Синтез и исследования биологической активности новых потенциальных блокаторов рецептора NR3C4 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Брылев, Максим Игоревич

• Брылев, Максим Игоревич
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Брылев, Максим Игоревич

ОГЛАВЛЕНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Рецептор NR3C4: строение, свойства, механизмы действия

1.2 Роль рецептора NR3C4 в возникновении и развитии различных физиологических нарушений

1.3 Компьютерное моделирование потенциальных лиганд биологических мишеней. Основные этапы

1.3.1 Настройка трехмерной библиотеки структурных формул

1.3.2 Методы компьютерного моделирования

1.3.3 Оценочные функции

1.3.4 Обработка результатов докинга

1.3.5 Сравнительный анализ инструментов докинга

1.4 Применение микроволнового излучения в синтезе биологически активных соединений

Глава 2 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Компьютерное моделирование соединений -потенциальных блокаторов рецептора NR3C4

2.2 Синтез наиболее перспективных по расчетным оценкам соединений

2.3 Физико-химический анализ синтезированных соединений

2.4 Определение кинетических закономерностей получения замещенных акридин-9( 10Н)-онов в концентрированной серной кислоте в условиях микроволнового излучения

2.5 Исследования биологической активности синтезированных соединений

2.5.1 Исследование аффинности испытуемых веществ к рецептору NR3C4 с помощью тест-системы PolarScreen Green

2.5.2 Исследования цитотоксичности испытуемых соединений по отношению к клеткам AR-UAS-bla GripTite™ 293

2.5.3 Исследования антагонистической активности испытуемых соединений к рецептору NR3C4 клеток AR-

UAS-bla GripTite™ 293

Глава 3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1 Ацилированные амиды L-и D-аминокислот

3.2 Ацилированные сложные эфиры L-и D-аминокислот

3.3 N-ацилированные аминоакридин-9(10Н)-оны

3.4 Ацилированные по N-концу пептиды

3.5 Очистки синтезированных соединений

3.6 Физико-химический анализ синтезированных веществ

3.7 Кинетические исследования получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в среде концентрированной серной кислоты в условиях микроволнового излучения

3.8 Порядок проведения исследований биологической активности и цитотоксичности соединений -потенциальных блокаторов рецептора NR3C4

3.8.1 Исследование аффинности синтезированных соединений к рецептору NR3C4 с помощью тест-системы PolarScreen Green

3.8.2 Культивирование клеточной культуры AR-UAS-bla GripTite™ 293

3.8.3 Определение неспецифической цитотоксичности испытуемых соединений по отношению к клеткам AR-UAS-bla GripTite™ 293 методом флуоресцентной микроскопии

3.8.4 Исследования антагонистической активности

испытуемых соединений

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Приложение 1 Исследование аффинности испытуемых веществ к рецептору NR3C4 с помощью набора PolarScreen Androgen Receptor Competitor Assay, Green Protocol

Приложение 2 Протокол культивирования клеточной культуры AR-

UAS-bla GripTite™ 293

Приложение 3 Протокол определения неспецифической цитотоксичности испытуемых соединений по отношению к клеткам AR-UAS-bla GripTite™ 293

Приложение 4 Протокол инкубирования испытуемых веществ с культурой AR-UAS-bla GripTite™ 293 и регистрации флуоресценции с помощью конфокальной микроскопии

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВС - виртуальный скрининг

ВЭЖХ-МС - высокоэффективная жидкостная хроматография-масс-

спектрометрия

Да - дальтон

ДНК - дезоксиринонуклеиновая кислота

ДМСО - диметилсульфоксид

ДФАК - дифениламин-2-карбоновая кислота

ЛГРГ - лютеинизирующий гормон рилизинг-гормона

МАБ - максимальная андрогенная блокада

МВИ - микроволновое излучение

МГц - мегагерц

м.д. - миллионная доля

мкМ - микромолярный

нм - нанометр

РПЖ - рак предстательной железы

СВЧ - сверхвысокая частота

СПКЯ - синдром поликистозных яичников

ТСХ - тонкослойная хроматография

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

1XNN - белок-лигандный комплекс рецептора NR3C4

ADME - absorption (всасывание), distribution (распределение),

metabolism (метаболизм), excretion (выделение)

ADME/T - absorption (всасывание), distribution (распределение), metabolism (метаболизм), excretion (выделение), toxicity (токсичность)

AF - активационная функция

вое

DBD

DCC DIEA DMAP DMF

EDCIHC1

FMOC HEPES

HOBt LBD

LDS0

logP

NR3C4

PDB

PMF PBS

- бутилоксикарбонил

- ДНК-связывающий домен

- дициклогексилкарбодиимид

- К-этил->1,1Ч[-диизопропиламин

- 4-диметиламинопиридин

- диметилформамид -гидрохлорид 1-этил-(3'-(3-диметиламино)пропил)карбодиимида

- флуоренилметилоксикарбонил-

- 2-[4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1 -ил]этилсульфоновая кислота

- 1 -гидроксибензотриазол

- лиганд-связывающий домен

- средняя доза вещества, вызывающая гибель половины членов испытуемой группы

- логарифм коэффициента липофильности

- nuclear receptor subfamily 3, group С, member 4 - ядерный рецептор подсемейства 3, группа С, элемент

- база данных структур белок-лигандных комплексов Protein Data Bank

- потенциал средней силы

- фосфатно-солевой буфер

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и исследования биологической активности новых потенциальных блокаторов рецептора NR3C4»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследлования

Рак предстательной железы относится к наиболее часто выявляемым опухолям среди онкологических заболеваний у мужчин. В структуре онкологической заболеваемости ряда стран рак простаты занимает 2-3-е место после рака легкого и желудка. В России заболеваемость раком простаты занимает 1-ое место по уровню прироста среди онкологических заболеваний у мужчин [1-6].

По данным многочисленных исследований, среди всех гормонально зависимых опухолей рак предстательной железы является наиболее чувствительным к гормональной терапии. Одним из основных видов гормонотерапии в лечении рака предстательной железы является применение антагонистов рецептора NR3C4 (nuclear receptor subfamily 3, group С, member 4). Они блокируют связывание мужских половых гормонов с клеточными рецепторами, препятствуя проявлению биологических эффектов данных гормонов в клетках предстательной железы, тем самым, останавливая рост опухоли [7].

В настоящий момент одним из наиболее популярных антагонистов рецептора, применяемых для лечения РПЖ является стероидный препарат -ципротерона ацетат, обладающий, помимо целевого действия, рядом побочных.

В связи с этим, разработка эффективных препаратов, практически не обладающих побочными действиями стероидных аналогов, представляется важным этапом в создании лекарственных средств нового поколения.

Современные методы компьютерного моделирования активных соединений, основанные на информации о строении и биологических свойствах мишени, позволяют провести расчеты, направленные на получение структур соединений - потенциальных блокаторов рецептора NR3C4, с их последующим синтезом и исследованием биологической активности.

Степень разработанности темы исследования

Применение новых рациональных методов поиска активных структур, основанных на информации о строении и свойствах биологических мишеней, делает возможным получение высокоэффективных биологически активных соединений с целевым действием. На данный момент существуют методические подходы, позволяющие создать на базе компьютерного моделирования активные лиганды данных мишеней на основе модифицированных аминокислот и пептидов, с последующим проведением компьютерного моделирования биоактивности рассчитанных соединений, их синтезом и подтверждением фармакологической активности [8-9].

Разработкой потенциальных препаратов-антагонистов рецептора NR3C4 с применением методов компьютерного моделирования занимались такие исследователи, как P. Marwah, S. Yamamoto, С. Guo, Е.Е. Parent, H.-Y. Tian, Т. Andrieu, L.C. Henderson [8-13].

Несмотря на исследования вышеперечисленных авторов, сохраняется проблема поиска новых блокаторов рецептора NR3C4, вследствие дороговизны их получения и применения в терапии стероидных препаратов (цитопротерона ацетат, спиронолактон, мегестрола ацетат, медроксипрогесторона ацетат), прием которых приводит к снижению либидо, развитию эректильной дисфункции, оказывает токсическое действие на печень.. В связи с этим, поиск нестероидных антагонистов рецептора NR3C4 на основе модифицированных аминокислот и пептидов обуславливает актуальность диссертационного исследования.

Цели и задачи исследования

Цель - исследование и получение биологически активных веществ -блокаторов рецептора NR3C4.

Для достижения цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Подобрать группы соединений, среди которых будет проводиться компьютерное моделирование потенциальных антагонистов рецептора

nr3c4.

2. Провести компьютерное моделирование потенциальных антагонистов рецептора nr3c4.

3. Осуществить синтез наиболее перспективных соединений — блокаторов рецептора NR3C4.

4. Установить строение синтезированных соединений с помощью комплекса современных физико-химических методов (спектроскопия ЯМР *Н, масс-спектрометрия и ПК-спектроскопия).

5. Определить основные кинетические характеристики процесса получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в условиях микроволнового излучения и показать возможность применения микроволновой активации в химическом синтезе.

6. Оценить биологическую активность in vitro синтезированных соединений к рецептору NR3C4 с целью отбора потенциальных лекарственных средств.

Научная новизна работы

Научно обоснован выбор групп соединений для проведения компьютерного моделирования потенциальных антагонистов рецептора

nr3c4.

Впервые проведено компьютерное моделирование потенциальных блокаторов рецептора NR3C4 среди соединений, относящихся к четырем группам: ацилированные амиды L- и D-аминокислот, ацилированные сложные эфиры L- и D-аминокислот, ацилированные аминоакридин-9(10Н)-оны, ацилированные по N-концу ди- и трипептиды.

Синтезированы 32 (в том числе, 20 ранее не описанных) целевых соединения, структура которых подтверждена методами спектроскопии ЯМР *Н, масс-спектрометрии и ИК-спектроскопии.

Впервые определены основные кинетические характеристики , (константы скорости, энергия активации) процесса получения замещенных акридин-9(10Н)-онов в условиях микроволнового излучения.

Научно обоснован и экспериментально доказан выбор 3-х эффективных и безопасных потенциальных антагонистов рецептора N1^4 нового поколения.

Практическая значимость полученных результатов

С помощью методов компьютерного моделирования и органического синтеза получены 32 (в том числе, 20 ранее не описанных) соединения -потенциальных антагониста рецептора МК3С4. Среди синтезированных соединений проведен анализ результатов биоскрининга (аффинности, цитотоксичности и антагонистической активности к рецептору КЕ1зС4). Выявлены 3 наиболее аффинных и малотоксичных антагониста рецептора М1зС4, рекомендованных для дальнейшего углубленного изучения с целью создания лекарственных средств на их основе.

Методология и методы исследования

Диссертационная работа выполнена на базе лаборатории биологически активных соединений НИИ фармации ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова Минздрава России.

При выполнении работы были использованы методы компьютерного моделирования степени связывания веществ с рецептором НК3С4, оценки АБМЕ/Т-свойств, органического синтеза, флеш- и обращеннофазовой хроматографии, тонкослойной хроматографии (ТСХ), денситометрии, спектроскопии ЯМР 1Н, масс-спектрометрии, ИК-спектроскопии, поляризационной спектрофлуориметрии, флуоресцентной и конфокальной микроскопии.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности.

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности «14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пункту 1 и 2 паспорта «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Положения, выносимые на защиту

Выбранные группы соединений для проведения компьютерного моделирования.

Смоделированные методом докинга соединения - потенциальные антагонисты рецептора N1^3С4 и их расчетные характеристики.

