Серологическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами - включениями гидроперикардита методом непрямого иммуноферментного анализа тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.02, кандидат наук Борисова, Мария Сергеевна

• Борисова, Мария Сергеевна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Борисова, Мария Сергеевна

Оглавление стр.

1. Введение

2.Основная часть

2.1. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии

2.2. Аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит

птиц

2.2.1. Распространение и ущерб, причиняемый этой болезнью

2.2.2. Характеристика возбудителя семейства Ас1епоушс1ае

2.2.3. Эпизоотологические данные болезни

2.2.4. Клинические признаки и патологоанатомические изменения у птиц при аденовирусном гепатите с тельцами-включениями гидроперикардите птиц..29 2.2.5.Диагностика аденовирусного гепатита с тельцами-включениями

гидроперикардита

птиц

2.2.6. Профилактика и меры борьбы с болезнью

2.3. Собственные исследования

2.3.1. Получение специфических компонентов для иммуноферментного анализа

2.3.1.1. Получение очищенного антигена вируса

2.3.1.2. Получение отрицательной и положительной сыворотки крови

кур

2.3.2. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления антител к аденовирусу в сыворотках крови кур

2.3.2.1. Определение оптимальных концентраций и условий взаимодействия

компонентов

2.3.2.2. Определение диагностического титра сыворотки в иммуноферментном анализе

2.3.2.3. Способ опосредованного расчета титра антител

2.3.2.3.1. Определение коэффициентов линейной регрессии и

допустимых значений оптической плотности контрольных

сывороток

2.3.2.3.2.0пределение пороговых показателей реакции, разграничивающих специфическое и неспецифическое

взаимодействие

2.3.2.4. Оценка чувствительности и специфичности тест-системы

2.3.3. Практическое применение разработанной иммуноферментной

тест -системы

2.3.3.1. Изучение динамики формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против аденовирусного гепатита с

тельцами-включениями гидроперикардита

2.3.3.2. Серологический мониторинг на аденовирусный гепатит с тельцами - включениями гидроперикардит птиц в

птицехозяйствах

3.Заключение

3.1 .Обсуждение результатов

исследований

3.2.Вывод ы

3.3. Практические предложения

Список сокращений

Список литературы

Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Серологическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами - включениями гидроперикардита методом непрямого иммуноферментного анализа»

1. Введение

Актуальность темы исследования. Надежное благополучие по инфекционным болезням является одним из непременных условий успешного ведения промышленного птицеводства.

Для крупных птицеводческих комплексов особую опасность представляют вирусные болезни, в том числе аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, из-за их недостаточной изученности, высокой контагиозности, большого разнообразия путей и факторов передачи инфекционного агента. Проблема вирусных болезней приобретает все возрастающую актуальность еще и по той причине, что некоторые инфекционные болезни стали протекать атипично, значительно возросла роль ассоциации различных агентов вирусной и бактериальной природы.

Аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит (АДВГГ) (инфекционный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит, инфекционный гидроперикардит (ИГП) кур, болезнь Ангара, инклюзионный гепатит, гидроперикардиальный синдром) - высококонтагиозная вирусная широко распространенная болезнь цыплят, основными патологоанатомическими признаками которой являются накопление транссудата в перикардиальной полости, гепатит и нефрозо-нефрит. АДВГГ регистрируется во многих странах мира, как у бройлеров, так и у несушек. Экспериментально доказано, что в возникновении болезни доминирующая роль принадлежит первой группе аденовирусов, 1 и 4-го серотипов [11].

Степень тяжести течения АДВГГ в природных условиях во многом зависит от влияния некоторых иммунодепрессивных агентов, таких как вирус инфекционной бурсальной болезни, болезни Марека и вирусной анемии цыплят и тогда болезнь протекает со сложной симптоматикой. В связи с этим основная роль в постановке правильного диагноза на ИГП принадлежит лабораторным методам.

Степень разработанности темы исследования. Вопросам серологической диагностики АДВГГ птиц посвящены работы ряда авторов, однако разработанные ими методы имеют недостатки [11,55,68]. Разработанная реакция непрямой гемагглютинации (РИГА) и иммунной адсорбции обладали низкой чувствительностью, и специфичность вышеуказанных тестов нуждалась в дальнейшем усовершенствовании [55]. Предложенная реакция диффузионной преципитации в агаровом геле с применением печеночного гомогената в качестве неочищенного антигена уступала по чувствительности ИФА.

Учитывая ассоциированное течение АДВГГ в условиях птицеводческих хозяйств необходимо разработать высокочувствительный и специфичный метод серологической диагностики.

Цель и задачи. Целью данной работы явилась разработка диагностической тест-системы для выявления антител к возбудителю АДВГГ в сыворотке крови кур на основе непрямого метода ИФА.

В соответствии с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:

- получить высокоочищенныи антиген возбудителя АДВГГ птиц для ИФА и специфическую гипериммунную сыворотку кур;

- определить оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия;

- установить величины пороговых показателей, разграничивающих специфическую (положительную) и неспецифическую (отрицательную) реакции и разработать способ опосредованного расчета титров антител при тестировании проб в одном разведении;

- дать оценку чувствительности и специфичности разработанной тест-системы;

- изучить динамику формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ;

- провести серологический мониторинг на АДВГГ птиц с применением разработанной тест-системы;

- разработать Методические положения по лабораторной диагностике АДВГГ птиц методом иммуноферментного анализа.

Научная новизна. Разработана иммуноферментная тест-система для выявления специфических антител к возбудителю аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита при тестировании проб сыворотки крови кур в одном разведении. Отработан метод получения высокоочищенного антигена вируса АДВГГ птиц, определены оптимальные концентрации компонентов реакции и условия их взаимодействия, а также установлены пороговые показатели, разграничивающие специфическую и неспецифическую реакции, разработан способ опосредованного расчета титра антител при тестировании проб в одном разведении. Дана сравнительная оценка непрямого метода ИФА с реакцией диффузионной преципитации в агаровом геле при АДВГГ птиц. Установлена высокая чувствительность и специфичность разработанной иммуноферментной тест-системы для выявления антител в сыворотке крови кур к возбудителю АДВГГ птиц.

Изучена динамика формирования антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ.

Теоретическая и практическая значимость работы. Практическая ценность разработанного диагностического набора для выявления антител к вирусу АДВГГ птиц подтверждается положительными результатами испытаний при проведении серологического контроля над распространением АДВГГ птиц, оценки эффективности иммунизации поголовья цыплят против данной болезни; ретроспективной диагностики АДВГГ птиц по приросту уровня специфических антител.

Разработаны ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии и утверждены академиком-секретарем А.М.Смирновым Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии методические положения «Лабораторная диагностика

аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита птиц методом иммуноферментного анализа» от 02 июля 2013 г. Методология и методы исследования

Вирус. В работе использовали вирус аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита кур, производственный штамм "Т 12" 4-го серотипа.

