогруппы во 2 положении остова и определенных заместителей - алифатических, спиртовых, вторичных аминных или определенных ароматических или гетроароматических. В качестве соединений-лидеров нами были выбраны агенты, изображенные на рисунке 89. Так, наиболее перспективными для дальнейших разработок и исследований, по результатам первичного скрининга, являются алифатические иминопроизводные (+)-камфоры (119) и (120), иминоспирт (130), иминоамин (137), агент (150), имеющий в своем остове 2-пиридин-замещенный фрагмент, п-метокси-ароматический имин (151) и пиримидин-2-тиольное производное (204). Рисунок 89.

Для указанных соединений были проведены более глубокие изучения биологической активности, включающие изучение на разных штаммах вирусов гриппа. Так, исследования активности алифатических иминов (119) и (120) в отношении вирусов гриппа Ы3К2 и И5К2 показали, что данные соединения не проявляют выраженной активности в отношении указанных вирусов. Совершенно другие результаты были получены нами при изучении активности соединения (130). Было показано, что указанной иминоспирт на основе камфоры проявляет широкий спектр противовирусной активности в отношении наиболее эпидемиологически важных штаммов. Результаты исследования приведены в таблице 2.

Таблица 2. Показатели противовирусной активности соединения (130) в отношении вирусов гриппа. ДТ - снижение титра вируса (^ТСГО50) в присутствии препарата в концентрации 0,5

^50

Вирус Показатели противовирусной активности иминоспирта (130) Показатели противовирусной активности ремантадина

CC50, мкмоль IC50, мкмоль SI AT CC50, мкмоль IC50, мкмоль SI AT

A/Cal (H1N1)pdm09 774.4±1.1 3.8±1.1 204 5.0 294 5±1 3 55.6±2.6 5 1.0

A/PR (H1N1) 1.2±1.2 645 5.5 47.8±1.2 6 1.5

A/Aichi (H3N2) 10.3±1.1 75 4.0 7.2±1.1 41 3.5

A/mallard (H5N2) 8.0±1.1 97 4.5 5.0±1.1 59 4.0

B/Lee 6.7±1.1 116 4.5 90.0±1.5 3 1.0

Как видно из представленных результатов, иминоспирт (130) проявлял высокую противовирусную активность против всех изученных вирусов гриппа. При этом его противовирусное действие не зависело от чувствительности или устойчивости использованного штамма к ремантадину, а также типа и подтипа вируса гриппа. Из изученных вирусов наиболее чувствительным к ингибирующему действию камфецина оказался вирус A/Puerto Rico/8/34 (H1N1), наиболее устойчивым - вирус A/Aichi/2/68 (H3N2). Однако и в последнем случае индекс селективности препарата составил 75, что свидетельствует о его избирательности в отношении вируса по сравнению с клетками.

Кроме того, полученные активные иминопроизводные камфоры были проверены на способность ингибировать осельтамивир-резистентный штамм вируса гриппа А/Владивосток/2/09(НШ1). Устойчивость этого вируса к осельтамивиру была ранее показана как неспособность осельтамивира снижать активность нейраминидазы в стандартном хемилюминесцентном тесте и наличие аминокислотной замены H274Y, выявленной при помощи секвенирования гена вирусной нейраминидазы. Было показано, что алифатические иминопризводные также не проявляют активности в отношении этого штамма, иминоспирт (130) оказывался эффективным, терапевтический индекс составляет 77. Наибольшую активность проявило соединение (150), SI составляет 206, также высокую активность показали метоксизамещенные ароматические имины (151) и (154) с показателями SI 101 и 38 соответственно.