Разработка методов синтеза соединений, обладающих наилучшими расчетными характеристиками.

Результаты исследования синтезированных соединений физико-химическими методами.

Методы и результаты исследования кинетических закономерностей получения производных акридин-9(10Н)-она в условиях микроволнового излучения.

Методы и результаты исследования биологической активности синтезированных соединений к рецептору М1зС4.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных в ходе работы результатов обеспечивалась определенным набором физико-химических и биологических методов исследования.

Расчетный поиск потенциальных антагонистов рецептора М13С4 проводили с использованием современных методов компьютерного моделирования с помощью программного комплекса «Алгокомб». Структуру синтезированных соединений и содержание целевого вещества подтверждали

методами спектроскопии ЯМР 'Н, масс-спектрометрии, ИК-спектроскопии. Результаты биологического исследования получены на достаточно большом количестве повторностей.

Статистическая обработка результатов исследования проводилась с использованием параметрического t-критерия Стьюдента,

непараметрического U-критерия Манна-Уитни, критерия Фишера, пробит-анализа выживаемости. Обработка данных производилась с помощью пакетов программ Microsoft Excel ХР, STATISTICA 6.0, BioStat 2009. Статистически значимыми расценивались эффекты при р<0,05.

Основные положения диссертации были представлены и доложены на VI Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Уфа, 2013), Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации» (Санкт-Петербург, 2013), Всероссийской медико-биологической научной конференции молодых учёных с международным участием «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2014), Международном молодежном научном форуме «Ломоносов» (Москва, 2014), научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии» (Москва, 2014).

Публикации

По тематике диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 5 статей в изданиях, включенных в перечень ведущих периодических изданий ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, результатов и их обсуждения, экспериментальной части, выводов и списка литературы, 4 приложений. Работа изложена на 135 страницах, включает 15 рисунков и 17 таблиц. Список литературы содержит 209 источников.

Во введении обоснована актуальность работы, определены цели и задачи исследования, отражены научная новизна полученных результатов, практическая ценность исследования, положения, выносимые на защиту, и приведена общая характеристика работы.

В первой главе диссертации проведен обзор литературных данных относительно строения и функций рецептора М^зС,), а также его роли в возникновении и развитии различных патологических нарушений. Рассмотрены основные препараты, применяемые в медицинской практике для блокирования импульса на уровне рецепторов предстательной железы. Отмечены основные фармакологические эффекты и побочные реакции вследствие приема данных препаратов.

Рассмотрены принципы компьютерного моделирования лигандов биологических мишеней. Перечислены основные этапы построения модели белок-лигандного комплекса (докинга).

Показаны особенности протекания процессов получения биологически активных соединений в условиях микроволнового излучения (МВИ). Приведены примеры основных классов химических реакций способных активироваться при помощи МВИ. Показаны преимущества использования этого источника энергии по сравнению с термическими способами нагрева в реакциях получения акридин-9(10Н)-нов.

Вторая глава посвящена обсуждению результатов проведенных исследований по поиску новых антагонистов рецептора N1^0}. Она включает: применение методов компьютерного моделирования, последующий синтез соединений, показавших наилучшие расчетные характеристики, выявление у синтезированных соединений биологической активности.

В третьей главе представлены методики синтеза и выделения рассчитанных соединений, а также методики проведения физико-химических исследований и определения основных кинетических параметров получения соединений акридинового ряда в условиях МВИ.

Показаны основные этапы проведения биотестирования синтезированных соединений. Далее представлены выводы по проделанной работе и список литературы. В приложениях к диссертационной работе приложены протоколы скрининга биологической активности испытуемых соединений (приложения 1 -4).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Рецептор NR3C4: строение, свойства, механизмы действия

Рецептор NR3C4 (nuclear receptor subfamily 3, group С, member 4), также известный как рецептор андрогенов, является типом ядерных рецепторов [15]. Это самый большой белок из данного семейства рецепторов [16-19].

Ген рецептора NR3C4 (около 90 килобайс, кб) был впервые клонирован в 1988 г. [17, 20]. Транскрипт рецептора после сплайсинга и процессинга размером около 11 кб оснований содержит открытую рамку считывания размером около 2,8 кб [21]. Соответствующий нормальный белок состоит из одной полипептидной цепи и содержит 919 аминокислотиых остатков [17].

Существует две изоформы рецептора NR3C4: изоформа А, в которой отсутствуют первые 187 аминокислот (87 кДа) и изоформа В с полной длиной аминокислотной последовательности (110 кДа). В молекуле рецептора выделяют четыре основных структурных домена (пептидных фрагмента) [22-23].

Как и другие ядерные рецепторы, рецепторы NR3C4 имеет модульную структуру и состоят из следующих функциональных областей [24]:

1. А/В или N-концевой домен, NTD [25] содержит около 559 аминокислот. Это наиболее вариабельный по длине и последовательности участок [22, 26]. В данном домене условно выделяют следующие более мелкие участки: последовательность 141 - 337 (или 101 - 370) образует участок с так называемой активационной функцией-1 (AF-1) [22, 27]. Она обусловливает основную транскрипционную активность рецептора [22, 28]; участок AF-5 (последовательность 360-485) обуславливает транскрипционную активность не связаную с лигандом; участок (последовательность 1-36) отвечает за димеризацию (FXXLF, где F - Phe, L -Leu и X - любой аминокислотный остаток), и совместно с участком (последовательность 370-494) осуществляет внутримолекулярное взаимодействие с лиганд-связывающим домен, LBD [29-30];

2. С или ДНК-связывающий домен, DBD (последовательность 559624);

3. D или шарнирная область (аминокислотные остатки 608-625), соединяющая DBD и LBD; важна для ядерной локализации и связывания с репрессорами [31];

4. Е - лиганд-связывающий домен, LBD, включающий в себя:

AF-2, проявляющего активность в присутствии связанного агониста и внутримолекулярно взаимодействующего с FXXLF N-концевого домена или с коактиваторами, содержащими LXXLL или FXXFL [30];

5. F или С-концевой домен очень консервативен. Замена одной аминокислоты в нем часто приводит к существенному снижению функциональной активности рецептора [22].

Функциональные области рецептора NR3C4 представлены на рисунке

1.1.1:

NTO DBD LBO

188 S

AR-A N- hAR

-t

624 706 670 1 »19 I

Г

А/В I CD Е J F

AF5 AF2

NTD DBD LBD

559 624 706 B70 919

AR-B N- hAR

■Hc

j AJB f CD E|F

AFI AF5 AF2

Рисунок 1.1.1 - Функциональные области рецептора NR3C4

Рецепторы NR3C4 модулируют важные нормальные клеточные процессы и действуют как транскрипционные факторы в контроле роста клеток, дифференциации, пролиферации и апоптоза в клетках-мишенях для андрогенов не только у мужчин, но и у женщин [32]. Ген рецептора находится на высоко-консервативном участке X хромосомы млекопитающих - Xqll-12 [16, 33].

Для взаимодействия комплекса рецептор-лиганд с ДНК и инициации биологического ответа необходимо участие целого ряда белков-корегуляторов и факторов транскрипции [20]. Обнаружены как не специфические регуляторы действия - общие для стероидных гормонов и общие при механизмах транскрипции, так и специфические регуляторы для отдельного типа стероидов. Некоторые корегуляторы являются отдельными идентичными белками [19], а некоторые - образуют целое семейство белков-кофакторов [34]. Корегуляторы делятся на стимуляторы активности рецепторов стероидных гормонов (коактиваторы) и на ингибиторы (корепрессоры) [19]. Показано in vitro, что сигнальная система рецептора NR3C4 человека активируется с участием ростовых факторов (фактор роста фибробластов, эпидермальный фактор роста) [21, 35]. Корегуляторные белки, по-видимому, не связываются со специфическими последовательностями ДНК, а действуют как адаптеры (модуляторы) между доменами молекулы рецептора и общим транскрипционным комплексом, образуя мультибелковые комплексы и модулируя функции рецептора при их трансактивации [19, 21].

Основными предположительными механизмами действия лигандов на клетку-мишень являются:

1. Диффузия тестостерона в клетку благодаря наличию положительного градиента концентрации [35-36];

2. Превращение тестостерона под действием 5а-редуктазы (5а-Р) в 5а-дигидротестостерон [32, 35-36];

3. Связывание лиганда (тестостерона или дигидротестостерона) с определенным участком молекулы рецептора NR3C4, который в цитоплазме находится в составе мультибелкового комплекса, приводит к ряду физико-химических преобразований этого мультибелкового комплекса и самой молекулы рецептора; конформационные изменения белковой цепи рецептора, его диссоциация из мультибелкового комплекса, гомодимеризация, демаскировка определенного(ых) участка(ов) молекулы

рецептора, которая в комплексе с лигандом становится более компактной и стабильной. Все эти сложные внутримолекулярные преобразования получили название «активация рецептора» [21];

4. Перенос (транслокация) активированной формы рецептора в ядро [35-36];

5. Связывание активированной формы рецептора с определенными акцепторными (гормончувствительными элементами - АЯЕб) участками ДНК [23, 35-36];

6. Реализация специфического ответа - изменение экспрессии определенных генов и синтеза специфических белков (ферментов, рецепторов и т.п.) [21, 35-36].

В настоящее время нет единого мнения относительно того, находится ли рецептор КЯ3С4 в цитоплазме клетки-мишени в виде апобелка (белок без простетической группы) в составе комплекса с белками теплового шока (Нзр90, Нзр70) и другими шаперонами (р23, р60, РКВ506) [37]; перемещаются ли они в ядро после связывания со стероидом или в нормальных условиях рецептор КЯ3С4 постоянно находится в ядре, а дигидротестостерон из цитоплазмы проникает в ядро, где и происходит «активация» комплекса рецептор-дигидротестостерон. Мнения исследователей отличаются существенно:

1. При физиологических условиях не только основная часть рецептора М13С4 сконцентрирована в клеточном ядре, но и в отсутствие дигидротестостерона остается там [38];

2. Свободные рецепторы М13С4 могут находиться и в цитоплазме, и в ядре; присутствие лиганда и его связывание с рецепторами "№13С4 регулирует распределение рецептора между цитоплазмой и ядром [23, 39].

1.2. Роль рецептора NRзC4 в возникновении и развитии различных физиологических нарушений

Половые гормоны стероидного строения играют важную роль в жизнедеятельности организма. Они обеспечивают мужскую половую дифференциацию, определяют функцию яичек, простаты, семенников у мужчин [40-41]. Показано их участие в созревании костной ткани, регуляции секреции гоиадотропинов и синтеза липидов различной плотности, выработке (3-эндорфинов, факторов роста, инсулина. Наряду с анаболическим эффектом андрогены регулируют либидо и половую потенцию, стимулируют функцию сальных желез и волосяных фолликулов [42-43].

Избыток мужских половых гормонов вызывает различные физиологические нарушения. Наиболее частым эндокринным нарушением у женщин считается гиперандрогения. Под термином «гиперандрогения» подразумевается симптомокомплекс нарушений в сфере специфических и метаболических эффектов андрогенов в женском организме, обусловленный патологией биосинтеза, транспорта и метаболизма андрогенных гормонов [44].

Самой распространенной причиной повышенного количества мужских половых гормонов является адреногенитальный синдром (врождённая гиперплазия коры надпочечников) [45]. Он характеризуется выработкой надпочечниками целого ряда жизненно важных гормонов, в том числе глюкокортикоидов. Наибольшее количество андрогенов в яичниках под действием специального фермента превращается в глюкокортикоиды. Выработка ферментов программируется генетически. Если же женщина рождается с дефектом фермента, способствующего этому превращению, то мужские половые гормоны не преобразуются в глюкокортикоиды, а накапливаются, оказывая действие на органы и ткани.