Штамм хранили при температуре минус

20°С в нативном виде. Освежение штамма проводили на 15-суточных СПФ-цыплятах через каждые три месяца хранения.

Сыворотки, тестируемые в непрямом варианте ИФА. Исследовали образцы сыворотки крови кур не контаминированные бактериальной и грибковой флорой.

Диагностикум: набор для определения антител к аденовирусу птиц 4 серотипа группы 1 (синдром гидроперикардита) иммуноферментным методом, производства ФГУ «ВНИИЗЖ»;

Инкубационные яйца и цыплята: яйца СПФ кур фирмы «Lohmann Tierzucht» (Германия) , 50 штук; цыплята, инкубированные из СПФ-яиц фирмы «Lohmann Tierzucht» в ГНУ ВНИВИП, 50 голов; цыплята 28-суточного возраста, полученные из хозяйства, благополучного по острым инфекционным болезням, 60 голов.

Оборудование, используемое в иммунологических тестах:

- механические дозаторы с объемом от 0,5 до 1000 мкл и 1- 8- канальные;

- полистироловые планшеты производства Nunc, США;

- иммуноферментный анализатор «Униплан». Растворы и реактивы:

- калий фосфорнокислый одозамещенный, ч., ГОСТ 4198;

- калий фосфорнокислый двузамещенный 3-водный, х. ч, ГОСТ 2493;

- натрия хлорид (NaCI), х.ч., ГОСТ 4233;

- фосфатно-цитратный буфер производства ООО «Биолот»;

- перекись водорода производства ОАО «Татхимфармпрепараты»;

- ортофеиилендиамии (ОФД) производства фирмы Sigma;

- гвин 20 (Р7949) производства фирмы Sigma;

- агар «Дифко»;

микробиологические среды: мясопептонный бульон (МПБ),

мясопептонный агар (МПА), мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (среда Китта-Тароцци), агар Сабуро, производства ГНУ ВНИВИП.

Приготовление вируссодержащего материала для заражения. У павших или вынужденно убитых цыплят с характерной патологоанатомической картиной болезни отбирали печень и готовили суспензию на фосфатно-солевом буфере (рН 7,2-7,4) в соотношении 1:10. Суспензию трехкратно замораживали и оттаивали и центрифугировали при 1000g в течение 30 минут. Супернатант исследовали в РДП с положительной сывороткой к вирусу АДВГГ. При получении положительной реакции из него готовили 10% суспензию на физиологическом растворе хлорида натрия с добавлением антибиотиков (пенициллина 1000 ЕД/см3 и стрептомицина 1000 мкг/ см ), выдерживали ее 2 часа при комнатной температуре и проверяли на стерильность в соответствии с ГОСТ 28085-89 "Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности". При отсутствии роста микрофлоры материал использовали для постановки экспериментов.

Получение вируса ИГП на цыплятах. Для постановки опытов использовали СПФ цыплят 15 - суточного возраста. Заражение проводили подкожно. Материалом для инфицирования служила 10% суспензия, приготовленная из печени павших цыплят с признаками АДВГГ.

Подопытных цыплят содержали в изолированном боксе.

Получение антигена. Вируссодержащим материалом для получения антигена служила печень цыплят, экспериментально зараженных вирусом АДВГГ. Для наиболее полной экстракции вируса гомогенат печени больных цыплят дополнительно обрабатывали ультразвуком.

Инактивацию вируса проводили формальдегидом в конечной концентрации 0,1% при температуре +37°С и экспозиции 48 часов.

Очистку вируссодержащего материала проводили методом гельхроматографии на макропористом стекле (МПС), обработанном поливинилпирролидоном (ПВП) [40]. Макропористое стекло размером пор 1200 А активировали концентрированной соляной кислотой (НС1) в соотношении 1:2 и выдерживали при температуре 20-22°С 1-2 суток, периодически встряхивая. После этого кислоту сливали, и МПС однократно промывали дистиллированной водой, затем его заливали равным объемом смеси Комаровского (6% раствор Н202 в 6 М растворе НС1 в соотношении 1:1). Смесь с МПС нагревали на водяной бане при 56°С в течение 2 часов в вытяжном шкафу. Обработанное МПС промывали дистиллированной водой до нейтральной реакции и под вакуумом удаляли воздух из пор. Затем заливали двумя объемами 4% раствора ПВП в дистиллированной воде и перемешивали на качалке в течение 4-5 часов. Раствор сливали, а МПС отмывали от несвязавшегося ПВП дистиллированной водой до исчезновения желтой окраски. Колонку размером 80><2см заполняли модифицированным МПС и уравновешивали 0,01М фосфатно-солевым буферным раствором (ФБР), рН 7,37,5. После стабилизации колонки над поверхностью МПС оставляли слой буфера в 1 мм. После этого на МПС наслаивали вируссодержащую жидкость. Элюцию вируса осуществляли 0,01 М ФБР, рН 7,3-7,5 с использованием перистальтического насоса, прибора РЭППС-1М (регистратор измерений электропроводимости и процента поглощения света) элюатом при жидкостной хроматографии при длине волны 280 нм, со скоростью 0,7-1,0 см3/мин и собирали его отдельной фракцией. Выход очищенного вируса регистрировался на ленте самописца в своеобразном пике, затем большим пиком выделялись примесные белки.

Постановка реакции диффузионной преципитации в агаровом геле. РДП

в агаровом геле ставили по методу, предложенному Оухтерлони, с использованием 1% агара «Дифко» [45].

Получение антивидового иммунопероксидазного конъюгата против IgG курицы. Конъюгат получали модифицированным методом периодатного окисления, основанным па образовании ковалентной аминосвязи между аминогруппами иммуноглобулина G и альдегидными группами пероксидазы, и ее последующем восстановлением до C-N-связи с помощью боргидрида натрия при совместной работе с ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи» [114] .

Иммуноанализ антител. Для сенсибилизации поверхности лунок полистироловых планшет использовали очищенный антиген аденовируса кур в оптимальной концентрации, разведенный 0,01 M ФБР, рН 7,3-7,5. Иммобилизацию антигена на поверхности лунок полистироловых планшет осуществляли в течение 16-18 часов при температуре 4-8°С. Несвязавшийся с поверхностью полистирола антиген, отмывали трехкратно в объеме 0,2 см3 0,01 M натрий-фосфатным буфером, содержащим 0,5М раствор хлорида натрия с 0,1% конечной концентрацией твина-20 (ФБРТ), рН 7,0-7,4. В процессе постановки ИФА исследуемые и контрольные сыворотки, конъюгат инкубировали в термостате при 37°С в течение 30 минут. В качестве субстрата использовали ортофенилендиамин в концентрации 5 мг на 12 см3 фосфатно-цитратного буфера, рН=4,9-5,0. Реакцию останавливали 10% раствором серной кислоты и считывали оптическую плотность (ОП) на иммуноферментном анализаторе «Униплан» при длине волны 492 нм.

