Синтез и физико-химические характеристики тетрапиррольных макроциклов с полярными группами для антимикробной фотодинамической терапии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Макаров Владимир Владимирович

• Макаров Владимир Владимирович
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Макаров Владимир Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Химическая модификация и спектральные характеристики макрогетероциклических

сенсибилизаторов для антимикробной ФДТ

1.1 Синтез ароматических тетрапиррольных соединений на основе хлоринов, корролов и фталоцианинов с полярными группами

1.1 Основные способы получения макрогетероциклов

1.2 Функционализация молекул, направленная на введение полярных групп

1.2.1 Производные феофорбида а и хлорина еб

1.2.2 Производные мезо-триарилкорролов

1.2.3 Производные фталоцианина

2 Сравнительные спектральные характеристики макрогетероциклов

2.1 Характеристики ХН ЯМР-спектров

2.2 Особенности электронных спектров поглощения

2.3 Спектры дезактивации возбужденных электронных состояний

3 Антимикробная фотодинамическая терапия с использованием фотосенсибилизаторов макрогетероциклического строения

.3.1 Основные механизмы фотодинамического действия ФС

.3.2 Макрогетероциклические фотосенсибилизаторы антимикробного действия и препараты

на их основе

1.3.3 Исследование фотоцитотоксичности ФС для АФДТ in vitro и in vivo

Глава 2. Характеристика реагентов, синтез и идентификация объектов исследования, методики выполнения эксперимента

2.1 Характеристика используемых реагентов и растворителей

2.1.1 Реагенты

2.1.2 Растворители

2.2 Методики синтеза и идентификация объектов исследования

2.2.1 Производные хлорофилла

2.2.1.1 Экстракция хлорофилла а и синтез феофорбида а 17(3)-метилового эфира

2.2.1.2 Синтез и идентификация 13(1)-^(2-гидроксиэтил)амида-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина е6

2.2.1.3 Синтез и идентификация 13(1)-№(1-пиперазинил)амида-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина е6

2.2.1.4 Синтез и идентификация 13(1)-№-(2-триметиламиноэтилиодид)амид- и 13(1)-N-(4-диметилпиперазинилиодид)амид-15(2),17(3)-диметиловых эфиров хлорина ев

2.2.1.5 Синтез и идентификация 3(1),3(2)-бмс-(^^№триметиламинометилиодид)-13(1)-№-(2-№',№',№'-триметиламмониоэтилиодид)амида-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина ев

2.2.2 Мезо-арилзамещенные корролы

2.2.2.1 Синтез и идентификация 10-(3'-метокси-4'-гидрокси-5'-иодфенил)-5,15-бмс(пентафторфенил)коррола

2.2.2.2 Синтез и идентификация 10-(3'-метокси-4'-(миристоил)окси-5'-иодфенил)-5,15-бмс(пентафторфенил)коррола

2.2.2.3 Синтез и идентификация 10-(3'-метокси-4'-(2"-№метилпиридилиодид)окси-5'-иодфенил)-5,15-бмс(пентафторфенил)коррола

2.2.2.4 Синтез и идентификация 10-(3'-метокси-4'-(гидрокси-5'-иодфенил)-5-(4"-(2-№,№-диметиламиноэтиламин)-тетрафторфенил)-15-(пентафторфенил)коррол

2.2.2.5 Синтез и идентификация 10-(4'-пиридил)-5,15-бмс(пентафторфенил)коррола

2.2.2.6 Синтез и идентификация 10-(№метил-4'-пиридилиодид)-5,15-бмс(пентафторфенил)коррола

2.2.3 Фталоцианины. Синтез и идентификация окта-4,5-(фенилсульфанил)фталоцианина и его алюминиевого комплекса в виде аммонийной соли

2.3 Методы исследования и используемая аппаратура

2.3.1 Спектральные методы исследования

2.3.1.1 Электронная абсорбционная спектроскопия

2.3.1.2 Стационарная и разрешенная во времени_флуоресцентная спектроскопия

2.3.1.3 ЯМР-спектроскопия

2.3.1.4 Масс-спектрометрия

2.3.1.5 Фотонная корреляционная спектроскопия

2.3.2 Методы термического анализа. Термогравиметрия

2.3.3 Метод изотермического насыщения

2.3.4 Методы электрохимии. Спектроскопия электрохимического импеданса

2.3.5 Количественные методы микробиологии и цитологии

Глава 3. Синтез, физико-химические свойства и фотоиндуцированная антимикробная активность потенциальных тетрапиррольных ФС

3.1 Химически модифицированные природные хлорины

3.1.1 Выделение метилфеофорбида а из природного сырья, синтез и ЯМР-спектральная идентификация производных хлорина еб на его основе

3.1.1.1 Выделение метилфеофорбида а из природного сырья

3.1.1.2 Синтез производных хлорина еб на основе метилфеофорбида а

3.1.1.3 ЯМР-идентификация производных хлорофилла а

3.1.2 Физико-химические характеристики устойчивости потенциальных хлориновых фотосенсибилизаторов

3.1.2.1 Особенности термодеструкции хлоринов

3.1.2.2 Генерация синглетного кислорода и фотоустойчивость хлоринов

3.1.3 Спектральные характеристики, агрегация хлоринов и их взаимодействие со средствами пассивной доставки

3.1.3.1 Состояние хлоринов в водных и неводных растворах, растворах полимеров и ПАВ по данным ЭСП и флуоресцентной спектроскопии

3.1.3.2 Исследование агрегации хлориновых ФС методами ЯМР-спектроскопии

3.1.4 Темновая и фотоиндуцированная цитотоксичность хлоринов in vitro

3.1.4.1 Оценка темновой цитотоксичности хлориновых ФС в отношении эритроцитов

3.1.4.2 Антимикробное фотодинамическое действие катионных хлоринов

3.2 Мезо-арил-замещенные корролы

3.2.1 Синтез "низкосимметричных" корролов А2В и АВС-типа

3.2.2 Спектральная идентификация соединений

3.2.3 Некоторые физико-химические характеристики корролов

3.2.4 Агрегация коррольных ФС и их взаимодействие с Твин

3.2.5 Состояние гидрофильно-липофильного баланса корролов

3.2.6 Исследование фотоцитотоксичности ИэСог в отношении музейных и антибиотикорезистентных штаммов микроорганизмов

3.3 Фталоцианины как фотосенсибилизаторы для АФДТ

3.3.1 Синтез фталоцианинов с сульфофенилсульфанильными группами

3.3.2 Спектральные характеристики, агрегация октасульфофталоцианинов и их взаимодействие с пассивным носителем Твин

3.3.3 Антимикробные свойства фталоцианиновых ФС in vitro

3.4 Влияние природы макроцикла, функционального замещения и природы среды на свойства

фотосенсибилизаторов для АФДТ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Список литературы

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Список сокращений

АФДТ - антимикробная фотодинамическая терапия

АФК - активные формы кислорода

- ацетон

ГЛБ - гидрофильно-липофильный баланс

Грам (+) - грамположительные микроорганизмы

Грам (-) - грамотрицательные микроорганизмы

ДТА - дифференциальный термический анализ

ДРС - динамическое рассеяние света

ДМАП - 4-(^№диметиламино)-пиридин

ЖСА - желточно-солевой агар

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

КОЕ - колониеобразующая единица

МГЦ - макрогетероцикл

МС - масс-спектрометрия

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПВП - поливинилпирролидон

ПЭГ - полиэтиленгликоль

РСА - рентгеноструктурный анализ

реактив - 2-хлор-1-метилпиридиния иодид

Мукаяма

среда Эндо - дифференциально-диагностическая питательная среда,

предназначенная для выделения энтеробактерий

среда Сабуро - селективная питательная среда для выращивания

патогенных грибков

ТА - термический анализ

ТГ - термогравиметрия

ТМС - тетраметилсилан (SiMe4)

ТСХ - тонкослойная хроматография

Твин 80 - полисорбат 80, неионогенное ПАВ

ФС - фотосенсибилизатор

ФДТ - фотодинамическая терапия

Фл - флуоресценция (спектр флуоресценции)

ЦПК - циклопентаноновое кольцо

ЭСП - электронный спектр поглощения

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

AcOH - уксусная кислота

АЛК - е-аминолевулиновая кислота

DABCO - 1,4-диазабицикло [2. 2.2] октан

DDQ - 2,3-дихлоро-5,6-дициано-1,4-бензохинон

DMF - N,N-диметилформамид

DMSO - диметилсульфоксид

DHBA - 2,5-дигидроксибензойная кислота

EtOH - этанол

MeOH - метанол

1-OctOH - 1-октанол

PSB - фосфатно-солевой буфер

PEI - полиэтиленимин

Py - пиридин

THF - тетрагидрофуран

TFA - трифторуксусная кислота

Na2H2Edta - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты,

трилон Б

H2P - порфирин

MP - металлопорфирин

H2TPP - мезо-тетрафенилпорфин

H2Chl a - феофитин а (хлорофилл-лиганд)

H2Phe a - метилфеофорбид а (феофорбид а 17(3)-метиловый эфир)

