Секретируемые белки (Yop), кодируемые плазмидой кальцийзависимости возбудителя чумы: Выделение и изучение иммунобиологических свойств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Микеров, Анатолий Николаевич

• Микеров, Анатолий Николаевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Микеров, Анатолий Николаевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 1. РЕГУЛЯЦИЯ БИОСИНТЕЗА IN VITRO СЕКРЕТИРУЕ-МЫХ БЕЛКОВ (Yop), КОДИРУЕМЫХ ПЛАЗМИДОЙ КАЛЬЦИЙЗАВИСИМОСТИ YERSINIA SPP.

1.1. Факторы вирулентности, кодируемые плазмидой кальцийзависимости.

1.2. Статус Yop и особенность их экспрессии in vitro у У. pestis.

1.3. Генетический контроль экспрессии Yop in vitro.

Глава 2. РОЛЬ БЕЖОВ Yop В ВИРУЛЕНТНОСТИ ИЕРСИНИЙ.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Бактериальные штаммы.

3.2. Питательные среды, препараты, реактивы и оборудование.

3.3. Методы исследований.

Глава 4. КИНЕТИКА ПРОДУКЦИИ И ВЫДЕЛЕНИЕ В ОЧИЩЕННОМ ВИДЕ БЕЛКОВ Yop ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ.

4.1. Иммунный ответ у кроликов на белки Yop У. pestis.

4.2. Кинетика продукции in vitro белков Yop у У. pestis.

4.3. Выделение белков Yop из внешней мембраны

У. pestis.

Глава 5. ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ БЕЖОВ

Yop, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ У. PESTIS.

Глава 6. УЧАСТИЕ БЕЛКОВ Yop В ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ПЕРЕСТРОЙКЕ У ЛЮДЕЙ, ПРИВИТЫХ ЖИВОЙ ЧУМНОЙ ВАКЦИНОЙ.

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВМ - внешняя мембрана

ДСН (SDS) - додецилсульфат натрия (sodium dodecylsulfate)

ЖЧВ - живая чумная вакцина кДа - килодальтон

КЖ - культуральная жидкость

КОЕ - колониеобразующие единицы

ПААГ-ДСН - электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии ДСН

ПЯЛ - полиморфноядерные лейкоциты

РБТЛ - реакция бласттрансформации лимфоцитов т.п.н. - тысяча пар нуклеотидов

УЗД - ультразвуковой дезинтеграт

ВШ - питательный бульон (brain heart infusion)

CD - кальцийзависимый фенотип (calcium dependent)

CI - кальцийнезависимый фенотип (calcium independent)

ConA - конканавалин A (concanavalin A)

EGTA - ethylene glicol bis (2-aminoethylether) N,N,N',N'- tetraacetic acid ELISA - твёрдофазный иммуноферментный метод (enzyme-linked immunosorbent assay) pCad (pYV, pCD, pIBl, Lcr) - 70-75 т.п.н. плазмида кальцийзависимости calcium dependence glasmid) Syc - специфические шапероны белков Yop (specific Yop chaperon) TS - температурочувствительный фенотип (temperature sensitive) TyeA - элемент аппарата секреции-транслокации Yop (translocation of

Yop effectors) Yop - Yersinia outer proteins или секретируемые белки YpkA - протеинкиназа А иерсиний {Yersinia proteinkinase A) Ysc - белки, участвующие в секреции Yop (Yop secretion) Lcr - белки, участвующие в регуляции "низкого кальциевого ответа" (low calcium response)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Секретируемые белки (Yop), кодируемые плазмидой кальцийзависимости возбудителя чумы: Выделение и изучение иммунобиологических свойств»

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Существование природных очагов чумы на территории России и сопредельных государств обусловливает необходимость совершенствования средств специфической профилактики этого заболевания. Одним из направлений, связанных с решением этой проблемы, является поиск антигенов с высокой иммунобиологической активностью. На сегодняшний день реально разрабатываются подходы к использованию в составе профилактических препаратов нового поколения лишь двух антигенов возбудителя чумы (Yersinia pestis) - капсульного антигена (Fl) (Meyer et al., 1974; Дальвадянц с соавт., 1977; Simpson et al., 1990; Tomas et al., 1992; Oyston et al., 1995) и V-антигена (Motin et al., 1994; Kutyrev et al., 1994; Leary et al., 1995; Anderson et al., 1995), кодируемых собственными плазмидами возбудителя чумы - pFra (100 т.п.н.) и pCad (70-75 т.п.н.), соответственно. Необходимость продуктов плазмиды кальцийзависимости (pCad) для проявления вирулентности возбудителем чумы (Portnoy et al., 1981; Ferber, Brubaker, 1981; Кокушкин, 1983; Кутырев с соавт., 1989) свидетельствует об актуальности изучения иммунобиологических свойств факторов патогенно-сти, кодируемых этой плазмидой.

Плазмида кальцийзависимости иерсиний обеспечивает продукцию ряда факторов, среди которых важное значение для реализации патогенных свойств возбудителя имеют секретируемые белки, или белки Yop (Yersinia outer proteins) (Bolin et al., 1985). Разработана модель бактериальной системы, Yop-вирулона (Cornelis, Wolf-Watz, 1998), согласно которой белки Yop подразделяются на 2 группы: эффекторы (YopE, YopH, YopM, YpkA, YopP, YopT), поражающие функции фагоцитирующих клеток и вызывающие их апоптоз, и транслокаторы (YopB, YopD, LcrV), обеспечивающие перенос эф-фекторных белков из бактериальной клетки внутрь фагоцита. YopN (LcrE) принимает участие в регуляции биосинтеза и секреции эффекторных и транслокаторных Yop. 6

Несмотря на большой интерес, проявляемый исследователями к Уор, до сих пор иммунобиологические свойства этих "белков вирулентности" остаются мало изученными. Известно лишь, что антитела к Уор регистрируются в сыворотках больных и выздоровевших от чумы людей (Магга е1.а1., 1985, ВоНп еХ. а1., 1985) и у биопробных животных, иммунизированных вакцинным и моноплазмидными (рСаё+) штаммами У. реБИБ (Видяева, 1992). В то же время, не установлена роль Уор в иммунобиологической перестройке у людей, привитых живой чумной вакциной, широко используемой для вакцинации. Не исследованы иммуногенные свойства этих белков. Остаётся неизученным вопрос относительно влияния Уор возбудителя чумы на организм биопробных животных.

ЦЕЛЬЮ РАБОТЫ явилось комплексное исследование иммунобиологических свойств белков Уор, кодируемых плазмидой кальцийзависимости возбудителя чумы.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ:

1. Оптимизировать условия культивирования бактерий У. реБйв с целью получения максимальной экспрессии Уор.

2. Получить очищенные препараты белков Уор возбудителя чумы (УорН-М, УорВ, УорБ-Ы и УорЕ) в препаративных количествах и поликло-нальные моноспецифические сыворотки к ним.

3. Изучить иммунобиологическую активность препаратов УорН-М, УорВ, УорБ-М и УорЕ в эксперименте.

4. Выяснить участие белков Уор в иммунобиологической перестройке у людей, привитых живой чумной вакциной. 7

НАУЧНАЯ НОВИЗНА

Впервые изучена кинетика продукции белков Yop у Y. pestis. Показано, что у моноплазмидного штамма Y. pestis КМ 123 (pCad+), также как и у Y. pseudotuberculosis (р1В1+), в процессе культивирования бактерий при 37°С в питательном бульоне ВШ с добавлением 5 мМ EGTA и 20 мМ MgCl2 белки Yop на первом этапе продукции секретируются в культуральную жидкость (КЖ), а на втором - накапливаются во внешней мембране (ВМ). Анализ количественного распределения белков Yop между КЖ и ВМ (срок исследования 20 ч) позволил сделать заключение о целесообразности выделения Yop из ВМ Y. pestis. Из ВМ Y. pestis КМ 123 (pCad+) впервые в препаративных количествах получены электрофоретически и иммунохимически чистые препараты белков Yop.