Статистическая обработка данных. Использовали общепринятые методы оценки дисперсии, стандартного отклонения и доверительного интервала варьирующих переменных, устанавливали количественные показатели связи зависимых переменных в виде коэффициентов корреляции или коэффициентов регрессионных уравнений. Для соответствующих вычислений применяли компьютерную программу Microsoft Excel.

Положения, выносимые на защиту:

- тест-система, разработанная на основе непрямого метода ИФА для выявления и оценки титров антител к вирусу АДВГГ в сыворотке крови кур при тестировании проб в одном разведении, включающая обоснования оптимальных концентраций компонентов и условий их взаимодействия, пороговых показателей реакции и способ опосредованного расчета титра антител;

- результаты сравнения разработанной тест-системы и реакции диффузионной преципитации в агаровом геле;

- данные динамики выработки антител у цыплят, иммунизированных инактивированной сорбированной и эмульгированной формами вакцины против АДВГГ;

- результаты серологического мониторинга на АДВГГ с применением разработанной тест-системы.

Степень достоверности и апробация результатов.

Научные положения, выводы и практические рекомендации, сформулированные в диссертационной работе научно-обоснованы, достоверны и вытекают из результатов собственных исследований. Исследования проведены на большом фактическом материале с использованием современных вирусологических, биохимических и серологических методов исследований.

По результатам научных исследований опубликовано 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, и 4 статьи опубликованы в сборниках материалов конференций и конгрессов.

Результаты исследований по теме диссертации доложены и обсуждены на заседаниях Методического совета отдела вирусологии и ОБП и Ученого совета ГНУ ВНИВИП Россельхозакадемии (2010-2013гг.), Международной научно-практической конференции молодых ученых «Аграрная наука XXI века. Актуальные исследования и перспективы» (Санкт-Петербург-Пушкин, 2013);

Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста и состоит из следующих разделов: введение, основная часть, заключение, список сокращений, список литературы и приложения.

Диссертация иллюстрирована 12 таблицами и 9 рисунками. Список литературы включает 134 источника, из которых 87 зарубежных.

2. Основная часть 2.1. Иммуноферментный анализ и его применение в ветеринарии

В течение последних десятилетий в диагностике инфекционных болезней широкое применение получил твердофазный иммуноферментный анализ. В отличие от классических иммунологических методов лабораторной диагностики, основанных на феноменах преципитации или агглютинации, инфекционный агент выявляется на первой фазе взаимодействия антиген-антитело и при последующей фермент-субстратной реакции, что определяет высокую чувствительность метода.

В патентной и научной литературе появляется все больше сведений о рекордных пределах обнаружения веществ данным методом, вплоть до 10-21 молей в образце [39]. Высокие результаты достигаются благодаря использованию неограниченных возможностей ферментов - биокатализаторов, которые позволяют создать каскадные системы усиления различных химических сигналов. Ферменты, используемые в иммуноанализе, должны удовлетворять следующим требованиям:

- доступность в чистом виде;

- простота и чувствительность методов определения продуктов ферментативной реакции;

- высокая стабильность и активность конъюгатов при хранении и в условиях выполнения анализа.

Наибольшее применение в иммуноферментном анализе среди ферментов, удовлетворяющих перечисленным выше требованиям, получили пероксидазы из корней хрена, щелочная фосфатаза из слизистой кишечника теленка и ß-галактозидазы Е. coli. Все три фермента определяются на уровне пикомолярных концентраций.

Пероксидаза остается самым доступным ферментом. Она содержит легко окисляемые периодатом, углеводные остатки, через которые может осуществляться связывание фермента с антителами или антигенами. В состав субстратной системы для измерения активности пероксидазы фотометрическим способом входят хромогены, дающие при окислении перекисью окрашенные соединения. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным [79].

Пероксидаза является гемсодержащей оксидоредуктазой, катализирующей окисление перекисью водорода различных органических соединений. Типичными, быстро окисляющими субстратами пероксидазы являются фенолы, ароматические амины и диалкиламины. Такие часто применяемые субстраты, как о-фенилендиамин, 5-аминосалициловая кислота, бензидин и его гомологи в результате окислительной конденсации образуют интенсивно окрашенные продукты. Растворы субстратов готовят непосредственно перед употреблением; спонтанное окисление субстрата в растворе, в том числе и в присутствии перекиси водорода, может быть замедлено добавлением полиэтилен гликоля или другого водорастворимого полимера [80]. Стабилизация водных растворов 3,3',5,5'-тетраметилбензидина достигается добавлением N-метилпирролидона [118]. В работе удобны водорастворимые алкилсульфонаты тетраметилбензидина [129].

Фенолы и М,Ы-диалкиламины применяются обычно в составе двухкомпонентных субстратных смесей: вторым компонентом являются соединения с первичными ароматическими аминогруппами. В результате такого окисления образуются красители хинониминового ряда. Типичными аминами являются 4-аминоантипирин, м- или п- замещенные анилины [82,100], З-амино-9-этилкарбозол [80]. Отличается особенно быстрое развитие окраски при применении 4-йодфенола [124]. Преимущества одних комбинаций реагентов перед другими могут состоять в стабильности при хранении растворов или сухих составов, в скорости развития окраски, ее интенсивности и стабильности во

времени после остановки реакции. 1М,М-диалкиланилины, содержащие в алкильной цепи карбоксильную или фосфатную группу [77], стабильны при хранении, дают интенсивную и стабильную окраску и низкую неспецифическую реакцию в присутствии белков нормальной сыворотки [77]. Для повышения стабильности коныогатов пероксидазы при лиофилизации, хранении в растворе очень часто авторы используют различные добавки [57,73,101,125,131]. Так, рекомендовано включение в композиции ионов алюминия, магния, цинка [73], солей кальция [73,57], полиэтиленгликоля [57], антибиотиков [125].