Опухоль надпочечников является еще одной причиной гиперанодрогении, так как при увеличении количества клеток,

вырабатывающих андрогены, значительно возрастает количество этих гормонов. К причинам гиперандрогении можно отнести и увеличение выработки мужских половых гормонов в яичниках, а также опухоли яичников, состоящие из клеток, продуцирующих андрогены.

Увеличение количества мужских половых гормонов может быть связано с патологией других эндокринных органов, например гипофиза -железы, регулирующей работу всех желез внутренней секреции.

Проявления гиперандрогении (гирсутизм и акне) могут возникать при повышенной чувствительности кожи к мужскому половому гормону — тестостерону. В этом случае, в отличие от ранее перечисленных, количество мужских половых гормонов в крови не изменяется [46-48].

При повышении продукции андрогенов или изменении их баланса в сторону активных фракций у женщин наблюдаются признаки дефеминизации (обратное развитие женских половых органов) и даже маскулинизации (развитие мужских половых признаков). Нередко стертые формы гиперандрогении играют важную роль в генезе бесплодия и невынашивания беременности [41].

Избыток андрогенов приводит к развитию гиперандрогенной дермопатии, которая проявляется в виде себореи, гирсутизма, алопеции и акне, резистентной к обычному противоугревому лечению [41, 49-50].

При гиперандрогении в яичниках могут возникать необратимые изменения, приводящие к образованию мелких кист и формированию плотной капсулы вокруг яичников. При повышенной выработке мужских половых гормонов в яичниках или надпочечниках может возникнуть ановуляция, что в дальнейшем может привести к бесплодию [51].

Гиперандрогения, возникшая вследствие нарушения работы гипофиза, часто сопровождается ожирением [52].

При гиперандрогении часто нарушается чувствительность тканей к инсулину. Уровень инсулина в крови при этом состоянии повышается и возрастает риск развития сахарного диабета [46].

Основные физиологические нарушения, связанные с гиперандрогением, приведены в таблице 1.2.1.

Таблица 1.2.1.

Физиологические нарушения при гиперандрогении

Косметические дефекты Гинекологические заболевания Нарушение обмена веществ

Акне Себорея Гирсутизм Аллопеция Нарушение менструального цикла Ановуляция Бесплодие Гиперплазия эндометрия Синдром поликистозных яичников (СПКЯ) Инсулинорезистентность (сахарный диабет II типа) Ожирение Гиперлипопротеинемия

Лечение заболеваний, которые сопровождаются симптомами андрогенизации у женщин, определяется видом патологии, локализацией процесса, степенью тяжести, возрастом и т.п. Терапия должна быть комплексной, охватывать все звенья и проявления. Так, например, этиопатогенетическая терапия включает в себя удаление опухолей, прекращение ятрогенного влияния, подавление повышенного синтеза андрогенов, лечение синдрома и болезни Кушинга, гипотиреоза, резекцию или каутеризацию яичников, назначение препаратов с антиандрогенным действием и др. [53-54]. Неотъемлемой частью терапии при стертых и выраженных симптомах андрогенизации является применение антиандрогенов с целью редукции этих симптомов.

Наряду с развитием мужских вторичных половых признаков мужские половые гормоны отвечают за рост, развитие и функциональную активность предстательной железы [55]. Экспериментальные исследования убедительно доказали их стимулирующую роль в механизмах роста злокачественных новообразований [56].

В большинстве экономически развитых стран мира (США, Швеции) рак предстательной железы занимает первое место в структуре

онкологической патологии [57]. В Европе рак простаты находится на втором месте по смертности от онкологических заболеваний у мужчин [58]. В России заболеваемость раком простаты занимает 1-ое место по уровню прироста среди онкологических заболеваний у мужчин [1-2].

Рецепторы МК3С4 традиционно рассматриваются среди факторов, вовлеченных в процесс развития рака предстательной железы [20]. Основные стероидные гормоны (тестостерон и дигидротестостерон), связываясь с рецептором внутри клеток предстательной железы, активируют биологические эффекты данных гормонов в клетках, стимулируя тем самым рост опухоли [7].

Основным методом лечения при раке предстательной железы является гормональная терапия, так как среди всех гормонально зависимых опухолей рак простаты является наиболее чувствительным к данному виду терапии [59]. Основные принципы гормональной терапии при РПЖ заключаются либо в подавлении продукции тестостерона в организме мужчины, либо в предотвращении его воздействия на ткани простаты. Методами, применяемыми для этой цели, являются хирургическое удаление яичек, введение эстрогенов кастрационных уровней, действующих по механизму отрицательной обратной связи на гипофиз, применение агонистов лютеинизирующего гормона рилизинг-гормона (ЛГРГ) и использование препаратов антиандрогенного действия с целью блокирования андрогенного импульса на уровне рецепторов МКзС4 предстательной железы [60].

Антиандрогены в стандартно применяемых дозировках не вызывают медикаментозной кастрации, их действие оказывает неполную блокаду андрогенов и уровни тестостерона в сыворотке остаются нормальными или повышенными. В этой связи антиандрогены чаще всего используются в сочетании с хирургической кастрацией или с аналогами ЛГРГ. Подобная схема лечения получила название максимальной андрогенной блокады (МАБ) [59].

Отдельные исследования и данные мета-анализа [61] подтверждают

умеренное увеличение общей выживаемости (при раке простаты) при использовании комбинированного лечения, включающего препараты из группы антиандрогенов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Брылев, Максим Игоревич, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Чиссов, В.И. Состояние онкологической помощи населению России в 2010 году / В.И.Чиссов, В.В. Старинский, Г.В. Петрова. - М.: ФГУ «МНИОИ им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития России», 2011. - 112 с.

2. Березин, П.Г. Октреотид-лонг в лечении больных кастрационно-рефрактерным раком предстательной железы / П.Г. Березин, В.В. Милованов, А.А. Иванников // Онкология. Журнал им. П.А. Герцена. - 2013. - № 1. - С. 4750.

3. Boccardo, F. Bicalutamide monotherapy versus flutamide plus goserelin in prostate cancer patients: results of an Italian Prostate Cancer Project study / F. Boccardo, A. Rubagotti, M. Barichello // J. Clin. Oncol. - 1999. - № 17. - P. 20272038.

4. Бухаркин, Б.В. Гормональное лечение местнораспространенного и диссеменированного рака предстательной железы / Б.В. Бухаркин; под. ред. Б.П. Матвеева. - М.: Клиническая онкоурология, 2003. - 563 с.

5. Калинин, С.А. Лекарственная терапия гормонорезистентного рака предстательной железы: автореф. дис. ... кан. мед. наук: 14.00.14 / Калинин Сергей Анатольневич - М., 2005. - 27 с.

6. Алексеев, Б.Я. Гормональная терапия в комбинированном лечении рака предстательной железы / Б.Я. Алексеев // Вместе против рака. - 2004. - № 3.-С. 35-38.

7. Kinkade, C.W. Targeting AKT/mTOR and ERK МАРК signaling inhibits hormone-refractory prostate cancer in a preclinical mouse model / C.W. Kinkade, M. Castillo-Martin // J. Clin. Invest. - 2008. - № 9. - P. 3051-3064.

8. Marwah, P. Ci9-Steroids as androgen receptor modulators: Design, discovery, and structure-activity relationship of new steroidal androgen receptor antagonists / P. Marwah, A. Marwah, H.A. Lardy, H. Miyamoto, C. Chang // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2006. - Vol. 14 (17). - P. 5933-5947.

9. Yamamoto, S. Design, synthesis, and biological evaluation of 3-aryl-3-hydroxy-l-phenylpyrrolidine derivatives as novel androgen receptor antagonists / S. Yamamoto, H. Kobayashi, T. Kaku, K. Aikawa, T. Hara, M. Yamaoka, N. Kanzaki, A. Hasuoka, A. Baba, M. Ito // Bioorganic & Medicinal Chemistry. - 2013. - Vol. 21 (l).-P. 70-83.

10. Guo, C. Design of oxobenzimidazoles and oxindoles as novel androgen receptor antagonists / C. Guo, M. Pairish, A. Linton, S. Kephart, M. Ornelas, A. Nagata, B. Burke, L. Dong, J. Engebretsen, A.N. Fanjul // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2012. - Vol. 22 (7). - P. 2572-2578.

11. Parent, E.E. Synthesis and biological evaluation of a fluorine-18-labeled nonsteroidal androgen receptor antagonist, N-(3-[18F]fluoro-4-nitronaphthyl)-cis-5-norbornene-endo-2,3-dicarboxylic imide / E.E. Parent, C.S. Dence, T.L. Sharp, M.J. Welch, J.A. Katzenellenbogen // Nuclear Medicine and Biology. - 2006. - Vol. 33 (5).-P. 615-624.

12. Tian, H.-Y. A bufadienolide derived androgen receptor antagonist with inhibitory activities against prostate cancer cells / H.-Y. Tian, X.-F. Yuan, L. Jin, J. Li, C. Luo, W.-C. Ye, R.-W. Jiang // Chemico-Biological Interactions. - 2014. - Vol. 207.-P. 16-22.

13. Andrieu, T. A novel steroidal antiandrogen targeting wild type and mutant androgen receptors / T. Andrieu, R. Bertolini, S.E. Nichols, R. Setoud, F.J. Frey, M.E. Baker, B.M. Frey // Biochemical Pharmacology. - 2011. - Vol. 82 (11). -P. 1651-1662.

14. Ramensky, V. A novel approach to local similarity of protein binding sites substantially improves computational drug design results / V. Ramensky, A. Sobol, N. Zaitseva, A. Rubinov, V. Zosimov // Proteins. - 2007. - Vol. 69 (2). - P. 349-357.

15. Lu, N.Z. The pharmacology and classification of the nuclear receptor superfamily: glucocorticoid, mineralocorticoid, progesterone, and androgen receptors / N.Z. Lu, S.E. Wardell, K.L. Burnstein // Pharmacol. Rev. - 2006. - Vol. 58 (4). -P. 782-797.

16. Hiipakka, R.A. Molecular mechanism of androgen action / R.A. Hiipakka, S. Liao // Trends in EndocrinoI.Metab. - 1998. - Vol. 9. - P. 317-324.

17. Lubahn, D.B. The human androgen receptor: complementary deoxyribonucleic acid cloning, sequence analysis and gene expression in prostate / D.B. Lubahn, D.R. Joseph, M. Sar // Mol. Endocrinology. - 1988. - Vol. 2. - P. 1265-1271.

18. Смирнов, A.H. Ядерные рецепторы: номенклатура, лиганды, механизмы влияния на экспрессию генов / А.Н. Смирнов // Биохимия. - 2002. -Т. 67. - С. 1157-1181.

19. Aranda, A. Nuclear hormone receptors and gene expression / A. Aranda, A. Pascual // Physiol. Rev. - 2001. - Vol. 81. - P. 1269-1304.

20. Heinlein, C.A. Androgen receptor coregulators: an overview / C.A. Heinlein, C. Chang // Endocr.Rev. - 2002. - Vol. 23. - P. 175 - 200.

21. Mora, G.R. Activation of androgen receptor. Prostate cancer. Biology, genetics, and the new therapeutics / G.R. Mora, D.J. Tindall; eds. L.W.K. Chung. -Totowa: Humana Press, 2001. - P. 219-239.