На модели мышей впервые проведено комплексное исследование иммунобиологических свойств белков YopH-M, YopB, YopD-N и YopE возбудителя чумы, выделенных в очищенном виде. Установлено, что парентеральное введение мышам Balb/c препаратов Yop приводит к активизации кроветворных процессов и развитию морфологических признаков иммунобиологической перестройки, прежде всего, в селезёнке. В то же время, введение YopD-N мышам приводит к значительному снижению пролиферативной способности in vitro их спленоцитов в ответ на стимуляцию неспецифическим митогеном СопА и патологическим изменениям в почках. При изучении им-муногенных свойств Yop выявлено, что все изучаемые препараты стимулируют развитие гуморального, a YopB, YopE - и клеточного звена иммунитета, но не обеспечивают защиту мышей от вирулентных бактерий чумы (Y. pestis 231) в условиях проведённого эксперимента.

Впервые показано, что белки YopH-M, YopB и YopD-N Y. pestis участвуют в иммунобиологической перестройке у людей, привитых живой чумной вакциной; выявлено, что введение вакцины стимулирует выработку антител к Yop и вызывает появление сенсибилизированных к этим белкам Т-лимфоцитов. 8

На модели зернистых лейкоцитов человека впервые изучено действие препаратов Yop на состояние лизосомального аппарата фагоцитирующих клеток. Установлено, что YopD-N и, в меньшей степени, YopE вызывают секреторную дегрануляцию зернистых лейкоцитов, в то время как YopH-M и YopB не обладают таким действием.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

По результатам работы составлены методические рекомендации "Получение очищенных препаратов белков Yop из внешней мембраны бактерий Yersinia pestis методом электроэлюции", которые одобрены учёным советом Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб" (протокол № 9 от 9 декабря 1997 г.) и утверждены зам. директора РосНИПЧИ "Микроб" по учрежденческому уровню внедрения. Разработанные методические приёмы используются в работе отдела подготовки и усовершенствования специалистов по особо опасным инфекциям РосНИПЧИ "Микроб", о чём свидетельствует соответствующий акт о внедрении (утверждён зам. директора РосНИПЧИ "Микроб" от 24 мая 1999 г.).

В препаративных количествах выделены электрофоретически и имму-нохимически чистые препараты белков YopH-M, YopB, YopD-N и YopE возбудителя чумы и получены поликлональные моноспецифические мышиные сыворотки к ним. Кроме того, получен набор поликлональных полиспецифических человечьих и кроличьих сывороток, содержащих антитела к белкам Yop. Указанные препараты могут быть использованы для получения моно-клональных антител, а сыворотки - для исследования экспрессии Yop у Y. pestis в ходе инфекции, изучения формирования пассивной защиты экспериментальных животных от чумы, а также при анализе антигенного состава рекомбинантных штаммов, содержащих клонированные гены уор. 9

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены и представлены на "Научно-практической конференции, посвящённой 100-летию образования противочумной службы России" (Саратов, 1997), II Всероссийской научной конференции "Гомеостаз и инфекционный процесс" (Саратов, 1998) и 7th International Congress on Yersinia (Nijmegen, the Netherlands, 199^).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЁМ ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, состоит из введения, двух глав обзора литературы, четырёх глав собственных исследований (в т.ч. одной главы с описанием материалов и методов), заключения и выводов. Работа иллюстрирована 10 рисунками и 6 таблицами. Список литературы включает 18 отечественных и 197 зарубежных источников.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Микеров, Анатолий Николаевич

ВЫВОДЫ

1. В ходе культивирования бактерий моноплазмидного штамма Y.pestis КМ 123 (рСасГ) при 37 °С в питательном бульоне BHI с добавлением 5 мМ EGTA и 20 мМ MgCl2 белки Yop на первом этапе секретируются в культу-ральную жидкость, а на втором - накапливаются во внешней мембране. Выявлено, что содержание Yop во внешней мембране Y. pestis к 20 ч культивирования значительно превышает их количество в культуральной жидкости в любой из сроков исследования (0, 2, 4, 6, 8 и 20 ч). Полученные результаты свидетельствуют о целесообразности препаративного выделения белков Yop из внешней мембраны Y. pestis КМ 123 (рСасГ).

2. Предложенные методические приёмы (препаративный электрофорез и электроэлюция) позволяют выделять белки Yop из внешней мембраны Y. pestis в препаративных количествах (из 1 л бактериальной культуры до 3 мг каждого белкового препарата). Полученные препараты имеют высокую степень электрофоретической и иммунохимической гомогенности и не содержат примесей липополисахарида.

3. Очищенные препараты YopH-M, YopB, YopD-N и YopE стимулируют развитие морфологических признаков иммунобиологической перестройки и вызывают активизацию кроветворной функции в селезёнке привитых мышей. Установлено, что наибольшей иммунобиологической активностью в отношении мышей обладают YopB и YopD-N. Препарат YopB вызывает выработку наиболее высоких титров специфических антител и стимулирует развитие клеточного иммунного ответа, с одной стороны, а парентеральное введение препарата YopD-N приводит к значительному снижению пролиферативной способности спленоцитов в ответ на стимуляцию неспецифическим митоге-ном СопА и патологическим изменениям в почках - с другой.

4. Иммунизация мышей препаратами YopH-M, YopB, YopD-N и YopE в условиях проведённого эксперимента не обеспечивает им защиту от виру

89 лентных бактерий чумы (7. реБШ 231, 102-105 КОЕ) при подкожном инфицировании.

5. Препараты УорБ-М и, в меньшей степени, УорЕ (но не УорН-М, УорВ) возбудителя чумы оказывают значительное влияние на состояние ли-зосомального аппарата гранулоцитов человека. Инкубирование клеток цельной крови человека в присутствии УорБ-Ы или УорЕ (в концентрации 100 мкг/мл) вызывает секреторную дегрануляцию зернистых лейкоцитов.

6. Белки Уор 7. реэНз ЕУ участвуют в иммунобиологической перестройке у людей, привитых живой чумной вакциной. При оценке гуморального и клеточного звена иммунитета выявлено, что введение вакцины стимулирует выработку антител к Уор и вызывает появление сенсибилизированных Т-лимфоцитов.

90

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Целью настоящей работы явилось комплексное исследование иммунобиологических свойств белков Yop возбудителя чумы.

К моменту начала работы было известно, что сыворотки больных и выздоровевших от чумы людей и экспериментальных животных, иммунизированных авирулентными штаммами Y. pestis, содержат антитела к белкам, кодируемым плазмидой кальцийзависимости возбудителя чумы. Результаты проведённого исследования иммунного ответа кроликов на антигенные препараты, содержащие белки Yop (электрофоретический профиль белков, величина их молекулярных масс, данные иммуноблоттинга), а также анализ сведений, представленных в литературе, позволили идентифицировать белки с молекулярными массами 46, 42, 34 и 24 кДа, кодируемые плазмидой кальцийзависимости, как YopH-M, YopB, YopD-N и YopE в соответствии с современной номенклатурой и сделать вывод о том, что эти белки, играющие важную роль в патогенезе, вызывают иммунный ответ. Поэтому явилось актуальным выделение данных белков Yop в очищенном виде с целью изучения их иммунобиологических свойств. Поскольку для выполнения этой задачи требовались препаративные количества Yop, мы осуществили подбор оптимальных условий получения этих белков.