Щелочная фосфатаза и ее конъюгаты имеют высокую стабильность и низкий предел обнаружения, однако недостатком является относительно высокая стоимость фермента. В последнее время разработаны сверхчувствительные ферментативные системы, позволяющие детектировать в растворе до нескольких тысяч молекул щелочной фосфатазы, основанные на использовании в качестве субстрата молекулы ЫАДР. Образующийся в результате ферментативного гидролиза продукт ЫАД определяется в ферментативной системе регенерации кофактора [29]. Такого рода подходы для определения щелочной фосфатазы являются весьма перспективными в плане создания на их основе сверхчувствительных методов ИФА. (З-Д-галактозидаза также широко используется в ИФА. Из других ферментов, предлагавшихся в последние годы для твердофазного иммуноанализа, заслуживают упоминания ацетилхолинэстераза электрического угря [84], а-амилаза [59]. Анализ литературных данных показывает, что многие зарубежные фирмы в создании усовершенствованных методов твердофазного иммуноанализа идут по пути поиска новых ферментов. Представляется, однако, маловероятным, что поиск новых ферментов приведет к существенному повышению чувствительности анализа. Более перспективны, вероятно, пути увеличения количества связанного фермента в конъюгате или применения комбинаций ферментов - так называемый метод "каскадной амплификации". Для обогащения конъюгатов ферментом можно использовать для конъюгации предварительно полимеризованный фермент [78], оригинальный способ увеличения количества фермента состоит во

включении его в липосомы [130]. Метод каскадной амплификации, предложенный сотрудниками фирм Du Pont de Nemours [87], Miles [63] и другими авторами [88,98], основан на использовании в качестве метки и субстрата пары профермент - активатор профермента. Например, трипсиноген - кишечная энтеропептидаза (энтерокиназа). Другой путь комбинации ферментов, предлагаемый фирмой Syntex, также связан с использованием субстрата, продукт расщепления которого первым ферментом служит субстратом для второго [66,108].

Всякая процедура химической модификации фермента, даже такого, как пероксидаза, связана с потерей части активности, как при конъюгации, гак и при хроматографической очистке конъюгата. Этого можно избежать, если в число реагентов ввести специфическое антитело к ферменту [106]. Введение небольшого количества конкурентного лиганда в антитело, как правило, существенно не влияет на его иммунологические свойства [106], а комплекс модифицированного антиферментного антитела с ферментом уже является готовым меченым реагентом. Более того, комплекс фермент - антифермент (1:1) непосредственно применим в качестве реагента для открытия иммуноглобулинов животных, из сыворотки которых получены антиферментные антитела.

Очень важным моментом при получении конъюгата является выбор такого метода, который позволил бы максимально сохранить как иммуногенную, так и ферментативную активность исходных компонентов в коныогате. Способы получения конъюгатов, то есть комплексов фермента со специфическим реагентом, могут быть разделены на три группы. К первой группе относятся методы химического связывания. Вторая группа методов основана на образовании иммунохимического комплекса между ферментом и специфическим антителом к ферменту. Принцип методов третьей группы заключается в последовательном проведении двух этапов. На первом этапе, с одной стороны, фермент, а с другой стороны, специфический реагент химически модифицируется реагентами, имеющими между собой высокое значение константы связывания, например, авидин-биотин или гапнен-антитело. На втором этапе проводят

реакцию между модифицированными ферментом и специфическим реагентом, приводящую к образованию конъюгата по типу антиген-антитело.

Методы химического связывания можно, в свою очередь, разделить на следующие группы: 1 - методы периодатного окисления, основанные на образовании новых реакционных групп в ферменте и их последующем взаимодействии с реакционными группами специфического реагента; 2 - методы соединения фермента и специфического реагента за счет гомобифункционального реагента; 3 - методы соединения фермента и специфического реагента за счет гетеробифункционального реагента.

Выбор методики приготовления конъюгатов должен исключать возможность полимеризации и определяться стабильностью сшивающего агента в водной среде. Лучшим считается тот метод введения ферментной метки, который позволяет получить значительный выход гибридных молекул при сохранении высокой иммуногенной и эизиматической активности.

Показано, что периодатный метод позволяет получить конъюгат, обеспечивающий большую чувствительность в ИФА. Каталитическая активность получаемых конъюгатов остается достаточно высокой, так как при соблюдении мягких условий окисления активный центр фермента не затрагивается и остается слабо экранированным [79].

Полученные конъюгаты наряду с гибридными молекулами содержат остатки непрореагировавших компонентов, применявшихся при конъюгации: бифункциональные агенты, стабилизаторы и т.д. Особенно нежелательно присутствие непрореагировавших молекул антител (антигенов), конкуренция которых с конъюгатом снижает чувствительность анализа. Очистку конъюгата от несвязавшихся компонентов реакции проводят гель-фильтрацией на сефадексе О-200 или аффинной хроматографией. Конъюгаты хранят в небольших объемах при - 20 -70 °С или в жидком азоте, а также в лиофильно высушенном состоянии при 4 °С.

Активность и специфичность иммуноферментных конъюгатов зависит от исходной активности специфических антител. По имеющимся данным,

коныогаты чистых антител с ферментом дают очень низкие значения фона в контроле и используются в более высоком разведении, чем коныогаты гамма-глобул иновой фракции и фермента [127].

Для достижения высокой специфичности, чувствительности, воспроизводимости, экспрессивности и автоматизации иммунохимических анализов принципиально возможным является использование только первой стадии простого иммунохимического взаимодействия. Так как процесс комплексообразования пары анализируемое соединение (антиген -специфическое антитело) происходит в строго количественном соотношении, то экспериментально устанавливаемая концентрация метки, входящей в состав образующегося иммунохимического комплекса, однозначно связана с исходной концентрацией антигена.

Для осуществления такого анализа необходимо провести эффективное разделение комплексов от свободных компонентов. Эту задачу, оказалось, легко решить, если один из компонентов пары антиген - антитело прочно иммобилизовать на твердом носителе. Иммобилизация позволяет предотвратить агрегацию в растворе и осуществить физическое разделение образующихся иммунных комплексов от свободных компонентов. Возможность прочного связывания на носителе антител или антигенов с сохранением их способности к специфическому образованию иммунных комплексов и разработка на этом принципе твердофазных методов дали мощный импульс для развития иммуноферментных методов анализа.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Борисова, Мария Сергеевна, 2013 год

Список литературы

1. Аксенов, М.Ю., Гинзбург A.JI. Диагностика инфекционных заболеваний методом полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - М. - 1993. - С.3-9.

2. Алиев, A.C., Сираждинов P.C., Джавадов Э.Д., Алиев Г.С. Гидроперикардит (ГИП) птиц // Сборн. Трудов ученых Академии менеджмента и агробизнеса нечерноземной зоны Российской Федерации "Пути совершенствования переподготовки руководящих кадров и повышения эффективности аграрного производства". - Санкт-Петербург. - 1996. - С. 146-151.

3. Алиев, A.C., Никитина Н.В. Диагностика и специфическая профилактика инфекционного гидроперикардита птиц // Матер, научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего вет. образования в России и 100-летию вет. науки. С-Петербург. - 1998. - 4.1 - С. 14-15

4. Андреева, 3. М, В.А. Никонова, Т.С. Шобухова, Л.И. Ванеева, Н.Ф. Янкина. Ускоренный иммуноферментный анализ // Ж. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 1985, - №4, - С.60-63.

5. Бакулин, В.А., Аксенова Е.Г. Эпизоотология синдрома "гепатита-гидроперикардита" цыплят // Матер. научно-производственной конф. посвященной 190-летию высшего вет. образования в России и 100-летию вет. науки. - Санкт-Петербург. - 1998. - С.28.

