Селекция ЛАК клетками белка Tag7 человека, клонирование и изучение соответствующего гена тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Миркина, Ирина Ильинична

• Миркина, Ирина Ильинична
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Миркина, Ирина Ильинична

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ-

ВВЕДЕНИЕ-

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Основной принцип врожденного и приобретенного иммунного ответа-------------------------------------------------

2 Рецепторы, вовлеченные в неклональный иммунный ответ

2.1 Общая характеристика------------------------------------------------11

2.2 Семейство Toll/IL-IR

3 Белковые факторы, продуцируемые в процессе иммунного ответа: сигналы опасности

3.1 Прямое цитолитическое действие на чужеродный антиген-----------18

3.2 Хемоаттракция (хемотаксис)—

3.3 Стимуляция клепальных Т- и В- лимфоцитов и

клеток врожденного иммунитета------------------------------------22

4 Роль сигналов опасности в противоопухолевом иммунитете:

4.1 ЛАК клетки как in vitro модель для изучения противоопухолевого иммунитета

4.2 Причины иммунологической толерантности организма в отношении опухолей----------------------------------—-----------------------------25

4.3 Механизм повышения иммуногенности с помощью сигналов

опасности---------------------------------------------------------------28

5 Индукция программированной гибели клеток-мишеней,

пораженных чужеродным антигеном: 5. 1 Классификация механизмов клеточной гибели:

некроз и апоптоз------------------

5.2 Основные признаки апоптоза--------------------------------------------33

5.3 Основные механизмы трансдукции апоптотического сигнала:

5.3.1 Роль адапторных молекул в апоптозе---------------------------------34

5.3.2 Эффекторные молекулы: идентификация, пути активации и осуществления эффекторных функций в процессе апоптоза-----------38

5.4 Регуляция "апоптотической программы": ингибиторы и активаторы апоптоза и их значение для организма—---------------------------------43

ЗАКЛЮЧЕНИЕ-

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

-Ферменты и реактивы------------------------------г----------------------55

-Агарозный гель-электофорез ДНК------------------------------—

-Реакция обратной транскрипции и амплификация фрагментов кДНК

tag 7-

-Плазмидные и фаговые векторы-----------------------------------

-Штаммы бактерий---------------------------------------------------------57

-Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК----------------------------57

-Выделение плазмидной ДНК-------------------------------------------------59

-Определение первичной последовательности ДНК---------------------------60

-Выделение тотальной РНК

-Выделение хромосомной ДНК и приготовление образцов

хромосомной ДНК для Саузерн-блот-гибридизационного анализа-----------61

-Выделение фаговой ДНК-

-Нозерн- и Саузерн- блот гибридизационный анализ

-Конструирование геномной человеческой библиотеки-----------------------67

-Приготовление бактериальных штаммов, определение

титра и амплификация библиотеки----------------------------------------68

-Скрининг библиотеки

-Клонирование, экспрессия и выделение рекомбинантного

интерлейкина 2--------------------------------------------------------------72

-Получение поликлональной антисыворотки к белку Tag7--------------------74

-Очистка политональных Tag7-специфических антител-

-Выделение и культивирование лейкоцитов периферической

крови и ЛАК клеток человека------------------------------------------------76

-Культивирование трансформированных клеточных линий------------------77

-Определение цитолитической активности----------------------------------78

-Изучение фрагментации ДНК клеток-мишеней-----------------------------78

-Иммуногистохимический анализ--------------------------------------------79

-Иммунофлуоресцентный анализ---------------------------------------------80

Иммунопреципитация Tag 7-подобного иммунореактивного белка из клеточных лизатов и кондиционной среды-------------------------80

-Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блот анализ----81

-Иммуноаффинная хроматография Tagl-иммунореактивного белка--------84

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ:

- Мышиный ген tag 7 имеет своего человеческого гомолога-------------------86

- Идентификация и клонирование фрагмента

кодирующей ДНК гена tag 7 человека---------------------------------------87

- Клонирование полноразмерной к ДНК человеческого tag 7--------------------90

- Идентификация геномной копии tag7 человека-----------------------------93

- Изучение геномной организации tag7 человека. Сравнительный анализ геномных копий человеческог и мышиного tag 7-----------------------------94

-Иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный анализ экспрессии

Tag 7 в тканях и органах человека-----------------------------------------98

-Изучение экспрессии мРНК tag 7 в лейкоцитах периферической крови и

лимфокин- активированных киллерах человека-----------------------------106

-Анализ белков супернатанта ЛАК клеток с помощью Вестерн-блот

анализа с антителами к Tag7---------------------------------------------109

-Ингибирование цитолитической активности супернатанта

ЛАК клеток антителами к Tag7----------------------------------------—115

-Нуклеосомальная фрагментация ДНК клеток-мишеней, индуцированная супернатантом ЛАК клеток и ее ингибирование

антителами к Tag7-

-Хроматографическое выделение Tag7- иммунореактивного

белка на иммуно аффинном сорбенте------------------------

ВЫВОДЫ-

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ-

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АПК- антиген-презентирующие клетки

ЕК- естественные киллеры

ЦТЛ- цитотоксические Т-лимфоциты

МНС класса I и II- major histocompatibility complex -главный комплекс гистосовместимости класса I и II Т|,- Т- хелперы

ЛАК - лимфокин-активированные киллеры LPS- липополисахариды

ПАМП -патоген-ассоциированный молекулярный паттерн.