В работе использовали моноплазмидный pCacf вариант Y. pestis, т.к. у полноценного штамма возбудителя чумы белки Yop подвергаются деградации in vitro активатором плазминогена, кодируемым видоспецифической плазмидой пестициногенности. Культивирование Y. pestis проводили в среде ВШ с добавлением 5 мМ EGTA и 20 мМ MgCl2, начиная с посевной дозы 5 х 107 КОЕ, что, по нашим данным, обеспечивало максимальную экспрессию белков Yop.

В результате исследования кинетики продукции белков Yop нами установлено, что эти белки у моноплазмидного pCacf штамма Y. pestis, также как

82 и у Y. pseudotuberculosis (р1В1+), секретируются в КЖ. При этом Уор регистрировались в КЖ у Y. pestis начиная с 4 ч от начала культивирования. Отмечено максимальное накопление Yop в КЖ к 6 ч инкубации, после чего их присутствие в культуральном супернатанте снижалось, а в ВМ происходило дальнейшее накопление этих белков. Показано, что содержание Yop в ВМ к 20 ч культивирования Y. pestis значительно превышает их количество в КЖ в любой из сроков исследования. Полученные результаты указывали на целесообразность препаративного выделения белков Yop из внешней мембраны Y. pestis.

Трудности выделения белков Yop в очищенном виде обусловлены их плохой растворимостью и агрегацией в ходе очистки, о чём свидетельствуют данные зарубежных исследователей (Beusher et al., 1995). Проблему неудовлетворительной растворимости Yop мы решили путём фракционирования образца внешней мембраны методом препаративного электрофореза в поли-акриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) с последующей электроэлюцией.

Электроэлюцию белков из геля проводили в специально сконструированной нами в лабораторных условиях установке. Данная установка проста в исполнении и не требует наличия какого-либо специального оборудования, поскольку она адаптирована к коммерческому прибору для проведения электрофореза фирмы LKB. Кроме того, конструкция установки позволяет концентрировать элюированные белки в минимальном объёме, что значительно повышает эффективность их последующей преципитации. Для осажения белков к элюату добавляли ацетон, который, по данным D. Hager, R. Burgess (1980), эффективно отделяет ДСН и краситель кумасси от белковой молекулы.

Использование данного способа выделения позволило нам одновременно, одноэтапно получить с достаточно высокой степенью очистки препараты белков YopH-M, YopB, YopD-N и YopE, относительно мало отличающихся

83 по молекулярной массе (46, 42, 34 и 24 кДа, соответственно). Полученные препараты были электрофоретически и иммунохимически гомогенными и в них отсутствовала примесь липополисахарида. В результате использования комплекса методических приёмов (условия культивирования, препаративный электрофорез, электроэлюция) из 1 л бактериальной культуры было выделено до 3 мг каждого белкового препарата.

Таким образом, нами разработана оптимальная схема получения электрофоретически и иммунохимически чистых препаратов белков Yop из внешней мембраны Y. pestis в препаративных количествах.

Следующим этапом работы стала оценка действия четырёх очищенных нами препаратов (YopH-M, YopB, YopD-N и YopE) на организм мышей при парентеральном введении.

По результатам иммуноблоттинга, сыворотки мышей, привитых трёхкратным введением препаратов белков Yop, содержали циркулирующие антитела, моноспецифичные по отношению к препаратам YopH-M, YopB, YopD-N или YopE, что свидетельствовало о высокой степени очистки изучаемых белков. Титры специфических антител у 3-кратно привитых животных, как показали результаты иммуноферментного анализа (ELISA), составили 1:68886, 1:97420, 1:28963 и 1:24355 для YopH-M, YopB, YopD-N и YopE, соответственно. Таким образом, препарат YopB при парентеральном введении стимулировал выработку наиболее высоких титров специфических антител у мышей.

Состояние клеточного иммунитета у привитых мышей оценивали в реакций бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Результаты РБТЛ показали, что выраженной пролиферирующей способностью in vitro обладали только лимфоциты мышей, привитых YopB. В пользу специфичности реакции свидетельствовал факт отсутствия пролиферации спленоцитов, полученных от мышей, иммунизированных YopB, при стимуляции препаратом YopD-N, и наоборот - спленоцитов мышей, привитых YopD-N при стимуляции YopB.

84

Обращает на себя внимание низкий уровень пролиферации in vitro сплено-цитов, полученных от мышей, привитых YopD-N, при стимуляции неспецифическим митогеном СопА. Это, по-видимому, отражает негативное влияние данного препарата in vivo на спленоциты мышей.

Таким образом, наибольшей специфической стимулирующей активностью обладал YopB, о чём свидетельствуют высокие титры специфических антител и клеточный ответ у мышей, привитых этим препаратом.

О развитии иммуного ответа на Yop у привитых мышей свидетельствуют также данные морфологического исследования. Установлено, что препараты всех изучаемых белков при парентеральном введении вызывают появление признаков, свидетельствующих о наличии иммунобиологической перестройки, прежде всего, в селезёнке у привитых мышей: бластная трансформация увеличенных лимфоидных фолликулов, появление бластов и зрелых плазмоцитов в красной пульпе. Кроме того, морфологические изменения обнаруженные в селезёнке, указывали на резкую активизацию кроветворной функции этого органа (стимуляция лейко- и мегакариоцитопоэза).

Заслуживает внимания тот факт, что в почках у мышей, привитых YopD-N, регистрировались повреждения капилляров почечных клубочков и эпителия извитых канальцев, что могло привести к неселективной форме протеинурии. Интересно, что эти изменения имели много общего с повреждениями, возникающими в почках у морских свинок, многократно привитых живой чумной вакциной (Назарова, 1995).

Таким образом, результаты оценки состояния гуморального и клеточного звена иммунитета, а также данные морфологического исследования имму-нокомпетентных органов свидетельствовали о наличии иммунобиологической перестройки у мышей, привитых очищенными препаратами белков Yop. Однако иммунобиологическая перестройка, стимулируемая Yop, не обеспечивала защиту мышей от вирулентных бактерий чумы при подкожном инфицировании. Следует отметить, что после заражения не выживали и мыши,

85 привитые исходным препаратом внешней мембраны, содержащим все изучаемые белки Yop.

Полученные результаты согласуются с опубликованными недавно данными (Andrews et al., 1999), согласно которым очищенные препараты белков Yop также не обеспечили защиту мышей при заражении вирулентным инкапсулированным штаммом возбудителя чумы. Интересно, что по данным этих исследователей, мыши, привитые препаратом YopD, не погибали после заражения вирулентным бескапсульным изогенным вариантом Y.pestis, что может свидетельствовать о важной роли этого белка для развития инфекционного процесса.

Как известно, роль белков Yop и системы Уор-вирулон в целом в инфекционном процессе, заключается в поражении функции фагоцитов. Первую линию защиты против бактериальной инфекции обеспечивают такие фагоцитирующие клетки, как полиморфноядерные нейтрофильные лейкоциты (ПЯЛ), составляющие наиболее многочисленную и мобильную популяцию среди лейкоцитов человека. Использование метода проточной цитометрии позволило установить, что в процессе инкубации клеток цельной крови человека с препаратами Yop возбудителя чумы (YopH-M, YopB, YopD-N и YopE) только YopD-N и, в меньшей степени, YopE вызывают секреторную деграну-ляцию зернистых лейкоцитов, основная часть популяции которых представлена ПЯЛ. При этом выраженность реакции повышается с увеличением периода инкубации от 30 мин до 3 ч. Поскольку дегрануляция фагоцитов сопровождается освобождением лизосомальных протеаз во внеклеточное пространство, последние могут вносить вклад в патогенез чумы, в частности, в развитие геморрагических и некротических изменений во внутренних органах и тканях у больных чумой людей. Кроме того, индукция секреторной де-грануляции у ПЯЛ может быть одним из путей предотвращения иерсиниями фагоцитоза, т. к. в случае освобождения содержимого лизосомальных гранул

86 в окружающую среду, ПЯЛ превращаются в клетки с низкой фагоцитирующей активностью.