6. Бакулин, В.А., Аксенова Е.Г., Горецкая Т.И. Эпизоотология и патоморфология "гидроперикардита" цыплят // Ветеринария. - 1998. - №8. - С. 17-19.

7. Бакулин, В.А. Гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит // Под ред. Бакулина В.А.: Бакулин В.А., Коровин P.M., Виноходов В.О., Ибрагимов Х.М., Гатаутдинов Ф.Г., Шишлянников Я.Ф., Таймасуков A.A., Аксенова Е.Г., Мурый В.А., Жбанова С.Ю., Ивашкин В.А. В кн.:. Патоморфогенез и дифференциальная диагностика болезни Гамборо, аденовирусной инфекции и других

иммунодепрессивных болезней птиц. - Санкт-Петербург, Ломоносов.- 1998. -С.74-97.

8. Бакулин, В.А., Мурый В.А. Влияние "гепатита с включениями-гидроперикардита" на вакцинацию цыплят против ныокаслской болезни // Архив вет. наук. - 1999. -Т. 1(48). - Ч.З. - С.422-429.

9. Бакулин, В.А. Аденовирусный гепатит с включениями — гидроперикардит // Зооиндустрия СПб., 2007. - №9 -С.4-7.

10. Бакулин, В.А., Мурый В.А., Гаврилов B.C. Аденовирусный гепатит с тельцами-включениями гидроперикардит кур в условиях Северного Кавказа. VI Междунар. вет. конгресс по птицеводству (8-11 апреля). - М., 2008 .- С. 92-94.

11. Бакулин, В.А., Дубовой A.C. Серолоическая диагностика аденовирусного гепатита с тельцами-включениями гидроперикардита кур// V междунар. вет. конгресс по птицеводству. - М., 2009. - С. 58-60.

12. Борисов, В.В., Сурнев Д.С., Гусев A.A. Восприимчивость цыплят кросса "Смена" к возбудителю синдрома гидроперикардита кур при экспериментальном заражении // Учен. зап. Витебской акад. вет. мед. -Витебск. - 1999 - - Т.35. - Ч. 1. - С.20-22.

13. Борисов, В.В., Борисов A.B., Старов С.К. Инактивированные вакцины -возможные варианты применения в промышленном птицеводстве //Матер, конф. по птицеводству. - М., 2003. - С.208-209.21.

14. Борисов, В.В. Опыт борьбы с аденовирусным гидроперикардитом кур в птицехозяйствах Северного Кавказа // Матер, конференции по птицеводству. -Зеленоград, 2003. - С. 211-212.

15. Борисов, В.В. Разработка средств и методов диагностики и специфической профилактики аденовирусных болезней кур: автореф. дис. ... д-ра. вет. наук // Борисов В.В. - Иваново, 2007.

16. Борисова, И. А. Разработка технологии изготовления и контроля инактивированной вакцины против ньюкаслской болезни и метапневмовирусной инфекции птиц: дисс... канд. биол. наук // Владимир, 2008. -167с.

17. Борисова М.С. Получение антигена вируса инфекционного гидроперикардита птиц для иммуноферментного анализа // Перспективы развития агропромышленного комплекса России в условиях членства в ВТО: матер, междунар. конгр. - СПб, 2013. - С.224 .

18. Борисова, М.С., Никитина Н.В. Антигенные свойства инактивированной сорбированной и эмульгированной вакцины против инфекционного гидроперикардита кур //Ветеринарная практика. 2013.-№2(61).-С.11-12.

19. Вербов, В.Н. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа // Твердофазный иммуноферментный анализ : сб. науч. тр. / Ленингр. НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.-Л., 1988.- Т.64.- С.3-27.

20. Георгиу, X. Оценка серологических реакций при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец // Вестник ветеринарии.-1998.-№8(2).-С.82-85.

21. Горбачев E.H., Вербов В.Н., Артюхов А.И. Оценка влияния физико-химических факторов на чувств, и специф. ИФА. Сб. "Твердофазный ИФА", Л., 1988, С. 76 - 80

22. Джавадов, Э.Д. Иммуноферментный метод диагностики болезни Гамборо: дис. ... канд. вет. наук// Л., 1988. - 189 с.

23. Джавадов, Э.Д., Никитина Н.В., Трефилов Б.Б., Явдошак Л.И. Способ определения специфических антител к вирусу энтерита гусей // RU 2323743 С2 22.05.2006.

24. Джавадов, Э.Д. Профилактика болезней птиц инактивированными вакцинами серии «Авикрон» // Джавадов Э.Д., Вихрева И.Н., Дмитриева М.Е.[и др.] // Матер. Междунар. конг.-СПб, 2009.-С.30-31.

25. Джавадов, Э.Д. Никитина Н.В., Борисова М.С. Разработка ИФА-диагностикума для определения антител к вирусу инфекционного гидроперикардита кур // Ветеринарная практика. 2013. - №1(60). - С. 27-30.

26. Дмитриев, Д.В. Серологический мониторинг на метапневмовирусную инфекцию птиц с применением ИФА // Ветеринарная практика.- СПб, 2010.-№2(49). - С. 20-22.

27. Дмитриев, Д.В. Непрямой метод иммуноферментного анализа в диагностике

метапневмовирусной инфекции птиц: автореф. дис. ... канд. вет. наук // СПб, 2010. -21 с.

28. Дубовой, A.C., Никитина Н.В., Сергеев В.Д. Разработка тест-системы для иммуноферментного метода диагностики аденовирусной инфекции птиц // Современные средства и методы борьбы с заразными болезнями сельскохозяйственных птиц: сб. науч.тр., ВНИВИП.- Л., 1988., С. 12-14.

29. Егоров, A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. Теория и практика ИФА// М.: Высшая школа, 1991.-288с.

30. Коровин, Р.Н., Рождественский И.К. Аденовирусные инфекции сельскохозяйственной птицы // Ленинград: Агропромиздат. - 1990. -77 с.

31. Котляр, П.Ю. Иммуноферментный метод диагностики инфекционного ларинготрахеита птиц: автореф. дис. ...канд. вет. наук // СПб., 1995.-18с.

32. Лагуткин, H.A., Арсентьев А.Р., Краснопевцева Ж.А., Ватропин В.И. Массовый гидроперикардит у мясных цыплят раннего возраста (неинфекционная этиология болезни) // Вопр. вет. вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -1992-Т.1.-4.2.-С.248-251.

33. Маслов, Д.В. Серологическая диагностика вирусного энтерита гусей методом иммуноферментного анализа: дис. ... канд. вет. наук/ Маслов Д.В.- Санкт-Петербург, 2006.

34. Никитина, Н.В., Трефилов Б.Б. Набор компонентов для диагностики реовирусного теносиновита кур иммуноферментным методом // ТУ 9388-00900495674-2001. Регистр.: 23.04.01.- С. 18.