H2Chln e6 - хлорин е6

H3Cor - коррол

H2Pc - фталоцианин

MPc - металлофталоцианин

MACE - моно^-аспартил хлорина е6 (mono-L-aspartyl chlorin e<6)

TOOKAD - ФС, палладиевый комплекс бактериофеофорбида а

1Ol - синглетный кислород

302 - триплетный кислород (основное состояние)

S0 - основное синглетное состояние фотосенсибилизатора

S1 - первое возбужденное синглетное состояние ФС

T1 - первое возбужденное триплетное состояние ФС

Ya - квантовый выход образования синглетного кислорода

s - коэффициент экстинкции полосы поглощения

p - коэффициент межфазного распределения

Rf - коэффициент удерживания в ТСХ

Spirulina

platensis - цианобактерия (сине-зелёная водоросль)

Urtica dioica L. - крапива двудомная

Escherichia coli - кишечная палочка, условно-патогенная грамотрицательная

(E. coli) бактерия

Pseudomonas - синегнойная палочка, условно-патогенная

aeruginosa грамотрицательная бактерия

Candida albicans - микроскопический дрожжеподобный грибок кандида

(C. albicans)

Staphylococcus - золотистый стафилококк, условно-патогенная

aureus грамположительная бактерия

(S. aureus)

MSSA - мецитиллин чувствительные S. aureus

MRSA - мецитиллин резистентные S. aureus

Enterobacter - энтеробактер, условно-патогенная грамотрицательная

cloacae бактерия

Klebsiella - клебсиелла, условно-патогенная грамотрицательная

pneumoniae бактерия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Синтез и физико-химические характеристики тетрапиррольных макроциклов с полярными группами для антимикробной фотодинамической терапии»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность и степень разработанности темы исследования.

Тетрапиррольные ароматические макрогетероциклы (МГЦ) - порфирины (Н2Р) и их аналоги [1-12] характеризуются широким спектром возможностей функционализации молекул [13-19], что открывает новые пути их применения в биологии и медицине [20-22], позволяет регулировать состояние их гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ), фотофизические свойства и связывание с различными нано-носителями с целью повышения биодоступности МГЦ, сродства к клеточным мембранам и их проницаемости. Одним из важных направлений медицинской химии является разработка альтернативных методов диагностики и лечения онкологических и инфекционных заболеваний, таких как фотодиагностика (ФД), противоопухолевая (ФДТ) или антимикробная фотодинамическая терапия (АФДТ) [23-33], где МГЦ применяются в качестве фотосенсибилизаторов (ФС), генерирующих при облучении активные формы кислорода (АФК). Достоинствами ФДТ и АФДТ по сравнению с традиционными химиотерапевтическими методами лечения является их малая инвазивность, селективное фотоинактивирующее воздействие ФС на опухолевые или патогенные клетки с поражением одновременно нескольких мишеней, а также отсутствие резистентности к предлагаемому лечению.

Несмотря на массу работ по синтезу и исследованию свойств тетрапиррольных макроциклов, направленных на создание препаратов для АФДТ 1-3 поколений, сравнительные характеристики ФС, принадлежащих к различным классам МГЦ, такие как степень их амфифильности и состояние в растворах, эффективность фотогенерации ими АФК и взаимодействия препаратов со средствами доставки, темновая и фототоксичность в отношении музейных и антибиотикорезистентных, в частности, грамотрицательных патогенов, все еще недостаточно описаны в литературе.

Цель работы. Синтез и функционализация полярными группами МГЦ хлоринового (И2Ш), коррольного (И3Сог) и фталоцианинового (И2Рс) типа, а также сравнительный анализ физико-химических характеристик и фотоиндуцированной антимикробной активности соединений.

Основные задачи исследования заключались в следующем:

1. Синтезировать и идентифицировать ряд H2Chl, H3Cor и H2Pc с полярными группами, оценить их термо- и фотостабильность, а также эффективность генерации синглетного кислорода (1О2).

2. Изучить агрегацию потенциальных ФС в воде, а также их связывание и локализацию в водных растворах биосовместимых носителей.

3. Экспериментально определить коэффициенты распределения (Р) ФС в системе "1-октанол (OctOH) - фосфатно-солевой буфер (PSB)" с целью оценки их аффинности к липидным мембранам клеток.

4. Проанализировать темновую и фотоиндуцированную цитотоксичность МГЦ in vitro в отношении патогенных микроорганизмов, включая антибиотикорезистентные штаммы бактерий.

Научная новизна. Получены и идентифицированы 7 новых МГЦ, исследована агрегация в воде и процессы солюбилизации потенциальных ФС в водных растворах мицеллярного (ПАВ Твин 80) и полимерного (ПВП) пассивных носителей. Рассчитаны константы связывания ФС - ПАВ, установлен характер локализации пигментов в структуре нано-носителя. Впервые определены коэффициенты распределения Р для ряда Н2СЫ и И3С0Г, сделаны выводы об аффинности соединений к липофильным клеточным мембранам. Установлено влияние катионных триалкиламмониевых групп в молекулах ФС на темновую токсичность H2Chl в отношении эритроцитов in vitro. Впервые на примере музейных и нозокомиальных штаммов условно патогенных микроорганизмов установлена антимикробная фотоиндуцированная активность ряда H2Chl, H3Cor и H2Pc in vitro.

Теоретическая и практическая значимость. Проведены обширные исследования, направленные на выявление перспективных препаратов для АФДТ. Анализ величин коэффициентов межфазного распределения позволил оценить степень амфифильности потенциальных ФС с полярными группами, а анализ констант взаимодействия с носителем и тушителем флуоресценции -прочность связывания и локализацию ФС в составе молекулярного комплекса ФС - ПАВ. Выявлена выраженная фотоиндуцированная антимикробная активность исследуемых соединений in vitro. Совокупность полученных результатов позволяет ощутимо приблизиться к пониманию зависимости "структура - свойство" с целью прогнозирования требуемых характеристик и осуществления целевого синтеза ФС, принадлежащих к различным классам МГЦ.

Методология и методы исследования. Методологической основой исследования выступали общенаучные и специальные методы, такие как синтез, инструментальный анализ, обобщение и сравнение. Работа выполнена с привлечением методов 1D и 2D ЯМР-, фотонной корреляционной, электронной абсорбционной (ЭСП), а также стационарной и разрешенной во времени флуоресцентной (Фл) спектроскопии, масс-спектрометрии (МС), термогравиметрии (ТГ), спектроскопии электрохимического импеданса, метода изотермического насыщения, а также методов цитологии и микробиологии.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Синтез и идентификация H2Chl, H3Cor и H2Pc с полярными группами, фотофизические характеристики и термоустойчивость МГЦ;

2. Процессы ассоциации и агрегации с участием H2Chl, H3Cor и H2Pc в воде и водных растворах ПАВ, взаимодействие ФС с носителями;

3. Особенности межфазного распределения МГЦ в системе "OctOH -PSB" как показателя его амфифильности;

4. Фотоцитотоксичность ФС в отношении патогенных микроорганизмов in vitro.

Степень достоверности и апробация результатов. Степень достоверности результатов обеспечивается использованием комплекса независимых методов, подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, полученных на современном высокоточном оборудовании и публикациями в рецензируемых журналах, индексируемых в РИНЦ, Scopus и WoS. Экспериментальные данные получены с применением методов математической статистики и современных теоретических представлений в области органической и физической химии.

Основные материалы диссертационной работы представлены на: V и VI Межд. конф. по физич. химии краун-соед., порф. и фталоц. (Туапсе, 2014, 2016 гг.); VI Межд. конф. "Супрамолек. системы на поверхн. раздела" (Туапсе, 2015 г.); XII и XIII Межд. конф. "Синтез и прим. порф. и их аналогов" (Кострома, 2016, 2019 г.); Межрег. науч. конф. студ. и молод. ученых "Медико-биологич., клинич. и социальн. вопросы здор. и патологии человека" (Иваново, 2016, 2017 гг.); Рег. студ. науч. конф. "Фунд. науки - специалисту нового века" (Иваново, 2016, 2017 гг.); XV Межд. конф. по терм. анализу и калорим. в России (Санкт-Петербург, 2016 г.); 9 Intern. соп£ on porph. & phthaloc. (ICPP-9, Нанкинь, Китай, 2016 г.); XI Межд. школе-конф. молод. ученых по химии порф. и их аналогов (Иваново, 2017

г.); III и VI Междисц. конф. "Молек. и биологич. аспекты химии, фармац. и фармакол." ("МОБИ-ХимФарма", Севастополь, 2017 г., Н.-Новгород, 2020 г.); VI Всеросс. конф. "Фотодинамич. терапия и фотодиагн." (Ростов-на-Дону, 2017 г.); XIII Межд. конф. "Проблемы сольв. и комплексообр. в раств." (Суздаль, 2018 г.); 5-я Росс. конф. по биомед. химии "МедХим - Россия 2021" (Волгоград, 2022 г.).

Работа выполнена при финансовой поддержке РНФ (проект № 15-1300096) и РФФИ (проект № 20-53-00038 Бел_а).