Значительный теоретический и практический интерес представляют результаты исследований, свидетельствующие об участии Yop в иммунобиологической перестройке у людей, привитых коммерческим препаратом живой чумной вакцины (ЖЧВ). Волонтёров вакцинировали однократно накожно и подкожно согласно инструкции по использованию вакцины.

Методом иммуноблоттинга показано, что в сыворотках у трёх из пяти волонтёров, привитых ЖЧВ (у двух после накожного и у одного после подкожного введения) присутствуют антитела к белкам Yop. При этом в условиях эксперимента не выявлено влияние способа вакцинации на антительный ответ к белкам Yop, продуцируемых in vivo вакцинным штаммом. В то же время, в продукции антител к Yop отмечены индивидуальные различия среди вакцинированных. В сыворотке человека, вакцинированного подкожно, обнаружены антитела к YopB и YopD-N, а в двух сыворотках, полученных от волонтёров, привитых накожным способом, присутствовали антитела к YopH-M в одном случае и к YopD-N - в другом. Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что белки Yop вызывают гуморальный ответ у людей, привитых живой чумной вакциной.

При оценке клеточного звена иммунитета у волонтёров, вакцинированных подкожно ЖЧВ выявлено, что препараты исследуемых белков обладают способностью инициировать реакцию бласттрансформации сенсибилизированных лимфоцитов крови вакцинированных, что в известной степени может свидетельствовать об участии этих белков в стимулировании клеточного ответа у людей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Микеров, Анатолий Николаевич, 1999 год

1. Видяева H.A., Кутырев В.В., Проценко O.A., Олейников П.Н., Аниси-мов П.И. Экспрессия антигенов чумного микроба, кодируемых плазмидой Са2+-зависимости // Молекул, генетика. 1990. -№ 6. - С. 17-21.

2. Видяева H.A., Кутырев В.В., Шанина Л.И., Проценко O.A. О гетерогенных антигенах // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инф.: Тез. докл. Всесоюзн. конф. (Волгоград, 21-22 окт. 1992 г. ) -Волгоград, 1992. С. 37-38.

3. Видяева H.A. Изучение экспрессии белков внешней мембраны, кодируемых плазмидой кальцийзависимости Yersinia pestis: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Саратов, 1992. - 21 С.

4. Дальвадянц С.М., Филиппов А.Ф., Белобородов P.A., Огарёв H.H. Эффективность сочетанной иммунизации морских свинок против чумы препаратами фракции 1 и основного соматического антигена // Профилакт. особо опасн. инф. Саратов, 1977. - Вып. 3. - С. 105-112.

5. Заренков М.И., Гончаров Е.К. Влияние 6 MD плазмиды Yersinia pestis EY76 на состав внешнемембранных белков Yersinia pseudotuberculosis II Молекул, генетика. 1991. - № 3. - С. 16-19.

6. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. М.: Мир, 1988.-446 С.91

7. Кокушкин A.M. Трансформирующая активность плазмид чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1983.-21 С.

8. Кравцов A.JI. Микрофлуориметрическое исследование в потоке гетерогенных популяций бактерий Y.pestis и клеток иммунной системы инфицированных чумой лабораторных животных: Дис. . докт. биол. наук. Саратов, 1997.-239 С.

9. Куклева JI.M., Кутырев В.В., Проценко О.А. Молекулярно-генетические аспекты инвазивных и антифагоцитарных свойств патогенных иерсиний // Молекул, генетика. 1996. - № 1. - С. 11-16.

10. Кутырев В.В., Филиппов А.А., Шавина Н.Ю., Проценко О.А. Генетический анализ и моделирование вирулентности Yersinia pestis II Там же. 1989. - № 8. - С. 42-47.

11. Назарова JI.C. Иммуноморфологический анализ вакцинальных и инфекционных процессов при холере и чуме в эксперименте: Дис. . докт. мед. наук. Саратов, 1995. - 360 С.

12. Паркер Ч.В. Медиаторы: высвобождение и функции // Иммунология / Под ред. У. Пола. М.: Мир, 1989. - Т.З. - С. 170-247.

13. Ромейс Б. Микроскопическая техника / Под ред. И.И. Соколова. М.: изд-во иностранной литературы, 1954. - 711 С.

14. Руководство по профилактике чумы / Под общ. ред. А.В. Наумова, JIB. Самойловой. Саратов, 1992. - 278 С.

15. Abrams W.R, Diamond L.W, Kane A.B. A flow cytometric assay of neutrophil degranulation // J. Histochemistry and Cytochemystry 1983.- V.31. - P. 737-744.

16. Achtman M, Scwuchow S, Helmuth R, Morelli J, Manning P.A. Cell-cell ■ interactions in conjugating Escherichia coli: Con mutants and stabilization of mating aggregates // Mol. Gen. Genet. 1978. - V. 164. - P. 171-183.

17. Allaoui A, Woestyn S, Sluiters C, Cornelis G.R. YscU, a Yersinia entero-colitica inner membrane protein involved in Yop secretion // J. Bacteriol. 1994. -V. 176-P. 4534-4542.

18. Allaoui A, Scheen R, Lambert de Rouvroit C, Cornelis G.R. VirG, a Yersinia enterocolitica lipoprotein involved in Ca2+ dependency, is related to ExsB of Pseudomonas aeruginosa II Ibid. 1995. - V. 177. - P. 4230-4237.

19. Andersson K, Carballeira N, Magnusson K.E, Persson C, Stendahl O, Wolf-Watz H, Fallman M. YopH of Yersinia pseudotuberculosis interrupts early phosphotyrosine signalling associated with phagocytosis // Mol. Microbiol. 1996. -V. 20. - P.1057-1069.

20. Anderson D.M. Schneewind O. A mRNA signal for the type III secretion of Yop proteins by Yersinia enterocolitica II Science. 1997. - V. 278. - P. 11401143:

21. Ben-Gurion R., Shafferman A. Essential virulence determinants of different Yersinia species are carried on a common plasmid // Plasmid. 1981. - V. 5. - P. 183-187.

22. Bergman T. Regulation and secretion of the virulence associated Yop proteins of Yersinia: Thesis . Ph.D. Department of Cell and Molecular Biology, University of Umea, Sweden, 1994. - 60 P.

23. Beuscher H.U., Rodel F., Forsberg A., Rollinghoff M. Bacterial evasion of host immune defense: Yersinia enterocolitica encodes a supressor for tumor necrosis factor alfa expression // Infect. Immun. 1995. - V. 63. - P. 1270-1277.

24. Bliska J.B., Guan K., Dixon J.E., Falkow S. Tyrosine phosphate hydrolisis of host proteins by an essential Yersinia virulence determinant // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1991.-V. 88.-P. 1187-1191.

25. Bliska J.B., Clemens J.C., Dixon J.E., Falkow S. The Yersinia tyrosine phosphatase: specificity of a bacterial virulence determinant for phosphoproteins in the J744 A.l macrophage // J. Exp. Med. 1992,- V. 176. - P. 1625-1630.

