Селективный плазмообмен в комплексе сопроводительного лечения больных впервые выявленной секретирующей множественной миеломой тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.12, кандидат наук Зудерман Наталья Евгеньевна

• Зудерман Наталья Евгеньевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Зудерман Наталья Евгеньевна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. МНОЖЕСТВЕННАЯ МИЕЛОМА: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ

ПРОБЛЕМЫ (обзор литературы)

1.1. Эпидемиология и этиопатогенез

1.2. Патофизиологические особенности клинических проявлений секретирующей множественной миеломы и диагностика

1.3. Миеломная нефропатия

Глава 2. КЛИНИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА БОЛЬНЫХ, МЕТОДЫ

ЛЕЧЕНИЯ И ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Клиническая характеристика больных

2.2. Методы лечения

2.3. Методы исследований

Глава 3. ЭНДОГЕННАЯ ИНТОКСИКАЦИЯ ПРИ СЕКРЕТИРУЮЩЕЙ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ ДО НАЧАЛА ЛЕЧЕНИЯ (исходный статус)

3.1 Специфические и неспецифические показатели эндогенной

интоксикации

3.2 Функциональное состояние почек

Глава 4. ДЕТОКСИКАЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ СЕЛЕКТИВНОГО

ПЛАЗМООБМЕНА

4.1 Динамика показателей эндогенной интоксикации

4.2 Изменения морфологической картины твердотельных образцов плазмы крови

4.3 Влияние селективного плазмообмена на функциональное состояние почек

Глава 5. РЕЗУЛЬТАТЫ ПРОТИВООПУХОЛЕВОЙ ТЕРАПИИ У БОЛЬНЫХ ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННОЙ СЕКРЕТИРУЮЩЕЙ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМОЙ ПРИ ВКЛЮЧЕНИИ В КОМПЛЕКС СОПРОВОДИТЕЛЬНОГО ЛЕЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНОГО ПЛАЗМООБМЕНА

5.1 Динамика специфических и неспецифических показателей

эндогенной интоксикации при проведении лекарственной противоопухолевой терапии

5.2 Динамика маркеров почечного повреждения на фоне

химиотерапевтического лечения

5.3 Клинические результаты применения в комплексе специфического

лечения больных секретирующей множественной миеломой

селективного плазмообмена

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Селективный плазмообмен в комплексе сопроводительного лечения больных впервые выявленной секретирующей множественной миеломой»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность исследования

Множественная миелома (ММ) - опухолевое заболевание, характеризующееся неконтролируемой пролиферацией клональных клеток, обусловленной хромосомными нарушениями и патологическими изменениями стромального микроокружения и присутствием моноклонального протеина в крови и/или моче (Бессмельцев С.С., 2016).

ММ является вторым по распространенности опухолевым заболеванием крови и составляет 10-13% от злокачественных заболеваний кроветворной системы и лимфатической ткани. Заболеваемость множественной миеломой в России составляет 2-3 случая на 100 тыс. населения, а летальность достигает 2% среди всех онкологических заболеваний. Средний возраст больных впервые выявленной множественной миеломой составляет около 70 лет, но в последние годы участились случаи заболеваемости в возрасте от 17 до 30 лет (Каприн А.Д. и соавт., 2019).

Успех лечения множественной миеломы зависит как от выбора оптимального метода противоопухолевой терапии, так и от эффективности борьбы с многочисленными осложнениями, сопровождающими развитие заболевания (Бессмельцев С.С. и соавт., 2016; Kumar S.K. et al.,2008). Эндогенная интоксикация и почечная недостаточность являются наиболее грозными осложнениями ММ, закономерно ухудшающими состояние больного при ММ и значительно затрудняющими проведение адекватной химиотерапии, что, соответственно, ухудшает прогноз и исход заболевания (Рыжко В.В. и соавт., 2009; Karin М. et al., 2002). В связи с этим сопроводительная терапия является неотъемлемой частью лечения больных с гемобластозами.

В настоящее время продолжается поиск схем лечения данной категории больных с применением разных программ химиотерапии и сочетанием с методами экстракорпоральной детоксикации. Особую важность при этом отводят возможности экстракорпорального удаления СЛЦ Ig (Рехтина И.Г. и соавт., 2013; Любимова Н.А. и соавт., 2017; Громова Е.Г. и соавт., 2016, 2018).

Авторы высказывают мнение о целесообразности экстракорпорального удаления из кровотока избытка СЛЦ Ig у больных моноклональными гаммапатиями с высокой их продукции вне зависимости от наличия и стадии почечной дисфункции.

С позиции выведения всех типов токсических субстанций максимальным потенциалом детоксикации обладает плазмаферез (Хорошилов С.Е., Никулин А.В., 2017). В течение многих лет в мире и в нашей стране изучалась возможность его применения у больных ММ. Однако эффективность плазмообмена с точки зрения интенсивного снижения сывороточных концентраций свободных легких цепей (СЛЦ) иммуноглобулинов и нефропротективного воздействия не потверждена (Рыжко В.В., 2009; Gertz M.A., 2005; Clark W.F. et al., 2005; Rahman T., Harper L., 2006). Применение новых технологий плазмосепарации с использованием использованием плазмосепараторов с высокопроницаемой мембраной позволяет суммировать детоксикационные эффекты гемофильтрации и традиционного плазмообмена, увеличивая объем детоксикации при минимизации потери белка и упрощении состава плазмозамещающих растворов (Соколов А.А., 2019). Изложенное позволяет думать об эффективности его применения у больных секретирующей ММ, но это требует клинического и лабораторного подтверждения, что определяет актуальность настоящего исследования.

Степень разработанности темы

В течение многих лет в мире и в нашей стране изучали возможность применения лечебного плазмообмена с целью прямой элиминации из системного кровотока СЛЦ Ig и предупреждению ОПП на ранних этапах развития миеломной нефропатии. При этом отмечали возможность восстановления функции почек при достижении 50% снижения концентрации СЛЦ Ig. Однако эффективность плазмообмена с позиций нефропротективного воздействия традиционного плазмообмена не подтверждена (Рыжко В.В., 2009; Gertz M.A., 2005; Clark W.F. et al., 2005; Rahman T., Harper L., 2006).

Традиционно экстракорпоральную детоксикацию у больных ММ применяют при развитии диализзависимой почечной недостаточности. При этом показано, что использование при проведении диализного лечения больным ММ диализаторов с высокопроницаемыми мембранами, позволяющими элиминировать вещества с пороговой молекулярной массой до 60 000 кДа, обеспечивает быстрое снижение или удаление СЛЦ ^ из системного кровотока, что способствует предотвращению необратимой почечной недостаточности и дает возможность проведения адекватной противоопухолевой терапии (Рехтина И.Г. и соавт., 2013; Громова Е.Г. и соавт., 2016, 2018; Любимова Н.А. и соавт., 2017). На основании проведенных исследований Н.А. Любимова с соавт. (2017), Е.Г. Громова с соавт. (2016, 2018) высказывают мнение о целесообразности экстракорпорального удаления из кровотока избытка СЛЦ ^ у больных моноклональными гаммапатиями с высокой их продукций вне зависимости от наличия и стадии почечной дисфункции. Однако эти исследования единичны, а когорта больных малочисленна.

Цель исследования - улучшение результатов сопроводительного лечения больных впервые выявленной секретирующей множественной миеломой путем включения в комплекс терапии селективного плазмообмена.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

1. Для определения характера эндогенной интоксикации при дебюте секретирующей ММ исследовать показатели специфических и неспецифических маркеров: сывороточное содержание парапротеина, СЛЦ Д?-микроглобулина, функциональные свойства альбумина (ОКА, ЭКА, ССА), состояние ПОЛ (содержание в эритроцитах и плазме крови МДА, активность СОД, эритроцитарной и плазменной КА крови).

2. Изучить функциональное состояние почек до начала специфического лечения путем исследования содержания биомаркеров почечного повреждения в крови и моче (цистатин С, ^-18, L-FABP, ЮМ-1, NGAL).

3. Оценить непосредственные результаты детоксикационного и нефропротективного воздействия селективного плазмообмена.

4. Оценить клиническую эффективность применения селективного плазмообмена в комплексе специфического лечения больных секретирующей множественной миеломой.

Научная новизна

Впервые:

- доказано, что при дебюте секретирующей множественной миеломы патофизиологические механизмы развития лимфопролиферативного процесса инициируют развитие эндогенной интоксикации, формирование неманифестированных метаболических нарушений на уровне проксимальных и дистальных канальцев нефрона с последующим снижением клубочковой фильтрации;

- установлена значимость маркеров L-FABP, KIM-1 крови и мочи, а также мочевого NGAL в предиктивной диагностике почечного повреждения, позволяющей оценивать формирование патологических изменений в почках на ранних стадиях развития;

- доказана эффективность детоксикационного и нефропротективного воздействия селективного плазмообмена. Предложен способ предупреждения почечного повреждения у больных впервые выявленной секретирующей множественной миеломой (Патент РФ №2652082 от 24.04.2018).

Теоретическая и практическая значимость работы

Подтверждено, что развитие секретирующей множественной миеломы сопровождается выраженной эндогенной интоксикацией, обусловленной патофизиологическими механизмами формирования лимфопролиферативного процесса. Определена морфологическая картина эндогенной интоксикации: бессистемный характер структурирования основных элементов фации с доминированием патологических морфотипов - иррадиального, циркуляторного и типа «двойная фация», а также множественные локальные морфологические маркеры интоксикации, воспаления и ишемии. Выявлены морфологические корреляты парапротеинемии: сетчатые структуры («вермикулы») и округлые аморфные образования разной оптической плотности.

Показано, что нарушение функции почек при дебюте секретирующей множественной миеломы зарегистрировано у всех больных - в 46,8% случаях в клинической, а в 53,2% - в преклинической стадиях. Выявлено повреждение функциональных структур почек на уровне клубочков, проксимальных и дистальных отделов канальцев нефрона.

Установлена эффективность детоксикационного воздействия селективного плазмообмена у больных секретирующей множественной миеломой в коррекции нарушений, связанных с развитием эндогенной интоксикации. После проведения селективного плазмообмена отмечено: эффективное уменьшение концентрации СЛЦ ^ и у^-микроглобулина; повышение связывающей способности альбумина; уменьшение индекса токсичности крови; снижение интенсивности активации процессов гипероксидации липидов; появление в твердотельных образцах плазмы крови физиологического типа фаций, сокращение встречаемости патологических морфотипов и параспецифических морфологических маркеров воспаления, эндогенной интоксикации, ишемии; улучшение фильтрационной функции почек и снижение выраженности структурного повреждения почек -уменьшение К1М-1 крови на 38,5%, L-FABP и NGAL мочи на 25,1 и 30,4% соответственно (р<0,05).

Методология и методы диссертационного исследования

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного познания. Работа выполнена в дизайне открытого сравнительного проспективного исследования с использованием анамнестических, общеклинических, лабораторных, статистических методов исследования.

Внедрение результатов исследования в практику здравоохранения

Результаты данного исследования используются в повседневной практике отделений онкогематологии, анестезиологии и реанимации ФГБУ «РНИОИ» Минздрава России.

Основное положение, выносимое на защиту

Включение в комплекс сопроводительного лечения больных секретирующей множественной миеломой селективного плазмообмена обеспечивает эффективное детоксикационное и нефропротективное воздействие, способствует снижению числа токсических осложнений химиотерапии, регрессу проявлений острой фазы почечного повреждения, предупреждению развития ОПП на фоне проводимого противоопухолевого лечения.

Степень достоверности и апробация результатов

Определяется достаточным количеством обследованных больных в процессе исследования, формированием групп сравнения, адекватными методами исследования, корректными методами статистической обработки. Сформулированные в диссертации выводы, положения и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из системного анализа результатов выполненных исследований.

Апробация диссертации состоялась 18 октября 2019 г. на заседании Ученого Совета при ФГБУ «Ростовский научно-исследовательский институт» Минздрава России. Основные положения диссертации доложены на 2-м онкологическом форуме Юга России, посвященном 85-летию ростовского научно-исследовательского онкологического института (Ростов-на-Дону, 2016); межрегиональной научно-практической конференции с международным участием (Ростов-на-Дону, 2016).