Личный вклад автора заключался в постановке и проведении эксперимента, систематизации полученных результатов, формулировке выводов, а также в подготовке (совместно с соавторами) научных публикаций. Постановка цели и задач исследования, обсуждение результатов работы осуществлялось совместно с научными руководителями.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 4 статьи в журналах, входящих в Перечень рецензируемых научных изданий, 1 патент РФ и 10 тезисов докладов на конференциях различного уровня.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из списка сокращений, введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и заключения, списка цитируемой литературы (210 источников) и приложения (52 стр.). Работа изложена на 229 страницах, содержит 37 схем, 8 таблиц и 55 рисунков.

Литературный обзор

Глава 1. Химическая модификация и спектральные характеристики макрогетероциклических сенсибилизаторов для антимикробной ФДТ

Благодаря многолетним усилиям ученых, работающих в области органического синтеза, химии ароматических макрогетероциклов - порфиринов и их аналогов -получен целый набор структурных групп пигментов, подчас, принципиально различающихся физико-химическими характеристиками и реакционной способностью [8, 13, 14]. Отдельные классы соединений, производные порфина (И2Р, рис. 1.1), такие как синтетические хлорины (И2СЫ), корролы (ИзСог) и фталоцианины (ШРс) получены еще в 30-60х гг. XX века [13, 34-37], другие -всего 20-30 лет назад [10, 38]. В результате дальнейшей функционализации и постфункционализации МГЦ им может быть придан широкий спектр требуемых свойств, например, растворимость в воде, интенсивная люминесценция, рецепторные и каталитические свойства и т.д. [2-7].

И2Р И2Ш ИзСог И2РС

Рисунок 1.1. Некоторые типы ароматических макрогетероциклов (МГЦ).

В настоящем разделе рассмотрены способы химической модификации трех классов МГЦ - хлоринов, корролов и фталоцианинов, необходимой с точки зрения их практического использования в качестве препаратов для фотодинамической терапии (ФДТ) онкологических заболеваний и микробных инфекций. Одним из главных требований к ФС является амфифильность, т.е. сохранение определенного гидрофильно-липофильного баланса МГЦ, регулирующего не только эффективность генерации этими пигментами активных форм кислорода (АФК), но и особенности его связывания белками крови, а также селективность накопления в атипичных клетках, что во многом предопределяет тип механизма клеточной смерти и позволяет улучшить результативность ФДТ [20-22, 25-27].

1.1 Синтез ароматических тетрапиррольных соединений на основе хлоринов, корролов и фталоцианинов с полярными группами 1.1.1 Основные способы получения макрогетероциклов

Хлорины. Н2СЫ и их производные получают как синтетически, так и из природных источников [34 - 42]. Молекула хлорофилла a (рис. 1.2) представляет собой гетерофункциональный макроцикл, что позволяет проводить широкую химическую модификацию входящих в его состав заместителей.

Рисунок 1.2. Основные способы первичной химической модификации хлорофилла а.

Как правило, ее основные пути направлены на получение производных феофорбида а и хлорина еб, а также на их дальнейшие превращения [13, 15, 34, 39, 41-43]. Для молекулы хлорофилла a [41, 42] можно выделить следующие пути

преобразования структуры: реакции сложноэфирных (карбоксильных) групп (гидролиз, переэтерификация, амидирование, восстановление); превращения экзоцикла (изомеризация, неокислительное размыкание (получение производных хлорина еб), окислительное размыкание (производные пурпурина 18), окисление СН-связи в 13(2)-положении); реакции карбонильной группы (окисление-восстановление, присоединение (защита карбонильной группы), конденсация); реакции с участием винильной группы (окисление-восстановление, присоединение электрофильно-нуклеофильных реагентов); электрофильное мезо-замещение (галогенирование, формилирование, нитрование и т.д.); окисление-восстановление пиррольных колец. Основные способы первичной химической модификации хлорофилла а с участием координационного центра, сложноэфирных карбоксильных групп и циклопентанонного кольца молекулы представлены на рисунке 1.2. Чаще всего в качестве продукта выделяют метилфеофорбид а (соед.1, рис. 1.2), который образуется при действии метанольного раствора серной кислоты на хлорофилл а.

Корролы. Все НзСог, в отличие от хлоринов, относятся к соединениям чисто синтетического происхождения, хотя и имеют родство с корриновым макроциклом витамина В12 [10, 17, 44]. Синтез мезо-арилзамещенных корролов преимуществено основан на реакциях конденсации ароматических альдегидов с пирролом и/или дипирролилметанами. В зависимости от характера арильных мезо-заместителей одна и та же синтетическая методика может приводить к различным выходам как конечных целевых, так и побочных продуктов, в основном, соответствующего мезо-замещенного порфирина. Это влечет за собой трудности при дальнейшем хроматографическом разделении смеси ИзСог и Н2Р из-за довольно близких значений времени удержания (Л). Поэтому большинство методик синтеза корролов отличаются невысокими выходами продукта (менее 20 - 30 %) [10, 17, 45, 46].

Конденсация пиррола с ароматическими альдегидами приводит к образованию корролов Аз-типа (рис. 1.3). Данный метод представляет собой модифицированную реакцию Ротмунда [14]. В качестве оптимального мольного отношения пиррол-альдегид обычно используется 3 к 1 [46], а в качестве катализатора - трифторуксусная кислота (ТБА). Для увеличения выхода продукта рекомендуется использовать альдегиды, которые в ароматическом кольце содержат электроноакцепторные заместители. Вследствие более высокой

реакционной способности такие альдегиды быстрее взаимодействуют с пирролом, что приводит к снижению выхода порфиринов в ходе реакции, при этом время протекания ее первой стадии (рис. 1.3) может сокращаться до 10 минут; молярное соотношение ТБЛ - альдегид также снижается [47].

я

сно + я

Н+

N

н

я

Ох

я

Рисунок 1.3. Формирование симметричного коррола А3-типа.

я

я

я

Выход Лз-корролов в соответствии с указанным способом составил 8 - 15% [48]. Для получения ЫзСог из стерически затрудненных альдегидов необходимо увеличить время проведения первой стадии процесса до 16 часов и использовать избыток пиррола (молярное соотношение "пиррол-альдегид" - 5:1), а также увеличить концентрацию ТБЛ (молярное соотношение "кислота - альдегид" 0.21:1). Вторая стадия процесса во всех случаях проводится одинаково и включает упаривание растворителя, растворение остатка в дихлорметане и добавление раствора дихлордициан-п-бензохинона (ВЭР) с целью проведения окислительной циклизации [48].

Описанная авторами работы [47] методика отличается использованием водно-метанольной (1:1 по объему) реакционной среды и соляной кислоты в качестве катализатора первой стадии процесса, которая длится 3 часа в избытке пиррола по отношению к альдегиду 2:1. Образующийся линейный интермедиат (билан) в этих условиях выпадает в осадок, который после экстракции хлороформом окисляют до коррола в течении 5 минут с помощью ЭЭр или в течении 1 часа при использовании пара-хлоранила при кипячении (рис. 3). Этим методом авторам [47] удалось достигнуть достаточно высоких выходов корролов - около 30%.

Для получения низкосимметричных корролов применяется конденсация дипирролилметанов с замещенными ароматическими альдегидами (рис. 1.4). При

этом коррол А2В-типа аналогично формируется в две стадии (ступенчатое кислотно катализируемое электрофильное замещение и окисление).

Рисунок 1.4. Формирование низкосимметричного коррола А2В-типа.

В статье [49] авторами было исследовано влияние природы кислотного катализатора, времени проведения процесса, концентрации и природы реагентов, а также растворителя на выход продукта в реакции получения мезо-замещенных ИзСог из соответствующих дипирролилметанов и альдегидов (рис. 1.4). Было показано, что наилучшими условиями для синтеза являются: молярное соотношение дипирролилметан-альдегид равно 2:1, катализатор - ТБЛ, растворители - хлорированные углеводороды (дихлорметан, хлороформ, дихлорэтан), а время проведения первой стадии реакции - 5 часов. Вторая стадия проводилась с использованием ЭЭр в качестве окислителя (рис. 1.4). Выход корролов в этом случае может составлять от 6 до 30 % [49].

Фталоцианины. Н2Рс также, как и корролы, являются соединениями синтетической природы. Для формирования макрогетероциклического остова фталоцианинов в основном используется реакция циклической тетрамеризации орто-дизамещенных производных бензола, таких как фталонитрил, фталимид, фталевый ангидрид и 1,3-дииминоизоиндолин [18, 36, 50] (рис. 1.5).

Распространенным методом получения незамещенного фталоцианинового лиганда является взаимодействие фталонитрила с металлическими литием или натрием в спиртовой среде при 408 К. После проводят стадию деметаллирования получившегося металлофталоцианина при действии концентрированной серной или ледяной уксусной кислот [50]. Данный способ синтеза характеризуется хорошими выходами и небольшим, не более 30 минут, временем реакции. "Низкотемпературный" синтез фталоцианинов из соответствующих фталонитрилов в среде кипящего хлороформа был предложен в работе [51].

о

Рисунок 1.5. Основные способы получения фталоцианинов [18].