ПРР- паттерн-распознающие клеточные рецепторы

IFNy- интерферон у

IL-1 - интерлейкин

IL-1R- рецептор интерлейкина

IL-2- интерлейкин2

DD- death domain- домен смерти

DED- death effector domain- эффекторный домен смерти

FASL- FAS лиганд

TNF- фактор некроза опухолей

TCR- Т-клеточный рецептор

sFASL- секретируемая форма FAS лиганда

FADD- FAS-associated death domain, FAS- ассоциированный домен смерти TRADD- TNF receptor-associated death domain- домен смерти, ассоциированный с рецептором TNF.

ICE -interleukin-ip converting enzyme- интерлейкин-lp-конвертирующий фермент

FLICE/ MORT1 - FADD-Iike IL-lp- converting enzyme- FADD- родственный

IL-1 p- конвертирующий фермент, каспаза-8

CAD -каспаз-активированная дезоксирибонуклеаза

FLIPs- FLICE-inhibitory proteins- FLICE- ингибирующие белки

EST- expression sequence tag

TAE- Tris-acetate-EDTA buffer

TBE- Tris- borate-EDTA- buffer

ПААГ- полиакриламидный гель

SDS- sodium dodecylsulfate, додецилсульфат натрия

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Селекция ЛАК клетками белка Tag7 человека, клонирование и изучение соответствующего гена»

ВВЕДЕНИЕ

Одной из наиболее актуальных проблем современности является рост заболеваний, связанных с дисфункционированием иммунной системы организма. В связи с этим приоритетной задачей молекулярной биологии и медицины является изучение молекулярных механизмов иммунитета.

Известны два вида иммунитета, сформировавшиеся в процессе эволюционного развития: врожденный и приобретенный. Врожденный иммунитет в той или иной форме присутствует во всех многоклеточных организмах и является филогенетически более древней системой, тогда как приобретенный иммунитет, сложившийся значительно позднее, характерен преимущественно для млекопитающих.

Приоритет в иерархии иммунных функций традиционно отдавался приобретенному иммунитету. Однако в настоящее время установлено, что врожденный иммунитет не менее важен для осуществления иммунного ответа. Более того, только координированная работа обеих форм иммунитета обеспечивает надежную защиту организма от бактериальной, грибковой, вирусной инфекций и злокачественных новообразований.

Изучение и клонирование генов, вовлеченных в работу врожденного и приобретенного иммунитета позволяет глубже понять механизм работы иммунитета в норме и причины сбоев в этом механизме, характерные для различных патологий.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Миркина, Ирина Ильинична

выводы

1 Впервые клонирована кДНК и геномная копия гена tag7 человека. Соответствующая аминокислотная последовательность гена tag7 проявляет гомологию с геном tag 7мыши и PGRP насекомых T.ni, а структурная организация гена tag7 консервативна для млекопитающих.

2 Показан секреторный характер белка Tag7 и его преимущественная локализация в лимфоидных клетках. Не обнаружена экспрессия tag7 в опухолевых клетках.

3 Обнаружена экспрессия мРНК tag7 в неактивированных лейкоцитах периферической крови здоровых доноров и ЛАК клетках человека и установлено, что культивирование лейкоцитов в присутствии высоких доз интерлейкина 2 индуцирует изменение профиля экспрессии tag7.

4 Обнаружено присутствие белка Tag7 в супернатанте ЛАК клеток человека, полученных на 4 и 6 день инкубации лейкоцитов периферической крови с интерлейкином-2. Данный белок проявляет цитолитическую активность в отношение трансформированных клеточных линий L929 и Jurkat, индуцируя клеточную гибель по механизму апоптоза.

Автор выражает глубокую признательность С. Л. Киселеву и Н.В. Гнучеву за постоянное внимание к работе и научное руководство. Автор также благодарит Л.П. Сащенко и всех сотрудников лаборатории молекулярной иммуногенетики рака и группы генотерапии рака за помощь в работе и написании диссертации. Автор благодарен Алексею В. Кибардину и Тамаре И. Лукьяновой за помощь и поддержку в процессе работы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Миркина, Ирина Ильинична, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1 Fearon Т. D. and Locksley R.M., " The Instructive Role of Innate Immunity in the Acquired Immune Response", Science, 1996, v.272, April 5, 50-53.

2 Medzhitov R. and Janeway Ch.A., "An ancient system of host defense", Current Opinion in Immunology, 1998, v. 10, 12-15.

3 Medzhitov R. and Janeway Ch.A., "Innate immunity: impact on the adaptive immune response", Current Opinion in Immunology, 1997, v.9, 4-9.

4 Абелев Г. И., "Взаимодействие врожденного и приобретенного иммунитета в защите организма от инфекции", Соросовский образовательный журнал, 1998, п. 2, 52-58.

5 Poccia F., Cipriani В., Vendetti S., Colizzi V., Poquet Y., Battistini L., Lopez-Botet M., Fournie J. J., Gougeon M.L., "CD94/NKG2 inhibitory receptor complex modulates both anti-viral and anti-tumoral responses of polyclonal phosphoantigen reactive V gamma 9V delta 2 T lymphocytes", J. Immunol. 1997, December 15, 159 (12), 6009-6017.

6 Bendelac A. and Fearon D.T., "Innate Immunity. Innate pathway that control acquired immunity", Current Opinion in Immunology", 1997, v.9, 1-3.

7 Dinarello C.A., "A TH1 -inducing, proinflammatory cytokine and new member of the IL-1 family"., J. Allergy Clin. Immunol., 1999, January, n.103, 11-24.

8 Muzio M., Ni J., Fend P., Dixit V.M., "IRAK (Pelle) Family Member IRAK-2 and MyD88 as Proximal Mediators of IL-1 Signaling", Science, 1997, November 28, v.278, 1612-1615.