35. Никитина, Н.В., Дубовой A.C. Набор компонентов для выявления антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76) иммуноферментным методом // ТУ 9388 016 00495674-2003.-С.18.

36. Никитина Н.В., Борисова М.С. Оценка эффективности вакцинации против инфекционного гидроперикардита кур методом иммунофементного анализа // Матер. Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Инновационные решения актуальных проблем в АПК». -Екатеринбург, 2013.- С. 22-26.

37. Никитина Н.В., Трефилов Б.Б., Борисова М.С. Изучение антигенности инактивированной сорбированной и эмульгированной форм вакцины против инфекционного гидроперикардита кур // Перспективы развития агропромышленного комплекса России в условиях членства в ВТО: матер, междунар. конгр. - СПб, 2013. - С.225 .

38. Николаева, И.П., Шаоева М.А. Изучение чувствительности некоторых клеточных культур к аденовирусу птиц // Научные основы технологии промышленного производства ветеринарных биологических препаратов. -Москва.-1981.-С.48.

39. Ройт, А., Бростофф Д., Мейл Д. Иммунология // М. : Мир, 2000. -С.592.

40. Сергеев, В.Д., Рождественский И.К. Методические рекомендации по очистке и концентрированию аденовирусов птиц // Л., 1988.- 30 с.

41. Сергеев, В.Д., Никитина Н.В., Мухамедшина JI.P. Иммуноферментный метод в диагностике болезней птиц // Тр. ВНИВИП. - Л., 1989.-С.75-82.

42. Сергеев, В.Д., Токарских В.В. Получение очищенного и специфического антигена вируса инфекционного бронхита кур для иммуноферментного анализа // Вирусные болезни с.-х. животных : тез. докл. Всерос. науч.-практ. конф. -Владимир, 1995.

43. Старкова, Т.В., Полетаева О.Г. Оценка различных методов инструментального учета результатов ИФА с антигеном трихинелл // Материалы докл. Седьмой науч. конф. по трихинеллезу человека и животных. - М., 1996.-С.93-95.

44. Сурнев, Д.С., Борисов В.В., Ельникова Е.В., Волкова М.А. Иммунный ответ у кур, привитых культуральной и тканевой эмульсионными вакцинами против синдрома гидроперикардита // Матер. 1-ого междунар. ветер, конгресса по птицевод., 18-22 апр. 2005. - М, 2005. - С. 97-101.

45. Сюрин, В.Н., Белоусова Р.В., Фомина Н.В. Ветеринарная вирусология // М.: Агропромиздат, 1991.-С.376.

46. Фадель, М., Надточей Г.А., Контримавичус Л.М., Суворов A.B. Метод ИФА для диагностики вирусного энтерита гусей // Ветеринария.-1989.-№7.-С.36-39.

47. Чард, Т. Радиоиммунологические методы // М. : Мир, 1981. - С.246.

48. Abdul-Aziz T.A., Al-Attar M.A. New syndrome in Iraqi chicks // Vet. Rec. - 1991. - Vol.129.-P.272.

49. Abe T., Nakamura K., Tojo H., Mase M., Shibahara T., Yamaguchi S.,YuasaN. Histology, immunohistochemistry, and ultrastructure of hydropericardium syndrome in adult broiler breeders and broiler chicks // Avian Dis. - 1998. - Vol.42. - '3. - P.606-612.

50. Adair B.M., Curran W.L., McFerran J.B. Ultrastructural studies of the replication of fowl adenovirus in primary cell cultures // Avian Pathol. - 1979. - Vol.8. - P. 133-144.

51. Afzal M.R., Ahmad I. Efficacy of an inactivated vaccine against hydropericardium syndrome in broilers // Vet. Rec. - 1990. - Vol. 126. - P.59-60.

52. Ahmad I., Malek M.I., Iqbal K., Ahmed K., Naz S. Efficacy of formalized liver-organ-vaccine against Angara disease in broilers // Vet. Arh. - 1990. - Vol.60. -P.131-138.

53. Ahmad K., Ahmad I., Muneer M.A., Ajmal M. Experimental transmission of Angara disease in broiler fowls // Stud. Res. Vet. Med. - 1992. - Vol.1. - P.53-55.

54. Akhtar S., Zahid S., Khan M.I. Risk factor associated with hydropericardium in broiler flocks // Vet. Rec. - 1992. - Vol. 131. - '21. - P. 481 -484.

55. Akhtar S. Hydropericardium syndrome in broiler chickens in Pakistan // World Poult. Sci. J. - 1994. - Vol.50. - P. 177-182.

56. Akhtar S., Afzal M. Sindrome de hydropericardio en polios de engorda en Pakistan: etiologia, diagnostico y control // Proc. 20th Annu ANECA Conf. - 1995. - P.405-415.

57. Anawis, M.A., Lindberg R.E. Stabilized enzyme conjugate composition // Patent №EP0152847.-1985-08-28.

58. Anjum A.D., Sabri M.A., Iqbal Z. Hydropericrditis syndrome in broiler chickens in Pakistan // Vet. Rec. - 1989. - Vol.124. - 110. - P.247-248.

59. Ashihara, Y., Kasahara Y. Method of measuring biological ligand by utilising amylase // Patent №EP0152305.-1985-08-21.

60. Asrani R.K., Sharma S.K., Gupta V.K., Singh S.P., Katock R.C., Nigam J.M.

Hydropericardium - hepatopathy syndrome: an emering threat to Asian poultry //Proc. Xlth International Congress of the World Veterinary Poultry Association. Hungary, Budapest. - 1997.-P.48.

61. Bergmann V. Einschlurj ko rperchenstruktur und electronenmikroskopischer Virusnachweis bei spontaner Einschlur ko rperchenhepatitis des Huhnes // Arch. Exp. Vet. Med. - 1978. - Vol.32. - P.6.

62. Bhatti B.M., Qureshi M.S., Bajwa T.M. Haematology and clinical chemistry values in broiler chickens affected with hydropericardium syndrome prevalent in Pakistan // Vet. Arhiv. - 1989. - Vol.59. - '3. - P. 107-111.

63. Blake, D.A., Boguslaski R.C. Specific biding assay based on enzyme cascade amplification // Patent №EP0144744,-1985-06-19.

64. Borisov V.V., Borisov A.V., Gusev A.A. Hydropericardium syndrome in chickens in Russia // Xlth Int. Congr. World Vet. Poultry Ass.: Abstr. - Budapest, 1997. - P. 258.

65. Borrego J.L., Soto E. Reporte de campo de une brote de hepatitis con cuerpos de inclusion (HCl) en reproductoras pesadas a edad temprana // Proc. 20th Annu ANECA Conf.- 1995.-P. 1-4.