3.2.1.2. Противовирусная активность производных борнеола, изоборнеола и

Синтезированные нами соединения на основе (-)-борнеола и (+)-борниламина, также как и производные (+)-камфоры, были изучены нами в качестве ингибиторов вируса гриппа. Интересные результаты были получены при анализе данных по противовирусной активности эфиров борнеола, содержащих насыщенные К-гетероциклические фрагменты. Так, наибольшую противовирусную активность при минимальной цитотоксичности проявили соединения, содержащие в своем остове морфолиновый фрагмент (227) и (237) (рис. 90). Следует также отметить соединения (228), (229) и (239), содержащие пиперазиновый фрагмент - данные вещества имеют высокую вирусингибирующую активность, однако проявляют достаточно высокую токсичность. Амиды (262-269), синтезированные нами на основе борниламина (схемы 31-32) заметной противовирусной активности не проявили. В общем можно сказать, что введение морфорлинового фрагмента значительно улучшает противовирусные свойства целевых соединий; кроме того, было показано, что эфиры на основе хлорацетата борнеола, проявляют более выраженную активность против вирусов гриппа, чем таковые на основе хлорпропионата. Важным, на наш взгляд является тот факт, что синтезированные нами эфиры морфолина, не содержащие борнанового остова (270) и (271) (рис. 63) не проявляют противовирусной активности вовсе. Данный факт подтверждает наши предположения о том, что для проявления противовирусной активности наличие каркасного фрагмента является одним из определяющих факторов. На основании вышесказанного можно сделать вывод о том, что данный класс соединений является перспективным для разработки новых противовирусных агентов.

борниламина

277, 278

Рисунок 90.

СС50 5 80 1С50 7.1 в! 82

СС50 51 1С50 3.2 в! 16

СС50 552 1С50 12.2

'50

СС50 48 1С501.9 25

в! 45

Среди синтезированных нами производных (-)-борнеола, содержащих ароматический фрагмент, веществ, проявляющих особенно выраженную активность против вирусов гриппа, обнаружено немного. Тем не менее, было показано, что продукт взаимодействия 2-меркаптобензимидазола и двух молекул хлорпропионата борнеола соединение (251) проявляет противовирусную активность. Интересно отметить, что только продукты с N-алкилильными фрагментами (такие как (255) и (258)) имеют высокий терапевтический индекс. Так, например, при сравнении биологических свойств агентов (257) и (258), содержащих 1,2,4-триазольные фрагменты, видно, что токсичность соединения, в котором триазольный структурный блок присоединен через атом серы (257) выше, чем у аналогичного (258) более чем в 50 раз. Рисунок 91.

и

255 258

h3c'n~4.

251

сс50 530 сс50 329 сс50 608

ic50 8.0 ic5014 ic50 42

SI 67 SI 24 S115

H

n-n

257

сс5011 1С507 812

В общем, можно сделать вывод о том, что введение в соединения на основе бициклических каркасных спиртов насыщенного К-гетероциклического структурного блока является более перспективным направлением, нежели введение ароматических фрагментов.

3.2.1.3. Активность против вирусов гриппа четвертичных аммонийных солей на основе монотерпенов, производных камфорной кислоты и гидразона

камфоры

В заключение раздела, посвященному изучению производных монотерпенового ряда в качестве ингибиторов вируса гриппа, рассмотрим активность соединений, имеющих в своем остове четвертичный атом азота; продуктов взаимодействия (+)-камфоры и (+)-фенхона с орто-замещенными анилинами; производных (+)-камфорной кислоты и гидразона камфоры. Так, проведенные исследования активности моночетвертичных солей синтезированных нами на основе камфоры, в отношении вируса гриппа А/СаН£эгша/07/09 (H1N1)pdm09 показало, что данный класс соединений является не токсичным в условиях проведенных биологических экспериментов, при этом наибольшую противовирусную активность проявило соединение (274) (рис. 92). Важные результаты были получены при изучении активности солей, синтезированных нами на основе эфиров борнеола. Так, было показано, что соединение (280) проявляет крайне высокую вирусингибирующую активность наряду с низкой токсичностью. В тоже время аналогичное соединение (277), имеющее другой противоион, хоть и является также не токсичным для клеток, проявляет активность практически в 20 раз ниже. Рисунок 92.

272

СС50 2190 1С50 115 18

273

СС50 1992 1С50 144 в! 14

274

СС50 1886 1С50 40 47

275

СС50 1784 1С50 139 8113

277

СС50 1733 1С50 52 в! 32

СС50 1311 1С50 2.4 в! 546

Результаты проведенных нами исследований активности против вирусов гриппа производных борнеола и камфоры, имеющих четвертичный аммонийный атом азота, говорят о том, что данный класс соединений также может рассматриваться в качестве перспективного для синтеза новых агентов.

Среди соединений, имеющих в своем остове бензимидазольные, бензоксазольные и бензтиазольные фрагменты и полученных нами реакцией камфоры и фенхона с орто-замещенными анилинами (схемы 36, 37) наибольшую активность против вирусов гриппа проявили агенты (292) и (298), содержащие бензимидазольный гетероцикл. Следует отметить, что агенты, содержащие бензоксазольный (288), (294) и бензтиазольный (290), (296) фрагменты являются значительно более токсичными в условиях проведённых нами исследований. Рисунок 93.

292 298

СС50 2066 СС50 2066

1С5029 1С50 41

71 50

Рассмотрим далее биологическую активность веществ, полученных взаимодействием аминов различного строения с камфорной кислотой или камфорным ангидридом. Так, было показано, что синтезированные нами «аналоги» высокоэффективного противовирусного агента БТ-246 (рис. 69), соединения (309-311, схема 44) не проявили активности против вирусов гриппа вовсе. Среди полициклических производных, синтезированных нами на основе камфорной кислоты (схема 45) было обнаружено соединение, проявляющее широкий спектр противовирусной активности. Так, продукт взаимодействия камфорной кислоты и о-аминобензиламина, соединение (320) проявляет широкий спектр противовирусной активности. Было показано, что данный агент является эффективным ингибитором не только вируса гриппа Н1Ш, но и проявляет высокую активность в отношении вируса гриппа А/АюЫ/2/68 (Ю№) и вируса птиц А/та11аМ/Реп^у^аша (Н5Ш)399.

Рисунок 94.

СС50 1118 1С50 18 (РР(Н11М1)) 62

1С50 27 (АюМ/2/68 (НЗМ2)) в1 41

1С50 21 (таПагсУРеппву^ата (Н5М2)) 53

Соединения, синтезированные нами на основе гидразона камфоры, в условиях проведённых нами биологических экспериментов не проявили активность в отношении вирусов гриппа. Резюмируя, можно сделать вывод, что среди соединений, биологическая активность которых

рассматривалась в данной главе несомненным соединением лидером можно считать четвертичную соль на основе борнеола - агент (280).

3.2.1.4. Изучение противовирусной активности соединений, синтезированных

на основе сесквитерпеноидов400

В данном разделе будет рассмотрена активность против вирусов гриппа соединений, полученных нами при проведении реакций гумулена, кариофиллена, изокариофиллена и эпоксипроизводных кариофиллена и изокариофиллена в условиях реакции Риттера (схемы 4751). Полученные нами трициклические соединения, содержащие ацетамидный фрагмент, были изучены нами в качестве ингибиторов вируса гриппа А/СаНйэгша/07/09 (H1N1)pdm09. Следует отметить, что, несмотря на то, что работ по превращению соединений терпенового ряда в условиях реакции Риттера опубликовано достаточно много, ранее в литературе не было работ, посвященных изучению биологических свойств соединений, полученных в указанных условиях. Синтезированные нами ацетамиды (336-339) и (342), (343) формально можно отнести к трициклическим каркасным соединениям. Известно, что соединения каркасной структуры проявляют широкий спектр биологической активности, в том числе противовирусной. Полученные нами данные подтверждают высокий потенциал синтезированных нами соединений в качестве эффективных ингибиторов вирусов гриппа. Так, было показано, что симметричный трициклический ацетамид (336), имеющий остов, совпадающий с остовом природного а-кариофилленового спирта, является нетоксичным соединением и ингибирует указанный штамм вируса в концентрации 19 мкмоль (рис. 95). Соединения с кариоллановым (342) и кловановым (343) остовами, полученные нами на основе кариофиллена, также являются нетоксичными агентами, при этом эффективность этих соединений еще выше; что приводит к терапевтическим индексам, значительно превышающим таковые у препаратов сравнения. Наибольшая активность в отношении вируса гриппа Н1Ш была нами обнаружена у трициклического соединения (339), имеющего остов сесквитерпенового спирта гинсенола, выделенного ранее из женьшеня. Так, наряду с высокой активностью, данное соединение является нетоксичным в условиях проведённых нами экспериментов. Индекс селективности указанного агента практически в сто раз превышает таковые у препаратов сравнения.

Нами были получены интересные данные по биологической активности трициклических ацетамидов, содержащих спиртовую группу (342) и (343). Данные соединения были получены нами при проведении реакции Риттера моноэпоксипроизводных кариофиллена и изокариофиллена (Схема 51). Указанные вещества отличаются только пространственным

расположением гидроксильной группы, при этом биологические свойства этих соединений различаются достаточно сильно. Так, если агент (342) является не токсичным для живых клеток и имеет умеренную активность в отношении вирусов гриппа, то соединение (343) с цис-расположением спиртовой группы по отношению к узловому метилу, проявляет достаточно высокую токсичность и в тоже время является эффективным ингибитором вируса гриппа. При этом терапевтические индексы указанных соединений примерно равны. Рисунок 95.

V5

нм

336

СС5о 1140 1С50 19 60

337

СС50 707 1С50 6.4 109

338

СС50 1254 1С50 8.7 81143

СС5о 1140 1С50 2.6 81429

СС50 1154 Ю50 30.8 37

343

СС50 60 Ю50 1.5 8142

Среди описанных трициклических веществ, выбор соединения-лидера был сделан нами в пользу агента (339). Данный выбор обусловлен не только высокой активностью указанного вещества, но и доступностью исходного кариофиллена по сравнению с гумуленом и простым способом выделения и очистки данного вещества. Так, для разделения соединений (337) и (338) необходимо проводить колоночную хроматографию, изомеры разделяются с трудом, в то время как кристаллическое вещество (339) выкристаллизовывается из обработанной реакционной смеси. Для каркасного агента (339) были проведены дополнительные исследования биологической активности и механизма действия.

3.2.1.5. Изучение противовирусной активности дитерпеновых производных, синтезированных на основе изоцемброла и дегидроабиетиламина

На основе выделенного нами из живицы кедра сибирского дитерпенового спирта изоцемброла, были синтезированы аллиловые и метиловые эфиры (схема 52). Моноциклический аллиловый эфир (344) и трициклический аллиловый эфир (345) оказались не устойчивыми соединениями, в связи с чем, исследования биологической активности данных веществ нами не проводилось. Трициклические метиловые эфиры (346) и (347) являются стабильными кристаллическими веществами и были проверены нами в качестве ингибиторов вируса гриппа. Оказалось, что оба соединения не проявляют противовирусной активности, при этом агент (346) с экзоциклической двойной связью оказался практически в три раза более токсичным, чем эфир (347) с изопропилиденовой группой. Исходный изоцемброл также не проявил целевой активности.

Рассмотрим далее противовирусную активность соединений, полученных нами на основе дегидроабиетиламина. Следует отметить, что гидрохлорид дегидроабиетиламина (350) активно изучается в последние годы в качестве соединения, перспективного для лечения меланомы. Данная соль проявляет высокие цитотоксические свойства. Как уже обсуждалось выше, нами были описаны соли природного дитерпенового амина с различными противоионами. С целью понимания, происходит ли изменение активности синтезированных нами соединений в зависимости от противоиона, была изучена противовирусная активность как полученных нами солей (349а-п), так и кислот, которые были использованы в качестве противоионов (348а-п). В результате проведенных исследований было показано, что исходный дитерпеновый амин не проявляет вирусингибирующих свойств, являясь при этом достаточно токсичным для клеток (СС5о 66 мкмоль). Практически все исследуемые кислоты являются как нетоксичными, так и неактивными. Исключения составляют кофейная (348с) и дегидроабиетиловая кислоты (348]), для этих соединение терапевтический индекс равен 9. Гидрохлорид дегидроабиетиламина (350) еще более токсичный для клеток, чем исходный амин. В то же время, нами было показано, что соединение (349п) в виде соли глицирретовой кислоты -глицеррат ДГГАмина становится в пять раз менее токсичным, чем исходный амин и почти в 50 раз менее токсичным чем гидрохлорид ДГААмина (350). Важным при этом является тот факт, что сама глицирретовая кислота в нашем эксперименте не проявила активности против вируса гриппа. Таким образом, можно сделать вывод о том, что замена противоиона у исследуемого соединения может приводить к значительному изменению биологических свойств исследуемых соединений.

СОО"

н

ч|ЧН2

ДГААм

СС50 66.3 1С50 35 812

350

СС50 6.8 1С50 9.3 в! 1

349п

СС50 347 1С50 9.8 в! 35

Из всех описанных нами гетероциклических производных дегидроабиетиламина (351358, схема 54) наибольшую активность проявило соединение, содержащие пирролидиновый фрагмент (351), 1С50 составляет 5.9 мкмоль, однако данный агент также оказался достаточно токсичным в условиях проведения эксперимента (рис. 97). Наибольший терапевтический индекс среди гетероциклических производных ДГААмина наблюдался у соединений (354) и (358), при этом достигается он за счет невысокой токсичности указанных агентов. Рисунок 97.

351

СС50 21 1С50 5.9 814

354

СС50 800 1С50 83 г! ю

358