По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 - в журналах, рецензируемых ВАК при Минобрнауки России и входящих в международную научную базу Web of Science. Получен 1 патент на изобретение.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 156 страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы характеристики клинического материала, методов лечения и исследований, 3 глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы,

включающего 172 отечественных и 213 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 28 таблицами и 38 рисунками.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют пункту 2 «Исследования по изучению этиологии и патогенеза злокачественных опухолей, основанные на достижениях ряда естественных наук (генетики, молекулярной биологии, морфологии, иммунологии, биохимии и др.) паспорта специальности 14.01.12 -«онкология» и пункту 2 «Изучение синдромов критических состояний организма и внедрение в клиническую практику новых методов искусственной вентиляции легких, искусственного кровообращения, экстракорпоральной детоксикации, гипербарической оксигенации» паспорта специальности 14.01.20 -«анестезиология и реаниматология».

ГЛАВА 1

МНОЖЕСТВЕННАЯ МИЕЛОМА: СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ

ПРОБЛЕМЫ (обзор литературы)

1.1 Эпидемиология и этиопатогенез

Множественная миелома (ММ) - злокачественное лимфопролиферативное заболевание, которое характеризуется пролиферацией клональных плазматических клеток как следствие хромосомных нарушений и стромального микроокружения, продукцией моноклонального белка (Вотякова О.М., Демина Е.А., 2007; Lacina P. et al., 2018). Множественная миелома - один из самых распространенных гемобластозов. Множественная миелома составляет 1% от онкологических заболеваний, а гематологических опухолей - около 12%.

Заболеваемость в странах мира в различных группах населения отличается по полу и расе. По данным систематического анализа глобальной, региональной и национальной заболеваемости (2016) встречаемость ММ в мире составляет в среднем около 500 тыс. в год и 101 100 человек умирает. В Европе смертность от ММ составляет 4,1 на 100 000 в год. Наиболее часто множественная миелома встречается в индустриально развитых регионах Австралии, Новой Зеландии, Европы и Северной Америки (Jemal A. et al., 2007). Заболеваемость ММ в США в среднем составляет 4-5 новых случаев, а в популяции афроамериканцев достигает 9-10 заболевших на 100 тыс. населения в год (Rosenberg P.S. et al., 2015; Cid Ruzafa J. et al., 2016). В Японии этот показатель ниже и не превышает 1,2 случая на 100 тыс. населения в год; в Южной Корее - 1,4; Китае - 1,3; Тайване - 1,8 (Chen X.C. et al., 2014; Yamabe K. et al., 2015; Chen J.H. et al., 2016; Hong J.et al., 2016). Эпидемиология MM в России изучена недостаточно, данные, посвященные этому вопросу, присутствуют только в единичных публикациях. По данным А.Д. Каприна с соавт. (2019) заболеваемость ММ в России в 2018 году составила 2,78 на 100 тыс. населения. При этом впервые заболевание было диагностировано у 4 075 человек, умерли 2 587 больных.

Следует отметить, что в последние годы наблюдается значительный рост заболеваемости ММ. По данным ряда авторов за последние 25 лет регистрируется

увеличение впервые выявленных больных ММ на 123% (Виноградова О.Ю., 2019; Cowan F.J. et al., 2018).

Множественная миелома - это возрастная болезнь. Медиана возраста составляет 65 лет. В возрасте до 65 лет заболевает 37%, от 65 до 74 лет - 26%, от 75 лет и старше - 37% человек. Люди в возрасте 8О лет болеют в 1О раз чаще 50-летних. Количество больных моложе 4О лет не превышает 3%, а 3О лет - 0,3%. В последние годы участились случаи заболевания ММ в возрасте от 17 до 3О лет. Данных о заболевании детей в литературе нет (Бессмельцев С.С., Абдукадыров К.М. 2ОО7; Harousseau J.L., Dreyling M., 2010).

Литературные данные о частоте встречаемости ММ у мужчин и женщин отличны. В большинстве исследований показано, что мужчины болеют чаще женщин (Gibson СМ., 2О18). Между тем эпидемиологические данные Великобритании свидетельствуют о превалировании заболеваемости у женщин по сравнению с мужчинами - 53% против 47%. В других исследованиях значимых гендерных различий в заболеваемости ММ не выявлено (Becker N., 2011).

Множественная миелома считается неизлечимым заболеванием. В мире ежегодная смертность от ММ составляет около 63 ООО случаев (Becker N., 2011). В Европе ежегодно регистрируют более 14 ООО смертей, в США - около 11 000 случаев (Luciano J. Costa et al., 2016; Cowan et al., 2О18). Продолжительность жизни больных ММ невелика. В Великобритании и Швеции медиана 5-летней выживаемости для больных старше 65 лет составляет 3,1 и 5,2 года, для более молодых - 5,2 и 7,7 года соответственно. В Германии общая пятилетняя выживаемость больных ММ составляет 39%, в США - 47% (Gibson С.М., Haytham А.С, 2018).

Этиология множественной миеломы в настоящее время не определена. Возможными этиологическими факторами считают: воздействие ионизирующей радиации и химических мутагенов (асбест, производные бензола, инсектициды), употребление алкоголя, длительную антигенную стимуляцию на фоне хронических воспалительных заболеваний. Ожирение также является предрасполагающим фактором развития заболевания. Так увеличение индекса

массы тела на 5 единиц увеличивается риск развития заболевания на 11%. Определенное значение в этиологии ММ отводят генетическим факторам и наследственной предрасположенности, что косвенно подтверждается более частым развитием ММ у близких родственников и однояйцевых близнецов (Богданов А.Н. и соавт., 2008; Roberts D.L. et al., 2010; Ferri F.F., 2013). По мнению A.K. Dutta et al. (2017) тлеющая миелома также увеличивает риск развития онкологического процесса. В исследованиях О. Landgren et al. (2009) и Willrich M.A. et al. (2017) показано, что почти во всех случаях развитию множественной миеломы предшествовала моноклональная гаммопатия неопределенного генеза (MGUS).

В основе патогенеза ММ лежит опухолевая трансформация клеток-предшественниц В-лимфоцитов в терминальном центре периферических лимфоидных органов после соматических гипермутаций реаранжированных генов иммуноглобулинов и изотипического переключения синтеза антител с сохранением способности этих клеток дифференцироваться до конечного этапа -плазматических клеток, секретирующей М-белок. М-белок - это иммуноглобулин (Ig) или его компонент/фрагмент с аномальной последовательностью в своем строении аминокислот и потерей нормальной функции в результате мутации генов, ответственных за выработку иммуноглобулина (Ходулева С.А., 2010; Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2016).

При развитии ММ выявляются реципрокные адгезивные взаимодействия миеломных клеток с компонентами костномозгового гемопоэтического микроокружения, которые служат источником факторов роста и цитокинов и обеспечивают условия для роста опухолевых клеток, их выживания, дифференциации, миграции и защиты от апоптоза. Миеломные клетки экспрессируют на своей поверхности молекулы, обладающие адгезивными свойствами: ICAM-1 (CD54) и H-CAM (CD44), N-CAM (CD56) и LFA-3 (CD58), что является признаком, подтверждающим злокачественность трансформации плазматических клеток (Hedvat C.V., 2003). Выживание миеломных клеток увеличивается при действии ростовых факторов (IL-6, 10, 1a, 4, 5, 12, TNF),

секретируемых как клетками стромы, так и опухоли. Активирует путь JAK2/STAT3 в миеломных клетках IL-6, инициируя гиперэкспрессию Bcl-XL и ингибицию CD95 с последующей адгезией «клетка - клетка» или «клетка -внеклеточный матрикс», что регулирует выживаемость большинства опухолевых клеток. Миеломные клетки характеризуются высокой экспрессией на плазматической мембране синдекана-1 (CD138), стимулирующего ангиогенез, что обеспечивает рост и метастазирование опухоли (Харченко М.Ф., Бессмельцев С.С., 2010; Бессмельцев С.С., 2013). Важная роль в генезе ММ отводится активным киназам: PI3-K/AKT (фосфатидилинозитол-3-киназа/протеинкиназа В), MAPK (митоген-активируемые протеинкиназы; RAS/RAF/MEK/ERK), JAK/STAT3 (янус-киназа/передатчик сигнала и активатор транскрипции 3-го типа) и транскрипционны факторам NFkB и STAT3. Они регулируют транскрипцию генов, ответственных за адгезию, регуляцию клеточного цикла, лекарственную резистентность и другие функции (Anderson K.C., 2001).

Множественная миелома характеризуется выраженной геномной гетерогенностью, сложной комбинацией численных и структурных изменений хромосом, которые играют ключевую роль в онкогенезе, способствующих изменению структуры и функции генов-мишеней, что в свою очередь обусловливает нарушение регуляции клеточного цикла и дифференцировки, гибель и миграцию клеток (Soekojo C.Y. et al., 2018). При ММ отмечается хромосомная нестабильность, проявляющаяся количественными и структурными изменениями, нарушением экспрессии генов, что определяется у 30-50% больных, а частота и степень последних коррелирует со стадией заболевания, прогнозом и ответом на специфическое лечение (Mohamed A.N. et al., 2007).

Как и для большинства В-клеточных опухолей, для ММ характерно нарушение локуса генов тяжелых цепей иммуноглобулинов (IgH) на хромосоме 14, а в ряде случаев встречаются нарушения генов легких цепей (Soekojo C.Y. et al., 2018). Наиболее часто локусами-партнерами для транслокации служат: 6p25, 4р16, 6р21, 11q13, 16q23 (Robiou du Pont S. et al., 2017). У 15-20% больных

выявляется транслокация t(11;14)(q13;q32) с вовлечением гена циклина D1. В исследовании R. Fonseca et al. (2003) установлена взаимосвязь между анеуплоидией и транслокацией генов IgH. Аномальный кариотип и транслокация генов IgH были определены у 89 и 39% больных соответственно.

1.2 Патофизиологические особенности клинических проявлений секретирующей множественной миеломы и диагностика

Клиническая картина ММ разнообразна и обусловлена основными патогенетическими признаками заболевания: инфильтрацией костного мозга клональными плазматическими клетками; секрецией патологического моноклонального иммуноглобулина; существенным угнетением продукции нормальных поликлональных иммуноглобулинов. Клинические проявления при ММ включают костномозговой синдром (угнетение нормального гемопоэза как следствие плазмоклеточной инфильтрации костного мозга, поражение костей вследствие остеодеструкции); гиперкальциемию; нарушение функции почек; синдром повышенной вязкости крови; амилоидоз; геморрагический синдром; неврологические нарушения; синдром вторичного иммунодефицита

(Кравченко Д.В. и соавт., 2016). Как правило, клинически ММ проявляется, когда

12

масса опухоли составляет около 10 клеток (Вотякова О.М. и соавт., 2007).

Неконтролируемый рост плазматических клеток приводит к угнетению нормального кроветворения в костном мозге с развитием анемии, нейтропении, реже тромбоцитопении. При первичной диагностике ММ снижение уровня гемоглобина менее 100 г/л выявляется у 60-70% больных.

Нейтропения и тромбоцитопения чаще всего наблюдаются при поздних стадиях заболевания и сопровождаются повышением СОЭ.

Одним из ведущих симптомов заболевания, встречающихся более чем у 70% больных, является оссалгия, которая обусловлена деструкцией костей скелета. В генезе развития литических поражений костной ткани при ММ лежит ингибиция остеобластов и активация остеокластов, как следствие синтеза миеломными клетками остеокласт активирующих факторов, локальных цитокинов - IL-1b, IL-6, TNF и хемокинов. Избыточность продукции цитокинов

инициирует экспрессию активатора рецептора лиганда ядерного фактора кВ (RANKL) остеобластами и ослабление экспрессии остеопротегерина (OPG), что приводит к повышению костной резорбции и ослабление процессов формирования костной ткани. Нарушение баланса между резорбцией и формированием костной ткани в результате активации и/или увеличения количества остеокластов, снижение числа и функциональной активности остеобластов формирует картину остеолитического поражения скелета (Кравченко Д.В. и соавт., 2016; Fairfield H. et al., 2016). Механизм деструкции костной ткани при ММ представлен на рисунке 1.2.1.