9 Yanagata M., Merkie, J.P., and Sanes J.R., "Interspecific comparisons reveal conserved features of the Drosophila Toll protein", Gene, 1994, n. 139, 223228.

10 Medzhitov R., Preston-Hurlburt P. and Janeway Ch. A., "A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity", Nature, 1997, July 24, v.388, 394-397.

11 Mitcham J.M., Parnet P., Bonnert T.P., Garka K.E., Gerhart M.J., Slack J.L., Gayle M.A., Dower S.K. , and Sims J.E., "T1/ST2 Signaling Establishes It as a member of an Expanding Interleukin-1 Receptor Family", JBC, 1996, n.10, v.271, March 8, 5777-5783.

12 Taguchi T., Mitcham J.L., Dower S.K. , Sims J.E., and Testa J.R., "Chromosomal Localization of TIL, a Gene Encoding a Protein Related to the Drosophila Transmembrane Receptor Toll, to Human Chromosome 4pl4", Genomics, 1996, n.32, 486-488.

13 Chaudhary P.M., Ferguson C., Nguyen V., Nguyen O., Massa H.F., Eby M., Jasmin A., Trask B.J., Hood L., and Nelson P.S., "Cloning and Characterization of Two Toll/Interleukin-1 Receptor-Like Genes TIL3 and TIL4: Evidence for a Multi-Gene Receptor Family in Humans", Blood, 1998, n.ll, June 1, v.91, 4020-4027.

14 Rock F.L., Hardiman G., Timans J.C., Kastelein R.A., and Bazan J.F., "A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll", PNAS, 1998, January, v.95, 588-593.

15 Hultmark D., "Macrophage differentiation marker MyD88 is a member of the Toll/IL-1 receptor family", 1994, February 28, v.199, n. 1, 144-146.

16 Hardiman G., Jenkins N.A., Copeland N.G., Gilbert D.J., Garcia D.K., Naylor S.L., Kastelein R.A., and Bazan J.F., "Genetic Structure and Chromosomal Mapping of MyD88", Genomics , 1997, n.45, 332-339.

17 Colaco C., "Why are dendritic cells central to cancer immunotherapy?", Molecular Medicine Today, 1999, January, 14-17.

18 Liu C.C., Raffi S., Granelli-Piperano A., Trapani J.A, Young J.D., "Perforin and serine esterase gene expression in stimulated human T cells: Kinetics, mitogen requirements and effects of cyclosporin A", J. Exp. Med., 1989, v.170, 2105-2118.

19 Henkart P.A., "Mechanisms of lymphokine-mediated cytotoxicity", Annual Rev. Immunol., 1985, v.3, 31-52

20 Jones J., Morgan B.P., "Killing of cells by perforin", Biochem J., 1991, v.280, 199.

21 Kagi D., Ledermann В., Burki K., Seiler O., Odermatt В., Olsen KJ. Podack ER, Zinkerrnagel RM, Hengartner H,: "Cytotoxicity meriated by T cells and natural killer cells is greatly impaired in perforine-deficient mice", Nature, 1994, n.369, 31-36.

22 Masson D., Tschopp J., "A family of serine esterases in lytic granules of cytotoxic T lymphocytes, Cell, 1987, v.49, 679.

23 Сащенко Jl.П., Лукьянова Т.И., Миркина И.И., Понгор Ш., Гнучев Н.В.,

"Влияние гранулярных сериновых протеаз и протеинкиназ на цитолитическое действие ЛАК клеток", Доклады РАН, 1998, 360, 305309.

24 Shresta S., Maclor D.M., Heusel J.W., Russell J.H., Ley T. J., "Cytotoxic lymphocytes require granzyme B for the rapid induction of DNA fragmentation and apoptosis in susceptible target cells", Proc. Natl. Acad. Sci USA, 1995, 92, 5679-5683.

25 Shresta S., Goda P., Wesselschimdt R., Ley T.J., " Residual cytotoxicity and granzyme K expression in granzyme A-deficient cytotoxic lymphocytes", J. Biol. Chem., 1997, 272, 20236-20244.

26 Shresta S., Pham Ch., Thomas D.A., Graubert T.A. and Ley T.J., "How do cytotoxic lymphocytes kill their targets ?", Current Opinion in Immunology, 1998, n.10, 581-587.

27 Hasegawa Y., Bonavida B., "Calcium-independant pathway of TNF-mediated lysis of target cells", J. Immunol., 1989, v. 142, 2670.

28 Klefstrom J., Vastrik I., Saksela E., Valle J., Eilers M. and Alitalo K., "c-Myc induces cellular susceptibility to the cytotoxic avtion of TNF-a", EMBO, 1994, v.13, n. 22, 5442-5450.

29 Wang J. and Lenardo M. J., "Molecules involved on cell death and peripheral tolerance", Current Opinion in Immunology, 1997, n.9, 818-825.

30 Grell M., Wajant H., Zimmermann G. and Scheurich P., "The type 1 receptor (CD 120a) is the high-affinity receptor for soluble tumor necrosis factor", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, January, v.95, 570-575.

31 Scott D.W., Grdina T., Shi Y., " T cells commit suicide, but B cells are murdered", J. Immunol., 1996, April 1, v.156, n. 7, 2352-2356.

32 Osborne B.A., "Apoptosis and the maintenance of homeostasis in the immune system", Current Opinion in Immunology, 1996, n.8, 245-254.