Металлокомплексы фталоцианинов образуются при взаимодействии фталонитрила с галогенидами металлов при нагревании выше 473 К в апротонных растворителях или при сплавлении реагентов [18]. В ходе синтеза возможно образование хлорированных макроциклов в качестве побочных продуктов, очистка от которых зачастую невозможна. Поэтому для получения чистых фталоцианинов из дихлоридов металлов было предложено вводить в реакционную смесь 2-метилнафталин, который легко подвергается хлорированию и выводится из реакции [52].

1.1.2 Функционализация молекул, направленная на введение полярных

групп

Порфириновый макроцикл и родственные ему МГЦ гидрофобны по своей природе. Низкая растворимость порфиринов обусловлена относительно высокой энергией кристаллической решетки и низкими энергиями сольватации молекул [15, 53, 54]. Наличие в структуре макроциклов полярных групп повышает их растворимость в воде и физиологических жидкостях, что является важным условием для улучшения биосовместимости и успешного применения этих соединений в биологии и медицине. Гидрофильные тетрапиррольные соединения

подразделяются на катионные, анионные и электронейтральные макрогетероциклы [15, 19].

В качестве анионных групп в гидрофильных тетрапиррольных МГЦ чаще всего выступают сульфо- и карбокси-группы. Для солюбилизации ароматических тетрапирролов электронейтральными заместителями используются фрагменты углеводов и полиэфиров [19]. Катионные МГЦ, в отличие от анионных или нейтральных аналогов, обладают выраженной фотоиндуцированной антимикробной активностью в отношении грамотрицательных бактерий, проявляют противовирусные и противогрибковые свойства [25, 27-29, 33]. Фрагментами с положительным зарядом в составе ФС могут выступать триалкиламмониевые, ^метилпиридильные и родственные им группы [55-57]. Рассмотрим особенности формирования водорастворимых форм МГЦ различных классов.

1.1.2.1 Производные феофорбида а и хлорина вв

Разнообразие молекул природных хлоринов, включая хлорофилл а и бактериохлорофилл а, открывает широкие возможности для направленной модификации этих соединений с целью получения замещенных МГЦ и их конъюгатов с другими молекулами, обладающих улучшенными фотофизическими характеристиками, повышенной гидрофильностью, а также селективностью накопления в атипичных и микробных клетках [39-42, 56].

Например, для конъюгирования бактериохлоринового макроцикла с гомотаурином (3-аминопропан-1-сульфоновая кислота), содержащим сульфо-группу, используется возможность размыкания циклопентанонного кольца МГЦ с образованием амидов (схема 1.1) [19].

Способ внедрения фрагмента аспарагиновой кислоты в положение 15 приведен в патенте [58]. На первой стадии происходит активация хлорина гв N этил-№-(3-диметиламино-пропил)карбодиимид (БЭС), в результате чего образуется ангидрид. Далее проводят реакцию взаимодействия очищенного продукта реакции активации с аспартатом натрия с выделением ФС моно-Ь-аспартил хлорина еб (топо-Ь-аврайу! сЫогт гб - МАСЕ) (схема 1.2).

о=сн Н сн3

н

N Л7с2н5

' У "Ч Н

ра \

V /

Н / N

X ||

н3сх нс

/^сНз

Н2с Н

ноос нзсоос

о

H2N (сН2)3 803Н

-

БМ80/Лг

калиевый фосфатный буфер, рН 8.2

о=сн

н снз

а=Т л"

Нзс \ N N ,-с2Н5

" \ ж" ' н

ра

\ ' \ )

Н\/ -N N.

Н3сЛ || 1 _сн3

Н2с

1 сн2

нс п \

соосн3 ын

Коос сн2^.

"снсн2

8о3К

Схема 1.1. Конъюгирование бактериохлоринового макроцикла с гомотаурином [19].

н2с=сн сн3

н3с

н3с

^ ) с2н5

н2с 2|

нс

21 соон ноос

н2с=сн

н3с

с2н5

БЭс/ЭМЕ

н

н3с

т2

н2с=ш

нзс~Л

сн3 \

Каоос

Н2о/ЫаоН

н

\ /

сн-

сн

н3с

н2с н

21 .сн2 нс

с

№оос

№оос

3

Схема 1.2. Двухстадийный синтез моно^-аспартил хлорина еб [58].

3

Карбоновые кислоты гораздо слабее сульфокислот, поэтому получение водорастворимых форм таких соединений возможно только в ходе их солеобразования. В качестве противоиона могут выступать катионы натрия [5960] или органические производные солей аммония, например, соли пиперазиния и имидазолия (схема 1.3) [60].

Схема 1.3. Получение солей на основе карбоновой кислоты пирофеофорбида а [60].

Для синтеза хлоринов с К,К-диметиламинометильным заместителем в винильной группе используют реакцию взаимодействия с

диметилметиленаммоний йодидом ("реагентом Эшенмозера") [61]. С целью синтеза дикатионных хлоринов применяют реакцию кватернизации дважды аминометилированных производных хлорина еб, полученных действием бис-(К,К-диметиламино)метана (схема 1.4) [62].

Схема 1.4. Реакция кватернизации дважды аминометилированных производных хлорина еб, полученных действием бис-(Ы,Ы-диметиламино)метана [62].

В работах [63, 64] были получены О- и ^-замещенные амфифильные гликоконьюгаты пирофеофорбида а. Для получения О-гликозида применяли метод гликозилирования ацетатов углеводов в присутствии кислот Льюиса (схема 1.5) [64].

снз

V

ОАс о^с

Т—' ОАс

ОАс

с2н5

ч

АсО-( °Ас

нзс^

^сн3

О

БРз - О(С2Н5)2

Н3С н2с

нс 2|

Н3СООС

с2н5

^снз

О

Он

V—' он

Он

сн3О№

сн3он

н3с—сн

нзсЧ

нзс н2с нс

п

нзсоос

с2н5

^снз

О

Схема 1.5. Получение О- и 8-замещенных амфифильных гликоконьюгатов пирофеофорбида а (* - смесь изомеров) [64].

нс—сн

Метилфеофорбид а с этиленгликольным фрагментом в положении 1 3 описан в патенте [65]. 13(2)-Эфир метилфеофорбида а был получен растворением метилфеофорбида а в пиридине и толуоле при добавлении триэтиленгликоля,

затем реакционную смесь нагревали в течение 16 часов в атмосфере азота (схема 1.6).

13 [65].

1.1.2.2 Производные мезя-триарилкорролов

Мезо-арилкорролы представляют собой гидрофобные молекулы и для раскрытия их практически полезных свойств зачастую необходимо придать молекуле гидрофильность, которая, при высокой степени выраженности, может приводить к растворимости ШСог в воде и биологических жидкостях [10, 17].

При синтезе корролов с анионными фрагментами в основном применяется прямое сульфирование макроцикла различными агентами, например хлорсульфоновой или серной кислотами (схема 1.7) [66, 67]. Гидролиз двух хлорсульфоновых групп также приводит к образованию бис-сульфокислоты.

нОз8 с6Р5

Схема 1.7. Прямое сульфирование макроцикла 5,10,15-трис(пентафтор-фенил)коррола

хлорсульфоновой или серной кислотами [66, 67].

Хлорангидриды корролсульфоновых кислот могут быть также использованы в качестве универсального полупродукта для получения ЫзСог с различными, преимущественно, анионными и неионогенными функциональными группами (рис. 1.6). Примеры синтезов различных водорастворимых корролов, приведенные на рисунке 1.6, подробно рассмотрены в статье [68].

В работе [69] приведен ряд методик синтеза корролов А2В-типа, которые в дальнейшем подвергались сульфированию по ^-положениям хлорсульфоновой кислотой с последующим гидролизом сульфохлоридов (схема 1.8). Выходы соответствующих продуктов гидролиза, которые варьируются в зависимости от электронодонорных свойств заместителя в Сю-положении, лежат в интервале 63 - 98%.

Катионные фрагменты в молекулу коррола можно ввести через амино- и пиридильные группы, которые далее подвергаются кватернизации. Одной из первых работ в этой области является статья [70], в которой приводится синтез симметричных трис-пиридил- и аминокорролов по типу Аз с последующей кватернизацией (схема 1.9).

В литературе имеются данные о синтезе низкосимметричных катионных корролов А2В-типа как в виде лигандов, так и их металлокомплексов. В частности, в статье [71] предлагается ступенчатый подход к синтезу ди- и три-катионных корролов путем конденсации 5-(4-пиридил)дипирролилметана и соответствующего пентафторфенил- или пиридилкарбальдегида в пропионовой кислоте с последующим окислением полупродукта DDQ. Затем из ди(пиридил)коррола синтезировали комплекс с Mn(OAc)2-4H2O, после чего проводилась реакция с йодистым метилом в THF при 313 К до полного выпадения из раствора продукта кватернизации (схема 1.10).

Схема 1.10. Синтез дикатионных корролов по реакции конденсации 5-(4-пиридил)дипирролилметана и пентафторфенилкарбальдегида [71].