Рисунок 1.2.1. Механизм деструкции костной ткани при ММ (Tricot G., 2000, цит. по Кравченко Д.В. и соавт., 2016)

Поражения костей при ММ проявляются в виде единичных или множественных очагов остеолиза, генерализованного остеопороза, патологических переломов. Деструктивные процессы чаще всего развиваются в плоских костях (череп, ребра, грудина, кости таза). В 45% случаев наблюдается поражение позвоночника в виде компрессий спинного мозга, сопровождающихся корешковыми болями и нарушением функций тазовых органов. Также в патологический процесс могут вовлекаться трубчатые кости, при этом чаще очаги деструкции диагностируются в проксимальных отделах плечевой и бедренной костей. Истончение кортикального слоя приводит к патологическим переломам (Бессмельцев С.С., 2013).

Костный лизис приводит к мобилизации кальция из костей с нарушением фосфорно-кальциевого обмена, развитием гиперкальциемии. Гиперкальциемия

наблюдается у 25-30% больных ММ и зачастую осложняет течение болезни. Гиперкальциемия сопровождается диспептическими проявлениями со стороны желудочно-кишечного тракта. В ряде случаев наблюдается угнетение функции ЦНС. Повышенная концентрация кальция в крови способствует ухудшению концентрационной способности канальцев и гломерулярной фильтрации, а также развитию полиурии.

Чрезмерная продукция легких цепей приводит к формированию амилоидных фибрилл и отложению их в различных органах и тканях, нарушению их функций. Клиническая картина при амилоидозе разнообразна и зависит от локализации амилоида, который может откладываться в любых органах и тканях периваскулярно и/или диффузно. В первую очередь поражаются богатые коллагеном органы - кожа, сухожилия, суставы, мышцы, адвентиция сосудов. При AL-амилоидозе наиболее часто повреждается миокард, язык, поперечнополосатая и гладкая мускулатура, ЖКТ, запястные связки, кожа. При вторичном амилоидозе амилоид наиболее часто откладывается в печени, почках, надпочечниках, селезенке. Характерными клиническими проявлениями амилоидоза являются слабость, утомляемость, резкая потеря массы тела, различные кожные изменения, синдром «запястного туннеля», макроглоссия, гепатомегалия, одышка, стеаторея и др. (Pal P. et al., 2015).

Высокая концентрация в сыворотке крови патологического белка приводит к нарушению свертывающей системы крови, формированию геморрагического синдрома, который встречается у 15% больных. Чаще диагностируются нарушения тромбоцитарного звена, реже - плазменных и сосудистых факторов гемостаза. Одним из механизмов геморрагического синдрома при ММ является образование тромбоцитами с фиксированными на клеточной мембране парапротеином комплексов V, VII, VIII факторами свертывания крови, протромбином, фибриногеном. Тромбоцитопения также может быть обусловлена миелосупрессией, вызванной плазмоклеточной пролиферацией в разгар заболевания или на фоне проведения химиотерапиий (Кравченко Д.В. и соавт., 2016).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Зудерман Наталья Евгеньевна, 2020 год

Ш - - - -

IIA 13 52,0 11 50,0

ПБ 8 32,0 7 31,8

IIIA - - 3 13,6

IIIE 4 16,0 1 4,6

Примечание: р - значимость различий в группах по распределению стадий заболевания (критерий Хи-квадрат)

Таблица 2.1.7 - Распределение больных в группах исследования по стадиям множественной миеломы по международной системе стадирования (2005) (International Staging System, ISS)

Стадия ММ Группа исследования P

основная (n = 25) контрольная (n = 22)

абс. ч. % абс. ч. %

I 21 84 18 81,8 0,84

II 4 16 4 18,2

Примечание: р - значимость различий в группах по распределению стадий заболевания (критерий Хи-квадрат)

У 39 из 47 больных (83%) диагностировали II стадию и у 8 (17%) -III стадию заболевания. При этом у 20 из 47 больных (42,6%) при первичном обследовании выявили клинико-лабораторные признаки миеломной нефропатии, что соответствует данным литературы о вовлечении почек в патологический процесс к моменту диагностики ММ в 20-50% случаев (Салогуб Г.Н. и соавт., 2010).

При обследовании у всех больных выявили парапротеинемию, представленнную моноклональным белком классов G и А типами k и X (таблица 2.1.8). Парапротеинемию классов D, M, E и протеинурию Бенс-Джонса у больных, вошедших в настоящее исследование, не выявили.

Таблица 2.1.8 - Иммунохимические варианты множественной миеломы в группах исследования

Стадия ММ Группа больных P

основная (n = 25) контрольная (n = 22)

абс. ч. % абс. ч. %

G-миелома (k) 12 48,0 11 50,0 0,80

G-миелома (X) 9 36,0 8 36,4

А-миелома (k) 4 16,0 2 9,1

А-миелома (X) - - 1 4,5

Примечание: p - значимость различий в группах по распределению стадий заболевания (критерий Хи-квадрат)

Наиболее часто в исследуемых группах больных регистрировали G-миелому - 40 из 47 больных (85,1%), А-миелому диагностировали лишь в 7 случаях (15,9%). Отмечали некоторое преобладание k-типа: 23 против 17 при G-миеломе и 6 против 1 при А-миеломе (таблица 2.1.8).

2.2 Методы лечения

Противоопухолевая лекарственная терапия

Все больные в обеих группах получали противоопухолевую лекарственную терапию, включающую шесть 21-дневных циклов химиотерапии по схеме VCD:

л

- Бортезомиб 1,3 мг/м п/к в 1, 4, 8, 11 дни цикла;

- Циклофосфамид 400 мг в/в капельно в 1,8 дни цикла;

- Дексаметазон 40 мг внутрь или в/в в 1-4 и 8-11 дни 1-го цикла, далее в 1-4 дни или 20 мг внутрь в 1, 2, 4, 5, 8, 9, 11, 12 дни каждого цикла.

Каждый последующий цикл начинали на 22 день.

С целью профилактики вирусной инфекции в течение всего курса противоопухолевого лечения назначали ацикловир 500 мг внутрь 1 раз в сутки; ципрофлоксацин 500 мг внутрь один раз в сутки в течение 1-го цикла; омепразол 20 мг 1 раз в сутки внутрь (или лансопразол 15 мг) во время применения кортикостероидов.

Цикл ХТ начинали при отсутствии признаков инфекции, абсолютном количестве нейтрофилов >1,5х109/л, тромбоцитов >75х109/л, АЛТ <2-кратное значение верхней границы нормы, АЛТ <2-кратное значение верхней границы нормы, общем билирубине <2-кратное значение верхней границы нормы, СКФ >30 мл/мин.

Перед началом каждого цикла проводили обследование для выявления токсичности, нежелательных явлений. При развитии гематологической или негематологической токсичности проводили коррекцию сопроводительного лечения и режима дозирования бортезомиба (таблица 2.2.1). Анализ вида и степени токсичности и побочных проявлений проводили согласно шкале токсичности, рекомендованной ВОЗ (Переводчикова Н.И., 2013).

При развитии нежелательных явлений, связанных с приемом дексаметазона, его дозу снижали от 40 мг до 20 мг и от 20 мг до 12 мг в сутки, а при сохранении нежелательных явлений прием препарата отменяли.

Сопроводительная терапия включала в себя обязательное стандартное введение бисфосфанатов, инфузионно-дезинтоксикационную терапию, симптоматическое лечение.

Противоопухолевый эффект оценивали согласно единым критериям ответа, разработанным ЕВМТ/ГОМТКУАВМТК и дополненным экспертами Международной рабочей группы по изучению множественной миеломы (2006).

Таблица 2.2.1 - Коррекция режима дозирования бортезомида при развитии токсичности

Гематологическая токсичность

Абсолютное число нейтрофилов < 0,5х109/л Отмена дозы При восстановлении>0,5х109/л продолжить терапию в той же дозе При последующем снижении <0,5х109/л отменить дозу и в дальнейшем при возобновлении снизить дозу на 1 ступень

Тромбоциты < 30х109/л и/или признаки кровотечения Отмена дозы При восстановлении >30х109/л или купировании геморрагического синдрома продолжить терапию в той же дозе При последующем снижении<10х109/л отменить дозу и в дальнейшем при возобновлении снизить дозу на 1 ступень

Нефротоксичность

Креатинин сыворотки крови >2 верхней границы нормы, СКФ<40 мл/мин Отмена дозы, контроль функции почек После восстановления функции почек не менее 25% от исходного уровня возобновить терапию, снизив дозу на 1 ступень

Все другие виды негематологической токсичности 3-4 степени Отмена дозы до разрешения проявлений токсичности или возврата на исходный уровень Возможно снижение следующей запланированной дозы на 1 ступень

2 2 2 2 Примечание: снижение дозы от 1,3 мг/м до 1,0 мг/м или от 1,0 мг/м до 0,7 мг/м

расценивается как 1 ступень

Методика селективного плазмообмена

Селективный плазмообмен был включен в комплекс противоопухолевой лекарственной терапии больным основной группы. Фильтрационную детоксикацию проводили за сутки перед каждым циклом химиотерапии аппаратом «Aquarius» фирмы «Nikkiso» (Япония) (рисунок 2.2.1) с использованием систем магистралей и плазмосепаратора «Evaclio 2C20» (Япония) со скоростью перфузии 40-60 мл/мин. Объем плазмофильтрации составлял 10 литров. Плазмозамещение осуществляли альбумин содержащим плазмозамещающим раствором (Присмасол 4 - 9400 мл + Альбумин 20% -600 мл). Венозный доступ - катетеризация магистрального венозного сосуда (v. subclavia, v. femoralis) с использованием двухпросветного перфузионного катетера 16 F фирмы «Gambro» (Швеция). Антикоагуляция -нефракционированный гепарин в дозе, рассчитанной в соответствии с показателями коагулограммы (АЧТВ), вводимый в артериальный сегмент магистрали до плазмосепаратора.

Рисунок 2.2.1. Селективный плазмообмен на аппарате «Aquarius»

Гидродинамическая схема селективного плазмообмена представлена на рисунке 2.2.2.

Электролитный раствор

Pa

100 to 120 ml/min

OHO 9

Anticoagulant

CC Плазма

6.7 to 8.0 ml/min

às I

в

I

13.3 to 16.0 ml/min

Фильтрат

Рисунок 2.2.2. Гидродинамическая схема селективного плазмообмена

2.3 Методы исследований

Всем больным до начала лечения проводили общеклиническое обследование. Исследование периферической крови осуществляли на гематологическом анализаторе «SYSTEM EXXE-2100» (Япония); биохимические исследования - на автоматическом биохимическом анализаторе «VITROS 5600» (США). Состояние систем свертывающей и противосвертывающей систем гомеостаза изучали на автоматическом четырехканальном коагулометре «Trombolizer Compait X» (Германия).

Содержание Д?-микроглобулина в сыворотке крови определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА, ELISA) на аппарате «Chem Well AWARENESS TECHNOLOGY» (США).

Рентгенологические исследования проводили рентген-аппаратом AXIOMLuminos (Германия), компьютерную томографию - на 64-срезовом мультиспиральном томографе (США), МРТ - на магнитно-резонансном томографе GE 816NA 1,5 тх HD (США).

Концентрацию парапротеина в сыворотке крови исследовали методом каппилярного электрофореза аппаратом «Helena Bioscience V8» (Великобритания). Содержание Ig, k-СЛЦ и Х-СЛЦ определяли методом иммунонефелометрического анализа на аппарате «COBAS INTEGRA 400 plus» (Швейцария).

Дополнительно в целях диагностики и оценки гематологического ответа на пртивоопухолевое лечение осуществляли фенотипирование клеток костного мозга на проточном цитофлюориметре «BD FACS CantoII» (USA) с использованием оригинальных реактивов. Для определения фенотипа опухолевых маркеров костного мозга использовали панель МкАТ (моноклональных антител): CD38-FITC; CD138-PerCP-Cy5.5; CD117-APC; CD45-APC-Cy7; CD56-APC. Рассчитывали процент опухолевых клеток от всех живых, определяли процент нормальных костных бластов CD19+CD10+ от всех живых клеток.

Для решения поставленных задач, наряду с общеклиническим обследованием и специфическими исследованиями для диагностики ММ, изучали

неспецифические показатели эндогенной интоксикации в сыворотке крови, а также маркеры почечного повреждения в крови и моче (Цистатин С, КОЛЬ, Ь-БЛБР, 1Ь-18, К1М-1).