22. Febbo, P.O. Androgen receptor polymorphism and cancer prostate risk. Prostate cancer. Biology, genetics, and the new therapeutics / P.O. Febbo, P.W. Kantoff; eds. L.W.K. Chung. - Totowa: Humana Press, 2001. - P. 95-110.

23. Roy, A.K. Androgen receptor: structural domains and function; dynamics after ligand-receptor interaction / A.K. Roy, R.K. Tyagi, C.S. Song // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2001. - Vol. 949. - P. 44-57.

24. Brinkmann AO, Klaasen P, Kuiper GG, et al. (1989). "Structure and function of the androgen receptor". Urol. Res. 17 (2): 87-93.

25. Jenster, G. Identification of two transcription activation units in the N-terminal domain of the human androgen receptor / G. Jenster, H.A. van der Korput, J. Trapman, A.O. Brinkmann // J. Biol. Chem. - 1995. - Vol. 270. № 13. - P. 73417346.

26. Gaughan, L. Tip60 and hi stone deacetylase 1 regulate androgen receptor activity through changes to the acetylation status of the receptor / L. Gaughan, I.R. Logan, S. Cook // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P. 25904-25913.

27. He, B. Electrostatic modulation in steroid receptor recruitment of LXXLL and FXXLF motifs / В. He, E.M. Wilson // Mol. Cell Biol. - 2003. - Vol. 23.-P. 2135-2150.

28. Christiaens, K. Characterization of the two coactivator-interacting surfaces of the androgen receptor and their relative role in transcriptional control / K. Christiaens, C. Sevan, L. Callewaert // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P. 4923049237.

29. Berrevoets, C.A. Functional interactions of the AF-2 activation domain core region of the human androgen receptor with the amino-terminal domain and with the transcriptional coactivator TIF2 (transcriptional intermediary factor2) / C.A. Berrevoets, P. Doesburg, K. Steketee, J. Trapman, A.O. Brinkmann // Mol. Endocrinol.-1998.-Vol. 12. № 8. P. 1172-1183.

30. Dubbink, H.J. Distinct recognition modes of FXXLF and LXXLL motifs by the androgen receptor / H.J. Dubbink, КЮ Hersmus, C.S. Verma, PI.A. van der Korput, C.A.Berrevoets, J. van Tol, A.C. Ziel-van der Made, A.O. Brinkmann, A.C. Pike, J. Trapman // Mol. Endocrinol. - 2004. - Vol. 18. № 9. - P. 2132-2150.

31. Kaku, N. Characterization of Nuclear Import of the Domain-Specific Androgen Receptor in Association with the Importin a/(3 and Ran-Guanosine 5'-Triphosphate Systems / N. Kaku, K.I. Matsuda, A. Tsujimura, M. Kawata // Endocrinology. - 2008. - Vol. 149. № 8. - P. 3960-3969.

32. Дегтярь, В.Т. Специфические свойства рецепторов андрогенов человека / В.Т. Дегтярь, Н.Е. Кушлинский // Сибирский онкологический журнал. - 2005. - № 3. - С.58-67.

33. Brown, T.R. Human androgen insensitivity syndrome / T.R. Brown // J. Androl. - 1995. - № 4. - P. 299-303.

34. Collingwood, T.N. Nuclear receptors: coactivators, corepressors and chromatin remodeling in the control of transcription / T.N. Collingwood, F.D. Umw, A.P. Wolffs // J. Mol. Endocrinol. - 1999. - Vol. 23. - P. 255-275.

35. Farnsworth, W.E. Roles of estrogen and SHBG in prostate physiology / W.E. Farnsworth //The Prostate. - 1996. - Vol. 28. - P. 17-23.

36. Griffith, K. Androgens, androgen receptors, antiandrogens and the treatment of prostate cancer / K. Griffith, M.S. Morton, R.I. Nicholson // Eur. Urology. - 1997. - Vol. 32. - P. 24-40.

37. Rao, M.A. RanBPM, a nuclear protein that interacts with and regulates transcriptional activity of androgen receptor and glucocorticoid receptor / M.A. Rao, H. Cheng, A.N. Quayle // J. Biol. Chem. - 2002. - Vol. 277. - P. 48020-48027.

38. Roy, A.K. Regulation of androgen action / Roy, Y. Lavrovsky, C.S. Song, S. Chen, M.H. Jung, N.K. Velu, B.Y. Bi, B. Chatterjee // Vitam. Horm. - 1999. -№ 55.-P. 309-352.

39. Gordon, D.A. A cell-specific and selective effect on transactivation by 'the androgen receptor / D.A. Gordon, N.L. Chamberlain, F.A. Flomerfelt // Exp. Cell Res. - 1995.-Vol. 217.-P. 368-377.

40. Trapman, J. The Androgen Receptor in Prostate Cancer / J. Trapman, A.O. Brinkmann // Pathology - Research and Practice. - 1996. - Vol. 192. № 7. - P. 752-760.

41. Роговская, С.И. Андрогены и антиандрогены / С.И. Роговская // Гинекология. - 2000. - № 2. - С. 47-51.

42. Белоусов, Ю.Б. Клиническая фармакология и фармакотерапия / Ю.Б. Белоусов, B.C. Моисеев, В.К. Лепахин. - М.: Универсум, 1993. - 345 с.

43. Резников, А.Г. Антиандрогены / А.Г. Резников, С.В. Варга. - М.: Медицина, 1988.-208 с.

44. Дедов, И.И. Синдром гиперандрогении у женщин: методическое пособие для врачей / И.И. Дедов, Е.Н. Андреева, А.А. Пищулин. - М., 2006. -40 с.

45. Карева, М.А. Адреногенитальный синдром: современные аспекты диагностики и лечения / М.А. Карева // Фарматека. Спецвыпуск: педиатрия. -2011.-№ 1-11.-С. 34-39.

46. Резников, А.Г. Гиперандрогения у женщин. Чем она опасна и как ее лечить? [Электронный ресурс] /А.Г. Резников// Аптека. - 2000. - №22. - Режим доступа: http://www.apteka.Ua/article/l0789.html

47. Першина, Е.В. Синдром гиперандрогении в жизни современной женщины [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.perinatalmedcenter.ru/library/razdel31_122/sindrom_giperandrogenii. html

48. Матицына, JI.A. Гиперандрогении у девушек: Клинические проявления и коррекция [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://www.richter.com.ua/clauses/gynaecology/contraception_arch/79.html

49. Rosenberg, M.J. Acne and treatment / M.J. Rosenberg, M.S. Waugh // Am. J. Obstet. Gynecol. - 1998. -№ 179. - P. 577-582.

50. Zouboulis, C.C. Update and future of systemic acne treatment / C.C. Zouboulis, J. Piquero-Martin // J. Dermatology. - 2003 - № 206. - P. 37-53.

51. Малышева, О.Г. Гиперандрогения и беременность / О.Г. Малышева, C.B. Логинов, Л.А. Агаркова, Е.Л. Торопкина // Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований - 2013. - № 2. - С. 2122.

52. Манушарова, P.A. Синдром гиперандрогении у женщин / P.A. Манушарова, Э.И.Черкезова // Медицинский совет. - 2009. - № 3. - С. 19-24.

53. Вихляева, Е.М. Руководство по гинекологической эндокринологии / Е.М. Вихляева. - М.: Медицинское информационное агентство, 1997. - С. 227360.

54. Сметник, В.П. Неоперативная гинекология / В.П. Сметник, Л.Г. Тумилович. - С.-Пб.: Сотис, 1995. - 224 с.

55. Shafi, A.A. Androgen receptors in hormone-dependent and castration-resistant prostate cancer / A.A. Shafi, A.E. Yen, N.L. Weigel // Pharmacol Ther. -2013.-Vol. 140.-P. 223-238.

56. Habib, F.K. Steroid hormones and cancer. IV. Prostate cancer / F.K. Habib // Europ. J. Surg. Oncol. - 1997. - Vol. 23. - P. 264-268.

57. Гориловский, JI.M. Заболевание предстательной железы в пожилом возрасте/ Л.М. Гориловский. - М.: Медицинская литература, 1999. - 120 с.

58. Briganti, A. Impact of Age and Comorbidities on Long-term Survival of Patients with High-risk Prostate Cancer Treated with Radical Prostatectomy: A Multi institutional Competing-risks Analysis / A. Briganti, M. Spahn, S. Joniau // European Urology. - 2013.-Vol.63.-P. 693-701.

59. Велиев, Е.И. Гормональная терапия рака предстательной железы / Е.И. Велиев // Практическая онкология. - 2008. - №2. - С. 98-103.

60. Матвеев, Б.П. Рак предстательной железы / Б.П. Матвеев, Б.В. Бухаркин, В.Б. Матвеев. -М.: Клиническая онкоурология, 1999. - 153 с.

61. Гриднева, Я.В. Калумид (бикалутамид) в лечении больных местнораспространенным и диссеминированным раком предстательной железы / Я.В. Гриднева, Б.В. Бухаркин // Русский медицинский журнал. Онкология. -2008. -№13. -С. 940-944.

62. Бухаркин, Б.В. Современная медикаментозная гормональная терапия первично выявленного диссеминированного рака предстательной железы/ Б.В. Бухаркин / Российский медицинский журнал. Онкология. - 2003. -№ 11. — С. 688-690.

63. Soloway, M.S. Bicalutamide in the Treatment of Advanced Prostatic Carcinoma: A Phase II Noncomparative Multicenter Trial Evaluating Safety, Efficacy and Long-Term Endocrine Effects of Monotherapy / M.S. Soloway, P.F. Schellhammer, J.A. Smith // J. Urol. - 1995. - № 6. - P. 2110-2114.

64. Бухаркин, Б.В. Нестероидные антиандрогены в лечении рака предстательной железы / Б.В. Бухаркин, Я.В. Гриднева, А.А. Митин // Российский медицинский журнал. Онкология. - 2009. - № 22. - С. 1497-1499.

65. See, W.A. Bicalutamide as immediate therapy either alone or as adjuvant to standard care of patients with localized or locally advanced prostate cancer: first analysis of the early prostate cancer program / W.A. See, M.P. Wirth, D.G. McLeod // J. Urol. - 2002. - Vol. 168. - P. 429-435.

66. Sieber, P.R. Bicalutamide 150 mg maintains bone mineral density during monotherapy for localized or locally advanced prostate cancer / P.R. Sieber, D.L. Keiller, R.J. Kahnoski, J. Gallo, S. McFadden // J. Urol. - 2004. - Vol. 171. - P. 2272-2276.

67. Walters, W. P. Virtual screening - an overview / W.P. Walters, M.T. Stahl, M.A. Murcko // Drug Discovery Today. - 1998. - № 3. - P. 160-178.

68. Хёльтье Х.-Д. Молекулярное моделирование: теория и практика / Х.-Д. Хёльтье - М. : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009 - 320 с.

69. Stahura F.L. Virtual screening methods that complement HTS / F.L. Stahura, J. Bajorath // Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening. -2004. - № 7. - P. 259-269.

70. Guner, O. Pharmacophore modeling and three dimensional database searching for drug design using catalyst: recent advances / O. Guner, O. Clement, Y. Kurogi // Current Medicinal Chemistry. - 2004. - № 11. - P. 2991-3005.

71. Klebe, G. Virtual ligand screening strategies, perspectives and limitations / G. Klebe // Drug Discovery Today. - 2006. - № 11. - P. 580-594.

72. Rishton, G. M. Reactive compounts and to vitro false positives in HTS / G. M. Rishton // Drug Discovery Today. - 1997. - № 2. - P. 382-384.