66. Brot, N., Weissbach H. Novel reductase // Patent №US4374928.- 1983-02-22.

67. Capua I., Liberti L., Gough R.E., Casaccia C., Asdrubali G. Isolation and characterization of an adenovirus associated with inclusion body hepatitis in psittacine birds // Avian Pathol. - 1995. - Vol.24. - P.717-722.

68. Carlies, G. Bont D., Capron A. Enzymo-immunoassaiss// Bulletin d e'lnstitute Pasteur.-1981 .-T.79.-P.317-333, 343-346.

69. Casnocha, E. Dynamics of maternal and post-infection adenovirus antibodies in fowl / E. Casnocha, P. Lietava // Vet. Med. (Praha). 1980. - Vol. 25, N 5. - P. 277-284.

70. Cheema A.H., Afzal M., Ahmad J. An adenovirus infection of poultry in Pakistan // Rev. Sei. Tech. Off. Int. Epiz. - 1989. - Vol.8. - P.789- 795.

71. Cowen B.S. Chicken embryo propagation of type 1 avian adenoviruses // Avian Dis. - 1988. - Vol.32. - P.347-352.

72. Cowen B.S. Inclusion body hepatitis-anaemia and hydropericardium syndromes: aetiology and control // World's Poultry Science Journal. - 1992. -Vol.48. - '3. — P.247-254.

73. Dawson, E. Stabilization of peroxidase / Dawson E., Homan J. Patent №US4331761.-1982-05-25.

74. Droual R., Woolcock P.R., Nordhausen R.W., Fitzgerald S.D. Inclusion body hepatitis and hemorrhagic enteritis in two African grey parrots (Psittacus erithacus) associated with adenovirus // Journal of Veterinary Diagnostic Investigation. - 1995. -'7. - P.150-154.

75. Engvall, E., Perlmann P., Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) Qanlitative assay of immunoglobulin G // Immunochemistry.-l 971.-V.89.-P.871-879.

76. Fadly A., Riegle B ., Nazerian K., STEPHENS E. Some Observations on an Adenovirus Isolated from Specific Pathogen Free Chickens // Poultry Sc. — 1980. -Vol.59. -P.21 -27.

77. Frey, G., Zimmermann G. Agent and process for detection of redox system // Patent №DE3433946.-1986-03-27.

78. Frey tag, J.W., Ishikawa E. Immunoassay utilizing covalent conjugates of polymerized and antibody // Patent №EP0175560.-1986-03-26.

79. Gallacher, J. Partially oxidized enzyme conjugates// Patent №GB2067572.-1981-07-30.

80.Gallacher J. Stabilization of indicators for detecting enzyme activity / Gallacher J. // Patent №US4615972.-1986-10-07.

81. Gallina A.M., Winterfield R.W., Fadly A.M. Adenovirus infection and disease. Histopathology of natural and experimental disease// Avian Dis. - 1973. - Vol.17. -P.343-353.

82. Gantzer, M.L. Stabilized test composition, devise and method for the determination of peroxidatively active substances // Patent №EP0130520.-1985-01-09.

83. Gay G.M., Retana R.A., Soto P.E. Valoraction comparativa de una vacuana emulsionada experimental contra la hepatitis con cuerpos de inclusion // Proc. 20th Annu ANECA Conf. - 1995. - P.l 18-123.

84. Grassi, J., Pradelles P. Compound labeled with acetylcholine sterase from Electrophorus electricus, method for its preparation and its use a marker in enzyme immunoassays // Patent №EP0139552.-1985-05-02.

85. Grimes T.M. Cause and control of a parachute form of inclusion body hepatitis // Proc. of the 41st Western Poult. Dis. Conf. Marth 1-3. Sacramento. California. - 1992. -P.42-44.

86. Guy J.S., Schaeffler J.L., Barnes H. Inclusion body hepatitis in day-old turkeys // Avian Dis. - 1988. - Vol.32. - N3. - P.587-590.

87. Hall, J.E., Hargreaves W.R. Zymogene activation, cascade amplification immunoassay // Patent №EP0123265.-1984-10-31.

88. Harris, C. Cascade amplification enzyme immunoassay // Patent №US4463090.-1984-07-31.

89. Have, P., Hansen H. Detection of goose Parvovirus antibodies by microneutralisation and enzyme-linked immunosorbent assay // Proc. 7th World. Vet. Poult. Assoc.- 1981.- P.60.

90. Heck, F.C., Deyoe B.L., Williams J.D. Antibodies to Brucella abortus in sera from Strain 19 vaccinated and non-vaccinated cows as determined by enzyme linked immunosorbent assay and conventional serologic method // Vet. Immunol. Immunopathol.- 1982.-6(3).-P.629-634.

91. Helmboldt, C., Frazier M. Avian hepatic inclusion bodies of unknown significance. Avian Dis., - 1963. - N. 7(4).- P. 446-450.

92. Herrmann J.E. and Collins M.F.Collins, 1976 Quantitation of immunoglobulin adsorption to plastics.J Immunol. Methods 10. P.363-366.

93.Hess M., Matzerheri A., Prusas C., Vob M. Inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in chicks caused by fowl adenovirus serotype 4 // Proc. XIth International Congress of the World Veterinary Poultry Assotiation. Hungary, Budapest. - 1997.-P.251.

94.Hess M., Prusas C., Monreal G. Growth analysis of adenoviruses isolated from pigeons in chicken cells and serological characterization of the isolates // Avian Pathol. - 1998. - Vol. -27. -P.196-199.

95. Hess, M. Epidemiological studies on fowl adenovirus isolated from cases on infectious hydropericardium / M. Hess, R. Raue, C. Prusas // Avian Pathol. 1999. - Vol. 28.-P.433-439.

96. Ishikawa E., Kawai T., Miyai K. Enzyme immunoassay //Tokyo-New York.-1981.-280 P.

97. Jaffery, M.S. A treatise on Angara disease in chicken / M.S. Jaffery // Pakistan Vet. Med. Ass. Karachi, 1988.- P. 1-33.

98. Johannsson, A. Biochemical detection method and kit for use therein / Johannsson A. // Patent №EP0132948,-1985-02-13.

99. Kardi, V., Szegletes E. Use of ELISA procedures for the detection of Derzsy's disease virus of geese and of antibodies produced against it // Avian Pathologie.-1996.-№25.-P.25-34.

100. Katsuyama H. Color indicator composition and film for detecting hydrogen peroxide / Katsuyama H., Shishido T. // Patent №DE3213786.-1983-01-05.

101. Klenner, D., Kleinhamer G. Stabilization of peroxidase activity in solution // Patent № EP0197447.-1986-10-15.

102. Kumar R., Chandra R., Shukla S.K., Agrawal D.K., Kumar M.Hydropericardium syndrome (HPS) in India: a preliminary study on the causative agent and control of the disease by inactivated autogenous vaccine// Trop. Anim. Health. Prod. -1997. - Vol.29. - 13. - P.158-164.