33 Gao Y., Herndon J.M., Zhang H., Griffith T. S., and Ferguson T. A., "Antiinflammatory effect of CD95 Ligand (FASL)-induced apoptosis", J. Exp. Med., 1998, September, v. 188, n.5, 887-896.

34 Schneider P., Holler N., BodmerJ.L., Hahne M., Frei K., Fontana A., and Tschopp J., "Conversion of membrane-bound FAS(CD95)Ligand to its soluble form is associated with downregulation of its proapoptotic activity and loss of liver toxicity", J. Exp. Med., 1998, April 20, v. 187, n.8, 1205-1213.

35 Arai H., Gordon D., Nabel G.J., Nabel G.J, "Gene transfer of FAS ligand induces tumor regression in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, n. 94, 13862-13867.

36 Seino K.I., Kayagaki N., Okumura K., Yagita H., "Antitumor effect of locally produced CD95 ligand", Nat. Med., 1997, n.3, 165-170.

37 Seino K.I., Kayagaki N., Tsukada N., Fukao K., Yagita H., Okumura K., "Transplantation of CD95 ligand-expressing grafts. Influence of transplantation site and difficulty in protecting alio- and xenografts", Transplantation, 1997, n. 64, 1050-1054.

38 Nagata S., "Apoptosis by Death Factor", Cell, 1997, February 7, v.88, 355-365.

39 Devy O., "Antibiotic proteins of polymorphonuclear leukocytes", Eur. J. Haematol. 1996 May, 56 (5), 263-77

40 Lehrer R.I., Ganz T., "Defensins: endogenous antibiotic peptides from human leukocytes", Ciba Found Symp., 1992, n. 171, 276-293.

41 Lillard J.W., Boyaka P.N., Chertov O., Oppenheim J.J., McGhee J.R., "Mechanisms for induction of acquired host immunity by neutrophil peptide defensins". Proc Natl Acad Sci U S A , 1999, January 19, 96 (2), 651-6.

42 Karp C.L., Wysocka M., Ma X., Marovich M., Factor R.E., Nutman T., Armant M., Wahl L., Cuomo P., Trinchieri G.,"Potent suppression of IL-12 production from monocytes and dendritic cells during endotoxin tolerance". Eur. J. Immunol., 1998 October, 28 (10), 3128-36.

43 Flores-Romo L., Bjorck P., Duvert V., van Kooten C., Saeland S., Banchereau J. "CD40 ligation on human cord blood CD34+ hematopoietic progenitors induces their proliferation and differentiation into functional dendritic cells.", J. Exp. Med., 1997 January 20, 185 (2), 341-9.

44 Biron C.A. , "Role of early cytokines, including alpha and beta interferons IFN-alpha/beta), in innate and adaptive immune responses to viral infections.", Semin. Immunol., 1998, October, 10 (5), 383-90.

45 Ross E.M. and Caligiuri M.A., "Cytokine-induced apoptosis of human natural killer cells identifies a novel mechanism to regulate the innate immune response", Blood, 1997, February 1, v.89, n. 3, 910-918.

46 Carson W.E., Ross M.E., Baiocchi R.A., Marien M.J., Boiani N., Grabstein K., Caligiuri M.A., "Endogenous production of interleukinl5 by activated human monocytes is critical for optimal production of interferon-gamma by natural killer cells in vitro", J. Clin. Invest., 1995, December 96 (6), 2578-82.

47 Fehniger T.A., Shah M.H., Turner M.J., VanDeusen J.B., Whitman S.P., Cooper M.A., Suzuki K., Wechser M., Goodsaid F., Caligiuri

M.A.,"Differential Cytokine and chemokine gene expression by human NK cells following activation with IL-18 or IL-15 in combination with IL-12: implications for the innate immune response", J. Immunol., 1999, April 15, 162 (8), 4511-4520.

48 Rosenberg S.A., "Immunotherapy and gene therapy of cancer", Cancer Research (Suppl.), 1991, September 15, 51, 5074-5079.

49 Grimm E.A., Ramsey K.M., Mazumder A., "Lymphokine- activated killer cell phenomenon. Precursor phenotype is serologically distinct from pheripheral T-lymphocytes, memory cytotoxic thymus-derived lymphocytes and natural killer cells", J. Exp. Med., 1983, v.57, 884.

50 Ortaldo J.L., Mason A., Overton R., "Lymphokine-activated killer cells. Analysis of progenitors and effectors", J. Exp. Med, 1986, v. 164, 1193.

51 Ballas Z.K., Rasmussen W., van Otegham G.K., "Lymphokine-activated killer (LAK) cells. Delineation of distinct murine LAK precursor subpopulation", J. Immunol., 1987, v. 138, 1647.

52 Phillips J.H., Lanier L.L., "Dissection of the lymphokine-activated killer phenomenon. Relative contribution of peripheral blood natural killer cells and T-lymphocytes to cytolysis", J. Exp. Med., 1986, v.164, 814.

53 Sashchenko L.P., Gnuchev N.V., Lukjanova T.I., Redchenko I.V., Kabanova O.D., Lukanidin E.M., Blishchenko E.Yu, Satpaev D.K., Khaidukov S.V., Chertov O.Yu., "Time-dependant changes of LAK cells phenotypes correlate with the secretion of different cytotoxic proteins", Immunol. Lett., 1993, v.37, 153-157.

54 Pardoll D.M., "Cancer vaccines", Nature Medicine Vaccine Supplement, 1998, May, v.4, n.5, 525-531.

55 Hart I., and Colaco C., "Fusion induces tumor rejection", Nature, 1997, 388, 627-628.

56 Banchereau J., and Steinman R.M. , "Dendritic cells and the control of immunity", Nature, 1998, 392, 245-252.

57 Bakkar A.B.H., "Generation of anti-melanoma cytotoxic T lymphocytes from healthy donors after presentation of melanoma-associated antigen-derived epitopes by dendritic cells in vitro", Cancer Res., 1995, n.55, 5330-5334.

58 Bakker A.B.H., Phillips J.H., Figdor C.J. and Lanier L.L., "Killer cell inhibitory receptors for MHC class I molecules regulate lysis of melanoma cells mediated by NK cells, y§ T cells, and Antigen-specific CTL", J. Immunol., 1998, 160, 5239-5245.

59 Restifo N.P., Esquivel F., Asher A.L., Stotter H., Barth R.J., Bennink J.R., Mule J.J., Yewdell J.W., Rosenberg S. A., "Defective presentation of endogenous antigens by a murine sarcoma. Implications for the failure of an anti-tumor immune response", J. Immunol., 1991, August 15, 147 (4), 14531459.

60 Walker P.R., Saas P., and Dietrich P.Y., "Tumor expression of FAS ligand (CD95) and the consequences", Current Opinion in Immunology, 1998, n.10, 564-572.

61 Wagelie-Steffen A.L., Hartmann K., Vliagoftis H., Metcalfe D.D., "Fas ligand (FASL, CD95L, APO-1L) expression in murine mast cells", J. Immunol., 1998, n.94, 569-574.

62 Liu Q.Y., Rubin M.A., Omene C., Lederman S., and Stein C., "Fas Ligand is constitutively secreted by prostate cancer cells in vitro", Clinical Cancer Res., 1998, July, v. 4, 1803-1811.

63 Hahne M., Rimoldi D., Schroter M., Romeo P., Schreier M, French L, Schneider P, Bornand T., Fontana A., Lienard D. et al., "Melanoma cell expression of FAS (APO-1/CD95) ligand: implication for tumor immune escape", Science, 1996, n.274, 1363-1366.

64 Cardi G., Heaney J.A., Schned A.R., and Ernstoff M.S., "Expression of FAS (APO-1/CD95) in tumor-infiltrating and peripheral blood lymphocytes in patients with renal cell carcinoma", Cancer Res., 1998, May, n.58, 2078-2080.

65 Arai H., Gordon D., Nabel E.G., Nabel G.J., "Gene transfer of FAS ligand induces tumor regression in vivo", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, n.94, 13862-13867.

66 Seino K.I., Kayagaki N., Okumura K., Yagita H., "Antitumor effect of locally produced CD95 ligand", Nat. Med., 1997, n.3, 165-170.

67 Ma Y., Uemura K., Oka S., Kozutsumi Y., Kawasaki N. and Kawasaki T., "Antitumor activity of mannan-binding protein in vivo as revealed by a virus expression system: mannan-binding protein-dependent cell-mediated cytotoxicity", Proc. Natl. Acad. Sci., USA, January 1999, v.96, 371-375.

68 Wyllie A.H., Kerr J.F., Currie A.R., "Cell death: the significance of apoptosis", Int. Rev. Cytol., 1980, v.69, 251-306.

69 Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R., "Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics", Brit. J. Cancer, 1972, v.26, 239-257.

70 Blischenko E. Yu., Mirkina I. I., Mernenko O. A., Yatskin O. N., Satpaev

D.K., Strizhkov B.N. and Karelin A. A., "Cytotoxic activity of acetilcholine receptor ligands", Biochemistry and Molecular Biology International, 1997, July, v.42. n. 4, 739-747.

71 Mernenko O.A., Blishchenko E.Y., Mirkina 1.1., Karelin A.A., "Met-enkephalin induces cytolytic processes of apoptotic type in K562 human erythroid leukemia cells", FEBS Letters, 1996, n.383, 230-232.

72 Revillard J.P., Adorini L., Goldman M., Kabelitz D. and Waldmann H., "Apoptosis: potential for disease therapies", Trends in Immunology, 1998, July, v.19, n.7, 291-293.

73 Golstein P., Ojcius D. M., Young J.D.-E., "Cell death mechanism and the immune system", J. Immunol. Rev., 1991, n. 121, 29-65.

74 Warren H.S. and Smyth M.J., "NK cells and apoptosis", Immunology and Cell Biology, 1999, n. 77, 64-75.

75 Griffith T.S. and Lynch D. H., "TRAIL: a molecule with multiple receptors and control mechanisms", Current Opinion in Immunology, 1998, n. 10, 559-563.

76 Sashchenko L.P., Lukyanova T.I., Kabanova O.D., Mirkina I.I., Yatskin O.N., Pongor S., Gnuchev N.V., "Different pathways of the release of cytotoxic proteins in LAK cells", Immunol.Lett., v.53, 1996, 25-29.

77 Mirkina I. I., Mernenko 0. A., Satpaev D. K., Karelin A.A., Blishchenko

E. Yu., "Cytolytic processes induced by TNF in L929 and K562 differ in DNA fragmentation mechanisms", Immunol. Letters, 1996, n.52, 105-108.

78 Vercammen D., Beyaert R., Denecker G., Goosens V., Van Loo G., Declercq W., Grooten J., Fiers W., and Vandenabeele P., "Inhibition of caspases increases the sensitivity of L929 cells to necrosis mediated by tumor necrosis factor", J. Exp. Med., 1998, v.187, n.9, May 4, 1477-1485.

79 Zhai Y., Guo R, Hsu T. L., Yu G. L., Ni J., "LIGHT, a novel ligand for lymphotoxinp receptor and TR2/HVEM induces apoptosis and suppresses in vivo tumor formation via gene transfer", J. Clin. Invest., 1998, September, v.102, n.6, 1142-1151.