73. Lipinski, C. A., Lombardo, F., Dominy, B. W., and Feney P. J. (1997) Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings / C. A. Lipinski, F. Lombardo, B.W. Dominy, P.J. Feney // Advanced Drug Delivery Reviews. - 1997. - Vol. 23 - P. 3-25.

74. Roche, O. Computational chemistry as an integral component of lead generation / O. Roche, W. Guba // Mini Reviews in Medicinal Chemistry. - 2005. -№5.-P. 677-683.

75. Muresan, S. «In-house likeness»: comparison of large compound collections using artificial neural networks / S. Muresan, J. Sadowski // Journal of Chemical Information and Modeling. - 2005. - Vol. 45. - P. 888-893.

76. Pearce, B.C. An empirical process for the design of high-throughput screening deck filters / B.C. Pearce, M.J. Sofia, A.C. Good // Journal of Chemical Information and Modeling. - 2006. - Vol. 46.-P. 1060-1068.

77. Leach, A. R. Exploring the conformational space of protein side chains using dead-end elimination and the A* algorithm / A.R. Leach, A.P. Lemon // Proteins. - 1998. - Vol. 33. - P. 227-239.

78. Osterberg, F. Automated docking to multiple target structures: incorporation of protein mobility and structural water heterogeneity in AutoDick / F. Osterberg, G.M. Morris, M.F. Sanner // Proteins. - 2002. - № 46. - P. 34-40.

79. Claussen, H. FlexE: efficient molecular docking considering protein structure variations / H. Claussen, C. Huning, M. Rarey, T. Lengauer // Journal of Molecular Biology.-2001.-Vol. 308.-P. 377-395.

80. Doolittle, R.F. Natively unfolded regions of the vertebrate i brinogen molecule / R.F. Doolittle, J.M. Kollman // Proteins. - 2006. - Vol. 63. - P. 391-397.

81. Luo, B.-H. Structural basis of integrin regulation and signaling. / B.-H. Luo, C.V. Carman, T.A. Springer // Annu. Rev. Immunol. - 2007. - Vol. 25. - P. 619-647.

82. Xiao, T. Structural basis for allostery in integrins and binding of fibrinogen-mimetic therapeutics. / T. Xiao, J. Takagi, J.-H. Wang, B.S. Coller, T.A. Springer // Nature. - 2004. - Vol. 432. - P. 59-67.

83. Painter, J. Optimal description of a protein structure in terms of multiple groups undergoing TLS motion. / J. Painter, E.A. Merritt // Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. - 2006. - Vol. 62. - P. 439-450.

84. RCSB Protein Data Bank (PDB). Электронная база данных расшифрованных трехмерных структур белковых комплексов PDB [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://www.rcsb.org/pdb.html

85. Stahl, M. Development of filter functions for protein-ligand docking / M. Stahl, H.J. Böhm // Journal of Molecular Graphics & Modelling. - 1998. - Vol. 16.-P. 121-132.

86. Khandelwal, A. A combination of docking. QM/MM methods, and MD simulation for binding affinity estimation of metalloprotein ligands / A. Khandelwal, V. Lukacova, D. Comez // Journal of Medicinal Chemistry. - 2005. - Vol. 48. - P. 5437-5447.

87. Ferrara, P. New scoring functions for virtual screening from molecular dynamics simulations with a quantum-refined force-field (QRFF-MD). Application to cyclin-dependent kinase 2. / P. Ferrara, A. Curioni, E. Vangrevelinghe // Journal of Chemical Information and Modeling. - 2006. - Vol. 46. - P. 254-263.

88. Lyne, P.D. Accurate prediction of the relative potencies of members of a series of kinase inhibitors using molecular docking and MM-GBSA scoring / P.D. Lyne, M.L. Lamb, J.C. Saeh // Journal of Medicinal Chemistry. - 2006. - Vol. 49. -P. 4805-4808.

89. Kuhn, B. Validation and use of the MM-PBSA approach for drug discovery / B. Kuhn, P. Gerber, T. Schulz-Gasch, M. Stahl // Journal of Medicinal Chemistry. - 2005. - Vol. 48. - P. 4040-4048.

90. Kellenberger, E. Comparative evaluation of eight docking tools for docking and virtual screening accuracy / E. Kellenberger, J. Rodrigo, P. Muller, D. Rognan // Proteins. - 2004. - Vol. 57. - P. 225-242.

91. Kontoyianni, M. Evaluation of docking performance: comparative data on docking algorithms / M. Kontoyianni, L.M. McClellan, G.S. Sokol // Journal of Medicinal Chemistry. - 2004. - Vol. 47. - P. 558-56.

92. Wang, R.' An extensive test of 14 scoring functions using the PDBbind refined set of 800 protein-ligand complexes / R. Wang, Y. Lu, X. Fang, S. Wang // Journal of Chemical Information and Computer Sciences. - 2004. - Vol. 44. P. 21142125.

93. Ferrara, P. Assessing scoring functions for protein-ligand interactions / P. Ferrara, H. Gohlke, D.J. Price // Journal of Medicinal Chemistry. - 2004. - Vol. 47.-P. 3032-3047.

94. Perola, E. A detailed comparison of current docking and scoring methods on systems of pharmaceutical relevance / E. Perola, W.P. Walters, P.S. Charifson // Proteins. - 2004. - Vol. 56. - P. 235-249.

95. Cummings, M.D. Comparison of automated docking programs as virtual screening tools / M.D. Cummings, R.L. DesJarlais, A.C. Gibbs // Journal of Medicinal Chemistry. - 2005. - Vol. 48. - P. 962-976.

96. Motasemi, F. A review on the microwave-assisted pyrolysis technique / F. Motasemi, Muhammad T. Afzal // Renewable and Sustainable Energy Reviews. -2013. - Vol. 28. - 2013. - P. 317-330.

97. Upadhyay, S.K. Comparison of microwave-assisted and conventional preparations of cyclic imides / S.K. Upadhyay, S.R.K. Pingali, B.S. Jursic // Tetrahedron Letters. - 2010. - Vol. 51, Issue 17 - P. 2215-2217.

98. Rombouts, F. Microwave-assisted N-debenzylation of amides with triflic acid / F. Rombouts, D. Franken, C. Martinez-Lamenca, M. Braeken, C. Zavattaro, J. Chen, A.A. Trabanco // Tetrahedron Letters. - 2010. - Vol. 51, Issue 37. - P. 48154818.

99. Ertiirk, A.S.Microwave assisted synthesis of Jeffamine cored РАМАМ dendrimers Original Research Article / A.S. Ertiirk, M. Tiilii, A.E. Bozdogan, T. Parali // European Polymer Journal. - 2014. - Vol. 52. - P. 218-226.

100. Xu, H. Microwave-assisted three-component Knoevenagel-nucleophilic aromatic substitution reactions / H. Xu, X. Yu, L. Sun, J. Liu, W. Fan, Y. Shen, W. Wang // Tetrahedron Letters. - 2008. - Vol. 49, Issue 32. - P. 4687-4689.

101. Бердоносов, С.С. Микроволновая химия / С.С. Бердоносов // Соровский образовательный журнал. - 2001. - Том 7, № 1. - С. 32-38.

102. Clark, D.E. Microwaves: theory and application in Material Processing / D.E. Clark, D.C. Folz, S.J. Oda, R. Silberglit // Ceramic Transc. - 1995. - Vol. 59. -P. 24-28.

103. Gedye, R.N. The use of microwave ovens for rapid organic synthesis / R.N. Gedye, F.E. Smith, ICC. Westway, H. Ali, I. Baldisera, I. Laberge, J. Rausell // Tetrahedron Letters. - 1986. - Vol. 27, № 3. - P. 279-282.

104. Giguere, R.J. Application of commercial microwave ovens to organic synthesis / R.J. Giguere, T.L. Bray, S.M. Duncan // Tetrahedron Lett. - 1986. - Vol. 27, №41.-P. 4945-4948.

105. Dallinger, D. Microwave-Assisted Synthesis in Water as Solvent / D. Dal linger, C.O. Kappe // Chem. Rev. - 2007. - Vol. 107. - P. 2563-2591.

106. Kappe, C. O. Microwave dielectric heating in synthetic organic chemistry / C.O. Kappe // Chem. Soc. Rev. - 2008. - Vol. 37. - P. 1127-1139.

107. Kappe, C. O. Controlled microwave heating in modern organic synthesis / C.O. Kappe // Angew. Chem. - 2004. - Vol. 43. - P. 6250-6284.

108. Kuhnert, N. Microwave-Assisted Reactions in Organic Synthesis—Are There Any Nonthermal Microwave Effects / N. Kuhnert // Angew. Chem. - 2002. Vol. 41.-P. 1863-1866.

109. Zhang, A. Microwave-Promoted Pd-Catalyzed Cyanation of Aryl Triflates: A Fast and Versatile Access to 3-Cyano-3-desoxy-10-ketomorphinans / A. Zhang, J. L. Neumeyer // Org. Lett. - 2003. - Vol. 5. - P. 201-203.

110. Arvela, R.K. Rapid cvanation of aryl iodides in water using microwave promotion / R.K. Arvela, N.E. Leadbeater, H.M. Torenius, H. Tye // Org. Biol. Chem.-2003.-№ l.-P. 1119-1121.

111. Srinivas, K.V.N.S. Highly convenient and efficient one-pot conversions of aldehydes into nitriles and ketones into amides using HY-zeolite / K.V.N.S. Srinivas, E. Bolla Reddy, B. Das // Synlett. - 2002. - № 4. - P. 625-627.

112. Das, B. An Improved One-Pot Conversion of Aldehydes into Nitriles under Microwave Irradiation Using Ammonium Acetate / B. Das, C. Ramesh, P. Madhusudhan // Synlett. - 2002. - № 11. - P. 1599-1600.

113. Koshima, H. High-troughput synthesys of symmetrycally 3,5-disubstituted 4-amino-l,2,4-triazoles from aldehydes using microwave / H. Koshima,

M. Hamada, M. Tani, S. Iwasaki, F. Sato // Heterocycles. - Vol. 57. № 11. - 2002. -P. 2145-2148.

114. Llekmatshoar, R. Mild, Efficient, and Rapid Dehydration of Aldoximes to Nitriles Mediated by Phthalic Anhydride Under Microwave Irradiation / R. Llekmatshoar, M.M. Heravi, Y.S. Beheshtiha, K. Asadolah // Monatshefte fur Chemie.-2002.-Vol. 133.-P. 111-114.

115. Barnard, T.M. Scale-up of the green synthesis of azacycloalkanes and isoindolines under microwave irradiation // T.M. Barnard, G.S. Vanier, M.J. Collins // Org. Process Res. Dev. - 2006. - Vol. 10. № 6. - P. 1233-1237.

116. Westman, J. Solid phase synthesis aminopropenones and aminopropenoates; efficient versatile synthons for combinatorial synthesis heterocycles / J. Westman, R.Lundin // Synthesis. - 2003. - № 7. - P. 1025-1030.

117. Romera, J.L. Potassium iodide catalysed monoalkvlation of anilines under microwave irradiation / J.L. Romera, J.M. Cid, A.A. Trabanco // Tetrahedron Letters. - 2004. - Vol. 45. - P. 8797-8800.

118. Jennings, L.D. Design and synthesis of indolo[2,3-a]quinolizin-7-one inhibitors of the ZipA-FtsZ interaction / L.D. Jennings, K.W. Foreman, T.S. Rush // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters. - 2004. - Vol. 14. - P. 1427-1431.