103. Kwang, M.J., Tsai H.J., Lu Y.S., Fei A. C. Y., Lee Y. L., Lin D. F. , Lee C. Detection of antibodies against goose parvovirus by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)//J. Chin. Soc. Vet. Sci.- 1987.- Vol.13, № 1.- P. 17-23.

104. Kwang, M.J., Tsai II.J., Lu Y.S., Fei A. C. Y., Lee Y. L., Lin D. F-. and Lee C. Detection of antibodies against goose parvovirus by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) //Vet. Bull.- 1988.-Vol.58, №5.- P. 334.

105. Lamichhane C., Snyder D., Goodwin M.. Vertical and horizontal transmission of a highly pathogenic adenovirus associated with spiking mortality in broiler chichens on the Delmarva Peninsula//| Proc. of the 40th Western Poult. Dis. Conf. Acapulco, Guerrero Mexico. - 1991. - P.260-261.

106. Lenz, II., Kleinhammer G Process for the determination of an immunologically-bindable substance involving a Fab fragment //Patent № DE3430905.-1986-02-27.

107. Liao, Y.K., Lu Y.S. Detection of Derzsy's disease viral antigen by ELISA and latex agglutination // Proceedings of the 5th Asian-Australasian Association of Animal Production Societies Congress, Taipei, ROC on Taiwan. - 1990.-Vol.3.-P.208.

108. Litman, D., Ullman E. Simultaneous calibration heterogeneous immunoassay // Patent №US4533629.-1985-08-06.

109. Mazaheri A., Prusas C., Voss M., Hess M. Some strains of serotype 4 adenoviruses cause inclusion body hepatitis and hydropericardium syndrome in chickens // Avian Pathol. - 1998. - Vol.27. - P.269-276.

110. McCracken R.M., Adair B.M. Avian adenoviruses // In McFerran J.B., McNuIty (eds.) Virus infection of birds. Amsterdam. - 1993. - Vol.4. - P.123-144.

111. McFerran J.B. Immunity to adenoviruses // In Rose M.E., Rayne L.N., Freeman B.M. Avian immunology. - 1981. - P. 187-203.

112. McFerran J.B. Adenovirus (group 1) infection in chickens // In: Disease of poultry, ed. Calnek B.W., Barnes H.J., Beard C.W. et al., 9th ed., Iowa State University Press, Ames. I.A. - 1991. - P.553-563.

113. Naeem K., Niazi T., Malik S.A., Cheema A.H. Immunosupressive potential and pathogenicity of an avian adenovirus isolate involved in hydropericardium syndrome in broilers // Avian Dis. - 1995. - Vol.39. - P.723-728.

114. Nakane, P.K., Farr A.G. Immunohistochemistry with enzyme labeled antibodies: a brief review//J. of Immunological Methods.- 1981.- № 47.- P. 129-144.

115. Nassar T.J., El-Sanousi A., Bzour N., Abu-Ajamieh H. Efficacy of an inactivated oil emulsion vaccine against Hydropericardium syndrome in broiler chickens // Proc. XII international congress of the World Veterenary Poultry Association. September 1721. Cairo. Egypt. - 2001. - P.253.

116. Nighot P.K., Deshmukh D.B., Ghalasasi G.R., Survashe B.D. Inclusion body-hepatitis-hydropericardium syndrone: sequential histopathology // Proceedings XX World's Poultry Congress, New Delhi, India. - 1996. - Vol.IV. - P.321.

117. Oberoi M.S., Singh A., Singh B. Avian adenovirus infections in poultry birds in

northern India // Proceedings XX World's Poultry Congress, New Delhi, India. - 1996. -Vol.IV.-P.318.

118. Parham, M., Warren W. Assay of peroxidase enzyme activity // Patent №US4596770.-1986-06-24.

119. Qureshi A.A. Hydropericardium and ascites//| Poultry International. - 1989. -Vol.28.-P.44-48.

120. Ramis A., Marlasca M.J., Majo N., Ferrer L. Inclusion body hepatitis (IBFI) in a group of electus parrots (Eclectus roratus) // Avian Pathol. - 1992. - Vol.21. - P. 165169.

121. Riddell C. Virus hepatitis in domestic geese in Saskatchewan // Avian Dis. - 1984. - Vol.28. - P.774-782.

122. Sah R.L., Kataria J.M., Arya S.C., Verma K.C. Studies on inclusion body hepatitis in broiler chicks // Proceedings XX World's Poultry Congress, New Delhi, India. -1996. - Vol.IV. - P.313.

123. Singh Á., Singh Á., Oberoi M.S. Epidemiology of inclusion body hepatitis (IBH) in poultry in northern India // Proceedings XX World's Poultry Congress, New Delhi, India. - 1996. - Vol.IV. - P.311.

124. Stout, R. Catalyzed colorimetric substrates for peroxidase enzyme determinations // Patent №EP0103784.-1984-03-28.

125. Sun Ming. Stabilized peroxidase compositions // Patent №US4504579.-1985-03-12.

126. Toro H., Prusas C., Raue R., Cerda L., Geisse C., Gonzalez C., Hess M. Characterization of fowl adenoviruses from outbreaks of inclusion body hepatitis/ hydropericardium syndrome in Chile // Avian Dis. - 1999 - Vol.43 - '2 - P.262-270.

127. Voller A., Bidwell D.E., Bartlett A. The ensime linked immunosorbent assay. A guide with abstracts of microplate application, London, 1979. - V.l, p. 128.

128. Vos M., Monreal G. Aislamiento e identificación de adenovirus de lasaves, con atención especial en el syndrome del hidropericardio// Proc. 20th Annu ANECA Conf. -1995.-P.417-423.

129. Wada H., Kosaka Y. Composition for assaying hydrogen peroxide // Patent №DE3443415.-1986-02-27.

130. Wagner D. Amplified assay a ligand // Patent №EP174753.- 1986-03-31.

131. Wehner R., Mattersberger J. Process for stabilizing the activity of peroxidase in solution // Patent № DE3509238.-1986-09-18.

132. Yates, V.J. The presence of avian adenoviruses and adenoassociated viruses in healthy chickens / V.J. Yates, Y.O. Rheee, D.E. Fry // Avian Dis. -1976 -Vol. 20.-P. 146-152.

133. Zaman T., Khan M.Z. Serum profiles in hydropericardium affected broiler chicks // Pakistan Vet. J. - 1991. - 111. - P.50-52.

134. Zia, M. R., Sajjad-ur-Rahman, Siddique M., Sandhu M. A. Sajjad-ur-Rahman, Siddique M., Sandhu M. A. Comparative efficiency of two oil emulsion Hydropericardium Hepatitis syndrome vaccine // International journal of Agriculture&Biology. - 2001. - V. 3. - No. 4. - P. 436-438.