Исследовали содержание и функциональные свойства альбумина. Общую концентрацию альбумина (ОКА) определяли унифицированным колориметрическим методом с использованием набора реагентов «Ольвекс Диагностикум» (Санкт-Петербург). Эффективную концентрацию альбумина (ЭКА), то есть его транспортную функцию, определяли модифицированным методом с использованием конго красного по методу С.А. Чегера в модификации Мельника И.А. и Барановского П.В. (1985). Степень сорбции токсических лигандов (резервную связывающую способность альбумина - ССА), соответствующую отношению величин свободных связей пула молекул альбумина к общему количеству его связей, оценивали по отношению

ЭКА/ОКА • 100%.

Индекс токсичности рассчитывали по формуле ИТ = ОКА/ЭКА - 1.

Об интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) судили по накоплению молекулярного продукта - малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах крови, оценивали активность основных антиоксидантных ферментов крови - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КА). Их содержание определяли в плазме и 1% гемолизате венозной крови, взятой утром натощак. Интенсивность липопероксидации оценивали спектрофотометрическим методом по накоплению продуктов реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активных соединений) при 535 нм в пересчете на концентрацию малонового диальдегида, как наиболее изученного продукта перекисного окисления липидов (Стальная Н.Д., Горешвили Т.Г., 1977). Активность супероксиддисмутазы (КФ 1.15.1.1) оценивали по степени ингибирования восстановления нитросинего тетразолия в присутствии супероксидного радикала, генерируемого в реакции восстановления молекулярного кислорода адреналином в щелочной среде при 540 нм (Арутюнян Е.Е. и соавт., 2000). За единицу активности принимали количество фермента, вызывавшее 50% торможение реакции. Активность

каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли методом с использованием молибдата аммония (Королюк М.А. и соавт., 1988).

Для определения функционального состояния почек методом ИФА исследовали содержание в крови и моче маркеров почечного повреждения: цистатин С (BioVendor, Чехия), NGAL (BCM Diagnostics, США), L-FABP (Hycultbiotech, Нидерланды), К1М-1 (BCM Diagnostics, США), IL-18 (Bender Medsystems, США). Скорость клубочковой фильтрации рассчитывали по формуле СКФ = 80,35./цистатин С - 4,32 (Hoek F. et al., 2003).

В качестве нормальных величин (здоровые люди) исследуемых показателей были приняты значения, полученные у обследованных относительно здоровых мужчин и женщин без онкологических заболеваний, средний возраст которых сопоставим с возрастом описываемых больных.

Исследования проводили до начала лечения, после 1-го и 6-го цикла противоопухолевой лекарственной терапии.

В целях оценки непосредственного детоксикационного воздействия селективного плазмообмена эти исследования также выполняли до начала, через 30 минут и 24 часа после завершения экстракорпоральной детоксикации, проводимой при первом её применении до начала противоопухолевого лечения. Также изучали содержание исследуемых эндогенных токсических субстанций в эксфузированном плазмофильтрате. Дополнительно до и через 24 часа после селективного плазмообмена методами клиновидной и краевой дегидратации оценивали морфологическую картину твердотельных образцов плазмы крови, как субстрата детоксикации (Шабалин В.Н., Шатохина С.Н., 2010). Микроскопирование проводили в световом, темновом и поляризационном режимах с фоторегистрацией и использованием компьютеризированной программной системы на основе микроскопа «LEICA DM LS2».

Полученные результаты исследования вносили в электронные таблицы Microsoft Excel 2007. Статистическую обработку данных проводили с использованием статистического пакета STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США). При проведении статистического анализа придерживались

рекомендаций О.Ю. Ребровой (2006) и рекомендациям САМПЛ (Ланг Т., Альтман Д., 2014).

При обработке данных оценивали характер распределения показателей согласно критерию Шапиро-Уилка. В качестве меры центральной тенденции данных использовали медиану (Ме) с оценкой ее доверительного интервала (ДИ) и значения границы процентилей (10-90%). Категориальные данные были представлены в виде частот и процентов п (%). Значимость различий непрерывных показателей оценивали с помощью критерия Манна-Уитни. Для сравнения бинарных данных использовали двусторонний точный критерий Фишера и Хи-квадрат Пирсона. Использовали общепринятый уровень значимости: р<0,05. При сравнении нескольких групп по одному количественному признаку показателей проводили попарные сравнения между группами, при этом для исключения эффекта множественных сравнений проводили перерасчет уровня значимости согласно поправке Бонферрони.

ГЛАВА 3

ЭНДОГЕННАЯ ИНТОКСИКАЦИЯ ПРИ СЕКРЕТИРУЮЩЕЙ МНОЖЕСТВЕННОЙ МИЕЛОМЕ ДО НАЧАЛА ЛЕЧЕНИЯ

(исходный статус)

Известно, что развитие злокачественных опухолей приводит к патологическим изменениям метаболических процессов, сопровождающихся нарушением в системах гомеостаза (Шаталова Т.М. и соавт., 2003). Эндогенная интоксикация является одним из серьезных осложнений множественной миеломы. Опухоль, ее продукты, гиперпродукция моноклональных иммуноглобулинов, реакции на них со стороны организма приводят к развитию каскада взаимообусловленных патологических реакций с формированием эндотоксикоза, нарушением функций различных органов и систем, прежде всего, крови, костной ткани и почек (Малахова М.Я., 2000; Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2016; Рыжко В.В. и соавт., 2009; Ануфриева Н.Д., 2010; Педдер В.В. и соавт., 2012; В1шорои1оБ М.А. 2010).

Парапротеин, секретируемый злокачественным клоном ММ, может быть представлен в виде молекул интактного иммуноглобулина, свободных легких цепей, а также их сочетания (Кикпешипё А. е1 а1., 2009). Плазматические клетки синтезируют 5 изотипов тяжелых цепей и два типа СЛЦ (к- и X). Х-СЛЦ в свободном виде образуют димер с молекулярной массой 50 кОа, молекулы к-СЛЦ - мономер с молекулярной массой 25 кОа. Плазматические клетки (как нормальные, так и патологические) продуцируют на 40% больше легких цепей, чем тяжелых. Это обеспечивает возможность специфической конформации молекул интактных иммуноглобулинов в процессе их синтеза. Оставшиеся СЛЦ ]£ высвобождаются в циркуляторное русло, фильтруются и метаболизируются почками в соответствие с их молекулярной массой. Свободные легкие цепи иммуноглобулинов, в отличие от тяжелых цепей, легко проходят через гломерулярный фильтр и реабсорбируются проксимальным канальцевым эпителием, при этом к-СЛЦ проходят через гломерулярный фильтр со значительно большей скоростью, чем Х-СЛЦ. Скорость клубочковой фильтрации полимеров,

образованных из СЛЦ, меньше, чем для свободных молекул к- и Х-СЛЦ (Bradwell Л.К, 2006). Избыточность их продукции способствует формированию почечного повреждения (Рехтина И.Г. и соавт., 2015; 2017; 1^0 N. е1 а1., 1997).

Степень выраженности эндогенной интоксикации при ММ напрямую обусловлена первичным объемом опухоли и прогрессирует на фоне проведения химиотерапии, что связано как с распадом опухолевых клеток, так и непосредственно токсическим воздействием метаболитов лекарственных препаратов на функциональные системы гомеостаза в условиях угнетения функциональной активности физиологических систем детоксикации. Нередко это ограничивает возможности проведения адекватного противоопухолевого лечения и, как следствие, влияет на прогноз.

3.1 Специфические и неспецифические показатели эндогенной интоксикации

При первичном обследовании больных, вошедших в исследование, медиана концентрации парапротеина у больных обеих групп составила 49,6 г/л (41,6-58,7). Содержание к-СЛЦ было увеличено более чем в 2000 раз, Х-СЛЦ - более чем в 600 раз. Превалирование более чем в 3 раза секреции к-СЛЦ по сравнению с Х-СЛЦ, вероятно можно объяснить тем, что число плазматических клеток их продуцирующих в два раза больше (Bradwe11 Л.Я., 2006).

Данные о содержании парапротеина в плазме крови по классам и типам моноклонального белка представлены в таблице 3.1.1.

Д?-микроглобулин - один из значимых маркёров активности процесса при лимфоидных опухолях, в том числе, и при множественной миеломе. Синтез его возрастает при различных состояниях, связанных с увеличением активности иммунной системы. Д?-микроглобулин - низкомолекулярный белок (11 кОа), присутствующий на поверхности ядросодержащих клеток в качестве структурно-функционального компонента антигена главного комплекса гистосовместимости - ИЬЛ. Этот белок присутствует во всех клетках, но уровень его в крови отражает, главным образом, клеточный оборот и пролиферацию лимфоцитов, в которых он представлен в большом количестве.

Таблица 3.1.1 - Концентрация парапротеина и свободных легких цепей иммуноглобулинов в плазме крови в группах исследования до начала лечения (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%, процентили 10-90%)

Показатель Значения показателей в группах исследования

Здоровые люди (n=24) Основная (n = 25) Контрольная (n = 22)

Парапротеин (г/л), Встречаемость 0 - 3 52,4 (40,9-69,2) 29,4-82,9 p1<0,001; p2=0,12 25/25 48,2 (30,4-62,2) 18,4-64,9 p1<0,001 22/22

^СЛЦ (мг/л), Встречаемость 0 - 20 49984 (35203-56590) 23168-67915 p1<0,001; p2=0,11 16/25 40951 (38698-46093) 27061-49255 p1<0,001 13/22

Х-СЛЦ (мг/л), Встречаемость 0 - 27 16199 (14937-17526) 10614-23570 p1<0,001; p2=0,12 9/25 18505(14087-21612) 11798-25792 p1<0,001 9/22

Gk (мг/л), Встречаемость 0 - 20 45126(37626-65413) 23476-74988 p1<0,001; p2=0,35 12/25 39845 (38674-48432) 21202-54013 p1<0,001 11/22

GX, (мг/л), Встречаемость 0 - 27 12692 (12023-15464) 5737-17772 p1<0,001; p2=0,09 9/25 11494 (8801-15052) 7957-15800 p1<0,001 8/22

Ak (мг/л), Встречаемость 0 - 20 21046 (15091-27001) 9279-33040 p1<0,001; p2=0,25 4/25 19694 (19257-20131) 19257-20131 2/22

AX, (мг/л), Встречаемость 0 - 27 0/25 27067 1/22

Примечание: р1- значимость различий в сравнении со здоровыми людьми; p2-значимость различий в основной и контрольной группе (критерий Манна Уитни).

Степень повышения концентрации Д2-микроглобулина при злокачественных заболеваниях связана с опухолевой массой, активностью процесса, и по данным ряда авторов, влияет на прогноз (Парилова Н.К. и соавт., 2016).

У всех больных, вошедших в исследование, регистрировали высокое содержание Д2-микроглобулина в крови, превышающее нормальные значения более чем в 4 раза (таблица 3.1.2). При этом у больных III стадией ММ содержание Д2-микроглобулина в крови были почти в 2 раза выше, чем у больных II стадией.

Статистически значимо более высокие значения этого показателя регистрировали у больных 11Б и ШБ стадий, чем у больных без нарушения функций почек.

Таблица 3.1.2 - Содержание ^2-микроглобулина крови в основной (п=25) и контрольной (п=22) группах исследования (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%)

Показатель Значения показателей в группах исследования по стадиям ММ (II, III) и наличию почечной недостаточности (А, Б)

Здоровые люди (n = 13) Основная группа Контрольная группа

IIA (n=13) IIIA (n=0) II Б (n=8) ШБ (n=4) IIA (n=11) IIIA (n=3) ПБ (n=7) ШБ (n=1)

р2-МГ крови (мкг/мл) 0 - 3 81 (6,210,3) - 11,91 (7,113,1) 16,71 (12,320,8 ) 5,61 (4,27,0) 12,6 (8,614,3) 12,81 (6,814,2) 15,6

Примечание: 1 - р<0,05 в сравнении со здоровыми людьми

В настоящее время доказано, что определенный вклад в формирование эндогенной интоксикации при онкологическом процессе вносит нарушение молекулярной структуры и конформационных характеристик альбумина сыворотки крови (Горошинская И.А. и соавт., 2017; Давыдова Т.Н. и соавт., 2017). Одной из важных его функций является связывание и транспорт множества низкомолекулярных веществ, лекарственных препаратов, различных медиаторов и эндогенных токсических субстанций. Транспортные и конформационные свойства альбумина зависят от расположения трехмерных структур связывающих сайтов в его молекуле (Шейбах В.Н., 2015). Нарушение функциональных свойств альбумина связано как с блокированием активных центров молекулы альбумина на фоне выраженности токсической нагрузки, так и с его модификацией в результате окисления активными формами кислорода и азота (Смолякова Р.М. и соавт., 2003; Григорович Н.А. и соавт., 2013; Копытова Т.В. и соавт., 2014; Кит О.И. и соавт., 2017).