119. Holzgrabe, U. A new synthetic route to compounds of the AFDX-type with affinity to muscarinic M2-receptor / U. Holzgrabe, E. Heller // Tetrahedron. -2003.-Vol. 59.-P. 781-787.

120. Wang, C. Microwave-Promoted N-Alkylation of Acridones Without Solvent / C. Wang, T. Hang, H. Zhang // Synthetic Communications. - 2003. - Vol. 33, №3,-P. 451-456.

121. Sarju, J. Rapid microwave-assisted synthesis of phenyl ethers under mildly basic and nonaqueous conditions / J. Sarju, T.N. Danks, G. Wagner // Tetrahedron Letters. - 2004. - Vol. 45. - P. 7675-7677.

122. Radi, M. Parallel Solution-Phase Svnthesis of 4-Dialkylamino-2-methylsulfonyl-6-vinylpyrimidines / M. Radi, E. Petricci, G. Maga, F. Corclli, M. Botta//J. Comb. Chem. - 2005.-№7.-P. 117-122.

123. Chatti, S. Synthesis of New Diols Derived from Dianhydrohexitols Ethers under Microwave-Assisted Phase Transfer Catalysis / S. Chatti, M. Bortolussi, A. Loupy // Tetrahedron. - 2000. - Vol. 56. - P. 5877-5883.

124. Steinreiber, A. High-speed microwave-promoted Mitsunobu inversions. Application toward the deracemization of sulcatol / A. Steinreiber, A. Stadler, S.F. Mayer, K. Faber, C.O. Kappe // Tetrahedron Letters. - 2001. - Vol. 42. - P. 62836286.

125. Zhang, Z. One billionhertz microwave athermal action on the synthesys of aromathic esters at normal pressure / Z. Zhang, L. Zhou, M. Zhang, H. Wu, Z. Chen // Synthetic Communications. - 2001. - Vol. 31, № 16. - P. 2435-2439.

126. Liao, X. A novel way to prepare n-butylparaben under microwave irradiation / X. Liao, G.S.V. Raghavan, V.A. Yaylayan // Tetrahedron Letters. -2002.-Vol. 43.-P. 45-48.

127. Stadler, A. The effect of microwave irradiation on carbodiimide-mediated esterifications on solid support / A. Stadler, C.O. Kappe // Tetrahedron. — 2001.-Vol. 57.-P. 3915-3920.

128. Caddick, S. A convenient and practical method for the elective benzoylation of primary hydroxyl groups using microwave heating / S. Caddick, A.J. McCarroll, D.A. Sandham // Tetrahedron. - 2001. Vol. 57. - P. 6305-6310.

129. Deka, N. Microwave mediated solvent-free acetylation of deactivated and hindered phenols / N. Deka, A.-M. Mariotte and A. Boumendjel // Green Chemistry. - 2001. - № 3. - P. 263-264.

130. Paul, S. A20-Py/basic alumina as a versatile reagent for acetvlations in solvent-free conditions under microwave irradiation / S. Paul, P. Nanda, R. Gupta, A. Loupy // Tetrahedron Letters. - 2002. - Vol. 43. - P. 4261-4265.

131. Chakrabarty, M. Microwave-assisted Michael reactions of 3-(2'-nitrovinyl)indole with indoles on TLC-grade silica gel. A new, facile synthesis of 2,2-bis(3'-indolyl)nitroethanes / M. Chakrabarty, R. Basak, N. Ghosh // Tetrahedron Letters. - 2001. - Vol. 42. - P. 3913-3915.

132. Correc, O. Microwave solvent-free svnthesis of nitrocvclohexanols / O. Correc, K. Guillou, J. Hamelin, L. Paquin, F. Texier-Boullct, L. Toupet // Tetrahedron Letters. - 2004. - Vol. 45. - P. 391-395.

133. Lai Dhar, S. A novel salicvlaldehvde based mineral supported expedient synthesis of benzoxazinone nucleosides / S. Lai Dhar, S. Yadav, V.K. Rai // Tetrahedron Letters. - 2004. - Vol. 45. - P. 5351-5353.

134. Kuster, G.J. The preparation of resin-bound nitroalkenes and some applications in high pressure promoted cycloadditions / G.J. Kuster, H.W. Scheeren // Tetrahedron Letters. - 2000. - Vol. 41. - P. 515-519.

135. Yu, J. A microwave promoted new condensation reaction of aryl ketones with triethyl ortho-formate / J. Yu, Y. Hu, O. Huang, R. Ma, S. Yang // Synthetic Communications. - 2000. - Vol. 30, № 15. - P. 2801-2806.

136. Villemin, D. Potassium fluorideon alumina: dry synthesis of 3-arylidene-l,3-dihydro-indol-2-one under microwave irradiation / D. Villemin, B. Martin// Synthetic Communications. - 1998. - Vol. 28, № 17. - P. 3201-3208.

137. Varma, R.S. Microwave-assisted oxidation of alcohols under solventfree conditions using clayfen / R.S. Varma, R. Dahiya // Tetrahedron Letters. - 1997. -Vol. 38.-P. 2043-2044.

138. Varma, R.S. Iodobenzene diacetate on alumina: rapid oxidation of alcohols to carbonyl compounds in solventless system using microwaves / R.S. Varma, R. Dahiya, R.K. Saini // Tetrahedron Letters. - 1997. - Vol. 38. - P. 70297032.

139. Varma, R.S. Selective oxidation of sulfides to sulfoxides and sulfones by microwave thermolysis on wet silica-supported sodium periodate / R.S. Varma, R.K. Saini, H.M. Meshram // Tetrahedron Letters. - 1997. - Vol. 37 - P. 6525-6528.

140. Clophax, J. Application of focused microwaves to the scale-up of solvent-free organic reactions / J. Clophax, M. Liagre, A. Loupy, A. Petit // Org Proc. Res Dev. - 2000. - Vol. 4, № 6. - P. 498-504.

141. Kobavashi, S. Selective svnthesis of fluorinated carbohvdrates using N,N-diethyl-a,a-difluoro-(m-methylbenzyl)amine / S. Kobavashi, A. Yoneda, T. Fukuhara, S. Hara // Tetrahedron Letters. - 2004. - Vol. 45. - P. 1287-1289.

142. Nicewonger R.B. Synthesis of a novel, recyclable, solid-phase acylating reagent / R.B. Nicewongcr, L. Ditto, D. Kerr, L. Varady // Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters.-2002.-Vol. 12.-P. 1799-1802.

143. Petricci, E. An improved synthesis of solid-supported reagents (SSRs) for selective acvlation of amines bv microwave irradiation / E. Petricci, M. Botta, F. Corelli, C. Musnaini // Telrahedron Letters. - 2002. Vol. 43. - P. 6507-6509.

144. Marquez, H. Synthesis of l-benzoyl-3-aIkylthioureas by transamidation under microwave in dry media / H. Marquez, E.R. Perez, A.M. Plutin, M. Morales, A. Loupy//Tetrahedron Letters. -2000. - Vol. 41. - P. 1753-1756.

145. Soh, C.H.; An efficient and expeditious synthesis of di- and monosubstituted 2-aminoimidazoles / C.H. Soh, W.K. Chui, Y. Lam // J. Comb. Chem.-2008.-Vol. 10,№1.-P. 118-122.

146. Movassaghi, M. Single-step synthesis of pynmidine derivatives / M. Movassaghi, M.D. Hill // J. .AM. CHEM. SOC. - 2006. - Vol. 128. - P. 1425414255.

147. Jiao. L. Origin of the relative stereoselectivity of the b-lactam formation in the staudinger reaction / L. Jiao, Y. Liang, J. Xu // J. AM. CHEM. SOC. - 2006. -Vol. 128.-P. 6060-6069.

148. Bagley, M.C. Microwave-assisted synthesis of N-pyrazole ureas and the p38a inhibitor BIRB 796 for study into accelerated cell ageing / M.C. Bagley, T.Davis, M.C. Dix, C.S. Widdovvson, D.Kipling // Org. Biomol. Chem. - 2006. Vol. 4.-P. 4158-4164.

149. Feng, G. One-pot regioselective annulation toward 3,4-dihydro-3-oxo-2H 1,4-benzoxazine scaffolds under controlled microwave heating / G. Feng, J. Wu, W.-M. Dai // Tetrahedron. - 2006. - Vol. 62. - P. 4635-4642.

150. Xing, X. Microwave-assisted one-pot U-4CR and intramolecular O-alkylation toward heterocyclic scaffolds / X. Xing, J. Wu, G. Feng, W.-M. Dai // Tetrahedron. - 2006. - Vol. 62. - P. 6774-6781.

151. Kuriyama, M. Design and synthesis of thioether-imidazolium chlorides as efficient ligands for palladium-catalyzed Suzuki-Miyaura coupling of aryl bromides with arylboronic acids / M. Kuriyama, R. Shimazawa, R. Shirai // Tetrahedron. - 2007. - Vol. 63 - P. 9393-9400.

152. Humphries, P.S. Microwave-assisted synthesis utilizing supported reagents: a rapid and versatile synthesis of 1,5-diarylpyrazoles / P.S. Humphries, J.M. Finefield // Tetrahedron Letters. - 2006. - Vol. 47. - P. 2443-2446.

153. Adib, M. Microwave-assisted efficient, one-pot, three-component synthesis of 3,5-disubstituted f,2,4-oxadiazoles under solvent-free conditions / M. Adib, A.H. Jahromi, N. Tavoosi, M. Mahdavi, H.R. Bijanzadeh // Tetrahedron Letters. - 2006. - Vol. 47. - P. 2965-2967.

154. Hill, M.D. Observations on the use of microwave irradiation in azaheterocycle synthesis / M.D. Hill, M. Movassaghi // Tetrahedron Letters. - 2008. -Vol. 49.-P. 4286-4288.

155. Dandia, A. Microwave assisted green chemical synthesis of novel spiro[indole-pyrido thiazines]: a system reluctant to be formed under thermal conditions / A. Dandia, K. Arya, M. Sati, S. Gautam // Tetrahedron. - 2004. - Vol. 60.-P. 5253-5258.

156. Hong, B.C. Unprecedented microwave effects on the cycloaddition of fulvenes. A new approach to the construction of polycyclic ring systems / B.C. Hong, Y.-J. Shr, J.-H. Liao // Org. Lett. - 2002. - Vol. 4. - P. 663-666.

157. Zare, A. Zinc oxide as a new, highly efficient, green, and reusable catalyst for microwave-assisted Michael addition of sulfonamides to a,(3-unsaturated esters in ionic liquids / A. Zare, A. Hasaninejad, A.R.M. Zare, A. Parhami, H. Sharghi, A. Khalafi-Nezhad // Can. J. Chem. - 2007. - Vol. 85, № 4. - P. 438-444.

158. Villa, C. Microwave activation and solvent-free phase transfer catalysis for the synthesis of new benzylidene cineole derivatives as potential UV sunscreens /

C. Villa, M.T. Genta, A.Bargagna, E.Mariani, A. Loupy // Green Chemistry. - 2001. Vol.3.-P. 196-200.

159. Katritzky, A.R. Synthesis of C-Carbamoyl-l,2,3-triazoles by Microwave-Induced 1,3-Dipolar Cycloaddition of Organic Azides to Acetylenic Amides / A.R. Katritzky, S.K. Singh // J. Org. Chem. - 2002. - Vol. 67. - P. 90779079.

160. Deka, N. Microwave mediated solvent-free acetylation of deactivated and hindered phenols / N. Deka, A.-M. Mariotte, A. Boumendjel // Green Chemistry. -2001. -№ 3. - P. 263-264.

161. Kabalka, G.W. Microwave-assisted, solventless Suzuki coupling reactions on palladium-doped alumina / G.W. Kabalka, R.M. Pagni, L. Wang, V. Namboodiri, C.M. Hair // Green Chemistry. - 2000. - № 2. P. 120-122.

162. Diaz-Ortiz, A. Microwave irradiation in solvent-free conditions: an eco-friendly methodology to prepare indazoles, pyrazolopyridines and bipyrazoles by cycloaddition reactions / A. Diaz-Ortiz, A. de la Hoz, F. Langa // Green Chemistry. -2000.-№2.-P. 165-172.

163. Gerbec, J. A. Microwave-Enhanced Reaction Rates for Nanoparticle Synthesis / J.A. Gerbec, D. Magana, A. Washington, G.F. Strouse // J. Am. Chem. -2005.-№ 127. P. 15791-15800.

164. Washington, A.L. Microwave Synthesis of Cd-Se and Cd-Te Nanocrystals in Nonabsorbing Alkanes / A.L. Washington, G.F. Strouse // J. Am. Chem. Soc.-2008.-Vol. 130.-P. 8916-8922.

165. Han, S.Y. Recent development of peptide coupling reagents in organic synthesis / S.Y. Han, Y.-A. Kim // Tetrahedron. - 2004. - Vol. 60, № 11. - P. 24472467.

166. El-Faham, A. Morpholine-based immonium and halogenoamidinium salts as coupling reagents in peptide synthesis / A. El-Faham, F. Albericio // J. Org. Chem. - 2008. - Vol. 73. - P. 2731-2737.

167. Bacsa, B. Solid-phase synthesis of difficult peptide sequences at elevated temperatures: a critical comparison of microwave and conventional heating

technologies / B. Bacsa, K. Horvati, S. Bosze, F. Andreae, C.O. Kappe // J. Org. Chem. - 2008. - Vol. 73. - P. 7532-7542.

168. Caddick, S. Microwave enhanced synthesis / S.Caddick, R.Fitzmaurice // Tetrahedron. - 2009. - Vol. 65. - P. 3325-3355.

169. Diaz-Mochon, J.J. Peptoid dendrimers - microwave-assisted solid-phase synthesis and transfection agent evaluation / J.J. Diaz-Mochon, M.A. Fara, R.M. Sanchez-Martin, M. Bradley // Tetrahedron Lett. - 2008. - Vol. 49. - P. 923-926.

170. Matsushita, T. Rapid microwave-assisted solid-phase glycopeptide synthesis / T. Matsushita, H. Hinou, M. Kurogochi, H. Shimizu, S.I. Nishimura // Org. Lett. - 2005. - Vol. 7. - P. 877-880.

171. Paolini, A. A convenient microwave-assisted synthesis of N-glycosyl amino acids / A. Paolini, F. Nuti, M.D. Pozo-Carrero // Tetrahedron Lett. - 2007. -Vol. 48.-P. 2901-2904.

172. Palasek, S.A. Limiting racemization and aspartimide formation in microwave-enhanced Fmoc solid phase peptide synthesis / S.A. Palasek, Z.J. Cox, J.M. Collins//Journal of Peptide Science. - 2007. - Vol. 13. - P. 143-148.

173. Tullberg, M. Microwave-assisted solid-phase synthesis of 2,5-diketopiperazines: solvent and resin dependence / M. Tullberg, K. Luthman, M.J. Grotli // Comb. Chem. - 2006. - Vol. 8. - P. 915-922.

174. Campiglia, P. An efficient approach for monosulfide bridge formation in solid-phase peptide synthesis / P. Campiglia, I. Gomez-Monterrey, L. Longobardo, T. Lama, E. Novellino, P. Grieco // Tetrahedron Lett. - 2004. - Vol. 45. - P. 14531456.

175. Chapman, R.N. Optimized synthesis of hydrogen-bond surrogate helices: surprising effects of microwave heating on the activity of grubbs catalysts / R.N. Chapman, P.S. Arora // Org. Lett. - 2006. - Vol. 8. - P. 5825-5828.

176. Nagaike, F. Efficient microwave-assisted tandem N- to S-acyl transfer and thioester exchange for the preparation of a glycosylated peptide thioester / F. Nagaike, Y. Onuma, C. Kanazawa, H. Hojo, A. Ueki, Y. Nakahara // Org. Lett. -2006. - Vol. 8. - P. 4465-4468.

177. Merkx, R. Resin-bound sulfonyl azides: efficient loading and activation strategy for the preparation of the N-acyl sulfonamide linker / R. Merkx, M.J. van Haren, D.T.S. Rijkers, R.M.J. Liskamp // J. Org. Chem. - 2007. - Vol. 72. - P. 45744577.

178. Garcia-Martin, F. Chlorotrityl chloride (CTC) resin as a reusable carboxyl protecting group / F. Garcia-Martin, N. Bayo-Puxan, L.J. Cruz, J.C. Bohling, F. Albericio // QSAR & Combinatorial Science. - 2007. - Vol. 26, № 10. -P. 1023-1108.

179. Джесси, ji.Б. Пробоподготовка в микроволновых печах: теория и практика / Л.Б. Джесси, Г.М. Кингстон.-М.: Мир, 1991. -336 с.

180. Patterson, D. Enantiomer-specific detection of chiral molecules via microwave spectroscopy / D. Patterson, M. Schnell, J.M. Doyle // Nature. - 2013. -№ 497. - P. Л15-Л11.

181. Bo, O.l. Application of microwave spectroscopy for the detection of water fraction and water salinity in water/oil/gas pipe flow / O.L. Bo, E. Nyfors // Journal of Non-Crystalline Solids. - 2002. - Vol. 305, № 1-3. - P. 345-353.

182. Пентин, Ю. А. Физические методы исследования в химии / Ю.А. Пентин, Л.В. Вилков. - М.: Мир, 2006. - 683 с.

183. Лизунов, А.Ю. Влияние выбора трехмерной структуры белка на результаты виртуального скрининга на примере белка каспаза-7 / А.Ю. Лизунов // Молекулярные технологии. - 2010. - № 4. - Публикация 13.

184. Leo, A. Linear free-energy relationships between partitioning solvent systems / A. Leo, C. Hansch // J. Org. Chem. - 1971. - Vol. 56, № 11. - P. 15391544.

185. Egan, W.J. Prediction of Drug Absorption Using Multivariate Statistics / W.J. Egan, K.M. Merz, J.J. Baldwin // J. Med. Chem. - 2000. - №43. - P. 38673877.

186. Egan, W.J.; Lauri, G. Adv. Drug Del. Rev. - 2002. - №54. - P. 273.

187. Dixon, S. L. One-dimensional molecular representations and similarity calculations: methodology and validation / S. L. Dixon, K.Jr. Merz // J. Med. Chem. -2001.- №23.-P. 3795-3809.

188. Брылев, М.И. Математическое моделирование и синтез потенциальных антагонистов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев // Тезисы докладов Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2014». Москва.-2014.

189. Брылев, М.И. Молекулярное моделирование антагонистов рецепторов NR3C4 / М.И. Брылев, А.Ю. Лизунов, Д.С. Лоторев, H.A. Пелевин // Тезисы докладов XVII Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей (с международным участием) «Фундаментальная наука и клиническая медицина - человек и его здоровье». Санкт-Петербург. — 2014.-С. 64-65.

190. Брылев, М.И. Поиск антагонистов рецепторов NR3C4 методом молекулярного моделирования / М.И. Брылёв, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, H.A. Пелевин, A.A. Алексеев, А.Ю. Лизунов // Курский научно-практический вестник "Человек и его здоровье",-2014.-№ 1.-С. 10-18.

191. Григоровский A.M. Успехи химии производных акридина [Текст] / A.M. Григоровский // Успехи химии Т. 21. 1952. - 618 с.

192. Шейн, Д. Синтезы органических препаратов. Сборник 10 / Д. Шейн, А.Ф. Платэ // М.: Издательство иностранной литературы, 1960. - 85 с.

193. Маркович, Ю.Д. Синтез акридона конденсацией N-фенилантраниловой кислоты / Ю.Д. Маркович, Т.Н. Кудрявцева, C.B. Чевычелов, Д.Ю. Маркович, H.A. Пелевин // Известия КурскГТУ. - 2005. - №2. -С. 38-40.

194. Маркович, Ю.Д. Кинетические параметры реакции внутримолекулярной конденсации дифениламин-2-карбоновых кислот в условиях микроволнового излучения / Маркович Ю.Д., Кудрявцева Т.Н.,

Брылев М.И., Маркович В.Ю., Королева И.А. // Журнал общей химии. — 2012. — Т. 82.-С. 152-155.

195. Beilstein. Hanbuch der Organishchen Chemie [Text]. - Berlin: Gottingen, Heidelberg. Springer-Velard. - H. 335. - Syst. № 3187.

196. Маркович, Ю.Д. Микроволновая активация реакции сульфирования акридона и количественный анализ полученной смеси сульфоновых кислот / Ю.Д. Маркович, М.И. Брылёв, Т.Н. Кудрявцева, С.А. Ефанов, В.Ю. Маркович, И.А. Королева // Известия Юго-западного государственного университета. -2010,-№4. -С. 25-28.

197. Маркович, Ю.Д. Денситометрическое изучение кинетики реакции циклизации дифениламин-2-карбоновых кислот / Ю.Д. Маркович, Н.А. Пелевин, Т.Н. Кудрявцева, Д.С. Лоторев // Заводская лаборатория. - 2008. -Вып. 74.-С. 8-11.

198. Пелевин Н.А. Изучение циклизации дифениламин-2-карбоновых кислот: дис. ... канд. хим. наук: 02.00.03. / Пелевин Николай Александрович. -М., 2011.-124 с.

199. Van den Bogaart, Е. Duplex quantitative Reverse-Transcriptase PCR for simultaneous assessment of drug activity against Leishmania intracellular amastigotes and their host cells / E. van den Bogaart, G.J. Schoone, E.R. Adams, H.D.F.H. Schallig // International Journal for Parasitology: Drugs and Drug Resistance. - 2014. - № 4. - P. 14-19.

200. Menendez, A.T. Recommendations for Cell Banks Used in GXP Assays / A.T. Menendez, N. Ritter, J. Zmuda, D. Jani, J. Goyal // BioProcess International. -2012. - Vol. 10, № 1. - P. 28-40.

201. Mouse Granulocyte-Macrophage Colony-Forming Unit Assay / M.A. Dobrovolskaia, T.M. Potter. - Frederick: National Cancer Institute, 2009. - P. 13.

202. Брылев, М.И. Поиск антагонистов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, А.Ю. Лизунов, Н.А. Пелевин // Молекулярная медицина. - 2014. - №3. - С. 2833.

203. Брылев, М.И. Поиск новых эффективных блокаторов рецептора NR3C4 / М.И. Брылев, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, А.Ю. Лизунов, H.A. Пелевин // Тезисы докладов VI Российского симпозиума «Белки и пептиды». Уфа. - 2013. - С. 192.

204. Брылев, М.И. Новые антагонисты рецепторов NR3C4 / М.И. Брылёв, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, H.A. Пелевин, A.A. Алексеев, А.Ю. Лизунов // Тезисы докладов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инновации в здоровье нации». Санкт-Петербург. - 2013. — С. 27.

205. Брылев, М.И. Исследования биологической активности потенциальных антагонистов рецептора NR3C4 / М.И. Брылёв, Г.В. Раменская, Д.С. Лоторев, Е.С. Мухачева, Н.Б. Кузнецова, Л.А. Павлова, Ю.А. Лизунов, H.A. Пелевин // Тезисы докладов научно-практической конференции «Новые химико-фармацевтические технологии». Москва. - 2014. - С. 140-142.

206. Маркович, Ю.Д. Микроволновая активация процесса циклизации дифениламин-2-карбоновых кислот в среде концентрированной серной и полифосфорной кислот / Ю.Д. Маркович, Т.Н. Кудрявцева, М.И. Брылёв, И.А. Королева, В.Ю. Маркович, H.A. Пелевин // Тезисы докладов Международного молодежного научного форума «Ломоносов-2010». Москва. - 2010. - С. 45-46.

207. Ferencz, L. New sulphonamides with acridinic nucleus / L. Ferencz, V. Farcasan, I.A. Silberg // REVUE ROUMAINE DE CHIMIE. - 2003. - Vol. 48. -P. 801-812.

208. ABI 433A Peptide Synthesizer, User Guide, 2004.

209. Dick, F. Acid cleavage/deprotection in FMOC/tBu solid-phase peptide synthesis / F. Dick // Methods in Molecular Biology. - 1994. - Vol. 35. - P. 63-72.

Исследование аффинности испытуемых веществ к рецептору NR3C4 с

помощью набора PolarScreen Androgen Receptor Competitor Assay,

Green Protocol

1. Готовят стоковые растворы контрольного (ципротерона ацетат) и испытуемых веществ.

2. Готовят необходимый объем реакционного буфера. При приготовлении к 1 мл готового буфера (pH = 7,5) со стабилизаторами и глицерином из набора PolarScreen добавляют 2 мкл готового раствора 1 М дитиотреитола из набора PolarScreen.

3. Готовят рабочие растворы испытуемого и контрольного веществ.

4. Рассчитывают необходимые количества концентрированных препаратов: готового раствора крысиного рекомбинантного лиганд-связывающего домена (LBD, таггирован His-GST) и готового 200 нМ раствора в 20 мМ Трис, содержащем 90% метанола селективного флуоресцентного лиганда рецептора Fluormone™ AL Green, для приготовления рабочего раствора комплекса, содержащего 50 нМ LBD (Plis-GST) и 2 нМ Fluormone™ AL Green (концентрация LBD (His-GST) в концентрированных растворах указывается в сертификате к набору).

5. Размораживают LBD (His-GST).

6. Готовят необходимое количество комплекса, содержащего 50 нМ LBD (His-GST) и 2 нМ Fluormone™ AL Green LBD (His-GST) и Fluormone™ AL Green в реакционном буфере. Хранят приготовленный комплекс LBD (His-GST) и Fluormone™ AL Green не более 30 мин на льду.

7. В микропробирки вносят по 20 мкл тестируемых и контрольных веществ.

8. Добавляют в микропробирки по 20 мкл комплекса LBD (His-GST) и Fluormone™ AL Green и перемешивают пипетированием.

9. Готовят дополнительную контрольную пробу, содержащую 25 нМ раствор в реакционном буфере LBD (His-GST).

10. Готовят дополнительную контрольную пробу, содержащую 1 нМ раствор в реакционном буфере Fluormone™ AL Green.

11. Готовят дополнительную контрольную пробу, разводя комплекс LBD-Fluormone™ AL Green (п. 5) в 2 раза в реакционном буфере.

12. Закрывают планшеты пленкой и инкубируют в течение 6 часов при 2022 °С.

13. Проводят измерения поляризации флуоресценции проб на многоканальном спектрофлуориметре с технологией поляризации флуоресценции возбуждение 485 нм / эмиссия 535 нм, в режиме поляризации.

Приготовление стоковых растворов веществ:

Готовят стоковые растворы испытуемых веществ в 100% ДМСО: в концентрациях 1 мМ и 0,1 мМ. Хранят при - 20 "С.

Приготовление рабочих растворов веществ:

Готовят рабочие растворы, разводя стоковые растворы реакционным буфером до концентрации 10 мкм.

Протокол культивирования клеточной культуры AR-UAS-bla GripTite™ 293

Размораживание клеток:

1. Извлекают ампулу с клетками из жидкого азота и быстро оттаивают клетки, опустив ампулу в воду (+ 37 °С) (не опуская под воду) и легко помешивая клетки в ампуле.

2. Тщательно стерилизуют ампулу 70%-ным спиртом.

3. Переносят содержимое ампулы по каплям в 10 мл среды для размораживания клеток Recovery™ Cell Culture Freezing Medium.

4. Отмывают клетки от криоконсерванта центрифугированием при 500 g в течение 5 мин.

5. Удаляют супернатант и ресуспендируют клетки в 1 мл среды для размораживания клеток.

Определение жизнеспособности размороженных клеток:

1.2.1 Суспензию клеток смешивают с равным объемом 0,4%-ного раствора трипанового синего и инкубируют 3 мин при комнатной температуре.

1.2.2 Определяют количество мертвых (окрашенных) клеток в клеточной суспензии в камере Горяева.

1.2.3 Переносят клетки в 9 мл среды для размораживания клеток. Клетки культивируют в СОг-инкубаторе (37 °С / 5% С02).

Пересев клеток:

1. Флакон с клетками промывают PBS, добавляют Трипсин-ЭДТА и ополаскивают клеточный монослой.

2. Ресуспендируют клетки в равном объеме среды для культивирования. Контролируют под микроскопом отсутствие клеточных агрегатов.

3. Переносят клетки в центрифужную пробирку. Центрифугируют клетки 500 g в течение 5 мин.

4. Ресуспендируют клетки в необходимом объеме ростовой среды и переносят во флаконы. Кратность пересева - 1:4.

5. Клетки культивируют в СОг-инкубаторе (37 °С / 5% СОг) в пределах 595% от полного монослоя (не допуская полного слияния монослоя).

Приготовление фосфатно-солевого буфера (PBS):

Стандартные коммерческие таблетки PBS растворяли в требуемом количестве очищенной воды MilliQ, стерилизовали путем фильтрации через фильтр 0,22 мкм.

Состав среды для размораживания клеток

90% DMEM

10% сыворотка эмбриональная бычья

0,1 мМ раствор аминокислот без L-глутамина

25 мМ HEPES (рН = 7,3)

Состав ростовой среды

90% DMEM

10% сыворотка эмбриональная бычья

0,1 мМ раствор аминокислот без L-глутамина

25 мМ HEPES (рН = 7,3)

80 мкг/мл гигромицин

80 мкг/мл зеоцин

Протокол определения неспецифической цитотоксичности испытуемых

соединений по отношению к клеткам AR-UAS-bla GripTite™ 293

1. Флакон с выросшими клетками AR-UAS-bla GripTite™ 293 промывают

PBS.

2. Добавляют раствор трипсина с ЭДТА с феноловым красным (Invitrogen) и ополаскивают клеточный монослой. После набухания клеток (определяется визуально) раствор сливают и флаконы выдерживают при 37 °С до полного сползания монослоя.

3. Суспензию клеток разводят средой для анализа и определяют концентрацию и число клеток в камере Горяева.

4. Доводят средой для анализа концентрацию суспензии клеток до 2-3 х 105 кл/мл.

5. Клетки рассевают в 48-луночные планшеты. Объем 1 лунки равен 400 мкл. В каждую лунку вносили по 0,2 х 106 клеток.

6. Все вещества растворяли в ДМСО. Для каждого вещества готовили растворы трех концентраций: 10 мМ, 1мМ, 100 мкМ.

7. Каждое вещество к клеткам добавляли в трех 100-кратных разведениях. Конечные концентрации испытуемых веществ составляли 100 мкМ, 10 мкМ и 1 мкМ.

8. В каждом планшете также делали контрольные клеточные пробы (клетки только в культуральной среде без ДМСО и клетки в культуральной среде с ДМСО).

9. Планшеты с клетками инкубировали в С02-инкубаторе (37 °С/ 5% С02) при 37 °С при 96% влажности в течение 18 часов.

10. После окончания культивирования к 400 мкл культуральной среды ячейки 48-луночного планшета (содержащей 0,2 х 106 клеток/лунку) добавляли 60 мкМ раствора пропидия иодида в PBS.

11. Инкубировали 5 мин при комнатной температуре для окрашивания ДНК мертвых клеток.

12. Регистрировали на флуоресцентном инвертированном микроскопе количество клеток (общее число и число мертвых клеток, светящихся красным цветом).

13. Исходя из соотношения погибших клеток и общего количества клеток (пункт 3), рассчитывали жизнеспособность анализируемых клеток (в процентах живых клеток от общего числа). Для расчета использовали бесплатную программу «ImageJ».

Протокол инкубирования испытуемых веществ с культурой AR-UAS-bla GripTite™ 293 и регистрации флуоресценции с помощью конфокальной

микроскопии

1. Готовят 1 мМ стоковые растворы испытуемых и контрольных (тестостерона пропионат, ципротерона ацетат) веществ в ДМСО.

2. Готовят рабочие растворы веществ, разводя стоковые растворы в среде для анализа OptiMEM с сывороткой (Invitrogen) до концентрации 5 мкМ.

3. Флакон с клетками AR-UAS-bla GripTite™ 293 промывают PBS.

4. Добавляют раствор трипсина с ЭДТА с феноловым красным (Invitrogen) и ополаскивают клеточный монослой. После набухания клеток раствор сливают и флаконы выдерживают при 37 "С до полного сползания монослоя.

5. Суспензию клеток разводят средой для анализа и определяют концентрацию и число клеток в камере Горяева.

6. Разводят суспензию клеток средой для анализа до концентрации 3,125 х 105/мл.

7. В 8-луночные ячейки (NUNC) с прозрачным стеклянным дном вносят по 160 мкл клеточной суспензии (1,5 х 104 клеток в ячейку). В контрольные лунки без клеток добавляют 160 мкл среды для анализа.

8. Далее в лунки добавляют по 40 мкл испытуемого вещества или контрольного вещества (тестостерона пропионат, ципротерона ацетат) в концентрации 5 мкМ. При этом конечные концентрации веществ составляют 1 мкМ.

9. Инкубируют планшеты в течение 16 ч в С02-инкубаторе (37 °С / 5% С02 в условиях 96% влажности) для индукции экспрессии бета-лактамазы.

10. Добавляют в лунки по 40 мкл готового субстрата CCF4-AM.

11. Закрывают планшет и инкубируют 2 ч при комнатной температуре.

f

12. Исследуют планшеты методом конфокальнЪй микроскопии (конфокальный микроскоп Leica, возбуждающий фильтр: 405 нм, эмиссионные фильтры: 435 ± 15 нм и 530 ± 20 нм), отмечая синюю и зеленую флуоресценцию клеток и интенсивность их окрашивания.

13. Соотношение интенсивности синей и зеленой флуоресценции рассчитывали с помощью программы «ImageJ».

Приготовление субстрата CCF4-AM.

Раствор А: приготовить 1 мМ CCF4-AM в ДМСО, добавлением 912 мкл ДМСО на 1 мг сухого субстрата из набора для определения бета-лактамазной активности LiveBLAzer FRET B/G Loading, не допуская прямого освещения субстрата. До использования раствор хранить при - 20 "С.

Для приготовления рабочей концентрации субстрата CCF4-AM добавляют 6 мкл раствора А к 60 мкл готового раствора В из набора и перемешивают; к полученному раствору добавляют 934 мкл готового раствора С из набора и перемешивают.