Первый катионный водорастворимый коррол, синтезированный Гроссом и сотр. (схема 1.11) [72], послужил отправной точкой для дальнейшей модификации этих МГЦ путем нуклеофильного замещения атомов галогенов в мезо-арильных фрагментах.

В работе [73] были синтезированы и охарактеризованы новые анионные водорастворимые конъюгаты корролов с аминокислотами, которые содержали карбокси- и сульфо-группы. Взаимодействие А2В- и Аз-корролов с этиловым эфиром глицина и таурина в присутствии сильного основания оказалось оптимальным для получения коньюгатов ди- и три-замещенных корролов с аминокислотами с хорошими выходами (схема 1.12).

р р // %

р р р

Ь1 N

// \_/ \ СНз\ Г \ // \_// \

Схема 1.11. Модификация МГЦ путем нуклеофильного замещения атомов галогенов в мезо-арильных фрагментах 5,10,15-трис(пентафторфенил)коррола [72].

р

N

р

.ж К =

-ки ИК'

кия р^ ^ ^.р

// X

-Бг

№И, 373 К

БМЯО

Я = - (СИ2)2 - СИз

- СИ2 - СООС2И5

- (СИ2)2 - йОзИ

КИЯ

(СИ2)2 - СИз

- СИ2 - СООИ

- (СИ2)2 - йОзИ

р

р

р

р

р

р

р

р

КИЯ

№И 373 К

БМЗО

Я = - СИ2 - СООС2И5 - (СИ2)2 - ЙО3И

КИЯ

КИЯ

Я = - СИ2 - СООИ р - (СИ2)2 - ЙО3И

Схема 1.12. Синтез новых анионных водорастворимых конъюгатов корролов с аминокислотами [73].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Макаров Владимир Владимирович, 2023 год

Источник

Метод очистки

Метод анализа

Степень чистоты

Тетрафенилпорфин

Цианобактерия

БртИпа platensis

Цианобактерия

БртИпа platensis

Н2ТРР твердый порошок

твердый порошок

твердый порошок

Лого8 0^ашс8

БртИпа о^ашс (Китай)

Мах1ег (Германия)

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.98

>0.95

>0.95

Метиламин

СНзКШ Жидкость

ЬаЬ8ш1е2 (Россия)

Как заявлено поставщиком

0.33

Этилендиамин

Жидкость

Мосхимторг (Россия)

Как заявлено поставщиком

>0.69

К,К-Диметил-этилендиамин

Жидкость

Лсго8 0^ашс8

Как заявлено поставщиком

>0.99

К-Метилпиперазин

Жидкость

Лсго8 0^ашс8

Как заявлено поставщиком

>0.99

Пиридин-4-карбоксальдегид

Тетраметил-диаминометан

Иодистый метил

Жидкость

Жидкость

СНз1 Жидкость

ЛсГ08 0^ашс8

Л1drich ЛЫйсЬ

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.99

>0.99

>0.995

Пиррол

Ру

Жидкость

Л1drich

Перегонка

2,3,4,5,6-Пентафтор бензальдегид

СбБ5СН0 Жидкость

Л1drich

Как заявлено поставщиком

>0.98

3-Метокси-4-гидрокси-5 -иод-фенилкарбальдегид (Ванилин)

2-Хлоро-1-метилпиридиний иодид

4-(^-

диметиламино) пиридин

2.3-Дихлор-5,6-дициан-п-бензохинон

2,3,5,6-Тетрахлор-

1.4-бензохинон

Хлорсульфоновая кислота

Тионилхлорид

Тиофенол

Соляная кислота

Серная кислота

Трифторуксусная кислота

Ацетат магния тетрагидрат

Хлорид алюминия

Аммиак водный

Йодистый калий

твердый порошок

Реактив Мукаяма твердый порошок ДМАП твердый порошок

твердый порошок

п-хлоранил твердый порошок

жидкость

Л1drich

Л1drich

ЛЫГЮЬ

Л1drich

Л1drich

Л1drich

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.98

>0.98

>0.98

>0.98

>0.98

>0.98

жидкость

ЛЫГЮЬ

Как заявлено поставщиком

>0.98

жидкость

ЛЫГЮЬ

Как заявлено поставщиком

>0.98

НС1

жидкость

Экос-1

Как заявлено поставщиком

0.35

Н2804 жидкость

Экос-1

Как заявлено поставщиком

>0.93

ТБЛ жидкость

Mg(0Лc)2•4H20 твердый порошок

Л1С13 твердый порошок

Вектон (Россия)

Мосхимторг (Россия)

Мосхимторг (Россия)

Перегонка

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.99

>0.99

Шэ

жидкость

Экос-1

Как заявлено поставщиком

0.25

К1

твердый порошок

Мосхимторг (Россия)

Как заявлено поставщиком

>0.99

Хлорид натрия Карбонат калия Карбонат натрия

Гидрокарбонат натрия

КаС1 твердый порошок

К2С0з твердый порошок

^С0з твердый порошок

КаНС0з твердый порошок

Мосхимторг (Россия)

Мосхимторг (Россия)

Мосхимторг (Россия)

Мосхимторг (Россия)

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.99

>0.99

>0.99

>0.99

2.1.2 Растворители

Использованные в работе растворители, поверхностно-активные и

вспомогательные вещества приведены в таблице 2.2.

Таблица 2.2. Оценка качества растворителей, поверхностно-активных и вспомогательных

веществ.

Химическое название

Аббревиатура / фазовое состояние

Источник

Метод очистки

Метод анализа

Степень чистоты

Вода

1-Октанол

Ацетон

Этанол

Н20

жидкость

1-0сЮН,

жидкость

NN БМБ,

Диметилформамид жидкость

Ме2СО жидкость

БЮН

жидкость

Рапгеас (Испания)

Рапгеас (Испания)

Вектон (Россия)

Вектон (Россия)

Бидистилл я-ция Сушка с молекуляр

ными ситами 4

А,

Сушка с молекуляр

ными ситами 4

А,

вакуумная Сушка с молекуляр

ными ситами 4

А,

КипАяч, ени

е с М§, сушка с молекуляр ными

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Хроматография

Титрование по Фишеру

>0.98

>0.99

>0.99

0.96

ЛТТТП ЛГТТ ,

Метанол

Тетрагидрофуран

Уксусная кислота

Хлороформ

Дихлорметан

Четыреххлористый углерод

Пентан

Ме0Н жидкость

Сушка с молекуляр ными

ТНБ

жидкость

Л^Н

жидкость

СНС13 жидкость

СН2С12 жидкость

СС14 жидкость

С5Н12 жидкость

Вектон (Россия)

Вектон (Россия)

Вектон (Россия)

Вектон (Россия)

Вектон (Россия)

Вектон (Россия)

Вектон (Россия)

ситами 4

А,

Сушка с молекуляр

ными ситами 4

А,

Вымораж ивание, кипячение с

уксусным Перегонка

Перегонка

Перегонка

Титрование по Фишеру

Титрование по Фишеру

Титрование по Фишеру

Титрование по Фишеру

Титрование по Фишеру

Титрование по Фишеру

Как заявлено поставщиком

>0.99

>0.99

>0.99

>0.98 >0.99 >0.99 >0.99

Дейтерированный хлороформ

СБСЬ

жидкость

ЛЫгюЬ

Как заявлено поставщиком

>0.995

Диметил-сульфоксид d6

БМ80 d6

жидкость

Л1drich

Как заявлено поставщиком

>0.995

Тяжелая вода

Фосфатный буфер

Твин 80

Б20

жидкость

Р8В

твердый порошок

жидкость

Л1drich

Лgat-Med (Россия)

Panreac, Еи

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.995

>0.99

>0.97

Поливинил-пирролидон (М = 10000)

Окись алюминия

ПВП

твердый порошок

Л1203 твердый порошок

Рапгеа^ ЕИ

ЛЫгюЬ

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.99

>0.99

Силикагель

Трилон Б

^02

твердый порошок

Na2H2Edta твердый порошок

ЛЫйсЬ

Рапгеас, Еи

Как заявлено поставщиком

Как заявлено поставщиком

>0.99

>0.99

2.2 Методики синтеза и идентификация объектов исследования

Объекты исследования - потенциальные фотосенсибилизаторы для ФДТ (табл. 2.3., соед. 1 - 13), были получены в соответствии с приведенными ниже синтетическими схемами или методиками выделения из природных объектов, очищены и идентифицированы современными физико-химическими методами исследования. Исходное соединение метилфеофорбид а (соед. 1) для синтеза производных хлорина е6 получали, соответственно, из природного хлорофилла а [152]. Основным источником хлорофилла а являлась цианобактерия Бр^иПпа platensis. Для получения корролов и фталоцианинов использовались известные синтетические подходы, которые описаны в литературном обзоре диссертации.

Таблица 2.3 Объекты исследования.

№ соед. Структурная формула Название вещества

1 \\ ЮТ СО2СН3 еоосыз Феофорбид а 17(3)- метиловый эфир (метилфеофорбид а)

2 от / \ ^МН-СЫг-СЫг-ОН СО2СНз СООСН3 О 13(1)-Ы-(2- Гидроксиэтил)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6

Продолжение таблицы

3 ^ ми /^ТЛ си2—си / ) / \ гОгИ / о N ми со2сиз сооси3 о \ си2—си2 13(1)-Щ1-Пиперазинил)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина еб

4 ми с°2сиз сооси3 о ыи-си2-си2-ы (си3)3 ? 13(1)-Щ2-Триметиламиноэтил иодид)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6

5 ыи Ы--./ / ^ А .си^си2 си3 со2си3 „ / ^тт о ОХ 4 1 ® 2 3 соосиз N си3 I \ у"® си^си2 13(1)-Щ4-Диметилпиперазинил иодид)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6

6 е ® © е I (изс)з N N (сиз)з1 ^^—N ИN— / у' /у\ © © со2сиз сООСН3 о (сиз)з I 3(1),3(2)-бис-(ККN Триметиламинометил иодид)-13(1)-^-(2-^'М"М"-триметил-аммониоэтил иодид)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина вб

7 Б рАА 1 /Г~КЫ ЫК-Д 4-\ \ А у осн3 р^Ар р 10-(3 '-Метокси-4'-гидрокси-5'-иодфенил)-5,15-бис(пентафтор-фенил) коррол

Продолжение таблицы

12 SO3H _/ HO3S 0 О ноДУЧгМ^ГХ 3 V-NH NW ^../^ОзН ^ N У N HN-4 s S 0 ó SO3H 1 HO3S Окта-4-сульфоновая кислота окта-4,5-(фенилсульфанил)-фталоцианина

13 SO3NH4 _/ H4NO3S 0 0 \ S 4 3 v—-N N^ \<=../^SO3NH4 N Al(OH) N H4NO3S^^ jTy-SSO3NH4 \ s 0 ó SO3NH4 1 H4NO3S Аммонийная соль окта-4-сульфоновой кислоты окта-4,5-(фенилсульфанил)-фталоцианина алюминия

2.2.1 Производные хлорофилла 2.2.1.1 Экстракция хлорофилла а и синтез феофорбида а 17(3)-

метилового эфира

Экстракция представляется оптимальным методом для выделения хлорофилла из растительного сырья (Spirulinaplatensis, Urtica dioica L.). Далее показана схема выделения феофорбида а 17(3)-метилового эфира (метилфеофорбида а) из хлорофилла а, который в настоящей работе был получен из магниевого комплекса хлорофилла, экстрагированного из Spirulina platensis 96 % этанолом (схема 2.1) [152].

соед. 1

Схема 2.1. Синтез феофитина а (H2CM а) и метилфеофорбида а (H2Phe a, соед. 1) из хлорофилла а (MgChl а).

Стадия 1. 50 г сухой диспергированной растительной биомассы смешивали с 250 мл этилового спирта. Процесс экстракции проводили в течение 1 часа при температуре 323 К. При использовании ротационного испарителя или с помощью механической мешалки обеспечивали постоянное перемешивание реакционной массы без доступа света. Полученный экстракт фильтровали и подкисляли 36%-й HCl до получения 2 М раствора. Далее смесь помещали на 12 часов в холодильную камеру. Выпавший осадок отделяли от спиртового раствора, сушили под вакуумом и взвешивали.

Стадия 2. Полученные феофитин а (из Spirulina platensis), или смесь пигментов (a + b) (из Urtica dioicа L.) перерабатывались на метилфеофорбид а или смесь производных (a + b), соответственно. Процесс проводили при действии 5 %-ного (об.) раствора серной кислоты в метаноле. Реакционную смесь кипятили в течение 1 часа. После добавляли дистиллированную воду (1:1 по об. к метанолу) и помещали на 12 часов в холодильную камеру. Полученный осадок отделяли от раствора, промывали водой до рН ~ 7, высушивали под вакуумом и взвешивали. Определение значений выхода пигментов в ходе экстракции из растительного сырья производилось в пересчете на метилфеофорбиды из-за более высокой степени кристалличности продукта по сравнению с феофитинами. Чистоту соединений оценивали с помощью ТСХ, ЭСП, МС и ЯМР, она во всех случаях составляла не менее 94 масс. %.

С целью увеличения выхода и чистоты целевого продукта, использовали следующие приемы модификации процесса экстракции [152]: 1. В морозильную камеру на 12 часов отправляли влажную биомассу. Затем подвергали экстракции 250 мл растворителя (этанол) при действии механического перемешивания при температуре 323 К.

2. Переносили сухую зеленую массу в пластиковую тонкостенную емкость. Добавляли 250 мл растворителя и проводили экстракцию с помощью ультразвуковой ванны (частота - 40 кГц, мощность 70 или 120 Вт) при температуре 323 К без механического перемешивания.

3. Аналогично помещали биомассу в пластиковую емкость, добавляли 250 мл этанола, но совмещали ультразвуковую обработку (частота - 40 кГц, мощность -70 Вт) с постоянным механическим перемешиванием при 323 К.

4. Перед проведением экстракции при 323 К с помощью ультразвука (частота -40 кГц, мощность - 70 Вт) и использования механической мешалки добавили обработку жидким азотом смеси растительной биомассы и 250 мл этанола.

Спектральные характеристики соед. 1 приведены в Приложении А (рис. А1

- А3).

Феофорбид а 17(3)-метиловый эфир (соед. 1)

Масс-спектр: m/z (MALDI-TOF) (%) = 606.80 [M]+ (100), 607.82 [M+H]+ (78), 629.86 [M+Na]+ (49), 608.85 [M+2H]+ (20) Рассчитано: 606.72 г/моль.

Спектр 1Н ЯМР: S, м.д. (CDCh, ТМС) 9.55 (с, 1Н, 10-СН), 9.42 (с, 1Н, 5-СН), 8.59 (с, 1Н, 20-СН), 8.02 [д.д, 1H, 3(1)-СН, J = 17.8 и 6.4 Гц], 6.28 (с, 1H, 13(2)-CH), 6.26 [ш.д.д, 2Н, 3(2)-CH2, J = 17.9 и 11.6 Гц], 4.50 - 4.20 (м, 2Н, 17-СН, 18-CH), 3.90 (с, 3Н, 15(3)-СНз), 3.72 [кв, 2Н, 8(1)-СШ, J = 7.9 Гц], 3.71 (с, 3Н, 17(4)-СНз), 3.60 (с, 3Н, 12(1)-СНз), 3.43 (с, 3Н, 2(1)-СНз), 3.27 (с, 3Н, 7(1)-СНз), 2.65 - 2.17 (м, 4Н, 17(1), 17(2)-СШ), 183 [д, 3Н, 18(1)-СН3, J = 7.4 Гц], 1.72 [т, 3Н, 8(2)-СН3, J = 7.6 Гц], 0.58 (ш.с, 1Н, 21-NH), -1.59 (ш.с, 1Н, 23-NH).

ЭСП (DMF) Я макс, нм: 412, 507, 537, 609, 667; (1-OctOH) Лмакс, нм: 412, 507, 538, 611, 669.

2.2.1.2 Синтез и идентификация 13(1)-^(2-гидроксиэтил)амцда-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина вв

90 мг (0.149 ммоль) метилфеофорбида а (соед. 1) было растворено в 9 мл хлороформа, к раствору добавлено 0.6 мл (9.09 ммоль) этаноламина. Реакционная масса перемешивалась при комнатной температуре в течение 16 ч (схема 2.2) (Заметим, что для ускорения процесс может быть проведён при кипячении в дихлорметане в течение 2 ч.). Затем реакционная смесь была промыта от амина водой, разбавленным раствором HCl и снова - водой. После упаривания растворителя реакционная масса была подвергнута колоночной хроматографии

на силикагеле с использованием смесей дихлорметан-метанол в качестве элюента (от 1 до 10 % об. метанола). Выход 14 мг (15 %). Спектральные характеристики соед. 2 приведены в Приложении А (рис. A4 - А5).

13(1)-И-(2-Гидроксиэтил)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина ев (соед. 2)

Масс-спектр: m/z (MALDI-TOF) (%) = 668.32 [M]+ (100), 669.32 [M+H]+ (49), 667.32 [M-H]+ (22). Рассчитано: 667.81 г/моль.

Спектр 1H ЯМР: S, м. д. (CDCI3, ТМС) 9.68 (с, 1Н, 10-СН), 9.64 (с, 1Н, 5-СН), 8.82 (с, 1Н, 20-СН), 8.10 [д.д, 1Н, 3(1)-СН, J = 17.8 и 11.6 Гц], 6.37 [д, 1Н, 3(2)(транс)-СН, J = 17.9 Гц], 6.16 [д, 1Н, 3(2)(цис>СН, J = 11.6 Гц], 6.85 [ш. т, 1Н, 13(1) (амид)-NH, J = 5.4 Гц], {15(1)-СН2 5.59 и 5.32 [2д, 1Н кажд., J = 18.8 и 18.7 Гц]}, 4.48 [кв, 1Н, 18-СН, J = 7.3 Гц], 4.41 [д.д, 1Н, 17-СН, J = 9.7 и 1.8 Гц], {13(2)-СН2, 13(3)-СН2: 3.94-3.80 (м, 2Н) и 4.00 [т, 2Н, J = 5.1 и 4.6 Гц]}, 3.75 (с, 3Н, 15(3)-СН3), 3.62 (с, 3Н, 17(4)-СН), 3.56 (с, 3Н, 12(1)-СЩ, 3.51 (с, 3Н, 2(1)-СН3), 3.32 (с, 3Н, 7(1)-СН3), 3.78 [кв, 2Н, 8(1)-СШ, J = 7.7 Гц], 2.60-2.13 (м, 4Н, 17(1),17(2)-СН2), 1.73 [д, 3Н, 18(1)-СН3, J = 6.8 Гц]; 1.72 [т, 3Н, 8(2)-СШ, J = 7.5 Гц], -1.55 (с, 1Н, 21-NH), -1.76 (ш. с, 1Н, 23-NH).

соед. 1 соед. 2

Схема 2.2. Синтез 13(1)-Ы-(2-гидроксиэтил)амида-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина ев (соед. 2).

2.2.1.3 Синтез и идентификация 13(1)-^(1-пиперазинил)амида-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина вв

100 мг (0.165 ммоль) метилфеофорбида а (соед. 1) было растворено в 25 мл бензола, к раствору добавлено 0.545 г (6.34 ммоль) пиперазина. Реакционная масса перемешивалась в течение 2 ч при комнатной температуре (схема 2.3), затем была разбавлена хлороформом, промыта водой, разбавленным раствором HCl и снова водой. Затем растворитель был упарен. Реакционная смесь была

подвергнута колоночной хроматографии на силикагеле с использованием хлороформа и смесей хлороформ-метанол (до 10 % об. метанола). Для более тщательной очистки проводилась повторная хроматография. Выход 12 мг (11 %). Продукт представляет собой смесь пространственных изомеров (соотношение по 1Н-ЯМР-спектру 2:1). Спектральные характеристики соед. 3 приведены в Приложении А (рис. А6 - А9).

13(1)-Ы-(1-Пиперазинил)амид 15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина ев (соед. 3) [153]

Масс-спектр: m/z (MALDI-TOF) (%) = 679.36 [M-Cft+НГ (100), 680.37 [M-Ш3+2Н]+ (48), 678.40 [M-C№]+ (33), 701.36 [M+Li+Н^ (26). Рассчитано: 692.86 г/моль.

Спектр 1H ЯМР: Ö, м. д. (CDCI3, ТМС) - мажорный изомер: 9.74 (с, 1Н, 10-СН), 9.70 (с, 1Н, 5-СН), 8.87 (с, 1Н, 20-СН), 8.15 [д.д, 1H, 3(1)-СЫ, J = 18.1 и 11.5 Гц], 6.39 [ш.д.д, 1Н, 3(2) (транс)-СН, J = 17.9 и 4.5 Гц], 6.17 [ш.д.д, 1Н, 3(2)(цис)-СН, J = 11.4 и 3.5 Гц], 5.82 и 5.10 [2д, 1Н кажд., 15(1)-СШ, J = 19.2 и 19.4 Гц], {13-mNC4H8NH: 4.72 [ш.д.т, 1Н, J = 13.0 и 3.8 Гц], 4.05 - 4.00 (м, 1Н), 3.25 -3.11 (м, 2Н), 3.06 - 2.90 (м, 1Н), 2.37 - 2.14 (м, 4Н, вкл. 2.20 (с, 1H, 13-raNC4H8NH)}, 4.50 [кв, 1Н, 18-СН, J = 7.3 Гц], 4.43 [ш.д, 1Н, 17-СН, J = 8.2 Гц], 3.88 (с, 3Н, 15(3)-СШ), 3.67 (с, 3Н, 17(4)-СШ), 3.59 (с, 3Н, 12(1)-СШ), 3.54 (с, 3Н, 2(1)-СН3), 3.36 (с, 3Н, 7(1)-СШ), 3.85 - 3.81 (м, 2Н, 8(1)-СШ), 2.77 - 2.54 (м, 4Н, 17(1), 17(2)-СШ), 1.79 - 1.73 (м, 6Н, 18(1)-СШ; 8(2)-СШ), -1.67 (ш.с, 1Н, 21-NH), -1.87 (ш.с, 1Н, 23-NH); Минорный изомер: 9.71 (с, 1Н, 10-СН), 9.67 (с, 1Н, 5-СН), 8.82 (с, 1Н, 20-СН), 8.11 [д.д, 1Н, 3(1)-СН, J = 18.3 и 11.3 Гц], 6.39 [ш.д.д, 1Н, 3(2)(транс)-СН, J = 17.9 и 4.5 Гц], 6.17 [ш.д.д, 1Н, 3(2)(цис>СН, J = 11.4 и 3.5 Гц], 5.46 и 5.26 [2д, 1Н кажд., 15(1)-СШ, J = 19.1 и 19.2 Гц], {13-mNC4H8NH: 4.41 - 4.34 (м, 1Н), 4.05 - 4.00 (м, 1Н), 3.25 - 3.11 (м, 2Н), 3.06 - 2.90 (м, 1Н), 2.37 - 2.14 (м, 4Н, вкл 2.20 (с, 1H, 13-raNC4H8NH}}, 4.50 [кв, 1Н, 18-СН, J = 7.3 Гц], 4.43 [ш.д, 1Н, 17-СН, J = 8.2 Гц], 3.83 (с, 3Н, 15(3)-СШ), 3.64 (с, 3Н, 17(4)-СШ), 3.55 (с, 3Н, 12(1)-СН3), 3.52 (с, 3Н, 2(1)-СШ), 3.35 (с, 3Н, 7(1)-СШ), 3.85 - 3.81 (м, 2Н, 8(1)-СН2), 2.77 - 2.54 (м, 4Н, 17(1), 17(2)-СШ), 1 79 - 1.73 (м, 3Н, 8(2)-СШ), 1.68 [д, 3Н, 18(1) СН3, J = 7.2 Гц], -1.57 (ш.с, 1Н, 21-NH), -1.72 (ш.с, 1Н, 23-NH).

ЭСП (DMF) Я макс, нм: 401, 501, 529, 559, 608, 664; (1-OctOH) Ямакс, нм: 401, 501, 529, 558, 609, 665.

Схема 2.3. Синтез 13(1)-Ы-(1-пиперазинил)амида-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина ев (соед. 3) [153].

2.2.1.4 Синтез и идентификация 13(1)-N-(2-триметиламиноэтилиодид)амид- и 13(1)-N-(4-диметилпиперазинилиодид)амид-15(2),17(3)-диметиловых эфиров

хлорина вв

Стадия 1. К раствору 50 мг (0.082 ммоль) метилового эфира феофорбида а (соед. 1) в 2 мл хлороформа добавляли 0.36 мл (3 ммоль) ^^диметилэтилендиамина или 0.41 мл (3 ммоль) N-метилпиперазина (схема 2.4). Реакционную смесь перемешивали в течение 2 часов в темноте в инертной атмосфере при 313 К. Затем ее промывали водой до нейтрального значения рН. Органический слой отделяли, сушили над Na2SÜ4, отфильтровывали, растворитель упаривали досуха, далее полученный продукт очищали методом колоночной хроматографии на силикагеле. Элюировали смесью хлороформ-изопропанол 30:1 (по объему). Выход 30 - 37 мг (53 - 65 %).

Стадия 2. К раствору 30 мг (0.043 ммоль) амида хлорина еб в 1.5 мл хлороформа добавляли 1 мл (0.016 моль) метилиодида. Реакцию проводили при перемешивании при комнатной температуре в течении 30 минут. Растворитель упаривали досуха. Полученное соединение очищали методом колоночной хроматографии. Элюировали смесью хлороформ-метанол 15:1 (по объему). Продукты (соед. 4, 5) алкилирования получены с количественным выходом.

Спектральные характеристики соед. 4 приведены в Приложении А (рис. А10 - А11).

13(1)-М-(2-триметиламиноэтилиодид)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина еб (соед. 4) [154]

Масс-спектр: m/z (MALDI-TOF) (%) = 709.73 [M-I]+ (100). Рассчитано: 836.81 г/моль.

Спектр 1H ЯМР: Ö, м.д. (CDCls, ТМС) 9.54 (с, 1Н, 10-СН), 9.46 (с, 1Н, 5-СН), 8.79 (с, 1Н, 20-СН), 7.72 [д.д, 1Н, 3(1)-CH, J = 17.4 и 11.9 Гц], 7.30-7.24 (ш.м, 1Н, 13(1)(амид>Ш), 6.05 [д, 1Н, 3(2)(транс)-СН, J = 17.4 Гц], 5.86 [д, 1Н, 3(2)(цис)-СН, J = 11.9 Гц], 4.93 (с, 2Н, 15(1)-СШ), 4.49 (кв, 1Н, 18-СН, J = 7.3 Гц], 4.34 [ш.д, 1Н, 17-CH, J = 9.2 Гц], 3.64 (с, 6Н, 15(3)-СН3, 17(4)-СН3), 3.58 [кв, 2Н, 8(1)-СН2, J = 7.3 Гц], 3.28 (с, 6Н, 12(1)-СН3, 7(1)-СН3), 3.14 (с, 3Н, 2(1)-СН3), 3.122.88 (м, 4Н, 13(2), 13(3)-СН2), 2.66 (с, 9Н, 13(4)^(СН3)3+1-), {17(1), 17(2)-СШ: 2.61-2.53 (м, 1Н), 2.33-2.14 (м, 3Н)}, 1.76 [д, 3Н, 18(1)-CH3, J = 7.3 Гц], 1.68 [т, 3Н, 8(2)-CH3, J = 7.3 Гц], -1.55 (ш.с, 1Н, 21-NH), -1.80 (ш.с, 1Н, 23-NH).