26. Bliska J.B., Copass M.C., Falkow S. The Yersinia pseudotuberculosis adhe-sin YadA mediates intimate bacterial attachment to and entry into HEp-2 cells // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 3914-3921.

27. Bliska J.B., D.S. Black. Inhibition of the Fc receptor-mediated oxidative burst in macrophages by the Yersinia pseudotuberculosis tyrosine phosphatase // Ibid. 1995. V.63.-P. 681-685.94

28. Boland A., Cornelis G.R. Role of YopP in suppression of tumor necrosis factor alpha release by macrophages during Yersinia infection // Infect. Immun. -1998.-V. 66.-P. 1878-1884.

29. Bolin I., Norlander L., Wolf-Watz H. Temperature-inducible outer membrane ptotein of Yersinia pseudotuberculosis and Yersinia enterocolitica is associated with the virulence plasmid // Infect. Immun.- 1982. V. 37. - P. 506-512.

30. Bolin I., Wolf-Watz H. Molecular cloning of the temperature-inducible outer membrane protein 1 of Yersinia pseudotuberculosis II Ibid. 1984. - V. 43. - P. 7278.

31. Bolin I., Portnoy D.A., Wolf-Watz H. Expression of temperature-inducible outer membrane proteins of yersiniae // Ibid. -1985. V. 48. - P. 234-240.

32. Bolin I., Forsberg A., Norlander L., Skurnik M., Wolf-Watz H. Identification and mapping of the temperature-inducible, plasmid-encoded proteins of Yersinia spp. // Infect. Immun. 1988. - V. 56. - P. 343-348.

33. Bolin. I., Wolf-Watz. H. The plasmid encoded Yop2b protein of Yersinia pseudotuberculosis is a virulence determinant regulated by calcium and temperature at the level of transcription // Mol. Microbiol. 1988. - V. 2. - P. 237-245.

34. Boyd A.P., Sory M.-P., Iriarte M., Cornelis G.R. Heparin interferes with translocation of Yop proteins into HeLa cells and binds to LcrG, a regulatory component of the Yersinia Yop apparatus // Mol. Microbiol. 1998. - V. 27. -P. 425436.

35. Brubaker R.R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by yersiniae // Clin. Microbiol. Rev. -1991. V. 4. - P. 309-324.

36. Burrows T.W., Bacon G.A. The basis of virulence in Pasteurella pestis: an antigen determining virulence // Brit. J. Exp. Pathol. 1956. - V. 37. - P. 481-493.95

37. Burrows T., Bacon G.A. V and W antigens in strains of Pasteurella pseudotuberculosis II Ibid. 1960. - V. 41. - P. 38-44.

38. Carter P.B., Zahorchak R.J., Brubaker R.R. Plague virulence antigens from Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1980. - V. 28. - P. 638-640.

39. Cavanaugh D.C., Randall R. The role of multiplication of Pasteurella pestis in mononuclear phagocytes in the pathogenesis of flea-borne plague // J. Immunol. 1959.-V. 83.-P. 348-363.

40. Charnetzky W.T., Brubaker R.R. RNA synthesis in Yersinia pestis during growth restriction in calcium deficient medium // J. Bacteriol. 1982. - V. 149. - P. 1089-1095.

41. Charnetzky W.T., Shuford W.W. Survival and growth of Yersinia pestis within macrophages and an effect of the loss of the 47-megadalton plasmid on growth in macrophages // Infect. Immun. 1985. - V. 47. - P. 234-241.

42. Cheng L.W., Anderson D.M., Schneewind O. Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica II Mol. Microbiol. -1997. -V. 24. P. - 757-765.

43. China B., Michiels T., Cornelis G.R. The pYV plasmid of Yersinia encodes a lipiprotein, YlpA, related to TraT // Ibid. 1990. - V. 4. - P. 1585-1593.

44. Cornelis G., Sory M.P., Laroche Y., Derclaye I. Genetic analisis of the plasmid region controlling virulence in Yersinia enterocolitica 0:9 by mini-mu insertions and lac gene fusions // Microb. Pathog. 1986. - V. 1. - P. 349-359.

45. Cornelis G., Vanooteghem J.-C., Sluiters C. Transcription of the^op regulon from Y.enterocolitica requires trans acting pYV and chromosomal genes // Ibid. -1987.-V. 2.-P. 367-379.

46. Cornelis G.R., Biot T., Lambert de Rouvroit C., Michiels T., Mulder B., Sluiters C., Sory M.-P., Van Bouchaute M., Vanooteghem J.-C. The Yersinia yop regulon // Mol. Microbiol. 1989. - V. 3. - P. 1455-1460.

47. Cornelis G., Sluiters C., Lambert de Rouvroit C., Michiels T. Homology between VirF, the transcriptional activator of the Yersinia virulence regulon, and96

48. AraC, the Escherichia coli arabinose operon regulator // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - P. 254-262.

49. Cornelis G.R., Wolf-Watz H. The Yersinia Yop virulon: a bacterial system for subverting eukaryotic cells // Ibid. 1997. - V. 23. - P. 861-867.

50. Cornelis G.R. The Yersinia deadly kiss // J. Bacteriol. . 1998. - V. 180. - P. 5495:5504.

51. Cornelis G.R., Boland A., Boyd A.P., Geuijen C., Iriarte M., Neyt C., Sory M.-P., Stainier I. The Virulence Plasmid of Yersinia, an Antihost Genome // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62. - P. 1315-1352.

52. De Marco L., Mazzucato M., Mazotti A., Ruggery Z.M. Localization and characterization of an a-thrombin-binding site on platelet glycoprotein lb a // J. Biol. Chem. 1994.- V.269.- P. 6478-6484.

53. Fallman M., Andersson K., Häkansson S., Magnusson K.E., Stendahl O., Wolf-Watz H. Yersinia pseudotuberculosis inhibits Fc receptor-mediated phagocytosis in J774 cells // Infect. Immun. 1995. - V. 63. - P. 3117-3124.

54. Fallman M., Persson C., Wolf-Watz H. Yersinia proteins that target host cell signaling pathways // J. Clin. Invest. 1997. - V. 99. - P. 1153-1157.

55. Ferber D.M., Brubaker R.R. Plasmids in Yersinia pestis II Infect. Immun. -1981.-V. 31.-P. 831-841.

56. Fields K.A., Piano G.V., Straley S.C. A low-Ca2+ response (LCR) secretion (ysc) locus lies within the IcrB region of the LCR plasmid in Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 569-579.

57. Fletcher M.A., Klimas N., Morgan R., Gjerset G. Lymphocyte proliferation // Manual of clinical laboratory immunology / Edit. N.R. Rose, E.C. de Macario, J.L. Fahey, H. Friedman, G, M. Penn. Washington: ASM, 1992. - Chapter 32.971. P. 213-219.

58. Forsberg A., Bolin I., Norlander L., Wolf-Watz H. Molecular cloning and expression of calcium-regulated, plasmid-encoded proteins of Yersinia pseudotuberculosis II Microb. Pathog. 1987. - V. 2. - P. 123-137.

59. Forsberg A., Wolf-Watz H. The virulence protein Yop5 of Yersinia pseudotuberculosis is regulated at transcriptional level by plasmid-plB 1-encoded transacting elements controlled by temperature and calcium // Mol. Microbiol. 1988. -V. 2.-P. 121-133.

60. Forsberg A., Wolf-Watz H. Genetic analysis of the yopE region of the Yersinia spp.: identification of a novel conserved locus, yerA, regulating yopE expression // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 1547-1555.

61. Forsberg A., Viitanen A. M., Skurnik M., Wolf-Watz H. The surface-located YopN protein is involved in calcium signal transduction in Yersinia pseudotuberculosis II Mol. Microbiol. 1991. - V. 5. - P. 977-986.

62. Forsberg A., Rasqvist R., Wolf=Watz H. Regulation and polarized transfer of the Yersinia outer proteins (Yops) involved in antiphagocytosis // Trends Microbiol. 1994.-V. 2.-P. 14-19.

63. Fowler J.M., Brubaker R.R. Physiological basis of the low calcium response in Yersinia pestis II Infect. Immun. 1994. - V. 62. -P. 5234-5241.

64. Frithz-Lindsten E., Rosqvist R., Forsberg A. YerA mediates the secretion of the YopE cytotoxin of Yersinia pseudotuberculosis 11 Yersiniosis: Present and Future / Contrib. Micribiol. Immunol. (Basel, Karger) 1995. - V. 13. - P. 225-229.

65. Galyov E.E., Hakansson S., Wolf-Watz H. Characterization of the operon encoding the YpkA Ser/Thr protein kinase and the YopJ protein of Yersinia pseudotuberculosis II J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 4543-4548.98

66. Gemski P., Lazere J.R., Casey T. Plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1980. - V. 27. - P. 682-685.

67. Goguen J.D., Yother J., Straley S.C. Genetic analisis of the low calcium response in Yersinia pestis Mu dl (Ap lac) insertion mutants // J. Bacteriol. 1984. -V. 160.-P. 842-848.

68. Goguen J.D., Walker W.S., Hatch T.P., Yother J. Plasmid-determined cytotoxicity in Yersinia pestis and Yersinia pseudotuberculosis II Infect. Immun. -1986.- V. 51. P. 788-794.

69. Guan K., Dixon J.E. Protein tyrosine phosphatase activity of an essential virulence determinant in Yersinia II Science. 1990. -V. 249. - P. 553-556.

70. Haddix P.L., Straley S.C. Structure and regulation of the Yersinia pestis ysc BCDEF operon // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 4820-4828.

71. Haimovich B., Regan C., DiFazio L., Ginalis E., Ji P., Purohit U., Rowley R.V., Bolen J., Greco R. The Fc gamma RII receptor triggers ppl25FAK phosphorylation in platelets // J. Biol. Chem. 1996. - V. 271. - P. 16332-16337.

72. Hakansson S., Bergman T., Vanooteghem J.-C., Cornelis G., Wolf-Watz H. YopB and YopD constitute a novel class of Yersinia Yop proteins // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 71-80.

73. Hanski C, Naumann M. Grutzkau A, Pluschke G. Friedrich B, Hahn H, Riecken E. Humoral and cellular defense against intestinal murine infection with Yersinia enterocolitica II Ibid. 1991. - V. 59. - P. 1106-1111.

74. Hartland E.L, Green S.P, Phillips W.A, Robins-Browne R.M. Essential role of YopD in inhibition of the respiratiry burst of macrophages by Yersinia enterocolitica II Ibid. 1994. - V. 62. - P. 4445-4453.

75. Hartland E.L, Green S.P, Phillips W.A, Robins-Browne R.M. Role of YopD in the virulence of Yersinia enterocolitica II Yersiniosis: Present and Future / Contrib. Microbiol. Immunol. (Basel, Karger) 1995. - V. 13. - P. 235-238.

76. Hartland E.L, Robins-Browne R.M. Role of YopB and YopD in the virulence of Yersinia enterocolitica II Bacterial virulence Factors: Abs. General meeting of the American Society for Microbiology, 97-th. Murray, 1995. - P. 8.4.

77. Heesemann J, Gross U, Schmidt N, Laufs R. Immunochemical analysis of plasmid-encoded proteins released by enteropathogenic Yersinia sp. grown in calcium-deficient media // Infect. Immun. 1986. -V. 54. - P. 561-567.

78. Higgins C.F, Dorman C.J, Stirling D.A, Waddell L, Booth I.R, May G, Bremer E. A physiological role for DNA supercoiling in the osmotic regulation of gene expression in S. typhimurium and E. coli II Cell. 1988. - V. 52. - P. 569584.

79. Higuchi K, Kupferberg L, Smith J.L. Studies on the nutrition and physiology of Pasteurella pestis. III. Effects of calcium ions on the growth of virulent and100avirulent strains of Pasteurella pestis II J. Bacteriol. 1959. - V. 77. - P. 317-321.

80. Higuchi K., Smith J.L. Studies on the nutrition and phisiology of Pasteurella pestis. VI. A different plating medium for estimation of the mutation rate to aviru-lence // Ibid. 1961. - V. 81. -P. 605-608.

81. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // Ibid. -1983. V. 154. - P. 269-277.

82. Hoe N. P., Minion F. C., Goguen J. D. Temperature sensing in Yersinia pestis regulation of yopE transcription by IcrF II Ibid. - 1992. - V. 174. - P. 42754286.

83. Hoe N.P., Goguen J.D. Temperature sensing in Yersinia pestis: translation of the LcrF activator protein is thermally regulated // Ibid. 1993. - V. 175. - P. 79017909.

84. Holmstrom A., Rosqvist R., Wolf-Watz H., Forsberg A. Virulence plasmid-encoded YopK is essential for Yersinia pseudotuberculosis to cause systemic infection in mice // Infect. Immun. 1995. - V. 63. - P. 2269-2276.

85. Hueck C.J. Type III protein secretion systems in bacterial pathogens of animals and plants // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. - V. 62. - P. 379-433.

86. Koster M., Bitter W., Cock H., Allaoui A., Cornelis G.R., Tommassen J. The outer membrane component, YscC, of the Yop secretion machinery of Yersinia enterocolitica forms a ring-shaped multimeric complex // Mol. Microbiol. -' 1997.-V. 26.-P. 789-798.

87. Martinez R.J. Plasmid-mediated and temperature-regulated surface properties of Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1983. - V. 41. - P. 921-930.

88. Mazza G., Karu A.E., Kingsbury D.T. Immune response to plasmid- and chromosome-encoded Yersinia pestis antigens // Ibid. 1985. - V. 48. - P. 676-685.

89. McDonough K.A., Falkow S. A Yersinia pestis-specific DNA fragment encodes temperature-dependent coagulase and fibrinolysin-associated phenotypes // J. Bacteriol. 1989. - V. 3. - P. 767-775.

90. Mehigh R.J., Sample A.K., Brubaker R.R. Expression of the low-calcium response in Yersinia pestis II Microb. Pathog. 1989. - V. 6. - P. 203-217.

91. Mehigh R.J., Brubaker R.R. Major stable peptides of Yersinia pestis synthesized during the low-calcium response // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 13-22.

92. Melamed M.R., Adams L.R., Zimring A., Murnich J.G., Mayer K. Preliminary evaluation acridine orange as a vital stain for automated differential leukocyte counts // Am. J. Clin. Pathol. 1972. - V. 57. - P. 95-102.

93. Meyer K.F., Hightower J.A., McCrumb F.R. Plague immunization. VI. Vaccination with the fraction 1 antigen of Yersinia pestis II J. Infect. Dis. 1974.1031. V. 129. P. 41-45.

94. Michiels T., Wattiau P., Brasseur R., Ruysschaert J.-M., Cornelis G. Secretion of Yop proteins by yersiniae // Infect. Immun. 1990. - V. 58. - P. 2840-2849.

95. Michiels T., Cornelis G. R. Secretion of hybrid proteins by the Yersinia Yop export system//J. Bacteriol. 1991. -V. 173. - P. 1677-1685.

96. Michiels T., Vanooteghem J. C., de Rouvroit C. L., China B., Güstin A., Boudry P., Cornelis G. R. Analysis of virC an operon involved in the secretion of Yop proteins by Yersinia enterocolitica II Ibid. 1991. - V. 173. - P. 4994-5009.

97. Monack D.M., Mecsas J., Ghori N., Falkow S. Yersinia signals macrophages to undergo apoptosis and YopJ is necessary for this cell death // Ibid. 1997. - V. 94.-P. 10385-10390.

98. Motin V.L., Nakajima R., Smirnov G.V., Brubaker R.R. Passive immunity to Yersinia mediated by anti-recombinant V antigen and protein A-V antigen fusion peptide // Infect. Immun. 1994. - V. 62. - P. 4192-4201.

99. Mulder B., Michiels T., Simonet M., Sory M.-P., Cornelis G. Identification of additional virulence deterninants on the pYV plasmid of Yersinia enterocolitica W227 // Ibid. 1989. - V. 57. - P. 2534-2541.

100. Nakijama R., Brubaker R.R. Association between virulence of Yersinia pestis and suppression of gamma interferon and tumor necrosis factor alpha // Ibid. -1993.-V. 61.-P. 23-31.

101. Nakajima R., Motin V.L., Brubaker R.R. Suppression of cytokines in mice by protein A-V antigen fusion peptide and restoration of synthesis by active immunization // Ibid. 1995. - V. 63. P. 3021-3029.

102. Nilles M.L., Williams A.W., Skrzypek E., Straley S.C. Yersinia pestis LcrV104forms a stable complex with LcrG and may have a secretion-related regulatory role in the low-Ca2+ response // J. Bacteriol. 1997. - V. 179. - P. 1307-1316.

103. Nilles M.L., Fields K.A., Straley S.C. The V antigen of Yersinia pestis regulates Yop vectorial targeting as well as Yop secretion through effects on YopB and LcrG// Ibid. 1998. - V. 180. - P. 3410-3420.

104. Oyston P.C.F., Williamson E.D., Leary S.E.C., Eley S.M, Griffin K.F., Titball R.W. Immunization with live recombinant Salmonella typhimurium aroA producing Fl antigen protects against plague // Infect. Immun. 1995. - V. 63. -P. 563-568.

105. Palmer L.E., Hobbie S., Galan J.E. Bliska J.B. YopJ of Yersinia pseudotuberculosis is required for the inhibition of macrophage TNF alpha production and downregulation of the MAP kinases p38 and JNK // Mol. Microbiol. 1998. - V. 27. - P. 953-965.

106. Palmer L.E., Pancetti A.R., Greenberg S., Bliska J.B. YopJ of Yersinia spp. is sufficient to cause downregulation of multiple mitogen-activated protein kinases in eukaryotic cells // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 708-716.

107. Payne P.L., Straley S.C. YscO of Yersinia pestis is a mobile core component of the Yop secretion system // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 3882-3890.

108. Perry R. D., Haddix P.L., Atkins E.B., Soughers T.K., Straley S.C. Regulation of expression of V antigen and outer membrane proteins in Yersinia pestis II Contrib. Microbiol. Immunol. 1987. - V. 9. - P. 173-178.

109. Perry R.D., Fetherston J.D. Yersinia pestis etiologic agent of plague // Clin. Microbiol. Rev. - 1997. - V. 10. - P. 35-66.

110. Perry R.D., Straley S.C., Fetherston J.D., Rose D.J., Gregor J., Blattner F.R. DNA sequencing and analysis of the low-Ca2+ response plasmid pCDl of Yersinia pestis KIM5 // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 4611 -4623.

111. Persson C., Nordfelth R., Holmstrom A., Hakansson S., Rosqvist R., Wolf-Watz H. Cell surface bound Yersinia translokate the protein tyrosine phosphatase YopH by a polarized mechanism into the target cell // Mol. Microbiol. 1995. - V.10518.-P. 135-150.

112. Piano G.V., Barve S.S., Straley S.C. LcrD, a membrane-bound regulator of the Yersinia pestis low-calcium response // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 72937303.

113. Piano G.V., Straley S.C. Multiple effects of IcrD mutations in Yersinia pestis II Ibid. 1993. - V. 175. - P. 3536-3545.

114. Piano G.V., Straley S.C. Mutation in yscC, yscD, and yscG prevent highlevel expression and secretion of V antigen and Yops in Yersinia pestis II Ibid. -1995.-V. 177.-P. 3843-3854.

115. Portnoy D.A., Falkow S. Virulence-associated plasmids from Yersinia enterocolitica and Yersinia pseudotubeculosis // Ibid. 1981. - V. 148. - P. 877-883.

116. Portnoy D.A., Moseley S.L., Falkow S. Characterization of plasmids and plasmid-associated determinants of Yersinia enterocolitica pathogenesis // Infect. Immun. 1981. - V. 31. - P. 775-782.

117. Portnoy D.A., Wolf-Watz H., Bolin I., Beeder A.B., Falkow S. Characterization of common virulence plasmids in Yersinia species and their role in expression of outer membrane proteins // Ibid. 1984. - V. 43. - P. 108-114.

118. Price S.B., Leung K.Y., Barve S.S., Straley S.C. Molecular analysis of IcrGVH, the V antigen operon of Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1989. - V. 171. -P. 5646-5653.

119. Price S.B., Straley S.C. IcrH, a gene necessary for virulence of Yersinia pes106tis and for the normal response of Yersinia pestis to ATP and calcium // Infect. Immun. 1989. - V. 57. - P. 1491-1498.

120. Price S.B, Cowan C., Perry R.D, Straley S.C. The Yersinia pestis V antigen is a regulatory protein necessary for Ca-dependent growth and maximal expression of low-Ca-response virulence genes // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 26492657.

121. Reisner B.C., Straley S.C. Yersinia pestis YopM: thrombin binding and overexpression // Infect. Immun. 1992. - V. 60. - P. 5242-5252.

122. Rimpilainen M, Forsberg A, Wolf-Watz H. A novel protein, LcrQ, involved in the low-calcium response of Yersinia pseudotuberculosis shows extensive homology to YopH // J. Bacteriol. 1992. - V. 174. - P. 3355-3363.

123. Roggenkamp A, Schubert S, Jacobi C.A, Heesemann J. Dessection of the Yersinia enterocolitica virulence plasmid pYV08 into an operating unit and virulence gene modules // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 134. - P. 69-73.

124. Rohde J. R, Fox J. M, Minnich S.A. Thermoregulation in Yersinia enterocolitica is coincident with changes in DNA supercoiling // Mol. Microbiol. -1994. -V. 12. P. 187-199.

125. Rosqvist R, Bolin I, Wolf-Watz H. Inhibition of phagocytosis in Yersinia pseudotuberculosis: a virulence plasmid-encoded ability involving the Yop2b protein // Infect. Immun. 1988. - V. 56. - P. 2139-2143.

126. Rosqvist R, Skurnik M, Wolf-Watz H. Increased virulence of Yersinia pseudotuberculosis by two independent mutations // Nature (London). 1988. - V. 334.-P. 522-525.

127. Rosqvist R, Forsberg A, Rimpilainen M, Bergman T, Wolf-Watz H. The cytotoxic protein YopE of Yersinia obstructs the primary host defence // Mol. Microbiol. 1990. - V. 4. - P. 657-668.

128. Rosqvist R, Forsberg A, Wolf-Watz H. Intracellular targeting of the Yersinia YopE cytotoxin in mammalian cells induces actin microfilament disruption // Infect. Immun. 1991. - V. 59. - P. 4562-4569.107

129. Rosqvist R., Magnusson K.-E., Wolf-Watz H. Target cell contact triggérs expression and polarized transfer of Yersinia YopE cytotoxin into mammalian cells // EMBO J. 1994. - V. 13. - P. 964-972.

130. Ruckdeschel K., Roggenkamp A., Schubert S., Heesemann J. Differential contribution of Yersinia enterocolitica virulence factors to evasion of microbicidal action of neutrophils // Infect. Immun. 1996. - V. 64. - P. 724-733.

131. Ruckdeschel K., Roggenkamp A., Lafont V., Mangeat P., Heesemann J., Rouot B. Interaction of Yersinia enterocolitica with macrophages leads to macrophage cell death through apoptosis // Infect. Immun. 1997. - V. 65. - P. 48134821.

132. Sample A.K., Fowler J.M., Brubaker R.R. Modulation of the low calcium response in Yersinia pestis via plasmid-plasmid interaction // Microb. Pathog. -1987.-V. 2.-P. 443-453.

133. Sarker M.R., Neyt C., Stainier I., Cornelis G.R. The Yersinia Yop virulon: LcrV is required for extrusion of the translocators YopB and YopD // J. Bacteriol.1081998. -V. 180. P. 1207-1214.

134. Sarker M.R., Sory M.-P., Boyd A.P., Iriarte M., Cornelis G.R. LcrG is required for efficient translocation of Yersinia Yop effector proteins into eukaryotic cells // Infect. Immun. 1998. - V. 66. - P. 2976-2979.

135. Sato K., Nakajima R., Hara F., Une T., Osada Y. Preparation of monoclonal antibody to V antigen from Yersinia pestis II Contrib. Microbiol. Immunol. 1991. -V. 12.-P. 225-229.

136. Schulte R., Wattiau P., Hartland E.L., Robins Browne R.M., Cornelis G.R. Differential secretion of interleukin-8 by human epithelial cell lines upon entry of virulent or nonvirulent Yersinia enterocolitica II Infect. Immun. 1996. - V. 64. -P. 2106-2113.

137. Simonet M., Richard S., Berche P. Electrone microscopic evidence for in vivo extracellular localization of Yersinia pseudotuberculosis harboring the pYV plasmid // Ibid. 1990. - V. 58. - P. 841-845.

138. Simpson W.J., Thomas R.E., Schwan T.G. Recombinant capsular antigen (fraction 1) from Yersinia pestis induces a protective antibody response in Balb/c mice // Am. J. Trop. Med. Hyg. 1990. - V. 43. - P. 389-396.

139. Skrzypek E., Straley S.C. LcrG, a secreted protein involved in negative regulation of the low-calcium response in Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1993. -V. 175.-P. 3520-3528.

140. Skrzypek E., Straley S.C. Differential effects of deletions in IcrV on secretion of V antigen, regulation of the low-Ca2+ response, and virulence of Yersinia pestis II Ibid. 1995. - V. 177. - P. 2530-2542.

141. Skurnik M. Expression of antigens encoded by the virulence plasmid of Yersinia enterocolitica under different growt conditions // Infect. Immun. 1985. - V. 47.-P. 183-190.

142. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Genetic analisis of the 9, 5-kilobase virulence plasmid of Yersinia pestis II Ibid. 1988. - V. 56. - P. 2743-2748.

143. Sodeinde O.A., Sample A.K., Brubaker R.R., Goguen J.D. Plasminogen acti109vator/coagulase gene of Yersinia pestis is responsible for degradation of plasmid-encoded outer membrane proteins // Ibid. 1988. - V. 56. - P. 2749-2752.

144. Sodeinde O.A., Goguen J.D. Nucleotide sequince of the plasminogen activator gene of Yersinia pestis: relationship to ompT of Ecsherichia coli and gene E of Salmonella typhimurium II Ibid. 1989. - V. 57. - P. 1517-1523.

145. Sodeinde O.A., Subrahmanyam Y.V.B.K., Stark K., Quan T., Bao Y., Goguen J.D. A suface protease and the invasive character of plague // Science. -1992.-V. 258.-P. 1004-1007.

146. Sory M.P., Cornelis G.R. Translocation of a hybrid YopE-adenylate cyclase from Yersinia enrerocolitica into HeLa cells // Mol. Microbiol. 1994. - V. 14. - P. 583-594.

147. Stainier I., Iriarte M., Cornelis G.R. YscMl and YscM2, two Yersinia enterocolitica proteins causing down regulation of yop transcription 11 Mol. Microbiol. 1997. - V. 26. - P. 833-843.

148. Starnbach M.N., Bevan M.J. Cells infected with Yersinia present an epitope to class I MHC-restricted CTL // J. Immunol. 1994. - V. 153. - P. - 1603-1612.

149. Straley S.C., Brubaker R.R. Cytoplasmic and membrane proteins of Yersinia cultivated under conditions simulating mammalian intracellular environment // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - V. 78. - P. 1224-1228.

150. Straley S.C., Harmon P.A. Yersinia pestis grows within phagolysosomes in mouse peritoneal macrophages // Infect. Immun. 1984. - V. 45. -P. 655-659.

151. Straley S.C., Bowmer W.S. Virulence genes regulated at the transcriptional level by Ca2+ in Yersinia pestis include structurual genes for outer membrane proteins // Infect. Immun. 1986. - V. 51. - P. 445-454.

152. Straley S.C. The plasmid-encoded outer-membrane proteins of Yersinia pes110tis II Rev. Infect. Dis. 1988. - V. 10. - P. 323-326.

153. Straley S. C., Cibull M. L. Differential clearance and host-pathogen interactions of YopE" and YopICYopL" Yersinia pestis in B ALB/c mice // Infect. Immun. -1989. -V. 57. P. 1200-1210.

154. Straley S.C. The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae // Microb. Pathog. 1991. - V. 10. - P. 87-91.

155. Straley S.C., Piano G.V., Skrzypek E., Haddix P.L., Fields K.L. Regulation by Ca2+ in the Yersinia low-Ca2+ response // Mol. Microbiol. 1993. - V. 8. -P. 1005-1010.

156. Straley S.C., Skrzypek E., Piano G.V., Bliska B. Yops of Yersinia spp. pathogenic for humans // Infect. Immun. 1993. - V. 61. - P. 3105-3110.

157. Straley S.C., Perry R.D. Environmental modulation of gene expression and pathogenesis in Yersinia II Trend, in Microbiol. 1995. - V. 3. - P. 310-317.

158. Towbin H., Staehelin T., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from Polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some application // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

159. Une T., Brubaker R.R. In vivo comparison of avirulent Vwa" and Pgm" or Pst-r phenotypes of yersiniae // Infect. Immun. 1984. - V. 43. - P. 895-900.

160. Une T., Nakajima R., Brubaker R.R. Roles of V antigen in promoting virulence in Yersinia II Contrib. Microbiol. Immunol. 1986. - V. 9. - P. 179-185.

161. Viitanen A.-M., Toivanen P., Skurnik M. The IcrE gene is part of an operon in the Icr region of Yersinia enterocolitica 0:3 // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 3152-3162.

162. Visser L.G., Annema A., Furth R. Role of Yops in inhibition of phagocytosis and killing of opsonized Yersinia enterocolitica by human granulocytes // Infect.1.l1.mun. 1995. - V. 63. - P. 2570-2575.

163. Wattiau P, Cornelis G.R. SycE, a chaperone-like protein of Yersinia enterocolitica involved in the secretion of YopE. // Mol. