Симбиотические свойства низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Аль-Мосава, Назели Перчевна

• Аль-Мосава, Назели Перчевна
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Аль-Мосава, Назели Перчевна

ВВЕДЕНИЕ 4.

Глава 1. Обзор литературы. 11.

1.1. Низкокрахмальные мутанты гороха в сравнении с круглосемянным горохом. 11.

1.2. Симбиотическая азотфиксирующая система в корневых клубеньках бобовых. 25.

1.3. Взаимосвязь бобово-ризобиального симбиоза с углеродным обменом растений. ' 30.

1.4. Роль крахмала в азотфиксирующих клубеньках бобовых растений. 34.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 41.

Глава 2. Объекты и методы исследований. 41.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ. 60.

Глава 3. Рост и развитие мутаитных растений гороха, выращенных на симбиотическом азоте. 60.

3.1. Прорастание и развитие проростков гороха до образования корневых клубеньков. 61.

3.2. Влияние условий окружающей среды на рост и формирование симбиотической системы мутантных растений. 64.

3.3. Формирование клубеньков на корневых системах мутантных и круглосемянных Горохов. 70.

Глава 4. Крахмал в семенах и клубеньках круглосемянного гороха и гороха с морщинистыми семенами. 82.

Глава 5. Оценка продуктивности симбиотической системы мутантных растений гороха, выращенных на безазотной питательной среде. 92.

5.1. Нитрогеназная активность клубеньков гороха. 92.

4.2. Определение конечной эффективности симбиоза. 95.

Глава 6. Симбиосистема и фотосинтетический аппарат мутантов гороха. 102.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Симбиотические свойства низкокрахмальных мутантов гороха Pisum sativum L»

Актуальность проблемы.

Население Земного шара постоянно растёт. Проблема нехватки продуктов питания с каждым годом становится всё более актуальной. В настоящее время только 15% населения имеет полноценное питание. Предсказывается перспектива исчерпаемости ресурсов уже к 2050 году.

Для формирования высоких и стабильных урожаев сельскохозяйственным растениям необходим связанный азот.

Азот - один из самых распространённых элементов на Земле. Земная атмосфера на 78% состоит из азота. Кроме того, все почвы мира содержат 150 млрд. т. азота. Даже самые бедные дерново-подзолистые почвы в пахотном 20-сантиметровом слое содержат 2-4 т. азота на га, а чернозём содержит 20-30 т. (Ю.В. Новиков, 1998). Но несмотря на это, азота не хватает. Проблема нехватки азота имеет две стороны: 1) различные формы азота в почве недостаточно доступны для растений; 2) растения сами по себе, без ассоциации с микроорганизмами не способны фиксировать азот атмосферы.

Существует только два источника обеспечения растений азотом -химические азотные удобрения и биологическая азотфиксация.

Долгое время первый источник казался наиболее выгодным. Действительно, в удобрениях азот присутствует в виде аммонийных и нитратных солей, т.е. в наиболее усвояемой для растений форме. В начале 80-х годов потребление минеральных удобрений во всём мире составляло 60 млн. т., а к 2000 году предполагалось использовать 110-140 млн. т. (Брей, 1986). Так продолжалось до тех пор, пока не стало очевидным, что внесение минеральных удобрений, особенно в больших дозах, приносит больше вреда, чем пользы:

-действие удобрений недолговечно. Уже на следующий год их эффективность составляет едва 20% от первоначальной;

-значительная часть азота удобрений теряется под действием бактерий-денитрификаторов;

-производство азотных удобрений невыгодно экономически. На долю химически связанного азота .удобрений приходится 30-50% энергопотребления сельского хозяйства и около 1% всей энергии, расходуемой развитыми странами;

-кроме того, производство и применение минеральных удобрений загрязняют окружающую среду токсичными азотными соединениями, ухудшают качество сельскохозяйственной продукции, снижают плодородие почв. По последним данным 77% загрязнителей окружающей среды образуется при выращивании продуктов питания в виде сельскохозяйственных удобряемых культур.

При биологической ' фиксации азота источником энергии, как правило, является солнце, фиксированный азот усваивается растениями практически полностью.

По мнению A.A. Баева и K.M. Злотникова (1984), недостатком биологической азотфиксации как способа обеспечения растений азотом можно считать лишь то, что человечество не научилось еще достаточно активно управлять биологической азотфиксацией.

В настоящее время не вызывает сомнений то, что симбиотическая азотфиксация является эффективным и экологически чистым источником азота.

Тем не менее ни одна страна мира пока не может полностью отказаться от применения азотных удобрений, так как без них нельзя получать высокие урожаи.

Единственный выход из этого положения в будущем - это максимальное увеличение эффективности биологической фиксации азота.

Общие масштабы биологичской азотфиксации на планете составляют 175-324 млн.т. азота в год и в целом даже превосходят вклад в сельское хозяйство химических азотных удобрений (Черемисов, 1985; Шлегель, 1987). Но на единицу площади уровень азотфиксации пока недостаточен для обеспечения необходимых урожаев.

В связи с этим, актуальной задачей является изучение взаимосвязи симбиотической азотфиксации с генетически измененным метаболизмом бобового растения, что позволит создать формы, максимально использующие симбиотический потенциал растения-хозяина и клубеньковых бактерий.

В настоящее время большое внимание уделяется исследованию физиологии и биохимии как природных генетически измененных форм бобовых растений, так и полученных с помощью направленного мутагенеза.

Еще со времен Грегора Менделя было идентифицировано большое количество генетических вариантов у гороха. Эта альтернативная морфология семян контролируется г (rugosus) (White, 1917) и rb (Kooistra, 1962) локусами, где рецессивные аллели, кроме образования морщинистых семян, имеют множество эффектов на развитие и состав семян, что включает снижение содержания крахмала и увеличение пропорции амилозы в крахмале.

В настоящее время путь синтеза крахмала в зародышах гороха хорошо изучен (Denyer, Craig, Harrison, Wang, Hedley, Martin and Smith, 1995). 7

Различия в уровне и составе крахмала в семенах гороха побудили ученых исследовать ферменты биосинтеза крахмала. В результате, были идентифицированы биохимические основы мутаций на локусах г и rb (Smith, 1988; Smith, Betty, Bedford, 1989; Hedley et. al., 1986).

Вполне вероятно, что содержание в семенах крахмала, богатого энергией запасного продукта, может влиять и на азотфиксируюгций симбиоз растения-хозяина и клубеньковых бактерий. Однако, исследования в этом направлении нам не известны.

Таким образом, в настоящее время хорошо известно влияние генов г и rb на развитие семян гороха и состав запасных продуктов в них. Однако, до сих пор неясно, как подобные изменения в генотипе семян бобовых культур отражаются на азотфиксирующем симбиозе гороха с клубеньковыми бактериями.

Суммируя все выше изложенное, можно заключить, что актуальной задачей нашего времени является разработка теоретических и методических основ селекции бобовых культур на повышение интенсивности симбиотической азотфиксации, что позволит создать формы растений, способные максимально использовать потенциал симбиотического взаимодействия. Важна также проверка на интенсивность симбиотической азотфиксации генетически изменённых сортов (Verma, Debauney, 1996).

В настоящей работе мы сделали попытку исследовать влияние генетических изменений растения-хозяина на азотфиксирующий симбиоз с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae, на примере низкокрахмальных мутантов гороха.

Цель и задачи исследования.

Настоящая работа посвящена изучению симбиотических свойств трех природных низкокрахмальных мутантов гороха. Цель ее - выяснить, затрагивают ли изменения в локусах морщинистости у семян гороха симбиотическую систему растения, а именно - определить способность клубеньков мутантаых растений гороха к накоплению крахмала и выяснить, обладают ли такие клубеньки азотфиксирующей активностью. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Вырастить мутантные и контрольные растения (обычный круглосемянный горох) на безазотной питательной среде в условиях азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями КЫгоЫшп legшIШlosaпюl Ьу. \dciae.

2. Исследовать клубеньки природных морщинистых мутантов гороха на способность накапливать крахмал.

3. Провести наблюдения за ростом и развитием мутантных растений гороха в условиях азотфиксирующего симбиоза с клубеньковыми бактериями ШигоЫит leguminosarшll Ьу. ушае, в сравнении с обычным круглосемянным горохом.

4. Исследовать особенности формирования и строения симбиотической системы у мутантов в отличие от круглосемянного гороха.

5. Дать оценку азотфиксирующей активности клубеньков у низкокрахмальных мутантов гороха и эффективности работы симбиотической системы вцелом по конечному результату т.е. по количеству белка, накопленного растениями за весь период вегетации.

Впервые изучены симбиотические свойства трех природных низкокрахмальных мутантов гороха (птЬгЬ, ггЯЬШ), Ю1гЬгЬ) Р1зит БаЦуит Ь значительно различающихся количественным и качественным составом крахмала в семенах, в сравнении с обычным круглосемянным горохом (ТЖШ>11Ъ). В вегетационных опытах по выращиванию мутантных и контрольных растений на безазотной питательной среде, продемонстрирована потенциальная возможность низкокрахмальных мутантов к формированию значительно более эффективной симбиотической системы, в отличие от обычного гороха. Впервые, на примере накопления крахмала у клубеньков мутантов гороха, показано существование прямой зависимости между изменениями в генотипе семян и симбиотической системой бобовых растений. Клубеньки гороха накапливали крахмал прямо пропорционально тому количеству, которое содержали исходные семена, сохраняя при этом и качественный состав (соотношение амилозы и амилопектина) крахмала исходных семян. Результаты выращивания опытных растений как в благоприятных, так и в неблагоприятных для нормального развития и функционирования симбиотической системы условиях окружающей среды, явились хорошей иллюстрацией того, что крахмал в клубеньках не только является запасным питательным веществом, откладывающимся там тогда, когда приток Сахаров из надземной части растения превышает их расход на нужды симбиотической системы, но имеет первостепенное значение, как энергетический резерв для поддержания нормального уровня ее функционирования во время неблагоприятного

10 периода, т.е. служит гарантом стабильности симбиотической системы. Полученные результаты являются существенным вкладом в физиологию растений, так как, с одной стороны, служат дополнением к существующей картине о роли отложения в клубеньках крахмала, а, с другой стороны, определяют степень зависимости симбиотической системы от генетических изменений, происходящих в семенах бобовых растений.

Практическая ценность работы.

Изучение сим биотических свойств подобных мутантов позволяет расширить возможности управления процессом биологической азотфиксации в целях повыщения ее интенсивности. Важным источником растительного белка были и остаются зернобобовые культуры. Привлекает внимание способность клубеньков низкокрахмальных мутантов более активно фиксировать атмосферный азот, в результате чего мутантные растения накапливают за период вегетации больше белка, чем контрольные. Таким образом, низкокрахмальные мутанты гороха служат богатым источником экологически чистого и полноценного белка.

11

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Аль-Мосава, Назели Перчевна

ВЫВОДЫ.

1. Изменения генома растения-хозяина в г и гЬ локусах приводят к изменениям его симбиотических свойств.

2. Мутации в локусах морщинистости (г и гЬ) не только изменяют качественное и количественное содержание крахмала в семенах гороха, но и непосредственно влияют на способность клубеньков откладывать крахмал. Чем больше крахмала содержится в семенах гороха, тем больше его накапливается в клубеньках и наоборот. '

3. Накопленный корневыми клубеньками гороха крахмал сохраняет качественный состав (соотношение амилозы и амилопектина) исходных семян.

4. Низкокрахмальные мутанты гороха, благодаря повышенному содержанию белка в семенах, легче преодолевают период лимитированного (ограниченного доступом азота) роста и в оптимальных условиях выращивания опережают контрольные растения (круглосемянный горох) уже на первых этапах развития.

5. В оптимальных или близких к ним условиях выращивания низкокрахмальные мутанты гороха формируют более эффективный азотфиксирующий симбиоз по сравнению с обычным круглосемянным горохом. За одинаковые промежутки времени низкокрахмальные мутанты синтезировали в среднем в два раза больше белка по сравнению с круглосемянным горохом.

6. Накопленный клубеньками крахмал является важным энергетическим резервом симбиотической системы и имеет первостепенное значение для поддержания её стабильности в неблагоприятных условиях

120 окружающей среды. Крахмал, отложившийся в форме амилозы, при необходимости, легче и быстрее утилизируется в клубеньках, поэтому высокоамилозный мутант обладает преимуществом над низкоамилозным.

Работа осуществлена в рамках программы-сети Европейского Экономического сообщества (ЕЭС) по биотехнологии углеводов ("Cabinet") для зернобобовых, организованной доктором Клиффом Хедли в Джон Иннес Институте по изучению растений (Норвич, Великобритания).

121

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Как мы видим, изменение генома бобового растения-хозяина, приводящее к улучшению качества семян, приводит и к изменению свойств его симбиосистемы.

Представляет интерес тот факт, что мутанты гороха (rrrbrb, rrRbRb, RRrbrb), затрачивающие больше продуктов фотосинтеза и энергии на формирование семян с повышенным содержанием белка и липидов, образуют более активные симбиотические системы: Поддержание функционирования которых также требует больших затрат продуктов фотосинтеза - источника С и энергии.

Как и следовало ожидать, такие мутанты и их симбиосистемы более чувствительны к неблагоприятным условиям окружающей среды (пониженной температуре и недостатку света), чем менее продуктивный круглосемянный горох.

Последний более приспособлен к стрессовым условиям окружающей среды. Равно как и его симбиосистема. Благодаря способности накапливать г крахмал, клубеньки могут функционировать и в том случае, когда поступление фотосинтетатов в них ослабевает или прекращается из-за ухудшения погодных условий. В этом случае источником энергии и углерода для поддержания процесса восстановления азота служит отложенный в них крахмал.

119

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Аль-Мосава, Назели Перчевна, 2000 год

1. Алисова С.М., Тихонович И.А. Использование хлорофильных мутантов гороха как модели в изучении взаимосвязи между фотосинтезом и симбиотической азотфиксацией// Генетика, 1983. т. 19. N 9. с. 1512.

2. Альжапарова Ж.К., Фёдорова Е.Э., Троицкая Г.Н., Жизневская Г.Я. Азотфиксирующая система в клубеньках сои с водород-поглощающей нитрогеназой// Прикладная биохимия и микробиология. 1994. т. 30. N 1.-е. 115-120.

3. Андреева Н.И. ДАН, 1985, 282, N 2, с. 251-253.

4. Баев A.A., Злотникова K.M. Биологическая фиксация азота и генетическая инженерия//Биотехнология. -М. .Наука, 1984. -с. 217-223.

5. Белозёрский А.Н., Проскуряков Н. И. Практическое руководство по биохимии растений. М., 1951. 570 с.122

6. Берестецкий О.А., Доросинский Л.М., Кожемяков А.П. Эффективность препаратов клубеньковых бактерий в Географической сети опытов//Изв. АН СССР. Сер. биол. 1987. N 5. с. 670-679.

7. Борисов и др., 1992, Simbiosis, т. 14, с. 297-313.

8. Брей С.М. Азотный обмен в растениях. М., 1986. 196 с.

9. И. Васильчиков А.Г., Вероничев Б.А., 1999. Материалы 3-его межд. симп. "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования" т. 3,-с. 139-141.

10. Гавриленко В.Ф., Ладыгина М.Е., Хандобина Л.М. Большой практикум по физиологии растений. М., 1975. 392 с.

11. Генерозова И.П., Хайлова Г.Ф. Особенности разновозрастных клубеньков в условиях неэффективного симбиоза. 1978. Тез. докл. 4-ого Всесоюзного симпозиума. Электронная микроскопия в ботанических исследованиях, с. 99-102.

12. Демиденко Т.Т., Тимофеева Е.Ф. 1937. Докл. АН СССР, новая серия, 14, с. 209.

13. Доросинский Л.М. Клубеньковые бактерии и нитрагин. Л., 1970.191 С.

14. Задорин А.Д. Зернобобовые культуры в интенсивном земледелии . Сборник научн. трудов. Совершенствование селекции и технологии возделывания зерновых бобовых и крупяных культур. Орёл. 1992. с. 4-13.

15. Задорин А.Д. Научно технический бюллетень, ВНИИ ЗБК, вып. 42, Орёл, 1996.-с. 11-14.

16. Иванов В.Б. Активные красители в биологии. -И.: Наука. 1982. 214с.123

17. Иванов В.Б. Рост и размножение клеток в меристеме корня: Дис. д-ра биол. наук. М.: Ин-т физиологии растений АН СССР, 1971.

18. Иванов В.Б., Литинская Т.К. Одновременная окраска белков и углеводов проционовыми красителями. Цитология, 1967, 9, N -9, с. 11631165.

19. Израильский В.П., Рунов Е.В., Бернард В.В. Клубеньковые бактерии и нитрагин. М., 1933. 232 с.

20. Квасников Б.В., Долгих С.Т. 1955. Микробиология, 24, вып. 2, -с.180.

21. Лобанов H.A., Шумилин П.И., Трошина К.А. Изменчивость содержания белка в зелёной массе гороха. Научно-технический бюллетень. Выпуск 42, Орёл, 1996. -с. 29-33.

22. Малевская Е.М. Аптека на грядках. Целебные свойства овощей. -М., "Лабиринт", 1994, 116с.

23. Мишустин E.H., Шильникова В.К. Клубеньковые бактерии и инокуляционный процесс. М., Наука, 1973. 287 с.

24. Нгуен Тхи Чи и др. Физиол. растен., 1983, т. 30, вып., 4, с. 5.

25. Новиков Ю.В. Экология, окружающая Среда и человек. М., 1998.311с.

26. Павлюков В.Г. Практикум по тропическому растениеводству. М., 1988. 269 с.

27. Панников В.Д., Павлов А.Н. Минеральное питание растений и урожайность. -М., 1982, 60 с.

28. Паушева З.П. Практикум по цитологии растений. -М.: Агропромиздат, 1988. -271 с.124

29. Рихтер М., Аугустат 3., Ширбаум Ф. И збранные методы исследования крахмала. М: 1975.

30. Романов В.И., Чёткова С.А., Тихонович И.А. Азотфиксация и динамика поступления 14С ассимилированного листьями, в клубеньки хлорофильных мутантов гороха.// Физиол. растений. 1987, - т.34. N 3, -с. 486-492.

31. Сварадж, Четвериков, 1987. Известия АН Индии т. 53, N 5-6, 521526.

32. Тихонович И.А., Романов В.И., Алисова С.М. Азотфиксация и фотоассимиляты в клубеньках хлорофильных мутантов гороха.// Генетика, 1985. т. 21. N6, с. 1021.

33. Третьякова И.Н. Изучение механизма геотропических движений корешков прорастающих семян некоторых хвойных. Физиология растений, 1973,20, вып. 3, с. 514-520.

34. Третьякова И.Н. Цитофизическое изучение показателей роста и геотропизма проростков некоторых хвойных. Автореф. дис.канд. биол. наук. Красноярск: Ин-т леса Сиб. отд-ния АН СССР, 1974.

35. Троицкая Г.Н., Кудрявцева H.H., Ильясова В.Б. Особенности азотфиксирующих систем клубеньков различных видов бобовых растений, 1979,26, N2, с. 294-301.

36. Устименко-Бакумовский В.Г. Растениеводство тропиков и субтропиков. М., 1988, 382 с.

37. Фрей-Висслинг А., Мюлеталер К. Ультраструктура растительной клетки. М., 1968. 445 с.125

38. Хайлова Г.Ф. Особенности роста корней люцерны в стерильной изолированной культуре: Дис. канд. биол.наук. М: Ин-т физиологии растений АН СССР. 1971.

39. Хайлова Г.Ф. Изучение структуры клеток бактероидной ткани клубеньков бобовых растений в связи с отложением в ней крахмала. Физиол. растен., 1978,25, N 6, с. 1172-1178.

40. Чинг с соавт. В обзоре С.Я. Коць. Физиол. растен., т. 26, N 3, 223234,1994.

41. Чундерова А.Н. Оценка сортов бобовых растений на эффективность симбиоза с клубеньковыми бактериями методом ацетиленовой пробы// с. -х. биология. 1981, т. 16. N 3. с. 476.

42. Шулындин А.Ф. 1953. Микробиология, 22, N 3, с. 288.

43. Abu-Shakra S.S., Phillips D.A., Huffaker R.C. Nitrogen fixation and delayed leaf senescence// Science. 1978. Vol. 199. P. 973-975.

44. Anthan and Emerich, 1990, Plant Physiology, 92, 346-351.

45. Atkins C.A., Herridge D.F., Pate J.S. The economy of carbon and nitrogen fixing annual legumes. Experimental observations and theoretical consideration// Isotops in Biological Dinitrogen Fixation. Vienna, 1978. P. 211242.126

46. Bach M.K., Magee W.E., Burns R.H. Translocation of photosynthetic products to soybean nodules and their role in nitrogen fixation// Plant Physiol. 1958.Vol. 33. P. 118-124.

47. Bernicot H., Yean-Paul Lacampagne, F. Muel, Schneider. Grain Legumes, V. 21, 1998, P. 13-21.

48. Bethlenfalvay G.T., Phillips D.A. Photosynthesis and symbiotic nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris L.// Genetic Engineering for Nitrogen Fixation. New York, 1977. P. 401-408.

49. Bogracheva T.Y. et.al. (1995). J. Exp. Botany 46,1905-1913.

50. Bogracheva T.Y. et.al. (1998). Biopolymers 45, 323-332.

51. Bogracheva T.Y. (1998). Grain Legumes, N 20, p. 19.

52. Boiler B.C., Heichel G.H. Canopy structure and photosynthesis of alfalfa genotypes differing in nodule effectiveness// Crop Sci. 1984. Vol. 24. P. 91-96.

53. Brenchley W.E., Thornton H.G. 1925. Proc. Roy. Soc., ser. B, 98.

54. Ching T.M., Hedtke S., Russel S.A. et.al. Energystate and dinitrogen fixation in soybean nodules of dark grown plants// Plant Physiol. 1975. Vol. 55. P. 796-798.

55. Chu A.C.P., Robertson A.G. The effects of shading and defoliation on nodulation and nitrogen fixation by white clover// Plant and Soil. 1974. Vol. 41. P. 509-519.

56. Day, Copeland, 1991, Plant Physiol, and Biochemistry, 29,185-201.

57. Delauney A.Y., VermaD.P.S., 1996. In: Soybean Genetics. Mol. Biology and Biochem. p. 219-224.

58. Kay Denyer, Craig J., Harrison C., Wang T., Hedley C., Martin C. and Smith A. Understanding starch synthesis in developing pea embryos. 2-nd. Europ. Conf. on Grain Legumes, Copenhagen, 1995, p. 388-389.

59. Duhigg P., Melton B., Baltensperger A. Selection for acetylene reduction rates in "Mesilla" alfalfa// Crop Sci. 1978. Vol. 18. P. 813-816.

60. Eckardt J.E., Raguese C.A. Effects of diurnal variation in light and temperature on the acetylene reduction activity (nitrogen fixation) of subterranean clover//Agron. J. 1980. vOL. 72. p. 519-523.

61. Edie S.A., Phillips D.A. Effect of host legume on acetylene reduction and hydrogen evolution by Rhizobium nitrogenase// Plant Physiol. 1983. Vol. 72. P. 156.

62. French D. (1984). In Starch: Chemistry and Technology, (Whistler R.L., Bemiller J.N. and Paschall E.F. eds.), Academic Press, INC., San Diego, 183-247.

63. Georgy C.E., Orcutt F.C., Wilson P.W. 1933. Soil Sci., 36, 375.

64. Cordon A.J. et.al., 1987, J. Exp. Bot. v. 38. p. 84-98.

65. Cordon et.al., 1987. "Carbon metabolism in the legume nodule, in: "Carbon partitioning within and between organisms" ed. C.J. Pollock, J.F. Farrar, A.J. Cordon publ in: "Environmental Plant Biology Bios Scientific Publishers, p. 133-162.

66. Hardarson G., Golbs M., Danso S.K.A. Nitrogen fixation in soybean (Glycine max L. Merrill) as affected by nodulation patterns// Soil biology and Biochemistry. 1989. Vol. 21. N 6. P. 783-787.128

67. Hardy R.W.F., Burns R.S., Holstein R.D. Application of acetylene reduction assay for measurement of nitrogen fixation// Soil Biol. Biochem. 1973. Vol. 5. P. 47-81.

68. Hardy R.W.F., Burns R.C, Hebert R.R., Holsten R.D., Jackson E.K. Biological Nitrogen Fixation: A key to wordl Protein// Plant and Soil. 1981. Spec. Vol. P. 561-590.

69. Hardy R.W.F., Holstein R., Jackson E. et.al. C2H2 C2H4 assay for N2 fixation laboratory and field evaluation// Plant Physiol. 1968. Vol. 43, suppl. P. 913.

70. Hedley C.L. et.al. In Engineering crops for idustrial and uses, (Shewry P.R., Davis P., Napier J. Eds.) Portland Press, London (in press).

71. Hedley C.L. et. al. (1996). In Agri Food Quality 95. An Interdisciplinar approach, (Fenwick G.R., Hedley C.L., Richardson R.L., Khokhar S. Eds.). Royal Society of Chemistry, Cambridge, pp. 138-148.

72. Hedley C.L., Lloyd Y.R., Ambrose M.Y., Wang T.L. 1994. Annals of Botany, 74,365-371.

73. Hedley C.L., Smith C.M., Ambrose M.Y., Cook S. and Wang T.L. (1986). An analysis of seed development in Pisum sativum. 2. The effect of the r locus on the growth and development of the seed. Annals of Botany, 58, N 3, 371379.

74. Hedley C.L., and Wang T.L. (1987). Seed and foliar mutants in Pisum, pp. 219-244 in Thomas H. and Grierson D. (eds), Developmental mutants in higher plants. Cambridge, UK, Cambridge University Press.

75. Hedley C., Wang T. Peas in our time. New genes for an old crop. Agrofood Industry, Hi-Tech, 14-17, 1983.1290

76. Hedley С., Wang Т. Manipulating storage product in pea using genetic variants and induced mutants. 1-st Europ. Conference on Grain Legumes, Angers, France, 1992, p 143-144. Proceedings.

77. Hedley C. and Wang T. (1993). Peas in our time. New genes for an old crop. Agrofood chemistry, Hi-Tech, p. 14-17.

78. Hedley C., Wang T.L., Morris V., Bogracheva. 1997. Novel starches from pea seeds. Материалы 2-ого международного симпозиума "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования". Пущино, 1997, том 4, стр. 381.

79. Herridge D.F., Pate T.S. Utilisation of net photosynthate for nitrogen fixation and protein production in an annual legume // Plant Physiol. 1977. Vol. 60. P. 759-764.

80. Hobbs S.L.A., Machon T.D. Heritability of N2 (C2H2) fixation rates and related characters in peas (Pisum sativum L.) // Can. J. Plant Sci. 1982a. Vol. 62. P. 265-276.

81. Hobbs S.L.A., Mahon T.D. Variability, heritability and relationship to yield of physiological characters in peas // Crop Sci. 1982 b. Vol. 22. P. 773-779.

82. Karr et. al., 1985, Plant Physiol, Vol. 78, P. 576-581.

83. Kijne T.M. The Rhizobium infection process // Biological Nitrogen Fixation. New York, London, 1992. P. 349-398.

84. Kokini J.L. et. al. (1992). Food Technology 46 (6), 124-139.

85. Kooistra F. (1962). О n the differences between smooth and three types of wrinkled peas. Euphytica, 11,357-373.

86. Lamprecht H. (1956). Pisum sativum L. oder P. arvense L. eine nomen-klatorische studie anf genetischer basis. Agri Hortigue Genetica, 14,1-4.130

87. Lawn R.T., Brun W.A. Symbiotic nitrogen fixation in soybeans. 1. Effect of photosynthetic sours sink manipulations // Crop Sci. 1974. Vol. 14. P. 11- 101. Lawree, Weeler, 1975, New Phytol. 74: 437-445.

88. Lee T.A. (1969). Plant and Soil, 30,391.

89. Lindstrom E.S., Newton W.E., Wilson P.W. The relationship between photosynthesis and nitrogen fixation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1952. Vol. 38. P. 392-396.

90. Macleod M.R., Hedley C.L., Martin C.R., Jones D.A., Yohnson S., Bakhsh A., Barber L.M. and Wang T.L. New pea mutants at the R locus, In: 1-st European conference on Grain Legumes. Proceedings. Angers. France, 1992. p. 169-170.

91. Mahon T.D., Domey T.A. Light weight battery operated infrared gas analyser for field measurement of photosynthetic CO2 exchange // Photosynthetica. 1979. Vol. 13. P. 459-466.

92. Mahon T.D. Field evaluation of growth and nitrogen fixation in peas selected for high and low photosynthetic CO2 exchange // Can. J. Plant Sci. 1982. Vol. 62. P. 5-17.-a

93. Mahon T.D., Hobbs S.L.S. Selection of peas for photosynthetic C02 exchange rate under field conditions // Crop Sci. 1981. Vol. 21. P. 616-621.

94. Mendel G. (1865). Versuche uber Pflanzen-Heybriden Verhandlungen des naturforshenden vereins in Brunn. 4,3-47.

95. Minchin F.R., Pate T.S. The carbon balance of a legume and the functional economy of its root nodules //J. Exp. Bot. 1973. Vol. 24. P. 259-271.

96. Minchin F.R., Pate T.S. Diurnal functioning of the legume root nodule // J. Exp. Bot. 1974. Vol. 25. P. 295-308.

97. Neuhaus H.E. and Stiff M. 1990. Planta 182,445-454.

98. Pate J.S., Greig T.M. Rhytmic fluctuations in the synthetic activities of the nodulated root of the legume // Plant and Soil. 1964. Vol. 21. P. 163-184.

99. Perez D., Chambers S., Bacon Y., Morgan M., Lambert N., Hedley C., Wang T. Quantitative analysis of pea seed proteins from existing and induced mutants. 1-st Conf. on Grain Legumes, Angers, France, 1992, p. 173^174.

100. Phillips D.A., Dejong. Dinitrogen fixation in leguminous crop plants. In: "Nitrogen in crop production" Hauked R.D. Amer. Soc. of Agronomy. Madison, Wisconsin, USA, 1984, P. 121-132.

101. Reiback and Streeter, 1983, Plant Physiology 72, 634-640.

102. Romanov V.I., Cordon A.Y., Mincbin F.R., Witty Y.F., Skot L., James C.L., Borrisov A.Y. and Tikhonovich Y. A. (1995), Exp. Bot., 46,293,1809-1816.

103. RothL.T., Stacey G. Bacterium relase into host cells of nitrogen fixing soybean nodules: the symbiosome membrane comes from the sources // Eur. J. Cell. Biol., 1989. Vol. 49. p. 13-23.

104. Schreven D.A. van. 1959. In: "Nutrition of the legumes". Ed. Hallsworth E.G., New York, London, Acad. Press, 1959. Plant and Soil, 11, N 2, 93; 1970. 32, N 1,113; 1972a. 36. N 2, 325; 1972b. 37, N 1,49.

105. Scott et.al., 1976, Nature 263: 703-705.

106. Smith A.M., Bettey M. and Bedford J.D. (1989). Evidence that the rb locus alters the starch content of developing pea embryos through an effect on ADF glucose - pyrophosphatase. Plant Physiology, 89, 1279-1284.

107. Sprent J.I. Growth and nitrogen fixation in Lupinus arboreus as affected by shading and water supply // New Phytol. 1973. Vol. 72. p. 1005-1022.

108. Streeter J.G. Integration of plant and bacterial metabolism in nitrogen fixing systems // Nitrogen Fixation: Fundamentals and Applications. Dordrecht etc., 1995. p. 67-76.132

109. Sutton W.D., Tepsen N.M. Studies with detached lupine nodules in culture. 1. Maintenance and induction of acetylene reduction activity // Plant Physiol. 1975. Vol. 56. p. 665-670.

110. Thummler and Vernia, 1987, J. Biol. Chem., 262, 14730-14736.

111. Wang T.L., Hadaviziden A., Harwood A., Welham T.Y., Harwood W.A., Faulks R. and Hedley C.L. 1990. Plant Breeding 105, 311-320.

112. Wang T.L. and Hedley C. (1991). Seed development in peas. Knowing your three 'r's (or four, or five). Review Article. Seed Science Research, 1991, 1314.

113. Wang T.L., Hedley C.L. (1993). Seed mutants in Pisum. In "Pisum genetics", 25,64-70.

114. Wang T.L. et.al. (1998). J. of Exp. Bot. (in press).

115. Waters L.T., Breen P.J., Mach HJ. et.al. Translocation of 14C -photosynthate, carbohydrate content and nitrogen fixation in Phaseolus vulgaris L. during reproductive development//J. Amer. Soc. Hort. Sci. 1980. Vol. 105. P. 424427.

116. Wilson D.W., Fred E.B., Salmon M.R. Relation between carbon dioxide and elemental nitrogen assimilation in leguminous plants // Soil Sci. 1933. Vol. 35. p. 145-165.

117. White O.F. (1917). Studies of inheritance in Pisum. 2. The present state of knowledge of heredity and variation in peas. Proceedings of the American Phylosophicall Society 56, 487-588.1330

118. Wintermans I.F., de Mots A. "Biochim. et Biophys. Acta", 1965, 109,448.

119. Witty J.F., Miiichin F.R. Measurement of nitrogen fixation by the acetylene reduction assay: myths and mysteries // Nitrogen Fixation by Legumes in Mediterranean Agriculture. Dordrecht etc., 1988. p. 331-344.