Синтез и изучение свойств новых материалов с противоопухолевой активностью на основе полиазотистых гетероциклов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Миколайчук Ольга Владиславовна

• Миколайчук Ольга Владиславовна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Миколайчук Ольга Владиславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. МЕТОДЫ СИНТЕЗА ТРИЗАМЕЩЁННЫХ 1,3,5-ТРИАЗИНОВ С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

1.1. Реакции циклизации

1.2. Реакции нуклеофильного замещения атомов хлора в производных 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазина

1.3. Получение гибридных полиазотистых гетероциклических производных

1,3,5-триазина

ГЛАВА 2. НАНОФОРМЫ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

3.1. Синтез соединения

3.2. Синтез гибридного триазинилтетразола

3.2.1. Синтез исходных тетразолсодержащих производных

3.3. Синтез и идентификация конъюгата GO-1

3.4. Исследование физико-химических свойств водных растворов соединения

3.4.1. Плотность водных растворов соединения

3.4.2. Вязкость водных растворов соединения

3.4.3. Рефракции водных растворов соединения

3.4.4. Математическое описание Т-С-зависимостей плотности, вязкости и показателя преломления водных растворов соединения

3.4.5. Растворимость соединения 1.57 в воде

3.4.6. Распределение соединения 1.57 в системе н-октанол - вода

3.4.7. Изучение стабильности водных растворов соединения 1.57 методом ЯМР-спектроскопии

3.5. Биосовместимость соединения

3.5.1. Гемосовместимость

3.5.2. Изучение связывания с ДНК и ЧСА

3.5.3. Антиоксидантная активность

3.5.4. Генотоксичность соединения

3.5.5. Цитотоксичность соединения

3.5.6. Митохондриальный потенциал

3.6. Изучение физико-химических свойств водных растворов соединения

3.6.1. Стабильность соединения 3.6 в водных растворах

3.7. Изучение биосовместимости соединения

3.7.1. Исследование гемосовместимости

3.7.2. Изучение связывания соединения 3.6 с ДНК и ЧСА

3.7.3. Антирадикальная активность соединения

3.7.4. Цитотоксичность соединения

3.7.5. Влияние соединения 3.6 на стабилизацию НГР-1а

3.8. Биосовместимость нековалентного конъюгата на основе GO и соединения

3.8.1. Исследование гемосовместимости

3.8.2. Антиоксидантная активность

3.8.3. Генотоксичность

3.8.4. Изучение термодинамических параметров связывания GO-1.57 с ЧСА калориметрическим методом

3.8.5. Цитотоксичность конъюгата GO-1

3.8.6. Изучение механизмов эндоцитоза конъюгата GO-1

ГЛАВА 4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

4.1 Синтез производных 1,3,5-триазинов

4.2 Синтез производных тетразола

4.3 Синтез гибридных триазинилтетразолов

4.4 Изучение стабильности соединений 1.57 и

4.5 Синтез GO

4.6 Синтез конъюгата GO с 2,4,6-тризамещённым-1,3,5-триазином

4.7 Изучение биосовместимости

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДНК — Дезоксирибонуклеиновая кислота РНК — Рибонуклеиновая кислота

IC 50 — Концентрация полумаксимального ингибирования

ДМФА — Л^-Диметилформамид

Glu 30 — Глутаминовая кислота

ВИЧ-1 — Вирус иммунодефицита человека

GO — Оксид графена

ЧСА — Сывороточный альбумин человека

PBS — Натрий-фосфатный буферный раствор

THF — Тетрагидрофуран

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и изучение свойств новых материалов с противоопухолевой активностью на основе полиазотистых гетероциклов»

Актуальность темы исследования

На сегодняшний день лекарственная противоопухолевая терапия представлена тремя направлениями: химиотерапия, таргетная терапия и иммунотерапия. Химиотерапия является неспецифическим лечением, в котором используются химические вещества, ингибирующие пролиферацию клеток за счёт воздействия на клеточные ДНК, РНК, рецепторы, метаболизм и компоненты цитоскелета [1]. В связи со сложностью получения таргетных и иммунных препаратов (данный факт значительно повышает их стоимость), химиотерапия все ещё является актуальным подходом, т. к. цитостатики являются низкомолекулярными химическими веществами, которые значительно легче синтезировать. Главным недостатком химиотерапии является отсутствие специфичности цитостатиков к опухолевым клеткам, что обуславливает развитие широкого спектра токсических побочных эффектов, среди которых можно выделить повышенную утомляемость, алопецию, апластическую анемию и тромбоцитопению, иммунодефицит, нейропатию, развитие кожных язв, нарушение когнитивных и репродуктивных функций, диарею, тошноту, потерю аппетита. Стоит отметить и развитие резистентности к терапии, что обуславливает необходимость поиска новых химических веществ с цитостатическими свойствами.

Таким образом, проблема синтеза новых биологически активных веществ и создания на их основе новых лекарственных средств для лечения онкологических заболеваний является одной из важнейших задач. Цель и задачи работы

Цель работы — создание новых перспективных материалов на основе 1,3,5-триазинов и тетразолов, а также оксида графена для уменьшения системной токсичности и регулирования биоактивности.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) создание новых перспективных биологически активных соединений 1,3,5-триазинового ряда, обладающих противоопухолевой активностью;

2) синтез наноформы соединения-лидера с оксидом графена;

3) изучение физико-химических свойств полученных соединений 1,3,5-триазинового ряда;

4) in vitro тестирование полученных соединений и конъюгата. Научная новизна и практическая значимость

1. Проведён синтез новых гетероциклических соединений на основе 1,3,5-триазина, в том числе содержащих одновременно триазиновый и тетразолильный фрагменты.

2. Впервые синтезирован и охарактеризован нековалентный конъюгат, содержащий оксид графена, обогащённый кислородсодержащими функциональными группами и цитостатический препарат на основе 1,3,5-триазина (степень загрузки — 68 %).

3. Проведено комплексное изучение физико-химических свойств водных растворов цитостатического препарата на основе 1,3,5-триазина, включающее изучение стабильности, растворимости, коэффициента распределения, плотности и вязкости.

4. Проведено изучение биосовместимости синтезированных материалов: гемосовместимости, антиоксидантных свойств, генотоксичности.

5. Изучена цитотоксичность полученных соединений на различных клеточных линиях.

Достоверность и апробация результатов исследования

Результаты были опубликованы в шести работах в рецензируемых научных журналах, индексируемых в базах данных Scopus и Web of Science и представлены на шести международных и всероссийских научных конференциях. Список публикаций

1. Mikolaichuk O., Sharoyko V., Popova E., Protas A., Fonin A., et. al. Biocompatibility and bioactivity study of a cytostatic drug belonging to the group of alkylating agents of the triazine derivative class // J. Mol. Liq. - 2021. - Vol. 343. - P. 117630.

2. Mikolaichuk O., Popova E., Protas A., Rakipov I., Nerukh D., et. al. A cytostatic drug from the class of triazine derivatives: Its properties in aqueous solutions, cytotoxicity, and therapeutic activity // J. Mol. Liq. - 2022. - Vol. 356. - P. 119043.

3. О. В. Миколайчук, В. В. Шаройко, Е. А. Попова, А. В. Протас, А. В. Фонин, и др. всего 12 человек. Синтез, исследование взаимодействия с ДНК и противоопухолевая активность нового тетразолсодержащего производного 2-амино-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазина // Известия АН. Серия химическая. - 2022. - №5. - с. 1050.

4. Molchanov O., Maistrenko D., Granov D., Vasina L., Popova A., Vasilevskaya I., Mikolaichuk O., et. al. Biomarkers and potential targets for immune and cellular therapy in triple negative breast cancer // Cell Ther Transplant. - 2022. -Vol. 11(2). - P. 18.

5. Mikolaichuk O., Popova E., Protas A., Shemchuk O., Vasina L. Study of biocompatibility, cytotoxic activity in vitro of a tetrazole-containing derivative of 2-amino-4,6-di(aziridin-1-yl)-1,3,5-triazine // Biochem Biophys Res Commun. // 2022. - Vol. 629. - P. 176.

6. Sharoyko V., Mikolaichuk O., Shemchuk O., Abdelhalim A. O. E., Potanin A., et. al. Novel non-covalent conjugate based on graphene oxide and alkylating agent from 1,3,5-triazine class // J. Mol. Liq. - 2023. - Vol. 372. - P. 121203.

Список конференций

1. Материалы 5-й Российской конференции по медицинской химии с международным участием «МедХим-Россия 2021» 5-8 октября 2021. О. В. Миколайчук, А. В. Протас, Е. А. Попова, А. М. Малкова, В. А. Островский, А. А. Богданова, Ю. Н. Павлюкова, Н. Т. Шманёва, Ю. А. Нащекина, В. В. Шаройко, К. Н. Семёнов «Производные 5-фенилтетразол-2-илуксусной кислоты как ключевые реагенты в синтезе биологически активных веществ, проявляющих противоопухолевую активность», Волгоград, Российская Федерация, 2021.

2. Материалы XXIV Международной медико-биологической конференции молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая медицина — человек и его здоровье» апрель 2021. О. В. Миколайчук, А. В. Протас, Г. О. Юрьев, К. Н. Семёнов «Исследование взаимодействия производного 1,3,5-триазина с ДНК», Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2021.

3. Материалы LXXXII научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины — 2021» 24 апреля 2021 года. О. В. Миколайчук, А. В. Протас, Е. А. Попова «Синтез и исследование свойств новых гибридных гетероциклических систем на основе 1,3,5-триазинов», Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2021.

4. Материалы Всероссийской научной конференции «Марковниковские чтения: органическая химия от Марковникова до наших дней» 8-11 октября 2021 года. О. В. Миколайчук, А. В. Протас, Е. А. Попова, А. А. Спиридонова, О. Я. Волкова, А. М.

Малкова, В. В. Шаройко, К. Н. Семёнов «Синтез, структура и биологическая активность некоторых производных 1,3,5-триазина», Сочи, Российская Федерация, 2021.

5. Материалы Всероссийского Конгресса "КOST-2021" по химии гетероциклических соединений 12-16 октября 2021 года. О. В. Миколайчук, А. В. Протас, Е. А. Попова, А. А. Батыренко, А. М. Малкова, В. В. Шаройко, К. Н. Семёнов «Синтез и исследование биологической активности новых производных 1,3,5-триазина», Сочи, Российская Федерация, 2021.

6. Материалы XXVIII Всероссийской конференции молодых учёных с международным участием "Актуальные проблемы биомедицины-2022" 24-26 марта 2022 года. О. В. Миколайчук, Е. А. Попова, А. В. Протас, М. Д. Лутцев, А. А. Потанин, А. М. Малкова «Исследование биосовместимости и биоактивности нового тетразолсодержащего производного 2-амино-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазина», Санкт-Петербург, Российская Федерация, 2022.

Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства здравоохранения Российской Федерации (государственное задание по теме «Создание и оценка противоопухолевой активности конъюгатов неанелированных 1,3,5-триазинил- тетразолов с молекулами адресной доставки к мишеням клеток опухоли микроокружения»). Положения, выносимые на защиту

1. Методика синтеза цитостатического препарата 5-((4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанола и его тетразолированного производного ((5-((4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метил-2-(5-фенил-2#-тетразол-2-ил)ацетата).

2. Данные по синтезу и идентификации конъюгата оксида графена с цитостатическим препаратом 5-((4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил- 1,3-диоксан-5-ил)метанола.

3. Изучение свойств водных растворов 5-((4,6-дихлор-1,3,5-триазин-2-ил)амино)-2,2-диметил-1,3-диоксан-5-ил)метанола и его тетразолированного аналога.

4. Результаты по изучению биосовместимости и биологической активности производных 1,3,5-триазина и конъюгата на его основе. Структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 144 страницах и состоит из перечня используемых сокращений, введения, обзора литературы, обсуждения полученных результатов, выводов, экспериментальной части и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 133 наименования. Диссертация содержит 23 таблицы, 63 рисунка и 31 схему.

Личный вклад автора заключался в синтезе и идентификации производных 1,3,5-триазина и триазинилтетразолов, оксида графена и конъюгата на его основе, в изучении биосовместимости и биологической активности полученных соединений и конъюгата, обсуждении результатов экспериментов и подготовке научных публикаций. Благодарности

Автор выражает благодарность всем, с кем было связано появление настоящей работы. Прежде всего, своим научным руководителям д. х. н., доценту, заведующему кафедрой общей и биоорганической химии ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова Семёнову Константину Николаевичу и д. б. н., доценту, профессору кафедры Шаройко Владимиру Владимировичу, всему коллективу кафедры: профессору, д. х. н. Поповой Елене Александровне, доценту к. х. н. Протас Александре Владимировне, Шемчук Ольге Сергеевне. Автор благодарит коллектив кафедры химии твёрдого тела Института химии СПбГУ за организацию работы на высоком уровне и создание творческой атмосферы во главе с д. х. н, профессором Муриным Игорем Васильевичем. Автор благодарит коллектив кафедры химии и технологии органических соединений азота СПбГТИ (ТУ), профессора, д. х. н. Островского Владимира Ароновича за советы и научные консультации.

Также автор выражает благодарность Корнякову И. В. За помощь в проведении рентгеноструктурного анализа, Лутцеву М. Д. за помощь в проведении исследований биосовместимости. Автор также выражает признательность всем сотрудникам Ресурсного центра СПбГУ за запись ЯМР-, ИК-, масс-спектров и физико-химическое изучение синтезированных веществ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. МЕТОДЫ СИНТЕЗА ТРИЗАМЕЩЁННЫХ 1,3,5-ТРИАЗИНОВ С ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Из широкого ряда замещённых триазинов 1,3,5-триазины выделяются благодаря своим уникальным свойствам [2]. Большое число соединений, содержащих 1,3,5-триазин в своей структуре проявляют широкий спектр биологической активности, что стимулирует разработку новых методов и оригинальных подходов к синтезу тризамещённых триазинов [3-5]. В настоящем обзоре литературы рассмотрены наиболее важные методы синтеза замещённых 1,3,5-триазинов. Основными синтетическими подходами к получению замещённых 1,3,5-триазинов являются реакции циклизации альдегидов, нитрилов, бигуанидов и реакции последовательного замещения атомов хлора в цианурхлориде.

1.1. Реакции циклизации 1.1.1. Получение тризамещённых 1,3,5-триазинов реакцией циклизации производных бигуанидов

Арилбигуаниды способны вступать в два типа реакций гетероциклизации с образованием триазинов по фрагменту «А» (с участием эфиров ароматических кислот, эфиров монохлоруксусной кислоты) и по фрагменту «В» (при участии ацетоуксусного эфира и Р-дикетонов) с образованием производных пиримидина (Рис. 1.1).

н

мн рта в

А

Рис. 1.1. Общая формула арилбигуанидов.

Так, в работе [6] при взаимодействии сложных эфиров (1.1-1.3) с соответствующими гидрохлоридами бигуанидов в растворе метилата натрия в метаноле (MeONa/MeOH) при кипячении с обратным холодильником в течение 45 ч был получен ряд 2-[(4-амино-6-Я2-1,3,5-триазин-2-ил)метилтио]-А'-(1-Я1-имидазолидин-2-илиден)-4-хлор-5-метилбензолсульфонамидов (1.4-1.6; Схема 1.1).

Схема 1.1

л

Г? ГГ

н

I ' '

Ме

тм=<п х

о'а

° МеОЫа/МеОН

1.1-1.3 кипячение / 45 ч ^ 1.4-1.6

1.1.1.4, Я1 = С6Н5СН2-, И -

1.2.1.5, Я1 = 4Р3С-С6Н4СН2-, Я2 =

1.3.1.6, Я1 = 4Е3С-С6Н4СН2-, Я2 =

Влияние соединений 1.4-1.6 на жизнеспособность трёх линий опухолевых клеток НСТ-116 (карцинома кишечника человека), MCF-7 (аденокарцинома протоков молочной железы человека) и HeLa (аденокарцинома шейки матки человека), а также клеток неопухолевого происхождения — НаСаТ (кератиноциты) проводилось с использованием МТТ-теста. Авторы [6] определяли 1С50 после 72 ч инкубации клеток; в качестве препарата сравнения использовался цисплатин. Результаты МТТ: соединение 1.4 = бензил, R2 = индолин) — 1С50 = 6 мкМ для HCT-116, 1С 50 = 7 мкМ для MCF-7; соединение 1.5 ^ = 4-трифлорометилбензил, R2 = 4-бензилпиперазин) — 1С50 = 5 мкМ для НСТ-116, 1С50 = 8 мкМ для HeLa; соединение 1.6 = 4-трифторметилбензил, R2 = хлор) — 1С50 = 5 мкМ для НСТ-116, 1С50 = 6 мкМ для MCF-7. Значения 1С50 соединений 1.4-1.6 по отношению к клеточной линии НаСаТ составило 33, 22 и 21 мкМ, соответственно.

В другой работе конденсацией между бигуанидом и различными сложными эфирами были синтезированы 1,3,5-триазиновые производные метформина (1.7-1.9) [7]. Авторы проводили синтез без выделения и очистки промежуточных продуктов,

используя гидрохлорид бигуанида, метоксид натрия (NaOMe) в метаноле (Схема 1.2).

Схема 1.2

VRl

NH, I NH2 .

\ 2 ■ С1 ^О I 1Л'r " 15 31

HN^NH R__ N^N 1.8,R> = C6H5

Ujj-^N^ эфир, NaOMe, MeOH ^N^N^R1 1"9'Rl = OH | кипячение |

Далее оценивалась цитотоксическая активность соединений 1.7-1.9 in vitro по отношению к двум клеточным линиям карциномы кишечника человека (HCT-116 и SW620). Все синтезированные производные 1,3,5-триазина проявляли сопоставимую или более высокую цитотоксичность, по сравнению с цисплатином. Соединение 1.7 проявило цитотоксичность с IC50 = 59,1 ± 1,5 мкМ для клеточной линии SW620 и 59,4 ± 1,7 мкМ для клеточной линии HCT-116. Напротив, цитостатический эффект соединений 1.8 и 1.9 был очень низким и составлял не более 5-20 %. Далее в работе [7] синтезировали наноформу соединения 1.7, инкапсулированного в наночастицы цитрата кальция (1.7а) (Схема 1.3).

Схема 1.3

X X

1.7 1.7а

Авторами был предложен метод синтеза с использованием бинарного растворителя ЕЮН-вода. Добавление 1,3,5-триазина 1.7 к водно-этанольному раствору хлорида кальция и цитрата натрия на воздухе при энергичном перемешивании при комнатной температуре приводило к образованию наночастиц 1.7а [6].

При разработке наноматериалов, используемых для адресной доставки лекарств важно изучать контролируемое высвобождение лекарственного средства при физиологических условиях. Как анаэробный, так и аэробный гликолиз приводят к накоплению Н+ во внеклеточном пространстве опухолей, вызывая выраженное закисление межклеточной жидкости в области микроокружения опухоли [8], поэтому высвобождение вещества 1.7 изучали в кислой среде при рН 5,0 и 3,0 и в

нейтральной среде (pH 7,4) для сравнения. Исследование in vitro показало, что наночастицы 1.7а реагируют на изменение pH среды с контролируемым высвобождением триазина 1.7. Через 24 ч высвобождалось 80,0 %, 48,8 % и 30,0 % соединения 1.7 при pH 3,0, pH 5,0 и pH 7,4, соответственно.

Другим успешным примером синтеза биологически активных 1,3,5-триазинов из производных бигуанида является исследование, проведённое Котайер и соавт. [9]. Синтез производных 4-амино-6-(ариламино)-1,3,5-триазина-2-карбогидразида проводили в две стадии из солей гидрохлорида арилбигуанида. На первой стадии проводилась нейтрализация соли 1.8 с использованием метоксида натрия в метаноле с последующей её реакцией с диметилоксалатом в кипящем метаноле. Это приводило к образованию промежуточных метил-4-амино-6-(ариламино)-1,3,5-триазин-2-карбоксилатов (1.9-1.11) с выходом в 83-92 % после перекристаллизации из метанола. Реакция промежуточных соединений (1.9-1.11) с гидразингидратом в кипящем этаноле приводила к получению целевых 2,4,6-тризамещённых-1,3,5-триазинов (1.12-1.14) (Схема 1.4).

Схема 1.4

о

| фенилгидразин, |

NH NH О_ хг-^хг EtOH, АсОН „А-

Н N.

NH,

N^N^NH, NaOMe,CH3OH Д X ™ Д Д Н Н кипячение HN N NH, HN N NH,

С1

"I] ..

1.12, Я = Н;

1.13, Я = ОМе;

1.8 1.9-1.11 1.12-1.14 1.14, Я = 4-С1.

Изучение цитотоксичности синтезированных 4-амино-6-(ариламино)-1,3,5-триазин-2-карбогидразидов (1.12-1.14) в диапазоне концентраций 0-125 мкМ проводили на семи опухолевых клеточных линиях человека: аденокарциномы яичников (ОУ90), карциномы яичников (А2780), аденокарциномы лёгкого (А549), карциномы лёгкого (Н1299), аденокарциномы молочной железы (MCF-7 и МБА-МВ-231) и аденокарциномы толстой кишки (НТ29). Обобщённые данные со значениями 1С50 представлены в Табл. 1.1. Анализ данных по цитотоксичности соединений 1.12-1.14 показывает, что их активность сопоставима с цитотоксической активностью соединения 1.15, являющегося ингибитором убиквитин-конъюгирующего фермента Е2В (Rad6B; Рис. 1.2). Rad6B активирует белок

клеточной адгезии Р-катенин, который отвечает за злокачественную прогрессию клеток рака молочной железы.

Табл. 1.1. Значения 1С50 (мкМ) замещённых производных 4-амино-6-(ариламино)-1,3,5-триазин-2-карбогидразида.

Номер соединения ОУ90 А2780 МСЕ-7 МБА-МВ231 А549 Н1299 НТ-29

1.12 75,0 7,3 5,9 2,6 7,8 65,0 3,3

1.13 80,0 14,7 6,2 7,6 5,2 65,0 5,4

1.14 85,0 36,6 8,8 24,6 7,5 30,0 4,6

1.15 60,0 7,8 5,0 4,6 7,2 45,0 8,3

Рис. 1.2. Химическая структура ингибитора убиквитин-конъюгирующего фермента

Е2В (Rad6B).

Интересные данные по цитотоксической активности триазинового цикла описываются в работе [10], где были представлены методы получения производных 2-(4-амино-6-(4-(2-хлорфенил)пиперазин-1 -ил)- 1,3,5-триазин-2-ил)ацетонитрила

1.16 как прекурсора в синтезе амино-4-{[4-(2-Я'-фенил)пиперазино]-1,3,5-триазин-6-ил}ацетонитрила 1.17. Целевые соединения получали взаимодействием N карбамимидоил-4-(2-хлорфенил)пиперазин-1 -карбоксимидамида и этилцианоацетата в метанольном растворе при комнатной температуре.

Промежуточный 2-амино-4-(4-арилпиперазино)-1,3,5-триазин 1.16, связанный непосредственно с циановиниловым фармакофором, использовался для последующей реакции с 5-нитро-2-фуральдегидом в реакции конденсации Кневенагеля, катализируемой триэтиламином, с получением (Е)-2-(4-амино-6-(4-фенилпиперазин-1-ил)-1,3,5-триазин-2-ил)-3-(5-нитрофуран-2-ил)акрилонитрила

1.17 с выходом 57 % (Схема 1.5).

I

•CN

N N—^ NH2

cnch2cooc2h5

MeOH

MeOH

N

■ HC1

nh

1.16

O

Et3N ЕЮН, кипячение

H

02n

c1 n n nh2

1.17

Скрининг цитотоксической активности проводился на 10 опухолевых клеточных линиях человека: цервикальной аденокарциноме шейки матки (SISO), плоскоклеточной карциноме пищевода (KYSE-520, KYSE-70, KYSE-510), крупноклеточной карциноме лёгкого (LCLC-103H), карциноме мочевого пузыря (RT-4), карциноме мочевыводящих путей (RT-112 и RT-5637), карциноме поджелудочной железы (YAPC и DAN-G). Среди производных триазина наибольшая цитотоксическая активность была обнаружена для соединения 1.17, которое в арильном кольце содержит хлор (IC50 1,66 мкМ для RT-4, 1,05 мкМ для RT-112, 0,92 мкМ для RT-5637, 0,92 мкМ для KYSE-70, 0,45 мкМ для KYSE-510, 0,95 мкМ для KYSE-520, 0,72 мкМ для YAPC, 0,86 мкМ для DAN-G, 0,90 мкМ для SISO и 0,89 мкМ для LCLC-103H), что свидетельствует о перспективности введения галогеновых заместителей в структуру 1,3,5-триазинов.

Джунаид и соавт. использовали микроволновый синтез для получения 6N2-диарил-1,3,5-триазин-2,4-диаминов (Схема 1.6) [11].

NH,

HN^NH 1. ЕЮН, HC1,140-C

NH2 N^N

HIN JNH -------.----. -------.

+ NH2-R2 + I 2. NaOH, 140°C n^N''

ill H

1.18,= 4-Ме2КС6Н4, Я2 = 2-РС6Н4

1.19, = 4-ОМеСбН4, Я2 = 4-МеС6Н4

Реакция между цианогуанидином, ароматическими альдегидами и ариламинами в присутствии соляной кислоты под действием микроволнового облучения приводила к образованию продуктов перегруппировки Димрота, которые в свою очередь претерпевают спонтанное дегидрирование и ароматизацию с получением 6, М2-диарил-1,3,5-триазин-2,4-диаминов (1.18 и 1.19) (Схема 1.6).

Полученные соединения были исследованы на антипролиферативную активность в отношении клеточной линии карциномы простаты человека DU145 (С = 10 мкМ). Было показано, что соединения 1.18 и 1.19 ингибировали пролиферацию клеток более, чем на 45 %.

1.2. Реакции нуклеофильного замещения атомов хлора в производных 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазина

Рассмотрен метод, который заключается в последовательном нуклеофильном замещении атомов хлора в присутствии основания (Схема 1.7). Исходным соединением является 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазин (цианурхлорид, ТХТ).

Схема 1.7

CI CI Nu2 NU2

N^N Nu > NXN _Nu_^ n-4n Nu > NXN

J|l 0°C II Л комнатная N I t > 80°C II \

Cl-^N^Cl Cl-^N^Nu, ™-ч«я» CI-^N Nu, Nuj^N^Nu,

TXT Nu = нуклеофил

Несмотря на широкое распространение представленного метода синтеза, в нем имеются существенные недостатки, в основном связанные с жёсткими условиями нуклеофильного замещения третьего атома хлора и низкими выходами тризамещённого продукта [12,13].

1.2.1. Реакции 2,4,6-трихлор-1,3,5-триазина с аминами различной природы

Первым продуктом замещения атомов хлора в ТХТ был М2,М2,ЩМ4,Мб,Мб-гексаметил-1,3,5-триазин-2,4,6-триамин (альтретамин), который был одобрен FDA под торговой маркой Hexalen® для лечения рака яичников [14,15]. Синтез целевого тризамещённого ТХТ проводили диметиламинированием ТХТ водным раствором 40 %-ного диметиламина и гидроксида калия в 1,4-диоксане в одну стадию с получением альтретамина (1.20) с высоким выходом (Схема 1.8) [16,17].

Схема 1.8

I I

cu ^n. .ci .n.___n.___n.

"Y y nh(CH3)2 ^ - Y Y

1,4-диоксан NYN

С1 ^

1.20

В организме животных и человека альтретамин подвергается окислительному N-деметилированию с образованием гидроксиметильных производных. Показано, что именно гидроксиметилмеламины ответственны за цитотоксическую и противоопухолевую активность альтретамина [18]. Альтретамин действует как алкилирующий агент, однако детальный механизм его противоопухолевого действия неизвестен. Альтретамин предположительно повреждает опухолевые клетки за счёт образования формальдегида, как продукта N-деметилирования при участии цитохрома P450. При пероральном приёме альтретамин метаболизируется в печени, образуя в основном моно- и дидеметилированные метаболиты. В опухолевых клетках происходят последовательные реакции деметилирования и высвобождения формальдегида in situ. Показано, что альтретамин способен ковалентно взаимодействовать с остатками гуанина и цитозина, входящими в состав ДНК [19]. Альтретамин после перорального приёма хорошо всасывается и подвергается быстрому деметилированию в печени, вызывая значительное снижение концентрации действующего вещества в плазме. В последующих исследованиях у пациентов с рецидивирующим раком яичников после монотерапии препаратом Hexalen® в течение 14, 21 или 28-дневного цикла было достигнуто 6 полных клинических ответов и 2 частичных ответа при общей частоте ответов 18 %, с продолжительностью от 2 до 36 месяцев. У некоторых пациентов регрессия опухоли сопровождалась улучшением общего состояния [20].

Авторами работы [21] был успешно проведён синтез производных тиомочевины, например, соединение 1.22 (без выделения промежуточных продуктов) с выходами до 71 %. Реакцию ТХТ с двумя эквивалентами замещённых аминов проводили при добавлении NaOH, предотвращая подкисление реакционной смеси с получением дизамещённого продукта 6-хлор-У2,А'4-дифенил-1,3,5-триазин-2,4-диамина 1.21 (Схема 1.9).

Схема 1.9

а Окга ? н н -^ n^N ^ — , rvNYNTNY^

с1ЛЛ,№Щ4ге 120-135°С, К2СОэ ^ l^J

0Н HN NH2

I 1.21 I 1.22

На следующей стадии авторы осуществили синтез целевых гибридных соединений на основе реакции между соединением 1.22, ацетофеноном и этил-3-оксобутаноатом с использованием Bi(NO3)3 (Схема 1.10).

Схема 1.10

„ н -- и fY YV в , __ я .

Т Bi(N03)3, кипячение, EtOH I

HN_NH2 " NH

T

S 1.22

Цитотоксическая активность этил 1-(4,6-бис(фениламино)-1,3,5-триазин-2-ил)-6-метил-4-фенил-2-тиоксо-1,2,3,4-тетрагидропиримидин-5-карбоксилата 1.23 оценивалась в экспериментах in vitro в отношении клеточных линий: HeLa, MCF-7, HL-60 (клетки промиелоцитарного лейкоза человека), HepG2 (клеточная линия гепатоцеллюлярной карциномы человека) и MCF-12A (эпителиальная клеточная линия, полученная из протоков молочной железы человека) методом МТТ. Цисплатин, использовался в качестве препарата сравнения. Результаты показали, что соединение 1.23 проявляет умеренную активность в отношении клеточных линий HeLa (IC50 = 96,6 ± 0,5 мкМ), MCF-7 (IC50 = 87,4 ± 0,8 мкМ), HL-60 (IC50 = 83,7 ± 0,3 мкМ), однако не проявляет активности в отношении клеточной линии MCF-

. JU, -V' crWO

V

12A, что говорит о селективности цитотоксического действия полученного производного 1,3,5-триазина.

Продолжая рассматривать варианты синтеза биологически активных 1,3,5-триазинов, хотелось бы выделить исследование по синтезу 2,4-диамино-6-арил-1,3,5-триазинов, которые были получены с использованием твердофазного синтеза [22]. Различная реакционная способность аминирования моноарилзамещённых триазинов приводит к тому, что амин, связанный со смолой, селективно замещает хлор в неочищенной реакционной смеси с получением триазина 1.24. Затем третий атом хлора замещается амином в среде ДМФА при высокой температуре (Схема 1.11). Отщепление смолы проводилось обработкой 50 % трифторуксусной кислотой в дихлорметане. Таким образом, были получены 2,4-диамино-6-арил-1,3,5-триазины 1.25-1.27.

Схема 1.11

..Л.. [П'

ф-СНО + 1уш2

+ [I

МвВг

О-х '

нм-я.

с1

ДМФА

N

I >1

n

к2. Л ,

2 n n „ ч „ н i чл,

1.25, II, = ОД, Я2 = 4-СН3С6Д,, Я3,1С, = {^/Н !

1.26, Я] = 0^5, И2 = 4-СНзСба,, К3> 1Ц = НМ N-1;

1.27, Я, = С6Н5, Я2 = 4-СН3С6Н4, Я3, Я4 = — к N"1 .

Большинство полученных соединений продемонстрировали антипролиферативную активность в отношении клеточных линий миелогенного лейкоза (£562), аденокарциномы предстательной железы человека и H08910). В частности, соединение 1.26 проявляло заметную ингибирующую активность со

значениями 1С50 1,01, 2,23 и 1,06 мкМ в отношении клеточных линий К562, РС-3 и Н08910, соответственно.

Успешным оказалось проведение синтеза Р-лактамов, к которым присоединён диморфолинотриазиновый фрагмент [23]. Исходное соединение 4,4'-(6-хлор-1,3,5-триазин-2,4-диил)диморфолин (1.28) было синтезировано из ТХТ в ацетоне и обработано смесью триэтиламина и морфолина при -10°С с получением аддукта 1.28. Последующая реакция 1.28 с 4-нитроанилином в присутствии карбоната калия и ДМФА приводила к образованию тризамещённого триазина 1.29, в котором нитрогруппа подвергалась восстановлению с образованием соединения 1.30 (4,6-диморфолино-А^-(4-нитрофенил)-1,3,5-триазин-2-амин; Схема 1.12).

Схема 1.12

и О г СГ-Р 2 »¿У

1 о к-^к Никель Ренея Ч ¥ —^-" Л А -" II Л М2Н4;ЕЮН,Н20 Ч 7

/л,п * О, Пм^

С Г N С1

«---' О___J

1А1 1.28 1.29 130

Затем полученные из 1.30 основания Шиффа 1.31 вступали в реакцию с замещёнными уксусными кислотами в присутствии триэтиламина и тозилхлорида в различных молярных соотношениях с получением цис-Р-лактамов 1.32-1.33 с выходами 75-90 % (Схема 1.13).

Схема 1.13

о,

ны

Я'РЬСНО, ЕЮН,

N N -•

| | кипячение

Влияние полученных Р-лактам-триазинов на клеточные линии НЕК293, SW-1116, HepG2 и MCF-7 оценивалось с использованием МТТ теста [23]. Примечательно, что ни для одного из описанных соединений не наблюдалось ингибирующей активности по отношению к клеткам неопухолевого происхождения

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Миколайчук Ольга Владиславовна, 2023 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Molchanov O.E. et al. Biomarkers and potential targets for immune and cellular therapy in triple negative breast cancer // Cell Ther Transplant. - 2022. - Vol. 11. - № 2.

- P. 16-30.

2. Patel R. V, Keum Y.-S., Park S.W. Medicinal chemistry discoveries among 1,3,5-triazines: recent advances (2000-2013) as antimicrobial, anti-TB, anti-HIV and antimalarials. // Mini Rev. Med. Chem. Netherlands. - 2014. - Vol. 14. - № 9. - P. 768789.

3. Singla P., Luxami V., Paul K. Triazine as a promising scaffold for its versatile biological behavior // Eur. J. Med. Chem. - 2015. - Vol. 102. - P. 39-57.

4. Cascioferro S. et al. 1,3,5-Triazines: A promising scaffold for anticancer drugs development // Eur. J. Med. Chem. - 2017. - Vol. 142. - P. 523-549.

5. Raghu M.S. et al. Novel 1,3,5-triazine-based pyrazole derivatives as potential antitumor agents and EFGR kinase inhibitors: synthesis, cytotoxicity, DNA binding, molecular docking and DFT studies // New J. Chem. Royal Society of Chemistry. - 2021.

- Vol. 45. - № 31. - P. 13909-13924.

6. Tomorowicz L. et al. New 2-[(4-Amino-6-N-substituted-1,3,5-triazin-2-yl)methylthio]-N-(imidazolidin-2-ylidene)-4-chloro-5-methylbenzenesulfonamide Derivatives, Design, Synthesis and Anticancer Evaluation. // Int. J. Mol. Sci. - 2022. -Vol. 23. - № 13. - P. 7178.

7. Chalermnon M. Biguanide-Based Synthesis of 1,3,5-Triazine Derivatives with Anticancer Activity and 1,3,5-Triazine Incorporated Calcium Citrate Nanoparticles. // 2021. - Molecules. - Vol. 26 - P. 1028.

8. Thews O., Riemann A. Tumor pH and metastasis: a malignant process beyond hypoxia // Cancer and Metastasis Reviews. - 2019. - Vol. 38. - P. 113-129.

9. Kothayer H. et al. Synthesis and in vitro anticancer evaluation of some 4,6-diamino-1,3,5-triazine-2-carbohydrazides as Rad6 ubiquitin conjugating enzyme inhibitors // Bioorg. Med. Chem. Lett. - 2016. - Vol. 26. - № 8. - P. 2030-2034.

10. Prokhorov A. M. et. al. Triazines, Tetrazines, and Fused Ring Polyaza Systems. // Progress in Heterocyclic Chemistry. - 2012. - Vol. 24. - P. 421-441.

11. Junaid A. et al. 6,N2-Diaryl-1,3,5-triazine-2,4-diamines: Synthesis, antiproliferative activity and 3D-QSAR modeling // RSC Adv. Royal Society of Chemistry. - 2020. - Vol. 10, № 21. - P. 12135-12144.

12. Afonso C.A.M., Louren^o N.M.T., Rosatella A. de A. Synthesis of 2,4,6-tri-substituted-1,3,5-triazines. // Molecules. - 2006. - Vol. 11. - № 1. - P. 81-102.

13. Sharma A. et al. Exploring the orthogonal chemoselectivity of 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine (TCT) as a trifunctional linker with different nucleophiles: Rules of the game // Front. Chem. - 2018. - Vol. 6. - P. 00516

14. Hexalen ® (altretamine) - Product discontinuation. RxNews® OptumRx Clinical Services Department. - Optum. - 2018.

15. Keldsen N. et al. Altretamine (hexamethylmelamine) in the treatment of platinum-resistant ovarian cancer: a phase II study // Gynecol. Oncol. - 2003. - Vol. 88. - № 2. - P. 118-122.

16. Dubois J. et al. In vitro cytotoxicity of hexamethylmelamine (HMM) and its derivatives. // Anticancer Res. Greece. - 1990. - Vol. 10. - № 3. - P. 827-832.

17. Duong V.B. et al. A Simple Synthesis of the Anticancer Drug Altretamine // Letters in Organic Chemistry. - 2020. - Vol. 17. - № 8. - P. 628-630.

18. Damia G., D'lncalci M. Clinical Pharmacokinetics of Altretamine // Clin. Pharmacokinet. - 1995. - Vol. 28. - № 6. - P. 439-448.

19. Deepa P., Kolandaivel P., Senthilkumar K. Theoretical investigation of interaction between psoralen and altretamine with stacked DNA base pairs // Mater. Sci. Eng. C. -2012. - Vol. 32. - № 3. - P. 423-431.

20. Lee C.R., Faulds D. Altretamine. // Drugs. - 1995. - Vol. 49. - № 6. - P. 932-953.

21. Srivastava J.K. et al. Design and discovery of novel monastrol-1,3,5-triazines as potent anti-breast cancer agent via attenuating Epidermal Growth Factor Receptor tyrosine kinase // Scientific reports. - Vol.7. - №1. - P. 5851.

22. Hu Z. et al. Solid-Phase Synthesis and Antitumor Evaluation of 2,4-Diamino-6-aryl-1,3,5-triazines // J. Comb. Chem. American Chemical Society. - 2009. - Vol. 11. - № 2. -P. 267-273.

23. Ranjbari S. et al. Investigations of antiproliferative and antioxidant activity of ß-lactam morpholino- 1,3,5-triazine hybrids // Bioorg. Med. Chem. - 2020. - Vol. 28. - № 8. P. 115408.

24. Bunning T.H. et al. Synthesis and characterisation of a boron-rich symmetric triazine bearing a hypoxia-targeting nitroimidazole moiety // Symmetry (Basel). - 2021. -Vol. 13. - № 2. - P. 1-9.

25. Ostrovskii V.A. et. al. Medicinal chemistry of tetrazoles // Russ. Chem. Bull. -2012. - Vol. 61. - № 4. - P. 768-780.

26. Ostrovskii V.A. et. al. Developments in Tetrazole Chemistry (2009-16) // Adv. Heterocycl. Chem. - 2017. - Vol. 123. - P. 1-62.

27. Popova E.A. el. al. Tetrazole Derivatives as Promising Anticancer Agents // AntiCancer Agents Med. Chem. -2017. - Vol. 17. - № 14. - P. 1856-1868.

28. О. В. Миколайчук и др. Синтез, исследование взаимодействия с ДНК и противоопухолевая активность нового тетразолсодержащего производного 2-амино-4,6-ди(азиридин-1-ил)-1,3,5-триазина // Известия академии наук. Серия химическая.

- 2022. - №5. - стр. 1050.

29. Pathania S., Narang R.K., Rawal R.K. Role of sulphur-heterocycles in medicinal chemistry: An update // Eur. J. Med. Chem. -2019. - Vol. 180. - P. 486-508.

30. Sharma V. et al. A Comprehensive Review on Fused Heterocyclic as DNA Intercalators: Promising Anticancer Agents. // Curr. Pharm. Des. United Arab Emirates, 2021. - Vol. 27. - № 1. - P. 15-42.

31. P.N.Gaponik et. al. Metal derivatives of tetrazoles. // Russ. Chem. Rev. - 2006. -Vol. 75. - №6. - Р. 507-539.

32. Balaha M.F. et al. Synthesis, evaluation and docking study of 1, 3, 5-triazine derivatives as cytotoxic agents against lung cancer // J. Appl. Pharm. Sci. - 2016. - Vol. 6.

- № 4. - P. 28-45.

33. Moreno L.M. et al. Synthesis of New 1,3,5-Triazine-Based 2-Pyrazolines as Potential Anticancer Agents. // Molecules. - 2018. - Vol. 23. - № 8. - Р. 1956.

34. Filov VA, Stukov AN M.L. et al. Study of antitumor action of Dioxadet. // Ex-per. Oncol. - 1996. Vol. 18. - № 1. - P. 84-86.

35. Voeikov R. et al. Dioxadet-loaded nanogels as a potential formulation for glioblastoma treatment // J. Pharm. Investig. Springer Netherlands. - 2017. - Vol. 47. - № 1. - P. 75-83.

36. Bespalov V.G., Zhabin A.A., Stukov A.N., Beliaeva O.A., Murazov I.G., Semenov A.L., Kon'kov S.A. K.I.M. Synergism of antitumor action of dioxadet and cisplatin in

model of ascitic ovarian tumor. // Sib. J. Oncol. - 2013. - Vol. 1. - P. 42-46.

37. Zhikhoreva A.A. et al. Morphological changes in the ovarian carcinoma cells of Wistar rats induced by chemotherapy with cisplatin and dioxadet // Biomed. Opt. Express. The Optical Society. - 2018. - Vol. 9. - № 11. - P. 5817.

38. Latipova D.Kh., et. al. Synergism of antitumor activity of gemcitabine and dioxadet in mice with ascitic Ehrlich's tumor // Vopr Onkol. - 2011. - Vol. 57. - № 6. - P. 767770.

39. Bespalov V. G., et. al. Both heat and new chemotherapeutic drug dioxadet in hyperthermic intraperitoneal chemoperfusion improved survival in rat ovarian cancer model // J Surg Oncol. - 2016. - Vol. 113. - № 4. - P. 438-442.

40. Gershanovich M. L, Filov V.A., et al. Results of a cooperative clinical study of the anticancer drug dioxadet in phase II // Vopr. Oncol. - 1998. - Vol. 44. - № 2. - P. 216220.

41. Borisov A. E., Gershanovich M. L. et al. Use of dioxadet for chemiembolization of the hepatic artery in primary and metastatic liver cancer // Vopr. oncol. - 1998. - Vol. 44. - № 6. - P. 714-717.

42. Granov A. M, et al. Results of the use of endovascular interventions (embolization and chemoembolization) in the treatment of operable and advanced kidney cancer // Vopr. oncol. - 1998. - Vol. 44. - № 6. - P. 711-714.

43. Stukov A.N., Gershanovich M.L., et al. Antineoplastic drugs // Saint-Petersburg. NIKA. - 2011. - P. 656.

44. Ealias A.M., Saravanakumar M.P. A review on the classification, characterisation, synthesis of nanoparticles and their application // IOP Conf. Ser. Mater. Sci. Eng. 2017. Vol. 263, № 3.

45. Gu F.X. et al. Targeted nanoparticles for cancer therapy // Nano Today. - 2007. -Vol. 2. - № 3. - P. 14-21.

46. Debnath S.K., Srivastava R. Drug Delivery With Carbon-Based Nanomaterials as Versatile Nanocarriers: Progress and Prospects // Front. Nanotechnol. - 2021. - Vol. 3. -P. 15.

47. Singh S.K. et al. Amine-modified graphene: Thrombo-protective safer alternative to graphene oxide for biomedical applications // ACS Nano. - 2012. - Vol. 6. - № 3. - P. 2731-2740.

48. Georgakilas V. et al. Noncovalent Functionalization of Graphene and Graphene Oxide for Energy Materials, Biosensing, Catalytic, and Biomedical Applications. // Chemical reviews. - 2016. - Vol. 116. - №9. - P. 464-5519.

49. Gaponenko I.N. et al. Biological evaluation and molecular dynamics simulation of water-soluble fullerene derivative C6o[C(COOH)2]3 // Toxicol. Vitr. Elsevier Ltd. - 2020. - Vol. 62. - P. 04683.

50. Murthy S.K. Nanoparticles in modern medicine: state of the art and future challenges. // Int. J. Nanomedicine. 2007. - Vol. 2. - № 2. - P. 129-141.

51. Micha J.P. et al. Abraxane in the treatment of ovarian cancer: the absence of hypersensitivity reactions. // Gynecol. Oncol. United States. - 2006. - Vol. 100. - № 2. -P. 437-438.

52. Ibrahim N.K. et al. Phase I and pharmacokinetic study of ABI-007, a Cremophor-free, protein-stabilized, nanoparticle formulation of paclitaxel. // Clin. cancer Res. - 2002. Vol. 8. - № 5. - P. 1038-1044.

53. Robins T., Plattner J. HIV protease inhibitors: their anti-HIV activity and potential role in treatment. // J. Acquir. Immune Defic. Syndr. United States. - 1993. - Vol. 6. -№ 2. - P. 162-170.

54. Fang M. et al. Covalent polymer functionalization of graphene nanosheets and mechanical properties of composites // J. Mater. Chem. - 2009. - Vol. 19. - № 38. - P. 7098-7105

55. Feng L.-L. et al. Near Infrared Graphene Quantum Dots-Based Two-Photon Nanoprobe for Direct Bioimaging of Endogenous Ascorbic Acid in Living Cells // Anal. Chem. - 2017. - Vol. 89. - № 7. - P. 4077-4084.

56. Abdelhalim A.O.E. et al. Functionalisation of graphene as a tool for developing nanomaterials with predefined properties // J. Mol. Liq. - 2022. - Vol. 348. - P. 118368.

57. Pei X. et al. PEGylated nano-graphene oxide as a nanocarrier for delivering mixed anticancer drugs to improve anticancer activity // Sci. Rep. - 2020. - Vol. 10. - № 1. - P. 1-15.

58. Wang H. et al. Chlorotoxin-conjugated graphene oxide for targeted delivery of an anticancer drug // Int. J. Nanomedicine. - 2014. - Vol. 9. - № 1. - P. 1433-1442.

59. De Jaeghere F. et al. Oral bioavailability of a poorly water-soluble HIV-1 protease inhibitor incorporated into pH-sensitive particles: effect of the particle size and nutritional

state. // J. Control. release. - 2000. - Vol. 68. - № 2. - P. 291-298.

60. Zhang L. et al. Functional graphene oxide as a nanocarrier for controlled loading and targeted delivery of mixed anticancer drugs // Small. - 2010. - Vol. 6. - № 4. - P. 537544.

61. Motlagh N. et al. Fluorescence properties of doxorubicin coupled carbon nanocarriers // Appl. Opt. - 2017. - Vol. 56. - P. 7498.

62. Yan J. et al. Antitumor Effect of GO-PEG-DOX Complex on EMT-6 Mouse Breast Cancer Cells. // Cancer Biother. Radiopharm. - 2018. - Vol. 33. - № 4. - P. 125-130.

63. Bullo S. et al. Dual Drugs Anticancer Nanoformulation using Graphene Oxide-PEG as Nanocarrier for Protocatechuic Acid and Chlorogenic Acid // Pharm. Res. Pharmaceutical Research. - 2019. - Vol. 36. - № 6. - P. 91.

64. Rosli N.F. et al. Graphene Oxide Nanoplatelets Potentiate Anticancer Effect of Cisplatin in Human Lung Cancer Cells // Langmuir. - 2019. - Vol. 35. - № 8. - P. 31763182.

65. Zhuang W. et al. Combined Adsorption and Covalent Linking of Paclitaxel on Functionalized Nano-Graphene Oxide for Inhibiting Cancer Cells // ACS Omega. - 2018. - Vol. 3. - № 2. - P. 2396-2405.

66. Wei L. et al. Functionalized Graphene Oxide as Drug Delivery Systems for Platinum Anticancer Drugs // J. Pharm. Sci. - 2021. - Vol. 110. - № 11. - P. 3631-3638.

67. Singh G. et al. Fabrication of chlorambucil loaded graphene- oxide nanocarrier and its application for improved antitumor activity. // Biomed. Pharmacother. - 2020. - Vol. 129. - P. 110443.

68. Yaghoubi F. et al. A functionalized graphene oxide with improved cytocompatibility for stimuli - responsive co - delivery of curcumin and doxorubicin in cancer treatment // Sci. Rep. Nature. - 2022. - P. 1-18.

69. Wei X. et al. Engineering of gemcitabine coated nano-graphene oxide sheets for efficient near-infrared radiation mediated in vivo lung cancer photothermal therapy // J. Photochem. Photobiol. - 2021. - Vol. 216. - P. 112125.

70. Zhang Y. et al. Synthesis and characterization of Tamoxifen citrate modified reduced graphene oxide nano sheets for breast cancer therapy // J. Photochem. Photobiol. 2018. - Vol. 180. - P. 68-71.

71. Palmieri V. et al. Graphene oxide touches blood: in vivo interactions of bio-

coronated 2D materials // Nanoscale Horiz. - 2019. - Vol. 4. - № 2. - P. 273-290.

72. Kumar I.A. et al. Development of triaminotriazine functionalized graphene oxide capped chitosan porous composite beads for nutrients remediation towards water purification // Int. J. Biol. Macromol. - 2021. - Vol. 170. - P. 13-23.

73. Z. Beiranvand, et. al. Functionalization of fullerene at room temperature : physicochemical properties. // RSC Advances. - 2016. - P. 112771-112775.

74. Hajizadeh Z. et al. Cu(II) immobilized on Fe3O4@HNTs-tetrazole (CFHT) nanocomposite: synthesis, characterization, investigation of its catalytic role for the 1,3 dipolar cycloaddition reaction, and antibacterial activity // RSC Adv. - 2020. - Vol. 10. -№ 44. - P. 26467-26478.

75. Kaszynski P. et al. Chirality of the trisubstituted nitrogen center - XRD, dynamic NMR, and DFT investigation of 1,2-dihydrobenzo[e][1,2,4]triazine derivatives // Tetrahedron. - 2017. - Vol. 73. - № 27. - P. 3823-3830.

76. Ostrovskii, V. A., Koldobskii, G. I., & Trifonov R.E. Tetrazoles // Compr. Heterocycl. Chem. III. Elsevier. - 2008. - P. 257-424.

77. Sarvary A., Maleki A. A review of syntheses of 1,5-disubstituted tetrazole derivatives // Mol. Divers. - 2015. - Vol. 19. - № 1. - P. 189-212.

78. Popova E.A., Trifonov R.E., Ostrovskii V.A. Tetrazoles for biomedicine // Russ. Chem. Rev. - 2019. - Vol. 88. - № 6. - P. 644 - 676.

79. Koren A.O., Gaponik P.N., Ostrovskii V.A. Reactions of Azolium cations. II [1]. Regioselective N2 alkylation of 5-aryltetrazoles with isopropyl alcohol in sulfuric acid media: Effect of electronic properties of aryl substituents on the reaction rate // Int. J. Chem. Kinet. - 1995. - Vol. 27. - № 9. - P. 919-924.

80. Ostrovskii V.A., Popova E.A., Trifonov R.E. Tetrazoles // Comprehensive Heterocyclic Chemistry IV, Elsevier. - 2022. - P. 182-232,

81. Abdelhalim A.O.E. et al. Graphene Oxide of Extra High Oxidation: A Wafer for Loading Guest Molecules // J. Phys. Chem. Lett. - 2021. - Vol. 12. - № 41. - P. 1001510024.

82. Nano Jaleel A., Shaikh Y.H., Arts S. Effect of Viscosity and Density of Substance on Dielectric Properties of Medicinal Compounds in Solution. // Nano Biomedicine and Engineering. - 2020. - Vol. 12. - №4. - P. 351-357.

83. Patrick G. An Introduction to Medicinal Chemistry. // Oxford University Press. -

2017. - P. 1-912.

84. Czechtizky W., Hamley P. Small molecule medicinal chemistry: strategies and technologies. // Wiley. - 2015. - P. 1-528.

85. Silverman R.B., Holladay M.W. The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action: Third Edition // Elsevier Inc. - 2015. - P. 1-517.

86. Kustov A. V. et al. The energetics of solvation and ion-ion interactions in prospidium chloride aqueous solutions // J. Mol. Liq. - 2018. - Vol. 263. - P. 49-52.

87. Akba§ H. et al. Synthesis, structural and thermal properties of the hexapyrrolidinocyclotriphosphazenes-based protic molten salts: Antiproliferative effects against HT29, HeLa, and C6 cancer cell lines // J. Mol. Liq. - 2017. - Vol. 230. - P. 482495.

88. Nikolaienko T.Y. Interaction of anticancer drug doxorubicin with sodium oleate bilayer: Insights from molecular dynamics simulations // J. Mol. Liq. - 2017. - Vol. 235.

- P. 31-43.

89. Jouyban A., Rahimpour E., Karimzadeh Z. A new correlative model to simulate the solubility of drugs in mono-solvent systems at various temperatures // J. Mol. Liq. - 2021.

- Vol. 343. - P. 117587.

90. Gurung J., Anjudikkal J., Pulikkal A.K. Amphiphilic drug-additive systems in aqueous and organic solvent-water mixed media: A comprehensive account on physicochemical properties // J. Mol. Liq. - 2020. - Vol. 318. - P. 114221.

91. Mondal M. et al. Investigation of molecular interactions insight into some biologically active amino acids and aqueous solutions of an anti-malarial drug by physicochemical and theoretical approach // J. Mol. Liq. - 2021. - Vol. 341. - P. 116933.

92. Alhumaydhi F.A. et al. Probing the interaction of memantine, an important Alzheimer's drug, with human serum albumin: In silico and in vitro approach // J. Mol. Liq. - 2021. - Vol. 340. - P. 116888.

93. Alam M.S., Ashokkumar B., Mohammed Siddiq A. The density, dynamic viscosity and kinematic viscosity of protic polar solvents (pure and mixed systems) studies: A theoretical insight of thermophysical properties // J. Mol. Liq. - 2018. - Vol. 251. - P. 458469.

94. Garca-Coln L.S., del Castillo L.F., Goldstein P. Theoretical basis for the Vogel-Fulcher-Tammann equation // Phys. Rev. B. - 1989. - Vol. 40. - № 10. - P. 7040-7044.

95. Ioffe B. V. Refractometry as a Method for the Physicochemical Analysis of Organic Systems // Russ. Chem. Rev. - 1960. - Vol. 29. - № 2. - P. 53-66.

96. Hodges G. et al. A comparison of log Kow (n - octanol - water partition coefficient) values for non - ionic , anionic , cationic and amphoteric surfactants determined using predictions and experimental methods // Environ. Sci. Eur. - 2019. - P. 1-18.

97. Tiejun C. et al. Computation of octanol-water partition coefficients by guiding an additive model with knowledge // J. Chem. Inf. Model. - 2007. - Vol. 47. - № 6. - P. 2140-2148.

98. Mikolaichuk O. V et al. A cytostatic drug from the class of triazine derivatives: Its properties in aqueous solutions, cytotoxicity, and therapeutic activity // J. Mol. Liq. - 2022. - Vol. 356. - P. 119043.

99. Zhivkova Z.D. Studies on drug-human serum albumin binding: the current state of the matter. // Curr. Pharm. - 2015. - Vol. 21. - № 14. - P. 1817-1830.

100. Herrera I., Winnik M.A. Differential binding models for isothermal titration calorimetry: Moving beyond the Wiseman isotherm // J. Phys. Chem. B. A - 2013. - Vol. 117. - № 29. - P. 8659-8672.

101. Bishop G.R., Chaires J.B. Characterization of DNA structures by circular dichroism. // Curr. Protoc. nucleic acid Chem. - 2003. - Chapter 7. - P. 7.11.

102. Topala T. et al. Experimental techniques employed in the study of metal complexes-DNA - interactions // FARMACIA. - 2014. - Vol. 62. - P. 6

103. Chang Y.M., Chen C.K.M., Hou M.H. Conformational changes in DNA upon ligand binding monitored by circular dichroism // Int. J. Mol. Sci. - 2012. - Vol. 13. - № 3. - P. 3394-3413.

104. Lando D.Y. et al. Comparative thermal and thermodynamic study of DNA chemically modified with antitumor drug cisplatin and its inactive analog transplatin // J. Inorg. Biochem. - 2014. - Vol. 137. - P. 85-93.

105. Wolfe A., Jr G.H.S., Meehan T. Polycyclic aromatic hydrocarbons physically intercalate into duplex regions of denatured DNA // Society. - 2002. - Vol. 26. - P. 63926396.

106. Moore C.M., Pendse D., Emberton M. Photodynamic therapy for prostate cancer -A review of current status and future promise // Nat Clin Pract Urol. - 2009. - Vol. 6. - № 1. - P. 18-30.

107. Dolmans D., Fukumura D., Jain R.K. Photodynamic therapy for cancer // Nature Reviews Cancer. - 2003. - Vol. 3. - № 5. - P. 380-387.

108. Reinhard A. et al. Photodynamic therapy as a new treatment modality for inflammatory and infectious conditions // Expert Review of Clinical Immunology. Expert Reviews Ltd., 2015. Vol. 11, № 5. P. 637-657.

109. Ji W. et al. The effect of Radachlorin® PDT in advanced NSCLC: A pilot study // Photodiagnosis Photodyn. Ther. 2013. Vol. 10, № 2. P. 120-126.

110. Kochneva E. V. et al. Photosensitizer Radachlorin®: Skin cancer PDT phase II clinical trials // Photodiagnosis Photodyn. Ther. - 2010. - Vol. 7. - № 4. - P. 258-267.

111. O. V. Mikolaichuk, et. al. Study of biocompatibility, cytotoxic activity in vitro of a tetrazole-containing derivative of 2-amino-4,6-di(aziridin-1-yl)-1,3,5-triazine. // Biochemical and Biophysical Research Communications. - 2022. - Vol. 629. - P. 176182.

112. Santoso JT, Lucci JA, Coleman RL, Schafer I, Hannigan EV. Saline, mannitol, and furosemide hydration in acute cisplatin nephrotoxicity: A randomized trial. Cancer Chemother Pharmacol. - 2003. - Vol. 52. - P. 13-18.

113. Marwa H. El-Wakil et. al. Discovery of a novel DNA binding agent via design and synthesis of new thiazole hybrids and fused 1,2,4-triazines as potential antitumor agents: Computational, spectrometric and in silico studies. // Bioorganic Chemistry. - 2019. - Vol. 90. - P. 103089,

114. Новиков В. Е., и др. Перспективы применения ингибиторов фактора адаптации к гипоксии в онкологии. // Вестник Смоленской государственной медицинской академии. - Том 14. - № 3. - 2015. - стр. 21-26.

115. Huang Z.R. et al. Development and evaluation of lipid nanoparticles for camptothecin delivery: A comparison of solid lipid nanoparticles, nanostructured lipid carriers, and lipid emulsion // Acta Pharmacol. Sin. - 2008. - Vol. 29. - № 9. P. 10941102.

116. Mikolaichuk O. V et al. Biocompatibility and bioactivity study of a cytostatic drug belonging to the group of alkylating agents of the triazine derivative class // J. Mol. Liq. -2021. - Vol. 343. - P. 117630.

117. V. V. Sharoyko, et. al. Novel non-covalent conjugate based on graphene oxide and alkylating agent from 1,3,5-triazine class // J. Mol. Liq. - 2023. - Vol. 372. - P. 121203.

118. Pochkaeva E.I. et al. Polythermal density and viscosity, nanoparticle size distribution, binding with human serum albumin and radical scavenging activity of the C60-L-arginine (C60(C6HdN4O2)8H8) aqueous solutions // J. Mol. Liq. - 2020. - Vol. 297. - P. 111915.

119. Ageev S. V. et al. Density, speed of sound, viscosity, refractive index, surface tension and solubility of C60[C(COOH)2]3 // J. Mol. Liq. - 2019. - Vol. 291. - P. 111256.

120. Serebryakov E.B. et al. Physico-chemical properties of C70-L-threonine bisadduct (C70(C4H9N02)2) aqueous solutions // J. Mol. Liq. - 2019. - Vol. 279. - P. 687-699.

121. Podolsky N.E. et al. Physico-chemical properties of C60(0H)22-24 water solutions: Density, viscosity, refraction index, isobaric heat capacity and antioxidant activity // J. Mol. Liq. - 2019. - Vol. 278. - P. 342-355.

122. Serebryakov E.B. et al. Physico-chemical properties of the C70-L-lysine aqueous solutions // J. Mol. Liq. - 2018. - Vol. 256. - P. 507-518.

123. Semenov K.N. et al. Physico-chemical properties of the C60-L-threonine water solutions // J. Mol. Liq. - 2017. - Vol. 242. - P. 940-950.

124. Sharoyko V. V. et al. Physicochemical study of water-soluble C60(0H)24 fullerenol // J. Mol. Liq. - 2020. - Vol. 311. - P. 113360.

125. Manyakina O.S. et al. Physico-chemical properties of the water-soluble C70-tris-malonic solutions // J. Mol. Liq. - 2015. - Vol. 211. - P. 487-493.

126. Shestopalova A.A. et al. Physico-chemical properties of the C60-arginine water solutions // J. Mol. Liq. - 2015. - Vol. 211. - P. 301-307.

127. Semenov K.N. et al. Physico-chemical properties of the C60-tris-malonic derivative water solutions // J. Mol. Liq. - 2015. - Vol. 201. - P. 50-58.

128. Semenov K.N. et al. Physico-chemical properties of the fullerenol-C70 water solutions // J. Mol. Liq. - 2015. - Vol. 202. - P. 1-8.

129. Sharoyko V. V. et al. Physicochemical investigation of water-soluble C60(C2NH402)4H4 (C60-Gly) adduct // J. Mol. Liq. - 2021. - Vol. 344. - P. 117658.

130. Abdelhalim A.O.E. et al. Graphene Oxide of Extra High Oxidation: A Wafer for Loading Guest Molecules // J. Phys. Chem. Lett. - 2021. - Vol. 12. - № 41. - P. 1001510024.

131. Abdelhalim A.O.E. et al. Synthesis, characterisation and biocompatibility of graphene-L-methionine nanomaterial // J. Mol. Liq. - 2020. Vol. 314. P. 113605.

132. Olive P.L. et al. Heterogeneity in Radiation-Induced DNA Damage and Repair in Tumor and Normal Cells Measured Using the "Comet" Assay // Radiat. Res. - 1990. -Vol. 122. - № 1. - P. 86.

133. Pochkaeva E.I., Anufrikov Y.A., Sharoyko V.V., Murin I.V., Faenkova V.P. Isothermal calorimetric titration of human serum albumin with the fullerene C60-L-arginine adduct // Russ. J. Gen. Chem. - 2019. - Vol. 89. - № 8. - P. 1731-1733.

Saint-Petersburg University

Manuscript copyright

Mikolaichuk Olga Vladislavovna

SYNTHESIS AND STUDY OF THE PROPERTIES OF NEW MATERIALS WITH ANTI-TUMOUR ACTIVITY BASED ON POLYNITROGENIC HETEROCYCLES

Scientific specialty 1.4.16. Medical chemistry The dissertation is submitted for the degree of Candidate of Chemical Sciences

Academic supervisors: Doctor of Biological Sciences, Sharoyko Vladimir Vladimirovich Doctor of Chemical Sciences, Semenov Konstantin Nikolaevich

Saint Petersburg 2023

145 CONTENTS

LIST OF ABBREVIATIONS.....................................................................................................147

INTRODUCTION.......................................................................................................................148

CHAPTER 1. LITERATURE REVIEW.....................................................................................153

1. METHODS FOR THE SYNTHESIS OF TRI-SUBSTITUTED 1,3,5-TRIAZINES WITH ANTI-TUMOUR ACTIVITY........................................................153

1.1. Cyclisation reactions......................................................................................153

1.2. Reactions of nucleophilic substitution of chlorine atoms in 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine derivatives.........................................................................159

1.3. Preparation of hybrid polynitrogenous heterocyclic derivatives of

1,3,5-triazine....................................................................................................................165

CHAPTER 2. NANOFORM OF DRUGS..................................................................................172

CHAPTER 3. RESULTS AND DISCUSSION..........................................................................178

3.1. Synthesis of compound 1.57..........................................................................178

3.2. Synthesis of hybrid triazinyltetrazole............................................................179

3.2.1. Synthesis of starting tetrazole-containing derivatives................................179

3.3. Synthesis and identification of the GO-1.57 conjugate.................................182

3.4. Study of the physicochemical properties of aqueous solutions of compound 1.57................................................................................................................187

3.4.1. Density of aqueous solutions of compound 1.57........................................188

3.4.2. Viscosity of aqueous solutions of the compound 1.57...............................190

3.4.3. Refractions of aqueous solutions of the compound 1.57............................193

3.4.4. Mathematical description of T-C dependences of density, viscosity and refractive index of aqueous solutions of compound 1.57................................................196

3.4.5. Solubility of compound 1.57 in water........................................................199

3.4.6. Distribution of compound 1.57 in the «-octanol - water system...............199

3.4.7. Study of the stability of aqueous solutions of compound 1.57 by NMR spectroscopy..........................................................................................................200

3.5. Biocompatibility of compound 1.57..............................................................203

3.5.1. Haemocompatibility...................................................................................203

3.5.2. Study of binding to DNA and HSA............................................................206

3.5.3. Antioxidant activity....................................................................................213

3.5.4. Genotoxicity of compound 1.57.................................................................219

3.5.5. Cytotoxicity of compound 1.57..................................................................222

3.5.6. Mitochondrial potential..............................................................................223

3.6. Study of the physicochemical properties of aqueous solutions of compound 3.6..................................................................................................................224

3.6.1. Stability of compound 3.6 in aqueous solutions.........................................224

3.7. Compound 3.6 biocompatibility study..........................................................224

3.7.1. Haemocompatibility study..........................................................................224

3.7.2. Study of the binding of compound 3.6 to DNA and HSA.........................227

3.7.3. Antiradical activity of compound 3.6.........................................................234

3.7.4. Compound 3.6 cytotoxicity........................................................................237

3.7.5. Effect of compound 3.6 on HIF-1a stabilisation........................................238

3.8. Biocompatibility of non-covalent conjugate based on GO and compound 1.57................................................................................................................239

3.8.1. Haemocompatibility study..........................................................................239

3.8.2. Antioxidant activity of GO-1.57 conjugate................................................242

3.8.3. Genotoxicity...............................................................................................245

3.8.4. Study of thermodynamic parameters of GO-1.57 binding to HSA by calorimetric method ......................................................................................................... 248

3.8.5. Cytotoxicity of the GO-1.57 conjugate......................................................248

3.8.6. Study of the mechanisms of endocytosis of the GO-1.57 conjugate..........249

CHAPTER 4. EXPERIMENTAL PART....................................................................................251

4.1 Synthesis of 1,3,5-triazine derivatives...............................................................253

4.2 Synthesis of tetrazole derivatives......................................................................255

4.3 Synthesis of triazinyltetrazoles.......................................................................257

4.4 Study of the stability of compounds 1.57 and 3.6..........................................258

4.5 GO synthesis...................................................................................................259

4.6 Synthesis of GO conjugate with 2,4,6-trisubstituted-1,3,5-triazine 1.57.......259

4.7 Biocompatibility study...................................................................................260

MAIN RESULTS AND CONCLUSIONS.................................................................................269

BIBLIOGRAPHY.......................................................................................................................270

147

LIST OF ABBREVIATIONS

DNA — Deoxyribonucleic acid

RNA — Ribonucleic acid

IC50 — Half maximal inhibition concentration

DMF — N, N-Dimethylformamide

Glu 30 — Glutamic acid

HIV-1 — Human immunodeficiency virus

GO — Graphene oxide

HSA — Human serum albumin

PBS — Phosphate-buffered saline

THF — Tetrahydrofuran

148

INTRODUCTION

Relevance of the research topic

To date, drug anticancer therapy is represented by three areas: chemotherapy, targeted therapy and immunotherapy. Chemotherapy is a non-specific treatment that uses chemicals that inhibit cell proliferation by affecting cellular DNA, RNA, receptors, metabolism, and cytoskeletal components [1]. Due to the difficulty of obtaining targeted and immune drugs (this fact significantly increases their cost), chemotherapy is still a relevant approach, since cytostatics are low molecular weight chemicals that are much easier to synthesise. The main disadvantage of chemotherapy is the lack of specificity of cytostatics to tumour cells, which leads to the development of a wide range of toxic side effects, among which are increased fatigue, alopecia, aplastic anaemia and thrombocytopenia, immunodeficiency, neuropathy, development of skin ulcers, impaired cognitive and reproductive functions, diarrhoea, nausea, loss of appetite. It is worth noting the development of resistance to therapy, which necessitates the search for new chemicals with cytostatic properties.

Thus, the problem of the synthesis of new biologically active substances and the creation of new drugs on their basis for the treatment of oncological diseases is one of the most important tasks.

Purpose and tasks of the work

The aim of the work is to create new promising materials based on 1,3,5-triazines and tetrazoles, as well as graphene oxide to reduce systemic toxicity and regulate bioactivity.

To achieve this goal, the following tasks were set:

1) creation of new promising biologically active compounds of the 1,3,5-triazine series with antitumour activity;

2) synthesis of a nanoform of the leader compound with graphene oxide;

3) study of the physicochemical properties of the obtained compounds of the 1,3,5-triazine series;

4) in vitro testing of obtained compounds and conjugate.

Scientific novelty and practical significance

1. Synthesis of new heterocyclic compounds based on 1,3,5-triazine, including those containing both triazine and tetrazolyl fragments, has been carried out.

2. For the first time, a non-covalent conjugate containing graphene oxide enriched with oxygen-containing functional groups and a cytostatic preparation based on 1,3,5-triazine (the degree of loading of the cytostatic drug is 68 %) was synthesised and characterised.

3. A comprehensive study of the physicochemical properties of aqueous solutions of a cytostatic drug based on 1,3,5-triazine was carried out, including the study of stability, solubility, distribution coefficient, density, and viscosity.

4. The biocompatibility of the synthesised materials was studied: haemocompatibility, antioxidant properties, genotoxicity.

5. The cytotoxicity of the obtained compounds was studied on various cell lines. Reliability and approbation of research results

The results were published in six papers in peer-reviewed scientific journals indexed in the Scopus and Web of Science databases and presented at six international and all-Russian scientific conferences.

List of publications

Mikolaichuk O., Sharoyko V., Popova E., Protas A., Fonin A., et. al. Biocompatibility and bioactivity study of a cytostatic drug belonging to the group of alkylating agents of the triazine derivative class // J. Mol. Liq. - 2021. - Vol. 343. - P. 117630.

2. Mikolaichuk O., Popova E., Protas A., Rakipov I., Nerukh D., et. al. A cytostatic drug from the class of triazine derivatives: Its properties in aqueous solutions, cytotoxicity, and therapeutic activity // J. Mol. Liq. - 2022. - Vol. 356. - P. 119043.

3. Mikolaichuk O., Sharoyko V., Popova E., Protas A., Fonin A., et. al. Synthesis, study of interaction with DNA and antitumour activity of a new tetrazole-containing derivative of 2-amino-4,6-di(aziridin-1-yl)-1,3,5-triazine // Russian Chemical Bulletin. - 2022. - No. 5. - 1050.

4. Molchanov O., Maistrenko D., Granov D., Vasina L., Popova A., Vasilevskaya I., Mikolaichuk O., et. al. Biomarkers and potential targets for immune and cellular therapy in triple negative breast cancer // Cell Ther Transplant. - 2022. -Vol. 11(2). - P. 18.

5. Mikolaichuk O., Popova E., Protas A., Shemchuk O., Vasina L. Study of biocompatibility, cytotoxic activity in vitro of a tetrazole-containing derivative of 2-amino-4,6-di(aziridin-1-yl)-1,3,5-triazine // Biochem Biophys Res Commun. // 2022. - Vol. 629. - P. 176.

6. Sharoyko V., Mikolaichuk O., Shemchuk O., Abdelhalim A. O. E., Potanin A., et. al. Novel non-covalent conjugate based on graphene oxide and alkylating agent from 1,3,5-triazine class // J. Mol. Liq. - 2023. - Vol. 372. - P. 121203.

List of conferences

1. Proceedings of the 5th Russian Conference on Medicinal Chemistry with international participation 'MedChem-Russia 2021' October 5-8, 2021. O. V. Mikolaichuk, A. V. Protas, E. A. Popova, A. M. Malkova, V. A. Ostrovsky, A. A. Bogdanova, Yu. N. Pavlyukova, N. T. Shmanyova, Yu. A. Nashchekina, V. V. Sharoyko, K. N. Semenov 'Derivatives of 5-phenyltetrazol-2-ylacetic acid as key reagents in the synthesis of biologically active substances exhibiting antitumour activity', Volgograd, Russian Federation, 2021.

2. Proceedings of the XXIV International Medical and Biological Conference of Young Researchers 'Fundamental Science and Clinical Medicine - Man and His Health', April 2021. O. V. Mikolaichuk, A. V. Protas, G. O. Yuryev, K. N. Semenov 'Study of the interaction of a 1,3,5-triazine derivative with DNA', St. Petersburg, Russian Federation, 2021.

3. Materials of the LXXXII scientific and practical conference with international participation 'Topical issues of experimental and clinical medicine — 2021' April 24, 2021. O. V. Mikolaichuk, A. V. Protas, E. A. Popova 'Synthesis and study of the properties of new hybrid heterocyclic systems based on 1,3,5-triazines', St. Petersburg, Russian Federation, 2021.

4. Proceedings of the All-Russian Scientific Conference 'Markovnikov Readings: Organic Chemistry from Markovnikov to the Present Day' October 8-11, 2021. O. V. Mikolaichuk, A. V. Protas, E. A. Popova, A. A. Spiridonova, O. Ya. Volkova, A. M. Malkova, V. V. Sharoyko, K. N. Semenov 'Synthesis, structure and biological activity of some 1,3,5-triazine derivatives', Sochi, Russian Federation, 2021.

5. Proceedings of the All-Russian Congress 'KOST-2021' on the chemistry of heterocyclic compounds October 12-16, 2021. O. V. Mikolaichuk, A. V. Protas, E. A. Popova, A. A.

Batyrenko, A. M. Malkova, V. V. Sharoyko, K. N. Semenov 'Synthesis and study of the biological activity of new derivatives 1 ,3,5-triazine', Sochi, Russian Federation, 2021. 6. Materials of the XXVIII All-Russian Conference of Young Scientists with International Participation 'Actual Problems of Biomedicine — 2022' March 24-26, 2022. O. V. Mikolaichuk, E. A. Popova, A. V. Protas, M. D. Luttsev, A. A. Potanin, A. M. Malkova ' Study of the biocompatibility and bioactivity of a new tetrazole-containing derivative of 2-amino-4,6 -di(aziridin-1-yl)-1,3,5-triazine', St. Petersburg, Russian Federation, 2022. The work was supported financially by the Ministry of Health of the Russian Federation (government assignment on the topic 'Creation and evaluation of the antitumour activity of conjugates of non-annulated 1,3,5-triazinyltetrazoles with targeted delivery molecules to microenvironment tumour cells targets'). Provisions for defense

1. Method for the synthesis of the cytostatic drug 5-((4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino)-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-5-yl)methanol and its tetrazolated derivative ((5-((4,6-di(aziridin-1 -yl)- 1,3,5-triazin-2-yl)amino)-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-5-yl)methyl-2-(5-phenyl-2H-tetrazol-2-yl)acetate).

2. Data on the synthesis and identification of graphene oxide conjugate with a cytostatic preparation based on 1,3,5-triazine.

3. Study of the properties of aqueous solutions of 5-((4,6-dichloro-1,3,5-triazin-2-yl)amino)-2,2-dimethyl-1,3-dioxan-5-yl)methanol and its tetrazolated analogue.

4. Results of the study of biocompatibility and biological activity of 1,3,5-triazine derivatives and a conjugate based on it.

Thesis structure

The dissertation work is presented on 137 pages and consists of a list of used abbreviations, an introduction, a literature review, a discussion of the results, conclusions, an experimental part and a list of references. The list of cited literature includes 133 titles. The dissertation contains 23 tables, 63 figures and 31 schemes.

The personal contribution of the author consisted in the synthesis and identification of derivatives of 1,3,5-triazine and triazinyltetrazoles, graphene oxide and conjugate based on it, in the study of biocompatibility and biological activity of the obtained compounds and conjugate, discussion of experimental results and preparation of scientific publications.

Acknowledgment

The author expresses his gratitude to everyone with whom the appearance of this work was connected, first of all to his supervisors, Dr Sci., Associate Professor, Head of the Department of General and Bioorganic Chemistry, Pavlov First St. Petersburg State Medical University Semenov Konstantin Nikolaevich and Dr Sci., Associate Professor, Professor of the Department Sharoyko Vladimir Vladimirovich, the staff of the department: Dr Sci., Professor Popova Elena Alexandrovna, PhD, Associate Professor Protas Alexandra Vladimirovna, Shemchuk Olga Sergeevna. The author thanks the staff of the Department of Solid-State Chemistry, Institute of Chemistry, St. Petersburg State University, for organising the work at a high level and creating a creative atmosphere, headed by Dr Sci., Professor Murin Igor Vasilyevich. The author thanks the staff of the Department of Chemistry and Technology of Organic Nitrogen Compounds of the St. Petersburg State Technical University, Dr Sci., Professor Ostrovsky Vladimir Aronovich for advice and scientific consultations.

The author also expresses his gratitude to I. V. Kornyakov for help with experiments with X-ray diffraction data, M. D. Lutsev for help in conducting biocompatibility studies. The author also expresses his gratitude to all the staff of the Resource Centre of Saint-Petersburg University for recording NMR, IR, mass spectra and phisical and chemical study.

CHAPTER 1. LITERATURE REVIEW 1. METHODS FOR THE SYNTHESIS OF TRI-SUBSTITUTED 1,3,5-TRIAZINES WITH ANTI-TUMOUR ACTIVITY

From a wide range of substituted triazines, 1,3,5-triazines stand out due to their unique properties [2]. Many compounds containing 1,3,5-triazine in their structure exhibit a wide range of biological activity, which stimulates the development of new methods and original approaches to the synthesis of trisubstituted triazines [3-5]. This literature review considers the most important methods for the synthesis of substituted 1,3,5-triazines. The main synthetic approaches to the preparation of substituted 1,3,5-triazines are the cyclisation reactions of aldehydes, nitriles, biguanides and the reactions of successive substitution of chlorine atoms in cyanuric chloride.

1.1. Cyclisation reactions 1.1.1. Obtaining trisubstituted 1,3,5-triazines by the cyclisation reaction of biguanide derivatives

Arylbiguanides can participate in two types of heterocyclisation reactions with the formation of triazines at fragment "A" (with the participation of aromatic acid esters, esters of monochloroacetic acid) and at fragment "B" (with the participation of acetoacetic ester and P-diketones) with the formation of pyrimidine derivatives (Fig. 1.1).

Thus, in [6], the interaction of esters (1.1-1.3) with the corresponding biguanide hydrochlorides in a solution of sodium methoxide in methanol (MeONa/MeOH) at reflux for 45 h gave the series of 2-[(4-amino-6-R2-1,3,5-triazin-2-yl)methylthio]-iV-(1-R1-imidazolidin-2-ylidene)-4-chloro-5-methylbenzenesulphonamides (1.4-1.6; Scheme 1.1).

H

NH NH b

A —-

Fig. 1.1. General formula of arylbiguanides.

rco«,

H „ ,

N^ HN NH

NYN HN /

Me-^^^S^. N , HN

C> 0 R --» N „

° MeONa/MeOH T ^O

1.1-1.3 reflux/ 4S b a 1.4-1.6

1.1.1.4, R1 = C6H5CH^, R2 =

1.2.1.5, R1 = 4F3C-C6H4CH2-, R2 = ^

1.3.1.6,R1=4F3C-C6H4CH2-,R2= Cl^f ^

The effect of compounds 1.4-1.6 on the viability of three tumour cell lines HCT-116 (human intestinal carcinoma), MCF-7 (human breast ductal adenocarcinoma), and HeLa (human cervical adenocarcinoma), as well as cells of non-tumour origin — HaCaT (keratinocytes) was studied using the MTT test. The authors of [6] determined IC50 after 72 h of cell incubation; cisplatin was used as the reference drug. MTT results: compound 1.4 (R1 = benzyl, R2 = indoline) — IC50 = 6 ^M for HCT-116, IC50 = 7 ^M for MCF-7; compound 1.5 (R1 = 4-trifluoromethylbenzyl, R2 = 4-benzylpiperazine) — IC50 = 5 ¡¡M for HCT-116, IC50 = 8 ¡M for HeLa; compound 1.6 (R1 = 4-trifluoromethylbenzyl, R2 = chlorine) — IC 50 = 5 ¡M for HCT-116, IC50 = 6 ¡M for MCF-7. The IC50 values of compounds 1.4-1.6 with respect to the HaCaT cell line were 33, 22, and 21 ¡M, respectively.

In another work, 1,3,5-triazine derivatives of metformin (1.7-1.9) were synthesised by condensation between biguanide and various esters [7]. The authors carried out the synthesis without isolation and purification of intermediates using biguanide hydrochloride, sodium methoxide (NaOMe) in methanol (Scheme 1.2).

Hf>

ether, NaOMe, MeOH reflux

Next, the in vitro cytotoxic activity of compounds 1.7-1.9 against two human intestinal carcinoma cell lines (HCT-116 and SW620) was evaluated. All synthesised 1,3,5-triazine derivatives showed comparable or higher cytotoxicity compared to cisplatin. Compound 1.7 showed cytotoxicity with IC50 = 59.1 ± 1.5 ¡M for the SW620 cell line and 59.4 ±1.7 ¡M for the HCT-116 cell line. On the contrary, the cytostatic effect of compounds 1.8 and 1.9 was very low and amounted to no more than 5-20 %. Further, in [7] a nanoform of compound 1.7 encapsulated in calcium citrate nanoparticles (1.7a) was synthesised (Scheme 1.3).

The authors proposed a synthesis method using the binary solvent EtOH-water. Addition of 1,3,5-triazine 1.7 to an aqueous ethanol solution of calcium chloride and sodium citrate in air with vigorous stirring at room temperature led to the formation of nanoparticles 1.7a [6].

When developing nanomaterials used for targeted drug delivery, it is important to study the controlled release of a drug under physiological conditions. Both anaerobic and aerobic glycolysis lead to the accumulation of H+ in the extracellular space of tumours, causing pronounced acidification of the intercellular fluid in the tumour microenvironment [8], so the release of compound 1.7 was studied in an acidic medium at pH 5.0 and 3.0 and in a neutral medium (pH 7.4) for comparison. An in vitro study showed that 1.7a nanoparticles responded to changes in the pH of the medium with controlled release of triazine 1.7. After 24 h, 80.0 %, 48.8 %, and 30.0 % of compound 1.7 were released at pH 3.0, pH 5.0, and pH 7.4, respectively.

Scheme 1.3

J™2

1.7

1.7a

Another successful example of the synthesis of biologically active 1,3,5-triazines from biguanide derivatives is the study by Kothayer et al. [9]. The synthesis of 4-amino-6-(arylamino)-1,3,5-triazine-2-carbohydrazide derivatives was carried out in two stages from arylbiguanide hydrochloride salts. At the first stage, salt 1.8 was neutralised using sodium methoxide in methanol, followed by its reaction with dimethyl oxalate in boiling methanol. This led to the formation of intermediate methyl 4-amino-6-(arylamino)-1,3,5-triazine-2-carboxylates (1.9-1.11) in 83-92% yield after recrystallisation from methanol. The reaction of intermediates (1.9-1.11) with hydrazine hydrate in refluxing ethanol gave the target 2,4,6-trisubstituted-1,3,5-triazines (1.12-1.14) (Scheme 1.4).

Scheme 1.4

-a

H

NH,

/O^A / CK N

W ^ | phenylhydrazine, |

T T _2_► N^N BtOHAcOH. N^N

ANANH2 NaOMe,CH3OH A A A A

H reflux HN N NH, HN N NH,

CI

U ...

1.12, R = H;

1.13, R = OMe;

1.8 1.9-1.11 1.12-1.14 1.14, R = 4-C1.

The study of the cytotoxicity of the synthesised 4-amino-6-(arylamino)-1,3,5-triazine-2-carbohydrazides (1.12-1.14) in the concentration range of 0-125 ^M was carried out on seven human tumour cell lines: ovarian adenocarcinoma (OV90), ovarian carcinomas (A2780), lung adenocarcinomas (A549), lung carcinomas (H1299), breast adenocarcinomas (MCF-7 and MDA-MB-231), and colon adenocarcinomas (HT29). Summarised data with IC50 values are presented in Table 1.1. Analysis of data on the cytotoxicity of compounds 1.12-1.14 shows that their activity is comparable to that of compound 1.15, which is an inhibitor of the ubiquitin-conjugating enzyme E2B (Rad6B; Fig. 1.2). Rad6B activates the cell adhesion protein P-catenin, which is responsible for the malignant progression of breast cancer cells.

Table 1.1. IC50 values (^M) of substituted 4-amino-6-(arylamino)-1,3,5-triazine-2-carbohydrazide derivatives.

No. OV90 A2780 MCF-7 MDA-MB231 A549 H1299 HT-29

1.12 75.0 7.3 5.9 2.6 7.8 65.0 3.3

1.13 80.0 14.7 6.2 7.6 5.2 65.0 5.4

1.14 85.0 36.6 8.8 24.6 7.5 30.0 4.6

1.15 60.0 7.8 5.0 4.6 7.2 45.0 8.3

N-%

A A

HN N NH2 6 „

Fig. 1.2. Chemical structure of an inhibitor of the ubiquitin-conjugating enzyme E2B

(Rad6B).

Interesting data on the cytotoxic activity of the triazine cycle are described in [10], where methods for obtaining derivatives of 2-(4-amino-6-(4-(2-chlorophenyl)piperazin-1-yl)-1,3,5- triazin-2-yl)acetonitrile 1.16 as a precursor in the synthesis of amino-4-{[4-(2-R'-phenyl)piperazino]-1,3,5-triazin-6-yl}acetonitrile 1.17. Target compounds were obtained by the interaction of jV-carbamimidoyl-4-(2-chlorophenyl)piperazine-1-carboximidamide and ethylcyanoacetate in methanol solution at room temperature.

The intermediate 2-amino-4-(4-arylpiperazino)-1,3,5-triazine 1.16, coupled directly to the cyanovinyl pharmacophore, was used for the subsequent reaction with 5-nitro-2-furaldehyde in a triethylamine-catalysed Knoevenagel condensation reaction to give (E)-2-(4-amino-6-(4-phenylpiperazin-1-yl)-1,3,5-triazin-2-yl)-3-(5-nitrofuran-2-yl)acrylonitrile 1.17 with a yield of 57 % (Scheme 1.5).

CI

|l 1.2-cyanoguanidine

n C

aoguanidine / I BuOH _ /r\ /-\ NH CNCH2COOC2H5

—-—- { VN N^; nh2———► _ N ^

■CN

O -2. NaOH ' -¡^5-~ _ A A

L in ^ ^ HN-^ CI N -

^ HC1 NH /k^O

Et3N EtOH, reflux

0

H

9

0,N

02N,

X

N N

Screening for cytotoxic activity was performed on 10 human tumour cell lines: cervical adenocarcinoma of the cervix (SISO), oesophageal squamous cell carcinoma (KYSE-520, KYSE-70, KYSE-510), large cell lung carcinoma (LCLC-103H), bladder carcinoma (RT-4), urinary tract carcinoma (RT-112 and RT-5637), pancreatic carcinoma (YAPC and DAN-G). Among the triazine derivatives, the highest cytotoxic activity was found for compound 1.17, which contains chlorine in the aryl ring (IC50 1.66 ^M for RT-4, 1.05 |iM for RT-112, 0.92 |iM for RT-5637, 0.92 |iM for KYSE-70, 0.45 |iM for KYSE-510, 0.95 |iM for KYSE-520, 0.72 |iM for YAPC, 0.86 |iM for DAN-G, 0.90 |iM for SISO and 0.89 ^M for LCLC-103H), which indicates that the introduction of halogen substituents into the structure of 1,3,5-triazines is promising.

Junaid et al. used microwave synthesis to obtain 6,V2-diaryl-1,3,5-triazine-2,4-diamines (Scheme 1.6) [11].

nh2

HN^NH i.EtQH,HCl,140°C N ^N + NH2-R2 + | 2. NaOH, 140°C N N

III jj

N 11

1.18, Rj = 4-Me2NC6H4, R2 = 2-FC6H4

1.19, Rj = 4-OMeC6H4, R2 = 4-MeC6H4

The reaction between cyanoguanidine, aromatic aldehydes and arylamines in the presence of hydrochloric acid under the action of microwave irradiation led to the formation of Dimroth rearrangement products, which in turn undergo spontaneous dehydrogenation and aromatisation to give 6,V2-diaryl-1,3,5-triazine-2, 4-diamines (1.18 and 1.19) (Scheme 1.6).

The resulting compounds were tested for antiproliferative activity against the human prostate carcinoma cell line DU145 (C = 10 ^M). Compounds 1.18 and 1.19 were shown to inhibit cell proliferation by more than 45 %.

1.2. Reactions of nucleophilic substitution of chlorine atoms in 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine derivatives

A method is considered, which consists in the successive nucleophilic substitution of chlorine atoms in the presence of a base (Scheme 1.7). The starting compound is 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine (cyanuric chloride, TXT).

Scheme 1.7

Cl Cl Nu2 Nii2

N-^N Nu , N-^N _N»_^ N^N N" , N^N

II J 0°C N J room temperature M I t>80°C II J

C1A N CI Cl^N Nu, Cl' N Nut Nu3/^N Nu,

TXT Nu = nucleophile

Despite the wide distribution of the presented synthesis method, it has significant drawbacks, mainly associated with the harsh conditions of the nucleophilic substitution of the third chlorine atom and low yields of the trisubstituted product [12,13].

1.2.1. Reactions of 2,4,6-trichloro-1,3,5-triazine with amines of various nature

The first chlorine substitution product in TXT was V2,V2,V4,V4,V6,V6-hexamethyl-1,3,5-triazine-2,4,6-triamine (altretamine), which was approved by the FDA under the brand name Hexalen® for the treatment of ovarian cancer [14,15]. The target trisubstituted TXT was synthesised by dimethylamination of TXT with an aqueous solution of 40 % dimethylamine and potassium hydroxide in 1,4-dioxane in one step to obtain altretamine (1.20) in high yield (Scheme 1.8) [16,17].

Scheme 1.8

I I

Cl. N. XI

"Y Y nh(ch3)2 - Y Y

NYN 1,4-Dioxane ' NYN CI ^

1.20

In animals and humans, altretamine undergoes oxidative V-demethylation to form hydroxymethyl derivatives. It has been shown that it is hydroxymethylmelamines that are responsible for the cytotoxic and antitumour activity of altretamine [18]. Altretamine acts as an alkylating agent, but the detailed mechanism of its antitumour activity is unknown. Altretamine presumably damages tumour cells due to the formation of formaldehyde as a product of V-demethylation with the participation of cytochrome P450. When taken orally, altretamine is metabolised in the liver, forming mainly mono- and didemethylated metabolites. In tumour cells, sequential reactions of demethylation and release of formaldehyde occur in situ. It has been shown that altretamine is able to covalently interact with guanine and cytosine residues that are part of DNA [19]. Altretamine after oral administration is well absorbed and undergoes rapid demethylation in the liver, causing a significant decrease in the concentration of the active substance in plasma. In subsequent studies in patients with recurrent ovarian cancer after Hexalen® monotherapy for a 14, 21 or 28-day cycle, 6 complete clinical responses and 2 partial responses were achieved with an overall response rate of 18%, with a duration of 2 to 36 months. In some patients, tumour regression was accompanied by an improvement in general condition [20].

The authors of [21] successfully performed the synthesis of thiourea derivatives, for example, compound 1.22 (without isolation of intermediate products) in yields up to 71 %.

The reaction of TXT with two equivalents of substituted amines was carried out with the addition of NaOH, preventing acidification of the reaction mixture to give the disubstituted product 6-chloro-iV2,iV4-diphenyl-1,3,5-triazine-2,4-diamine 1.21 (Scheme 1.9).

Scheme 1.9

. n^N ^ _. fYVY

cl^>a:lnaoh'40°c hn^/n-^ 120-135°c, k2co3 l^j n n ^

0h hn nh2

I U. I ,2,

At the next stage, the authors carried out the synthesis of target hybrid compounds based on the reaction between compound 1.22, acetophenone, and ethyl 3-oxobutanoate using Bi(NO3)3 (Scheme 1.10).

Scheme 1.10

h .. H a^ oVrS:

OXrO

Bi(N03)3, reflux, EtOH

HN.___NH2

Y

s 1.22

Cytotoxic activity of ethyl 1-(4,6-bis(phenylamino)-1,3,5-triazin-2-yl)-6-methyl-4-phenyl-2-thioxo-1,2,3,4-tetrahydropyrimidine-5-carboxylate 1.23 was evaluated in vitro with the cell lines: HeLa, MCF-7, HL-60 (human promyelocytic leukaemia cell), HepG2 (human hepatocellular carcinoma cell line) and MCF-12A (ductal-derived epithelial cell line human mammary gland) by the MTT method. Cisplatin was used as a comparator. The results showed that compound 1.23 exhibited moderate activity against cell lines HeLa (IC50 = 96.6 ± 0.5 pM), MCF-7 (IC50 = 87.4 ± 0.8 pM), HL-60 (IC50 = 83 .7 ± 0.3 pM), however, it does not show activity against the MCF-12A cell line, which indicates the selectivity of the cytotoxic effect of the resulting 1,3,5-triazine derivative.

Continuing to consider options for the synthesis of biologically active 1,3,5-triazines, we would like to highlight a study on the synthesis of 2,4-diamino-6-aryl-1,3,5-triazines, which were obtained using solid-phase synthesis [22]. The different amination reactivity of the monoaryl-substituted triazines results in the resin-bound amine selectively displacing chlorine in the crude reaction mixture to give triazine 1.24. The third chlorine

atom is then replaced by an amine in DMF at high temperature (Scheme 1.11). Resin cleavage was carried out by treatment with 50 % trifluoroacetic acid in dichloromethane. Thus, 2,4-diamino-6-aryl-1,3,5-triazines 1.25-1.27.

Scheme 1.11

O-c

Cl N^N

MgBr

GK

Cl

1 DMF T T

Q A A^. Q A A^. ^ A A

R 1 i ^ J"®' H I

^2 R2

>

1.25, R, = C6HS, R2 = 4-CH3C5H4, R3, R4 = ^ V-j ;

1.26, Rt = C6H5, R2 = 4-CH3C6H4, R3, = Ht/ N-j;