ЭСП (EtOH) Ямакс, нм: 397, 500, 529, 608, 662; (H2O) Ямакс, нм: 396, 502, 555, 604, 660.

Продукты 13(1 )-№(4-метилпиперазинил)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина е6 и соед. 5 представляет собой смесь пространственных изомеров (соотношение по 1Н-ЯМР-спектру 5:1). Спектральные характеристики полученных соединений приведены в Приложении А (рис. А12 - А18).

13(1)-И-(4-метилтперазшил)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир

хлорина ев

Масс-спектр: m/z (MALDI-TOF) (%) = 708.50 [M+H]+ (100), 709.51 [M+2H]+ (42), 707.47 [M]+ (20). Рассчитано: 706.89 г/моль.

Спектр 1H ЯМР: Ö, м.д. (CDCI3, ТМС) Мажорный изомер: 9.74 (1Н, с, 10-Н); 9.69 (1Н, с, 5-Н); 8.87 (1Н, с, 20-Н); 8.09-8.17 (1H, м, 3(1)-H); 6.40 (1Н, д, J~12 Гц, 3(2)(транс)-Н); 6.18 (1Н, д.д, J = 11.4 и 3.5 Гц, 3(2)(цис)-Н); 5.83 и 5.09 (2Н, все уш.д, J = 12 Гц, 15-СН2СО2СН3); 4.51 (1Н, кв., J = 7.3 Гц, 18-Н); 4.38 (1Н, д, J = 12 Гц, 17-Н); 3.87 - 3.81 (2Н, м, 8-СН2СН3); 3.89 (3Н, с, 15-СН2СО2СН3); 3.68 (3Н, с, 17-СН2СН2СО2СН3); 3.58 (3Н, с, 12-СН3); 3.53 (3Н, с, 2-СН3); 3.36 (3Н, с, 7-СН3); 2.73-2.54 (4Н, м, 17-СН2СН2СО2СН3); 13-СОNC4H8NCHз: 4.75 (1Н, уш.с); 3.28-3.08 (2H, м); 3.04 - 2.88 (2Н, м); 2.54 - 2.34 (4Н, м); 2.26 - 2.14 (2Н, м); 1.83 - 1.71 (6Н, м, 18-СН3; 8-СН2СН3); -1.64 (уш. с, 21-NH); -1.83 (уш. с, 23-NH).

Минорный изомер: 9.71 (1Н, с, 10-Н); 9.67 (1Н, с, 5-Н); 8.82 (1Н, с, 20-Н); 8.09-8.17 (1H, м, 3(1)-H); 6.40 (1Н, д, J =12 Гц, 3(2)(транс)-Н); 6.18 (1Н, д, J = 6 Гц, 3(2)(цис)-Н); 5.48 и 5.24 (2Н, все уш.д, J = 12 Гц, 15-СН2СО2СН3); 4.44 (1Н, м, 18-Н); 4.38 (1Н, м, 17-Н); 3.87 - 3.81 (2Н, м, 8-СН2СН3); 3.83 (3Н, с, 15-СН2СО2СН3); 3.64 (3Н, с, 17-СН2СН2СО2СН3); 3.55 (3Н, с, 12-СШ); 3.53 (3Н, с, 2-СН3); 3.35 (3Н, с, 7-СН3); 2.73-2.54 (4Н, м, 17-СН2СН2СО2СН3); 13-

CONC4H8NCH3: 4.15 (1Н, уш.с); 3.28-3.08 (2H, м); 3.04 - 2.88 (2Н, м); 2.54 - 2.34 (4Н, м); 2.26 - 2.14 (2Н, м); 1.83 - 1.71 (3Н, м, 8-СН2СН3); 1.68 (3H, д, J = 7.2 Гц, 18-СНз;);-1.54 (уш. с, 21-NH); -1.68 (уш. с, 23-NH).

13(1) -Ы-(4-диметилпиперазинилиодид)амид-15(2),17(3)-диметиловый эфир хлорина еб (соед. 5)

Масс-спектр: m/z (MALDI-TOF) (%) = 721.93 [M-I]+ (100), 722.94 [M-I+H]+ (48), 775.84 [M-I+2CH3+Na+H]+ (25). Рассчитано: 848.82 г/моль.

Спектр 1H ЯМР: Ö, м.д. (CDCI3, ТМС) Мажорный изомер: 9.59 (c, 1Н, 10-CH), 9.48 (c, 1Н, 5-CH), 8.81 (c, 1Н, 20-CH), 7.70-7.95 (м, 1H, 3(1)-CH), 6.10 [д, 1Н, 3(2)(транс)-СН, J = 17.8 Гц], 5.90 [д, 1Н, 3(2)(цис)-СН, J = 11.3 Гц], 4.95 [д.д, 2Н, 15(1)-СН2, J = 18.9 и 13.7 Гц], {13-CONC4HgN: 3.14 - 2.82 (м, 2Н), 2.64 - 2.55 (м, 2Н), 2.54 - 2.43 (м, 2Н), 2.28 - 2.15 (м, 2Н); 13-CОNC4H8N(CHз)2: 2.48 (с, 6Н)}, 4.50 [кв, 1Н, 18-СН, J = 7.3 Гц], 4.39 [д, 1Н, 17-СН, J = 10.1 Гц], 3.62 (с, 3Н, 15(3)-СН3), 3.60 (с, 3Н, 17(4)-СН), 3.33 (с, 3Н, 12(1)-СШ), 3.28 (с, 3Н, 2(1)-СШ), 3.18 (с, 3Н, 7(1)-СН3), 3.78 - 3.64 (м, 4Н, 8(1)-СШ, 17(2)-СН), 1 76 - 1.59 (м, 8Н, 18(1)-СН3, 8(2)-СН3, 17(1)-СН2), -1.65 (ш.с, 1Н, 21-NH), -1.86 (ш.с, 1Н, 23-NH); Минорный изомер: 9.64 (с, 1Н, 10-СН), 9.50 (с, 1Н, 5-СН), 8.81 (с, 1Н, 20-СН), 7.70-7.95 (м, 1H, 3(1)-СЫ), 6.15 [д, 1Н, 3(2)(транс)-СН, J = 18.6 Гц], 5.95 [д, 1Н, 3(2)(цис)-СН, J = 112 Гц], 5.30 [д.д, 2Н, 15(1)-СШ, J = 18.3 и 13.1 Гц], {13-raNC4HsN: 3.14 - 2.82 (м, 2Н), 2.64 - 2.55 (м, 2Н), 2.54 - 2.43 (м, 2Н), 2.28 - 2.15 (м, 2Н); 13-CОNC4H8N(CHз)2: 2.69 (с, 6Н)}, 4.50 [кв, 1Н, 18-СН, J = 7.3 Гц], 4.42 [д, 1Н, 17-СН, J = 9.6 Гц], 3.38 (с, 3Н, 12(1)-СН3), 3.37 (с, 3Н, 2(1)-СН3), 3.19 (с, 3Н, 7(1)-СН3), 3.78 - 3.64 (м, 10Н, 8(1)-С№, 15(3)-СН^ 17(2)-СШ, 17(4)-СНа), 1.76 - 1.59 (м, 8Н, 18(1)-СН3, 8(2)-СН3, 17(1)-СН2), -1.65 (ш.с, 1Н, 21-NH), -1.78 (ш.с, 1Н, 23-NH).

ЭСП (DMF) Я макс, нм: 390, 499, 529, 558, 608, 669; (EtOH) Ямакс, нм: 390, 498, 526, 557, 606, 669.

NN

NH N.

Чч

w //

-N HN-

/?

-O

CO2CH3 COOCH3

соед.1

NH2CH2CH2N(CH3)2

CH2—CH2 / \ NH ^,N-CH3

CH2— CH2

C°2CH3 COOCH3 O

— NH-CH2-CH2-N(CH3)2

или

CH2— CH2 / \ —N ^,N-CH3

CH2— CH2

CO2CH3 COOCH3 O

— NH-CH2-CH2-N (CH3)3 I

или

CH2— CH2 CH3

/ \ I 3

— N N—CH3 I

CH2— CH2

соед. 4, 5

0

ii. CH3I

Схема 2.4. Синтез иодидов 13(1)-Ы-(2-триметиламиноэтилиодид)амид- (соед. 4) и 13(1)-Ы-(4-диметилпиперазинилиодид)амид-15(2),17(3)-диметилового эфира хлорина ев (соед. 5).