80. Blischenko E. Y. and Karelin A. A., "Tubocurarin induces the wide spectrum of cytolytic effects in tumor cells", Immunology Letters, 1994, n. 42, 13-17.

81 Cohen J.J., Duke R.C., "Glucocorticoid activation of calciumdependent endonuclease in thymocyte nuclei leads to cell death", J. Immunol., 1984, v.132, 38-43.

82 Wyllie A.H., Morris R.G., Smith A.L., Dunlop D., "Chromatin cleavage in apoptosis: association with condensed chromatin morphology and dependance on macromolecular synthesis", J. Pathol., 1984, v. 142, 67-77.

83 Zhivotovsky B., Wade D., Gahm A., Orrenius S., Nicotera P.L., "Formation of 50 kb chromatin fragments isolated liver nuclei is mediated by protease and endonuclease activation", FEBS Lett., 1994, v.351,150-154.

84 Oberhammer F., Wilson J.W., Dive C., Morris I.D., Hickuns J.A., Wakeling A.E., Walker P.R., Sikorska M., "Apoptotic death in epithelial cells: cleavage of DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation", EMBO J., 1993, v. 12, 3679-3684.

85 Bortner C.D., Oldenburg N.B.E., Cidlowski J.A., "The role of DNA fragmentation in apoptosis", Trends in Cell Biology, 1995, v.5, 21-26.

86 Razin S.V., Hancock R., Iarovaia O., Westergaard O., Gromova I., Georgiev G.P., "Structural-functional organisation of chromosomal DNA domains", Cold Spring Harbor Symposia on Quantative Biology, 58, 1993, 2535.

87 Schulzeosthoff K., Walczak H., Droge W., Krammer P.H., "Cell nucleus and DNA fragmentation are not required for apoptosis", J. Cell Biol., 1994, v.127, 15-20.

88 Yonehara S., Ishii A., Yonehara M., "A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigen codownregulated with the receptor of tumor necrosis factor", J. Exp. Med., 1989, v.169, 1747-1756.

89 Trauth B. C., Klas C., Peters A. M., Matzku S., Moller P., Falk W., Debatin K.M., Krammer P.H., "Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis", Science, 1989, v.245, 301-305.

90 Oberhammer F., Fritsch G., Schmied M., Pavelka M., Printz D., Purchio T., Lassman H., Schulte-Hermann R., "Condensation of chromatin at the membrane of apoptotic nucleus is not associated with activation of an endonuclease", J. Cell Sei., 1993, v.104, 317-326.

91 Boldin M. P., Varfolomeev E. E., Pancer Z., Mett I. L., Camonis J. H., Wallach D., "A novel protein that interacts with the death domain of FAS/APOl contains a sequence motif related to the death domain", J. Biol. Chem, 1995, v.270, 7795-7798.

92 Peter M.E. and Krammer P.H., "Mechanisms of CD95 ( AP0-1/FAS)-mediated apoptosis", Current Opinion in Immunology, 1998, 10, 545-551.

93 Tschopp J., Irmler M. and Thome M., "Inhibition of FAS death signal by FLIPs", Current Opinion in Immunology, 1998, n.10, 552-558.

94 Hsu H., Shu H. B., Pan M. G., Goeddel D.V., "TRADD-TRAF2 and TRADD-FADD interactions define two distinct TNF receptor 1 signal transduction pathways", Cell, 1996, n. 84, 299-308.

95 Hsu H., Shu H.B., Baichwal V., Goeddel D.V., "TNF- dependent recruitment of the protein kinase RIP to the TNF receptor-1 signaling complex", Immunity, 1996, n.4, 387-396.

96 Liu Z.G., Hsu H., Goeddel D.V., Karin M., "Dissection of TNF receptor 1 effector function: JNK activation is not linked to apoptosis while NF-kappaB activation prevents cell death", Cell, 1996, n. 87, 565-576.

97 Beg A. A., Baltimore D., "An essential role for NF-kappaB in preventing TNF-alpha-induced cell death", Science, 1996, 274, 782-784.

98 Van Antwerp D.J., Martin S., Kafri T., Green D.R., Verma I.M., "Suppression of TNFa-induced apoptosis by NF-kB", Science, 1996, 274, 787-789.

99 Ellis R. M., Horvitz H. R., "Genetic control of programmed cell death in the nematode C. elegans", Cell, 1986, v. 44, 817-829.

100 Yuan J., Shaham S., Ledoux S., Ellis H.M., Horvitz H. R., " The C. elegans cell death gene ced-3 encodes a protein similar to mammalian interleukin-1 (3 converting enzyme", Cell, 1993, v.75, 641-652.

101 Ceretti D. P., Kozlosky C.J., Mosley B., Nelson N., Ness K. V., Greebstreet T. A., March C. J., Kronheim S. R., Druch T., "Molecular cloning of the interleukin-1 p converting enzyme", Science, 1992, v. 256, 97100.

102 Miura M., Zhu H., Rotello R., Hartweig E. A., Yuan J., "Induction of apoptosis in fibroblasts by IL-1 p converting enzyme, a mammalian homologue of the C.elegans cell death gene ced-3", Cell, 1993, v. 75, 653-660.

103 Cryns V.and Yuan J., "Proteases to die for", Genes & Development, 12, 1551-1570.

104 Alnemri E. S., Livingston D. J., Nicholson D. W., Salvesen G., Thornberry N. A., Wong W. W. and Yuan J., 1996, "Human ICE/CED-3 protease nomenclature", Cell, 87, 171.

105 Boldin M. P., Goncharov T. M., Goltsev Y. V., Wallach D., "Involvement of MACH, a novel MORTl/FADD-interacting protease, in Fas/APO-1- and TNF-receptor-induced cell death", Cell, 1996, 85, 803-815.

106 Enari M., Talanian R. V., Wong W. W., Nagata S., "Sequential activation of ICE-like and CPP32-like proteases during Fas-mediated apoptosis", Nature, 1996, 380, 723-726.

107 Fernandes-Alnemri T., Armstrong R. C., Krebs J., Srinivasula S. M., et al., "In vitro activation of CPP32 and Mch3 by Mch4, a novel human apoptotic cysteine protease containing two FADD-like domains", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 7464-7469.

108 Bossy-Wetzel E., Newmeyer D.D., and Green D.R., "Mitochondrial cytochrome c release in apoptosis occurs upstream of DEVD-specific caspase

activation and independently of mitochondrial transmembrane depolarization", EMBO J., 1998, 17, 37-49.

109 Chauhan D., Pandey P., Ogata A., Teoh N., Krett N., Halgren R., Rosen S., Kufe D., Kharbanda S., and Anderson K., "Cytochrome c-dependent and -independent induction of apoptosis in multiple myeloma cells", J. Biol. Chem., 1997, 272, 29995-29997.

110 Casciola-Rosen L., Nicholson D.W., Chong T., Rowan N. A., Thornberry N. A., Miller D.K., and Rosen A., "Apopain/CPP32 cleaves proteins that are essential for cellular repair: A fundamental principe of apoptotic death", J. Exp. Med., 1996, 183, 1957-1964.

111 Caulin C., Salvesen G.S., and Oshima R.G., "Caspase cleavage of keratin 18 and reorganization of intermediate filaments during epithelial cell apoptosis", J. Cell. Biol., 1997, 1379-1394.

112 Wright S.C., Schellenberger U., Wang H., Kinder D.H., Talhouk J.W., and Larrick J.W., "Activation of CPP32-like proteases is not sufficient to trigger apoptosis: inhibition of apoptosis by agents that suppress activation of AP24, but not CPP32-like activity", J. Exp. Med., 1997, October 6, v. 186, n. 7, 1107-1117.

113 Zhivotovsky B., Gahm A., Orrenius S., " Two different proteases are involved in the proteolysis of lamin during apoptosis", Biochem. Biophys. Res. Commun, 1997, April 7, 233 (1), 96-101.

114 Rao L., Perez D., White E., "Lamin proteolysis facilitates nuclear events during apoptosis", J. Cell Biol. 1996, n. 135, 1441-1455.

115 Bojes H.K., Feng X., Kehrer J.P., Cohen G.M., "Apoptosis in hematopoietic cells (FL5.12) caused by interleukin-3 withdrawal: relationship to caspase activity and the loss of glutathione", Cell Death Differ., 1999 January 6 (1), 61-70.

116 Sabol S.L., Li R., Lee T.Y., Abdul-Khalek R., "Inhibition of apoptosis-associated DNA fragmentation activity in nonapoptotic cells: the role of DNA fragmentation factor-45", Biochem Biophys Res Commun., 1998, December 9, 253 (1), 151-158.

117 Sakahira H., "Cleavage of CAD inhibitor in CAD activation and DNA degradation during apoptosis", Nature, 1998 , January 1; 391(6662), 96-99.

118 Enari M., Sakahira H., Yokoyama H., Okawa K., Iwamatsu A., Nagata S., "A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD", Nature, 1998, Jan 1; 391 (6662) , 43-50.

119 Ekert P.G., Silke J., Vaux D.L., "Inhibition of apoptosis and clonogenic survival of cells expressing crmA variants: optimal caspase substrates are not necessarily optimal inhibitors", EMBO J., 1999, January 15, 18(2), 330-338.

120 Fisher A.J., Cruz W., Zoog S.J., Schneider C. L., Friesen P.D., "Crystal structure of baculovirus P35: role of a novel reactive site loop in apoptotic caspase inhibition", EMBO J., 1999, April 15, 18 (8), 2031-2039.

121 Deveraux Q. L., Roy N., Stennicke H.R., Van Arsdale T., Zhou Q., Srinivasula S.M. , "IAPs block apoptotic events induced by caspase-8 and cytochrome c by direct inhibition of distinct caspases", EMBO J., 1998, v.17, n.8, 2215-2223.

122 Wang C.Y., Mayo M.W., Korneluk R.G., Goeddel D.V., Baldwin A.S.,

" NF-kB antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAPl and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation", Science, 1998, v.281, September 11, 1680-1683

123 Jaattela M., "Escaping cell death: survival proteins in cancer", Exp. Cell. Res., 1999, Apr 10, 248 (1), 30-43.

124 Chen P., Tian J., Kovesdi I., Bruder J.T., " Interaction of the adenovirus 14.7-kDa protein with FLICE inhibits Fas ligand-induced apoptosis", J. Biol. Chem., 1998, 273, 5815-5820.

125 Thome M., Schneider P., Hofmann K., Fickenscher H., Meinl E., "Viral FLICE-inhibitory proteins (FLIPs) prevent apoptosis induced by death receptors", Nature, 1997, April 3, v.386, 517-521.

126 Irmler M., Thome M., Hahne M., Schneired P., Hofmann K., Steiner V., Bordmer J.L., Schroter M., "Inhibition of death receptor signals by cellular FLIP", Nature, 1997, 388, 190-195.