До начала лечения у больных обеих групп наблюдали снижение общей концентрации альбумина (таблица 3.1.3). Более низкие показатели регистрировали при диагностике III стадии заболевания - медиана 28,87 г/л (24,3 - 32,2; n = 4) против 38,45 г/л (25,70 - 39,8; n = 21) в основной и 28,81 г/л (24,9 - 31,8; n = 4) против 39,21 г/л (37,8 - 43,3; n= 18) в контрольной группе (p<0,05).

О наличии эндогенной интоксикации свидетельствовало существенное снижение эффективной концентрации альбумина и его связывающей способности

в среднем в 2 раза относительно значений этого показателя у здоровых людей. При этом индекс токсичности был повышен 6,4 раза ^<0,001).

Таблица 3.1.3 - Функциональное состояние молекулы альбумина и индекс токсичности в группах исследования до начала лечения (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%, процентили 10-90%)

Показатель Значения показателей в группах исследования

Здоровые люди (n = 24) Основная группа (n = 25) Контрольная группа (n = 22)

ОКА (г/л) 45,5 (40,1-47,7) 30,7-55,4 30,7 (28,2-36,2) 25,5-45,6 Р1<0,001; Р2=0,47 36,4 (27,8-43,8) 24,9-46,3 p1=0,002

ЭКА (г/л) 37,2 (34,9-40,1) 25,9-43,8 16,3 (12,6-19,9) 8,4-22,8 Р1<0,001; Р2=0,59 17,2 (11,6-25,5) 9,6-28,6 Р1<0,001

ССА (%) 82,5 (72,9-86,3) 61,3-98,5 51,2 (32,5-57,6) 25,1-66,7 Р1<0,001; Ш=0,95 48,4 (26,4-66,6) 20,5-72,4 Р1<0,001

ИТ 0,21 (0,19-0,25) 0,15-0,37 1,59 (1,08-2,20) 0,51-2,57 Р1<0,001; Р2=0,15 1,32 (0,89-1,70) 0,40-2,13 Р1<0,001

Примечание: р1 - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми; P2 - значимость различий в основной и контрольной группе (критерий Манна Уитни)

В настоящее время многие вопросы патогенеза гематологических заболеваний, развития органных и системных нарушений, в том числе и при ММ, рассматривают с позиции нарушений процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), антиоксидантной защиты (АОЗ) организма, повреждения субстанций клеточных мембран (Титов В.Н., Лисицин Д.М., 2005; Антонеева И.И., 2006; Ануфриева Н.Д., 2010; Горошинская И.А. и соавт., 2017). Нарушение баланса течения окислительно-восстановительных реакций при ММ происходит за счет ряда патологических процессов, к которым относится анемия, гипоксия, эндогенная интоксикация, органные дисфункции, аномальный остеогенез, пролиферация плазматических клеток, цитостатическое действие химиотерапии (Trojan A. et al., 2003; Even А.М., 2004).

Оксидативный стресс - совокупность процессов повреждения клетки в результате окисления ее компонентов, в основе которого лежит каскад окислительных реакций между «активными» формами кислорода и полиненасыщенными жирными кислотами в липидах клеточных мембран. Избыточно образующиеся свободные радикалы оказывают повреждающее воздействие на структурно-функциональные элементы клетки. Одним из наиболее характерных продуктов ПОЛ является малоновый диальдегид. МДА реагирует с тиобарбитуровой кислотой, образуя триметиновый комплекс, что характеризует его в качестве маркера оксидативного стресса в организме. Образующийся при перекисном окислении липидов МДА, являясь активным веществом, может формировать различные продукты и нерастворимые конгломераты с компонентами клетки, в том числе, с дезоксиаденозином и дезоксигуанозином в молекулах ДНК, определяя его мутагенный потенциал (García J. et al., 2014).

Характер течения окислительно-восстановительных реакций до начала лечения свидетельствовал об интенсификации процессов ПОЛ на фоне неадекватной активности ферментов антиоксидантной защиты организма (таблица 3.1.4). При анализе показателей компонентов ПОЛ выявили, что до начала лечения при дебюте ММ содержание плазменного и эритроцитарного МДА было повышено в 1,4 и 1,3 раза соответственно (p<0,05). При этом активность одного из важнейших компонентов антиоксидантной защиты организма - супероксидисмутазы (СОД), была ниже нормальных значений в 1,2 раза (p<0,05).

Следует отметить, что СОД является мощным ингибитором свободнорадикального окисления в организме, защищающим биополимеры (белки, нуклеиновые кислоты и др.) от окислительной деструкции. СОД - это индуцируемый фермент, синтез его увеличивается, если в клетках активируется ПОЛ. Активация ПОЛ при сохранении равновесия между окислительными (прооксидантными) и антиоксидантными системами является физиологическим процессом адаптации. Состояние напряжения антиоксидантных систем, возникающее в результате нарушения баланса «прооксиданты - антиоксиданты» в

сторону преобладания первых, приводит к накоплению высоких концентраций активных кислородных метаболитов, которые вызывают гибель клеток посредством апоптоза или некробиоза (Меньшикова Е.Б. и соавт., 2006; 2016).

Таблица 3.1.4 - Содержание малонового диальдегида, активность супероксиддисмутазы и каталазы крови в группах исследования до начала лечения (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%, процентили 10-90%)

Показатель Значения показателей в группах исследования

Здоровые люди (П = 24) Основная группа (П = 25) Контрольная группа (П = 22)

МДА плазмы (нмоль/мл) 2,89 (1,35-3,78) 0,83-4,87 4,09 (2,96-4,91) 2,17-5,22 P1=0,011; p2=0,81 3,68 (2,82-5,41) 2,40-6,02 pl=0,015

МДА эр. (нмоль/мл 1% гемолизата) 1,58 (1,39-1,87) 0,98-2,04 2,06 (1,71-2,57) 1,13-3,18 P1=0,004; Р2=0,32 1,94 (1,50-2,44) 1,11-2,87 Р1=0,034

СОД (ед/мг НЬ) 466,7 (405,1-597,4) 334,7-642,3 411,1 (324,7-474,0) 254,9-612,3 P1=0,035; p2=0,90 380,9 (335,7-501,6) 311,5-563,1 Pl=0,021

КА плазмы (мкмоль Н2О2/мин*л) 34,4 (27,4-40,54) 20,3-47,7 46,0 (36,0-54,8) 16,8-68,6 P1=0,034; p2=0,47 41,4 (27,8-53,6) 17,3-63,2 pl=0,042

КА эр. (мкмоль Н2О2/мин*мг НЬ) 128,5 (114,6-149,3) 93,7-176,1 79,8 (68,1-99,5) 45,9-126,5 Р1<0,001; p2=0,35 92,8 (67,1-107,1) 51,3-129,1 Р1<0,001

СОД/КА эр. 3,81 (3,69-4,28) 3,51-4,53 4,78 (3,91-6,50) 3,25-7,65 P1=0,025; p2=0,42 5,31 (4,47-6,72) 4,06-7,51 Р1<0,001

Примечание: р1 - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми; P2 - значимость различий в основной и контрольной группе (критерий Манна Уитни)

Подтверждением повреждающего воздействия процессов гипероксидации липидов в настоящем исследовании явилось снижение активности внутриэритроцитарной каталазы в среднем в 1,6 раза ^<0,001) при ее статистически значимом повышении в плазме крови ^<0,05) (рисунок 3.1.1, 3.1.2).

Учитывая тот факт, что каталаза не имеет собственной внеклеточной формы, ее высокая активность в плазме крови может быть объяснена выходом этого фермента из клеток крови в результате повреждения клеточной мембраны, а также интенсивностью активации в условиях эндотоксикоза (Герасименко М.Н. и соавт., 2012).

160 140 120 100 80 60 40 20 0

мкмоль Н202/минхмг Hb 128,5

*

92,8

Ка эритроцитов

100 90 80 70

□ Здоровые люди 60 (п=24)

□ Основная группа (п=25)

О Контрольная группа (п=22)

мкмоль Н202/минхмл

50 40 30 20 10 0

Ка плазмы

Рисунок 3.1.1. Активность эритроцитарной Рисунок 3.1.2. Активность КА плазмы крови КА до начала лечения до начала лечения

Примечание: * - значимость различий с учетом поправки Бонферрони в сравнении со

здоровыми людьми (р<0,016).

Более выраженное ингибирование активности каталазы привело к значимому нарушению сбалансированной работы ферментативного звена антиоксидантной защиты в эритроцитах - коэффициет СОД/КА у больных ММ был увеличен в среднем в 1,3 раза (р<0,05) (таблица 3.1.4).

3.2 Функциональное состояние почек

Одним из наиболее серьезных и закономерных осложнений множественной миеломы является почечная недостаточность. Почти у половины больных при диагностике ММ регистрируется снижение клиренса эндогенного креатинина, а в ряде случаев почечная недостаточность является первым и основным клиническим проявлением заболевания (Knudsen L.M. et al., 1994; Adam Z. et al., 2009; Knudsen L.M. et al., 2000; Gertz M.A. et al., 2003). Наличие и степень выраженности почечной дисфункции при ММ зачастую определяют возможности проведения адекватной противоопухолевой терапии. Нарушение функции почек при ММ может развиваться и в процессе лечения заболевания и быть связанным как с прогрессированием опухолевого процесса, так и нефротоксичностью проводимой противоопухолевой химиотерапии (Рехтина И.Г. и соавт., 2015).

Как было отмечено в предыдущей главе, у 22 из 47 больных основной и контрольной групп (46,8%), вошедших в настоящее исследование, до начала лечения регистрировали содержание креатинина в сыворотке крови более

Л

177 мкмоль/л (196-310) или СКФ менее 40 мл/мин/1,73 м . У других 25 больных (53,2%) клинико-лабораторных признаков нарушения почечных функций не выявили. При этом по данным анамнестического обследования только у 6 больных обеих групп до начала заболевания была диагностирована ХБП, а встречаемость сопутствующих соматических заболеваний, являющихся модифицированными факторами риска ХБП, была одинаковой как у больных с наличием нарушений почечной дисфункции, так и без нее.

Учитывая тот факт, что уровень креатинина зависит не только от состояния почечных функций, но и от мышечной массы, возраста, пола, веса, вегетарианства, состояние водного баланса и пр., этот показатель не может считаться оптимальным для диагностики почечной дисфункции, особенно на ранних этапах ее развития, в том числе и при ММ. При расчете СКФ по креатинину крови, как одного из общепринятых в настоящее время клинических показателей функционального

Л

состояния почек, при значениях от 40 до 90 мл/мин/1,73 м между повышением концентрации креатинина и снижением СКФ нет пропорциональности. В этом диапазоне показатель СКФ дает ложноотрицательные результаты и не указывает на начало развития ренальных нарушений на ранних стадиях развития. Его повышение начинается только после снижения СКФ на 50% и ниже. Таким образом, клинически значимое нарастание концентрации креатинина крови происходит, когда глобальная функциональная способность почек уменьшается вдвое (Рехтина И.Г., Менделеева Л.П., 2017; ММе^оп I ^ а1., 2012; БЬсит !Ь. ^ а1., 2012).

Совершенствование методов диагностики и прогнозирования почечной недостаточности в настоящее время связывают с выявлением биомаркеров, ассоциированных с ранней стадией почечного повреждения и не зависящих от фильтрационной функции почек (Devarajan Р.е1 а1., 2008).

Биомаркеры почечного повреждения являются «свидетелями» патологического процесса в почках и отражают течение этапов его развития

(Edelstein C.L., 2011). Их клиническая значимость определяется соотношением с преимущественной локализацией повреждения определенного

микроструктурного компартмента почки (Bonventre J.V. et al., 2010), а также характером патологического процесса (Tesch G.H., 2010; Geus H. et al., 2012). Вместе с тем, необходимо отметить, что в настоящее время исследования по клиническому значению биомаркеров в различных популяциях больных носят накопительный характер, а их прогностическая значимость требует дополнительных доказательств.

В целях объективной оценки функционального состояния почек у больных, вошедших в настоящее исследование, мы провели анализ содержания основных маркеров почечного повреждения в крови и моче больных до начала лечения.

По данным многочисленных исследований установлено, что цистатин С более чувствительный маркер ренальной функции, чем креатинин, особенно в случаях умеренного снижения СКФ, происходящего в так называемой «слепой» зоне креатинина (Дильдабекова А.С., 2016; Zhang Z., Lu. B., 2011; Haase M., Bellomo R. et al., 2012; Fonseca I., Reguengo H. et al., 2015).

Цистатин С является ингибитором лизосомальных протеиназ, имеет низкий молекулярный вес - 13 кйа, продуцируется всеми ядерными клетками организма с константной скоростью, поступает в кровоток равномерно, а его сывороточная концентрация поддерживается на постоянном уровне, свободно фильтруется через клубочковую мембрану, реабсорбируется и подвергается метаболизму в эпителиоцитах проксимальных канальцев за счет мегалин-кубулин-опосредованного эндоцитоза и в норме экскреция цистатина С мочой минимальна (Каюков И.Г. и соавт., 2012; Алексеев А.В. и соавт., 2014; Вельков В.В., 2014; Смирнов А.В. и соавт., 2015; Hoskova L. et al., 2016).

Метаанализ, обобщающий данные 46 статей и 8 отчетов, содержащих результаты наблюдений около 4500 больных и лиц контрольных групп, показал, что цистатин С дает более точное приближение к реальным значениям СКФ, чем креатинин. Коэффициент корреляции концентрации цистатина С при реально измеренных значениях СКФ составлял 0,92 против 0,74 для креатинина. Значения

AUC ROC (количественная интерпретация ROC, площадь, ограниченная ROC-кривой и осью доли ложных положительных классификаций) для цистатина С были 0,93 против 0,84 для креатинина (Dharnidharka et al. (2002).

Анализ результатов исследования концентрации цистатина С в сыворотке крови больных, вошедших в настоящее исследование (таблица 3.2.1 и рисунок 3.2.1) показал, что только у 2-х больных исходное содержание цистатина С в крови было в пределах нормальных значений.

Таблица 3.2.1 - Показатели маркеров функционального состояния почек в плазме крови и моче в группах исследования до начала лечения (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%, процентили 10-90%)

Показатель Значения показателей в группах исследования

Здоровые люди (n = 21) Основная группа (n = 25) Контрольная группа (n = 22)

Цистатин-С крови (нг/мл) 965 (918-1056) 783-1172 1435 (1284-1927) 1085-2351 ^<0,001; p2=0,78 1540 (1236-2045) 1124-2433 p1<0,001

Цистатин-С мочи (нг/мл) 871 (432-1302) 355-2400 622 (455-785) 342-939 p1=0,08; p2=0,95 537 (455-942)350-1078 p1=0,22

СКФ по цистатину С (мл/мин/1,73м2) 85,2 (75,4-97,8) 59,0-112,5 53,7 (51,2-57,1) 44,9-66,6 p1<0,001; p2<0,001 41,1 (37,8-44,9) 37,4-45,7 p1<0,001

L-FABP крови (нг/мл) 406 (374-493) 303-580 1040 (813-1198) 474-1407 p1<0,001; p2=0,65 962,0 (743,9-1145,0) 619,7-1483,8 p1<0,001

L-FABP мочи (нг/мл) 320 (250-349) 122-454 712 (587-945) 245-1102 p1<0,001; p2=0,03 886,3 (722,3-1106,7) 643,1-1189,1 p1<0,001

NGAL крови (нг/мл) 3,15 (2,78-3,40) 1,87-3,90 2,48 (1,92-3,33) 0,76-5,40 p1=0,12; p2=0,10 3,65 (1,94-4,43) 1,18-4,81 p1=0,33

NGAL мочи (нг/мл) 0,16 (0,14-0,19) 0,10-0,22 0,45 (0,34-0,69) 0,09-1,20 p1<0,001; p2=0,24 0,47 (0,20-0,53) 0,15-0,65 p1<0,001

ЮМ-1 крови (нг/мл) 0,08 (0,07-0,12) 0,04-0,21 0,37 (0,31-0,44) 0,16-0,49 p1<0,001; p2<0,001 0,59 (0,43-0,69) 0,41-0,82 p1<0,001

ЮМ-1 мочи (нг/мл) 0,77 (0,58-0,93) 0,14-2,30 1,74 (1,20-2,37) 0,62-2,78 p1<0,01; p2<0,001 2,86 (2,20-3,77) 1,80-4,10 p1<0,001

ГЬ-18 крови (пг/мл) 28,2 (25,6-35,4) 22,4-42,9 182,6 (112,5-223,9) 82,0-306,6 p1<0,001; p2<0,001 375,8 (287,6-441,3) 210,1-474,7 p1<0,001

ГЬ-18 мочи (пг/мл) 20,8 (13,2-22,8) 9,1-25,2 14,1 (8,7-16,0) 7,1-22,6 p1=0,007; p2<0,001 21,9 (2,08-28,7) 9,5-33,6 p1=0,14

Примечание: р1 - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми; p2 - значимость различий в основной и контрольной группе (критерий Манна Уитни)

Во всех других случаях этот показатель был выше 1000 нг/мл, а СКФ по цистатину С была ниже, чем у людей с сохраненной функций почек.

Медиана значений СКФ составила 53,7 (51,2-57,1) в основной группе и

л

41,1 (37,8-44,9) мл/мин/1,73м в контрольной. При этом у 29 из 47 больных (61,7%) отмечали выраженное снижение СКФ - менее 40 мл/мин/1,73м . На фоне повышения сывороточного цистатина С роста его мочевой концентрации не отмечали (рисунок 3.2.1).

□ Цистатин С крови 12 Цистатин С мочи

*

Здоровые люди Основная группа Контрольная группа (п=24) (п=25) (п=22)

Рисунок 3.2.1 - Показатели цистатина С в крови и моче у здоровых людей и

в группах больных до начала лечения Примечание: * - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми с учетом поправки Бонферрони ^<0,016)

До начала лечения у больных обеих групп регистрировали повышение показателей биомаркеров структурно-клеточного повреждения почек - L-FABP, К1М-1 крови и мочи и NGAL мочи (таблица 3.2.1).

Выявили увеличенную концентрацию относительно здоровых людей L-FABP в среднем в 2,5 раза в крови и моче - в 2,5 раз (р<0,001) (рисунок 3.2.2).

□ Ь РДБР крови а Ь РДБР мочи

*

Здоровые люди Основная группа Контрольная группа (п=24) (п=25) (п=22)

Рисунок 3.2.2 - Показатели L-FABP в крови и моче у здоровых людей и в группах больных до начала лечения.

Примечание: * - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми с учетом поправки Бонферрони (р<0,016)

По классификации R.L. Smathers (2011) представители биомаркеров FABP носят название ткани, в которой они впервые были обнаружены (Bensaad К., 2014). В настоящее время одним из потенциальных лабораторных маркеров раннего повреждения почек является печеночная форма семейства - Ь^АВР. Это цитозольный белок с молекулярной массой 12-16 Юа. В почечной ткани L-FABP синтезируется в эпителиальных клетках проксимальных канальцев почек (Наточин Н. В., 2011). Все белки FABP имеют общие свойства - небольшой размер, третичную структуру, сродство к гидрофобным молекулам, хорошая растворимость в клетке, хорошая специфичность к ткани, из которой они синтезируются, участие в клеточной защите (Наипег1а^ N. et а!., 2004). У здоровых людей L-FABP практически не присутствует. Его экскреция увеличивается при повреждении интерстициальной ткани почек. Повышенная экспрессия L-FABP в клетках канальцев и его выделение с мочой были описаны у животных при ОПП. Показан защитный эффект L-FABP в отношении

тубулоинтерстициальных структур почки при перегрузке проксимальных канальцев белком (Пролетов Я.Ю. и соавт., 2013).

До начала лечения у всех больных наблюдали высокие концентрации К1М-1: в крови выше, чем нормальные значения в 4,2 раза, в моче - в 2,4 раза (р<0,001) (рисунок 3.2.3).

□ КИМ-1 крови 0КИМ-1 мочи

*

2,86

нг/мл

*

1,74

Здоровые люди (n=24)

Основная группа Контрольная группа (n=25) (n=22)

Рисунок 3.2.3 - Показатели К1М-1 в крови и моче у здоровых людей и в группах больных до начала лечения. Примечание: * - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми с учетом поправки Бонферрони (р<0,016).

К1М-1 (Kidney Injury Molecule-1, молекула повреждения почек-1) -трансмембранный гликопротеин с молекулярной массой 90 KDa. В нормальных тканях почки молекулы KIM-1 не определяют. В настоящее время доказано, что высокая экспрессия KIM-1 в клетках регенерирующих проксимальных канальцев почек наблюдается только после их ишемического или токсического повреждения и мало специфична для других повреждающих факторов (Уразаева Л.И., Максудова А.Н., 2014; Vaidya V.S. et al., 2006; 2009; Devarajan P., 2008; Schiffi H., Lang S.M., 2012).

Нейтрофильный липокаин - NGAL. Имеет молекулярную массу 25 kDa. Физиологически секретируется различными тканями организма, в том числе, эпителиальными клетками проксимальных канальцев почки в дистальных частях

4

3

2

1

0

нефрона при почечном повреждении различного генеза (Алексеев А.В. и соавт., 2014; Уразаева Л.И., Максудова А.Н., 2014; Kamijo-Ikemori A. et al., 2013; Ichikawa D. et al., 2017). Несмотря на то, что сывороточный NGAL свободно фильтруется клубочками, он в большой степени реабсорбируется в проксимальных канальцах за счет эндоцитоза. Доказано, что при почечном повреждении происходит быстрое увеличение синтеза мРНК, кодирующей мочевой NGAL, в восходящем колене петли Генле и в собирательных трубочках. По этой причине в моче преобладает «ренальный» пул NGAL, синтезируемый в почках, который не поступает в систему кровообращения, полностью экскретируется в мочу и экспрессируется пропорционально степени почечного повреждения (Mori K. et al., 2005; Schmidt-Ott K.M. et al., 2006). Увеличение плазменного уровня может иметь место только при состоявшемся повреждении проксимальных канальцев почки (Вельков В.В., 2015; Коноплев Б.А. и соавт., 2017).

В нашем исследовании содержание NGAL в крови нормальных значений не превышало, а в моче его концентрация была выше, чем у здоровых людей почти в 3 раза (р<0,001) (рисунок 3.2.4).

Здоровые люди Основная группа Контрольная группа (п=24) (п=25) (п=22)

Рисунок 3.2.4 - Показатели NGAL в крови и моче у здоровых людей и в группах больных до начала лечения. Примечание: * - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми с учетом поправки Бонферрони (р<0,016)

Интерлейкин-18 (IL-18) является конституциональным провоспалительным цитокином, секретируемым в клетках дистальных извитых, соединительных и собирательных канальцах человеческих почек в норме (Melnikov V. et al., 2001). Он содержит три внутриклеточных компонента, ответственных за конвертацию проформы IL-18 в активную форму, затем поступающую в мочу при ОПП (Gauer S. et al., 2007). В работах ряда исследователей показано, что при различных заболеваниях почек секреция мочевого IL-18 значительно возрастает, что демонстрирует достаточную чувствительность и специфичность в качестве маркера повреждения проксимальных канальцев. При этом показано, что при ОПП мочевой IL-18 секретируется раньше, чем регистрируется увеличение уровня креатинина плазмы (Parikh C. et al., 2004; Liangos O. et al., 2009; Zang Z. et al., 2010; Zheng J. et al., 2013).

В нашем исследовании содержание IL-18 в моче у больных обеих групп варьировало в пределах нормальных значений. В тоже время концентрация IL-18 в крови была значительно выше в среднем в 14 раз по сравнению с показателями, регистрируемыми у здоровых людей (р<0,001), что, вероятно, было связано с активностью течения иммуно-воспалительных реакций и эндогенной интоксикации, сопровождающих развитие секретирующей множественной миеломы и связи с функциональным состояние почек не имело (рисунок 3.2.5).

нг/мл

400

300

200

100

375,8 *

182,6 *

28'2 20,80

*

14,13

□ IL-18 крови И IL-18 мочи

*

21,88

W

Здоровые люди Основная группа Контрольная (n=24) (n=25) группа(n=22)

0

Рисунок 3.2.5 - Показатели ГЬ-18 в крови и моче у здоровых людей и в группах больных до начала лечения. Примечание: * - значимость различий в сравнении со здоровыми людьми с учетом поправки Бонферрони (р<0,016)

Суммируя изложенное, можно констатировать, что развитие секретирующей множественной миеломы сопровождается формированием почечной дисфункции, регистрируемой у 46,8% больных на клинической, а у 53,2% - на преклинической стадии почечного повреждения. Выявлено снижение СКФ, определяемой по цистатину С, рост концентрации маркеров почечного повреждения - L-FABP, KIM-1 крови и мочи, NGAL мочи, характеризующее нарушение функции, как на уровне проксимального, так дистального отдела канальцев нефрона.

Таким образом, нарушение функции почек у больных секретирующей ММ, включенных в настоящее исследование, до начала специфического лечения характеризуется признаками начальной стадии тубулонекроза, что определяется снижением СКФ, инициированным повреждением канальцевого эпителия (Томилина Н.А., Подкорытова О.Л., 2009).

Заключение. Дебют секретирующей множественной миеломы (в нашей работе А- и G-миелома) характеризуется развитием эндогенной интоксикации, обусловленной, прежде всего, патогенетическими механизмами формирования злокачественного лимфопролиферативного процесса. На фоне интенсивной продукции патологических белков - парапротеина, СЛЦ иммуноглобулинов, Д?-микроглобулина выявлено ослабление детоксикационных свойств молекулы альбумина, смещение баланса течения окислительно-восстановительных реакций организма в сторону преобладания процессов гипероксидации, повреждение функциональных структур почек на уровне клубочков, проксимальных и дистальных отделов канальцев нефрона, характеризующее начальную стадию почечного повреждения токсического генеза.

ГЛАВА 4

ДЕТОКСИКАЦИОННОЕ ВОЗДЕЙСТВИЕ СЕЛЕКТИВНОГО

ПЛАЗМООБМЕНА

Успех лечения множественной миеломы зависит не только от выбора оптимального метода противоопухолевой терапии, но и от эффективности борьбы с осложнениями, сопровождающими течение заболевания (Бессмельцев С.С., Абдукадыров К.М., 2016; Kumar S.K. et al., 2008).

Как было описано в предыдущей главе, развитие миеломной болезни у больных, вошедших в настоящее исследование, сопровождалось формированием эндогенной интоксикации, обусловленной, прежде всего, особенностями течения патологического процесса.

Эндогенная интоксикация является общепатологическим процессом и обусловлена попаданием эндогенных токсических субстанций в кровоток и их распространением по водным секторам организма, которое зависит от их физико -химических свойств - молекулярной массы, водо- и жирорастворимости. Эндогенные токсические субстанции представляют собой как обычные вещества и молекулярные комплексы физиологической природы, так и продукты нормального и извращенного метаболизма. Появление во внутренней среде организма агрессивных гуморальных факторов и их накопление в концентрациях выше гомеостатического уровня могут быть связаны как с нарушением процессов метаболизма этих факторов, так и повышением проницаемости клеточных мембран и переходом во внеклеточное пространство веществ, преимущественно содержащихся в клетках. Это приводит к изменению обычного физиологического баланса концентрации этих веществ, которое сопровождается нарушением специфической и неспецифической функции клеток с изменением функций детоксикационных систем гомеостаза, прогрессированием эндотоксикоза, нарушение транспорта кислорода, развитием гипоксии, в том числе и в органах детоксикации, формированием системных и органных повреждений (Мусселиус Ю.С., 2006; Хорошилов С.Е., Никулин А.В., 2017).

Эндогенная интоксикация закономерно ухудшает состояние больного при ММ и значительно затрудняет проведение адекватной химиотерапии (Бессмельцев С.С., Абдулкадыров К.М., 2016).

Вышеизложенное является теоретическим обоснованием применения у данной категории больных патогенетического подхода к проведению специфического противоопухолевого лечения с включением детоксикационного компонента.

С точки зрения выведения всех типов токсических субстанций, в том числе, связанных белками, максимальным потенциалом детоксикации обладает плазмаферез (Voinov V.A., 2013). В течение многих лет в мире и в нашей стране изучалась возможность применения лечебного плазмафереза у больных ММ. В литературе представлены данные об эффективности этого метода экстракорпоральной детоксикации у больных множественной миеломой при ранних стадиях почечного повреждения, высоком уровне моноклонального белка, гипервискозном синдроме. В ряде исследований было показано, что проведение плазмафереза способствует повышению фильтрационной и реабсорбционной способности почек, предупреждению поражения канальцевого аппарата, восстановлению функции почек при снижении концентрации СЛЦ в плазме крови на 50%, преодолению химиорезистентности, что способствовало достижению в большом проценте случаев полной клинико-гематологической ремиссии (Бессмельцев С.С. и соавт., 2001; Рехтина И.Г. и соавт., 2013; Pasquali S. et al., 1985; Gertz M.A., 2005; Rahman T., Harper L., 2006; Leung N. et al., 2008). Однако число этих исследований и когорта больных малочисленны. В.В. Рыжко с соавт. (2009) проведя анализ данных литературы и результатов собственных исследований, сделали вывод, что плазмаферез не потерял своего значения в лечении синдрома повышенной вязкости, парапротеинемической комы и других ургентных ситуаций при ММ. Вместе с тем эффективность плазмообмена с позиций интенсивного снижения сывороточных концентраций СЛЦ Ig и нефропротективного воздействия не подтверждена и в настоящее время этот метод экстракорпорального лечения в лечении множественной миеломы не рекомендован.

Ограничение детоксикационного и нефропротективного воздействий традиционного плазмообмена при ММ, вероятно, связано с большим объемом распределения токсических субстанций и, в первую очередь, СЛЦ в других жидкостных средах организма и тканях. Свободные легкие цепи иммуноглобулинов являются мелкими молекулами (от 25 до 50 кДа), что позволяет им легко перераспределяться во внесосудистой жидкости. В циркулирующей плазме находится лишь 15-20% СЛЦ от общего количества. Детоксикационные эффекты плазмообмена ограничены объемом плазмоэкстракции 1 объемом циркулирующей плазмы (5% массы тела), и, соответственно, возможностью их экстракорпоральной элиминации только из сосудистого русла. Достижение адекватного детоксикационного эффекта высокообъемного плазмафереза требует многократности его проведения, что приводит к депротеинезации, потере альбуминовой фракции белка, факторов свертывания и иммунных компонентов плазмы крови, ухудшению функций физиологических защитных систем организма.

Накопившийся опыт клинического применения высокообъемного плазмафереза свидетельствует о необходимости поиска путей повышения его эффективности при минимизации нежелательных побочных эффектов.

В последние годы в нашей стране активно применяются сверхпроницаемые мембраны с высоким диффузионным клиренсом, к которым относятся плазмосепараторы «Evaclio». Размер пор мембраны «Evaclio» составляет 0,0080,03 мкм и находится между размером пор диализаторов и обычных плазмофильтров. Это позволяет удалять весь спектр средне- и высокомолекулярных токсических субстанций до 75 ^a вплоть до молекул альбумина (рисунок 4.1, 4.2). При этом практически нет потерь низкомолекулярных компонентов плазмы - факторов свертывания, фибриногена, иммуноглобулинов, факторов коагуляции, компонентов системы комплемента, фибриногена, антитромбина III, факторов роста гепатоцитов.

Применение плазмосепарации с использованием сверхпроницаемых мембран позволяет суммировать детоксикационные эффекты диализного лечения

и традиционного плазмообмена, позволяет увеличить объем экстракции до 10 л при минимизации потери белка и упрощении состава плазмозамещающих

растворов.

Размер эндогенных токсических субстанций

5 тыс.

500 Мол. масса

Иммуноглобулины (от 70 ООО) Альбумин (50 ООО - 60 ООО) Интсрлсйкины (17 ООО - 45 ООО) TNF-o (17 000) Продукты цитолиза Свободный гемоглобин Миоглобин (*2-микроглобулин (11 800) Инулин (5 200) Витамин Bj2 (1 355)

фосфаты Глюкоза (180)

Крсатинин Мочевина (60)

"Большая"

Капиллярная мембрана

"Средняя"

Клеточная мембрана

"Маленькая"

Экстракорпоральная элиминация эндотоксических субстанций

Hemodialysis

Conventional Plasma Exchange

Selective Plasma Exchange

Double Filtration PlasmaAdsorptlon

Dlalyzer

<л о w «

= о о ii= ■Е О "Öj о

Target substance BUN Cr Antibii Sopori Е Л> о ■о < < в ■с o О m

Molecular weight 0 101 102 103 104 105 106

Conventional Plasma Separator or Centrifugal Plasma Separator_

EVACUO™

Plasma Fractlonator EVAFLUXTH

h

[Adsorben!

Рисунок 4.1. Размер эндогенных токсических субстанций (ЭТС)

Рисунок 4.2. Сравнительная характеристика экстракорпоральной элиминации ЭТС мембраной диализатора, плазмофильтра и серхпроницаемой мембраной плазмофильтров «ЕУАСЬЮ»

4.1 Динамика показателей эндогенной интоксикации

Анализ результатов исследования показал закономерное отсутствие экстракорпоральной элиминации парапротеина при проведении селективного плазмообмена, связанное с его молекулярной массой - более 140 000 кЭа. Одновременно отмечали эффективное удаление СЛЦ 1^. Содержание к-СЛЦ и Х-СЛЦ в эксфузированном плазмофильтрате составляло от 1 до 26,5 г. При этом в плазме крови больных через 30 минут после завершения экстракорпоральной детоксикации регистрировали снижение относительно исхода к-СЛЦ и Х-СЛЦ на 59,6 и 39,8% соответственно (р<0,001) и на следующие сутки эти показатели статистически значимо не увеличивались (таблица 4.1.1).

В процессе проведения селективного плазмообмена также наблюдали эффективное удаление Д?-МГ. Его концентрация в плазмофильтрате составляла 73,5% от исходного содержания в плазме крови и после завершения экстракорпоральной детоксикации значения этого показателя были ниже, чем в исходе на 65,7%, а на следующие сутки - на 62,7% (р<0,001).

Таблица 4.1.1 - Концентрация парапротеина, СЛЦ и в2-МГ в плазме крови до и после селективного плазмообмена и в эксфузированном плазмофильтрате (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%, процентили 10-90%)

Показатель Значения показателей на этапах исследования

До СПО Плазмофильтрат Через 30 минут после СПО Через 24 часа после СПО

Парапротеин (г/л) (п = 25) 52,4 (40,9-69,2) 29,4-82,9 2,90 (2,68-3,49) 2,07-4,50 р<0,001 51,0 (34,9-54,7) 28,7-68,0 ^0,15 42,4 (39,3-52,3) 27,8-60,8 р=0,09

к-СЛЦ (мг/л), (п = 16) 49984 (35203-56590) 23168-67915 25597 (22473-30213) 17490-40389 р<0,001 20212 (15632-30484) 12290-36913 р<0,001 20754 (12908-28631) 10225-42547 р<0,001

Х-СЛЦ (мг/л), (п = 9) 16199 (14937-17526) 10614-23570 9661 (7861-11572) 6180-12691 р<0,001 9757 (7910-11310) 5109-12971 р<0,001 9376 (7780-13281) 5298-14766 р<0,001

р2-МГ крови (мкг/мл), (П = 25) 10,2 (7,8-12,8) 4,9-4,1 7,5 (5,9-8,3) 4,9-9,8 р=0,003 3,5 (2,8-3,8) 2,3-4,4 р<0,001 3,8 (2,4-4,6) 0,8-5,5 р<0,001

Примечание: р - значимость различий в сравнении с исходной концентрацией в плазме крови (критерий Манна Уитни)

На фоне проведения селективного плазмообмена (таблица 4.1.2) статистически значимого снижения общей и эффективной концентрации альбумина не наблюдали, что подтверждало незначительность просеивания альбумина мембраной плазмосепаратора и нивелировало вероятность развития вторичных осложнений, обусловленных депротеинезацией больного (Сигй А. е! а1., 2016). Одновременно регистрировали увеличение связывающей способности альбумина, реализующей его детоксикационные свойства, на 22,3% через 30 минут и на 21,4% - на следующие сутки после завершения детоксикационного лечения ^<0,05). Это, на наш взгляд, связано со значительным снижением концентрации в системном кровотоке токсических субстанций и, как результат, деблокирование активных центров молекулы альбумина.

Компоненты ПОЛ - МДА, СОД, КА, имеющие большую молекулярную массу, при проведении селективного плазмообмена из кровеносного русла не удалялись. После завершения экстракорпорального лечения (таблица 4.1.3) каких-либо значимых изменений содержания МДА, активности СОД и внутриэритоцитарной КА не

отмечали. В то же время активность КА в плазме крови на следующие сутки снизилась 43,9% ^=0,03), что, вероятно, связано со стабилизацией мембраны эритроцитов в условиях снижения выраженности токсической агрессии.

Таблица 4.1.2 - Показатели функционального состояния молекулы альбумина и индекса токсичности до и после селективного плазмообмена (п = 25) (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%, процентили 10-90%)

Показатель Значения показателей на этапах исследования

До СПО Через 30 минут после СПО Через 24 часа после СПО

ОКА (г/л) 30,70 (28,20-36,20) 25,50-45,60 34,10 (28,70-36,60) 20,40-46,88 р=0,92 32,90 (26,90-36,38) 16,09-38,80 р=0,46

ЭКА (г/л) 16,30 (12,62-19,88) 8,36-22,84 19,00 (10,20-25,17) 8,20-27,68 р=0,42 18,40 (14,14-25,26) 9,94-30,75 р=0,086

ССА (%) 51,23 (32,50-57,60) 25,13-66,70 61,00 (37,22-75,10) 28,61-86,35 р=0,048 54,10 (45,90-69,18) 37,15-82,70 р=0,13

ИТ 1,59 (1,08-2,20) 0,51-2,57 1,18 (0,75-1,43) 0,25-2,02 р=0,074 1,09 (0,76-1,37) 0,21-1,68 р=0,035

Примечание: р - значимость различий в сравнении с исходными показателями (критерий Манна Уитни)

Таблица 4.1.3 - Концентрация МДА крови, активность СОД, эритроцитарной и плазменной КА крови до и после селективного плазмообмена (п = 25) (Ме (LQ; UQ), ДИ 95%, процентили 10-90%)

Показатель Значения показателей на этапах исследования

До СПО Через 30 минут после СПО Через 24 часа после СПО

МДА плазмы (нмоль/мл) 4,09 (2,96-4,91) 2,17-5,22 3,66 (3,45-4,25) 0,67-5,01 р=0,31 3,37 (2,82-4,60) 1,83-5,05 р=0,22

МДА эритроцитов (нмоль/мл 1% гемолизата) 2,06 (1,71-2,57) 1,13-3,18 1,92 (1,65-2,69) 1,27-3,24 р=0,72 2,39 (1,86-2,88) 0,86-3,42 р=0,53

КА плазмы (мкмоль Н2О2/мин*л) 46,0 (36,0-54,8) 16,8-68,6 33,6 (31,0-42,3) 12,8-56,0 р=0,093 25,8 (18,1-43,3) 15,9-69,6 р=0,03

КА эритроцитов (мкмоль Н2О2/мин*мг НЬ) 79,9 (68,1-99,5) 45,9-126,5 78,3 (66,0-95,2) 38,5-130,9 р=0,82 80,4 (69,5-107,6) 42,2-121,1 р=0,96

СОД (ед. актив/мг НЬ) 411,1 (324,7-474,0) 254,9-612,3 400,0 (353,9-543,3) 225,9-620,2 р=0,63 419,2 (352,7-471,3) 296,7-550,2 р=0,78

Примечание: р - значимость различий в сравнении с исходными показателями (критерий Манна Уитни)

Таким образом, однократное проведение селективного плазмообмена способствовало эффективному снижению концентрации СЛЦ, Д2-МГ крови, улучшению функциональных свойств альбумина, сохранению сниженной активности ферментов антиоксидантной защиты без увеличения МДА, указывающей на уменьшение интенсивности активации процессов ПОЛ.

4.2 Изменения морфологической картины твердотельных образцов плазмы крови

Изучение морфологической картины плазмы крови - один из методов объективизации состояния гомеостаза, который занял определенную нишу в диагностике различных патологических состояний. Структурообразование биологических жидкостей в процессе дегидратации имеет четкие закономерности и дает интегральную информацию о количественном и качественном составе органических и неорганических составляющих системы. Исследование внеклеточной структуры биологической жидкости при фазовом переходе из динамического (жидкого) в статическое (твердотельное) состояние раскрывает информацию о процессах ее самоорганизации на субмолекулярном уровне. Различные методы дегидратации биологической жидкости (на стекле в открытой воздушной системе - клиновидная дегидратация, под покровным стеклом в аналитической ячейке - краевая дегидратация) предоставляют возможность визуальной оценки структурных маркеров патологического процесса, системных, подсистемных, локальных признаков структурирования основных белковых, липидных, минеральных и других компонентов плазмы, характера нарушений и результатов лечебного воздействия (Потехина Ю.П. и соавт., 2004; Тарасевич Ю.Ю. и соавт., 2010; Шатохина С.Н, Шабалин В.Н., 2013; Булойчик Ж.И. и соавт., 2018).

Нами была изучена морфологическая картина 968 твердотельных образцов плазмы крови 25 больных впервые выявленной секретирующей множественной меланомой до и после завершения селективного плазмообмена (основная группа).

Исследование морфологической картины твердотельных образцов плазмы крови методом клиновидной дегидратации Для выявления различий в системной самоорганизации плазмы крови был проведен анализ встречаемости различных физиологических и патологических морфотипов фаций до начала и после завершения экстракорпоральной детоксикации (таблица 4.2.1).

Таблица 4.2.1 - Морфотипы фаций крови у больных впервые выявленной секретирующей ММ до и после селективного плазмообмена (п = 25)

Тип фации До СПО Через 24 часа после СПО Р

абс. ч. % абс. ч. %

Физиологические типы фаций

Радиальный - - - - -

Частично-радиальный - - 10 40 <0,001

Патологические типы фаций

Иррадиальный 9 36 12 48 0,57

Циркулярный 12 48 4 161 0,032

Двойная фация 19 76 6 241 <0,001

Примечание: р - значимость различий в сравнении с исходными показателями (точный двусторонний критерий Фишера)

Результаты исследования показали, что до начала лечения формирование нормотипов фаций (рисунок 4.2.1) с радиальной или частично-радиальной симметрией основных системных признаков - «трещин», «секторов», а также «отдельностей» и «конкреций» не наблюдали. Это свидетельствовало о существенном нарушении молекулярного состава плазмы крови за счет присутствия некомплементарных патологических форм белков, продуктов незавершенного липидного и минерального обменов. Именно это привело к инверсии процессов самоорганизации и формированию при клиновидной дегидратации отрытой капли плазмы крови патологических морфотипов (Шатохина С.Н., Шабалин В.Н. и соавт., 2011).

Рисунок 4.2.1. Структуропостроение белковой фации сыворотки крови здорового человека.

Примечание: «фация» - сухая пленка белка с фиксированными круговыми концентрационными «волнами», «трещинами», «отдельностями», «конкрециями»

Почти у половины больных регистрировали фации циркулярного типа, характеризующегося развитием цельных звеньев «отдельностей» или единичных фрагментарных круговых «трещин», объединенных по краевой зоне и заполненных темноокрашенным пигмент содержащим субстратом (рисунок 4.2.2).

Рисунок 4.2.2. Фрагменты фаций плазмы крови патологической структуры циркулярного типа: а - образование системы фрагментных краевых «трещин», заполненных пигментным содержимым; б - цельная циркулярная структура полиморфных «отдельностей», расположенных по периметру фации плазмы крови. Ув.х40

Иррадиальный тип фаций плазмы крови встречался в 1,3 раза реже, чем циркулярный. Наблюдали большое разнообразие патологических подтипов, начиная с единичных циркулярных трещин в краевой зоне на фоне аморфной структуры фаций, вплоть до поперечного расположения «трещин» в краевой, промежуточной и центральной зонах (рисунок 4.2.3). Такое хаотичное бессистемное распределение свидетельствовало о значимых нарушениях

метаболизма в условиях течения опухолевого процесса, играющих важную роль в формировании системных и органных повреждений (Шатохина С.Н., Шабалин Б.Н., 2011).

в г

Рисунок 4.2.3. Фрагменты фаций плазмы крови иррадиального типа: а - единичные иррадиальные «трещины» на дегидратированной текстуре фации; б, в, г - типичное иррадиальное разнонаправленное расположение «трещин» в фациях с нарушенной

радиальной симметрией. Ув. х 40

Идентификация патологических типов «двойной фации» показала, что частота ее формирования встречалась чаще, чем циркулярного и иррадиального в 1,6 и 2,1 раза соответственно (р<0,05). Для патологического типа «двойной фации» характерно, прежде всего, выход на основную поверхность нижней фации и наличие дополнительной верхней фации меньшего размера, состоящей из токсических белков, ассоциированных с солями, пигментным содержимым и структурирующейся в соответствии с патологической направленностью входящих элементов плазмы крови (рисунок 4.2.4). Такой тип демонстрировал присутствие в плазме крови высокой концентрации токсических субстанций, продуктов

незавершенного метаболизма, распада опухоли и пр., ответственных за формирование эндогенной интоксикации.

Рисунок 4.2.4. Фрагменты патологической структуры плазмы крови типа «двойная фация»:

а - белковые натеки верхней фации у края нижней, солевой слой, ассоциированный с пигментсодержащими комплексами на поверхности верхней; б и в - плотная кристаллизация солей поверх белкового валика на границе двух фаций; г - четкое разграничение границ двух

фаций в краевой зоне. Ув. х 40

Выявленные аномалии формирования морфотипов в процессе клиновидной дегидратации свидетельствуют о полном сбое радиальной симметрии основных системообразующих структур и возникновении патологических типов фаций. Эти данные отчетливо демонстрируют нарушения первого уровня самоорганизации плазмы крови как следствие глубоких метаболических нарушений, связанных с развитием множественной миеломы (Котова О.В. и соавт., 2004).

После проведения селективного плазмообмена морфологическая картина твердых фаций изменилась (таблица 4.2.1). У 10 из 25 больных регистрировали появление физиологического типа структурной самоорганизации - частично-

радиального типа фаций (р<0,05). Встречаемость иррадиального типа в сравнении с исходом оставалась высокой. В тоже время выявление циркуляторного морфотипа и типа «двойной фации» после проведения селективного плазмообмена (таблица 4.2.2, рисунок 4.2.5) было существенно меньше, чем до начала экстракорпорального лечения - в 3 и 3,2 раза соответственно (р<0,05).

и О

ш

<и

(О

у

ш а

I-

и ш

(О I-

о

I-

и (О

22 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0

19

12

й! ш «й И

12

шя

Щ

ш

ШШ шиш

□ До СПО

Ш Через 24 часа после СПО

6*

[У*" II»*

::::

:::

Щ 81

ПЬ

7

Иррадиальный Циркуляторный тип тип

Тип "Двойная фасция"

Рисунок 4.2.5. Частота встречаемости патологических морфотипов твердотельных образцов плазмы крови до и после проведения СПО Примечание: * - значимость различий в сравнении с исходом

Полученные результаты имеют закономерное объяснение, поскольку формирование иррадиального морфотипа фации в большей степени связано с развитием и тяжестью опухолевого процесса, тогда как циркуляторный и, особенно, тип «двойной фации» твердотельных образцов плазмы крови формируются преимущественно на фоне эндотоксикоза при высокой концентрации в плазме крови эндогенных токсических субстанций (Шатохина С.Н., Шабалин В.Н., 2013; Шихлярова А.И. и соавт., 2015; 2016).