127 Lenardo M. J., "Interleukin-2 programs mouse alpha beta T lymphocytes for apoptosis", Nature, 1991, 3533, 858-861.

128 Tsujimoto Y., Finger L.R., Yunis J., Nowell P.C., Croce C.M., "Cloning of the chromosome breakpoint of neoplastic B cells the t(14;18) chromosome translocation", Science, 1984, v.226, 1097-1099.

129 Korsmeyer S.J. and Greenberg P.D., "Cancer: Tuning in on death programs", Current Opinion in Immunology, 1998, 10, 543-544.

130 Favrot M., Coll J.L., Louis N. and Negoescu A., "Cell death and cancer: replacement of apoptotic genes and inactivation of death suppressor genes in therapy", Gene Therapy, 1998, n. 5, 728-739.

131 Sedlak T.W., Oltvai Z.N., Yang E., Wang K., Boise L.H., Thompson C.B., Korsmeyer S.J." Multiple Bcl-2 family members demonstrate selective dimerization with Bax", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1995, 92, 7834-7838.

132 Jurgensmeier J.M., Xie Z., Deveraux Q., Ellerby L., Bredesen D., Reed J.C., "Bax directly induces release of cytochrome c from isolated mitochondria", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1998, 95, 4997-5002.

133 Li H., Zhu H., Xu C. J., Yuan J., "Cleavage of BID by caspase 8 mediates the mitochondrial damage in the Fas pathway of apoptosis", Cell, 1998, August 21, 94 (4), 491-501.

134 Kiselev S. L., Kustikova 0. S., Korobko E.V., Prokhortchouk E.B., Kabishev A. A., Lukanidin E.M., and Georgiev G.P., "Molecular Cloning and Characterization of the mouse tag! gene encoding a novel cytokine", JBC, 1998, v.273, n.29, 18633-18639.

135 Kang D., Liu G., Lundstrom E. C., and Steiner H., "A peptidoglycan recognition protein in innate immunity conserved from insects to humans", Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 1998, August, v.95, 10078-10082.

136 Maniatis T., Fritsch E. F., Sambrook J., J. Molecular cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1982.

137 Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D.D., " Short protocols in molecular biology: a compendium of methods from Current protocols on molecular biology", 1989.

138 Titus D. E., "Promega Protocols and Applications Guide", second edition, March, 1991.

139 Amersham International pic: Membrane transfer and detection methods, Amersham UK, 1991.

140 Stratagene: ZAP Express cDNA Synthesis Kit and ZAP Express cDNA Gigapack III Gold Cloning Kit, Instruction manual.

141 Holbrook N. J., Smith K. A., Fornace A.J., Comeau C.M., Wiskocil R.L. & Crabtree G.R., "T-cell growth factor: complete nucleotide sequence and organization of the gene in normal and malignant cells", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984, v. 81, 1634-1638.

142 Ojcius D. M., Zychlinsky A. and Young J.D.E., Ionophore-induced apoptosis: role of DNA fragmentation and calcium fluxes", Exp.Cell Research, 1991, 197, 43-49.

143 Heider K.H., Dammrich J., Sktoch-Angel P., Hermelink H.K., "Differential expression of CD44 splice variants in intestinal and diffuse type human gastric adenocarcinoma and normal gastric mucosa", Cancer Res. 53, 1993, 4197-4203.

144 Laemmli, U.K.Nature.1970, v.221, 680.

145 Ochiai M., Ashida M., "A pattern recognition protein for peptidoglican. Cloning the cDNA and the gene of the silkworm, Bombyx mori", J. Biol. Chem., 1999, April 23, 274 (17), 11854-11858.

146 Lawton P., Nelson J., Tizard R., and Browning J.L., " Characterization of the mouse lymphotoxin-(3 gene", J. Immunol., 1995, 154, 239-246.

147 Gnuchev N. V., Sashchenko L. P., Kabanova O. D., Luk'janova T. I., Satpaev D. K., Mirkina I. I., Chertov O. Yu., Blishchenko E. Yu., "The role of apoptotic and necrotic processes in cytolysis mediated by LAK cells with different phenotypes", Journal of Cellular Biochemistry, 1995, v. 19, Suppl. B, 296.

148 Lee R.K., Spielman J., Zhao D.Y., Olsen K. J., Podack E. R., "Perforin, Fas ligand, and tumor necrosis factor are the major cytotoxic molecules used by lymphokine-activated killer cells", J. Immunol., 1996 September, 157 (5), 1919-1925.

149 Ohmi Y., Ohta A., Sasakura Y., Sato N., Yahata T., Santa K., Habu S., Nishimura T., "The role of phorbol ester-sensitive protein kinase C isoforms in lymphokine-activated killer cell-mediated cytotoxicity: dissociation between perforin-dependent and Fas-dependent cytotoxicity", Biochem. Biophys. Res. Commun., 1997. v.235 (3), 461-464.

150 Ueno M., Yahara I., Kishi K., "Isolation and partial characterization of cytoplasmic granules of LAK cells from mice showing side effects of recombinant human IL-2", Fundam. Appl. Toxicol. 1997, Mar. 36 (1), 39-46.

151 Blishchenko E.Yu, Mirkina I. I., Mernenko O. A., Satpaev D.K. and Karelin A. A, "Analysis of the cytolytic processes induced by different biologically active substances at transformed cell lines", Journal of Cellular Biochemistry, 1995, v. 19, Suppl.B, 280.

152 Warren H.S. and Smyth M.J., "NK cells and apoptosis", Immunology and Cell Biology, 1999, 77, 64-75.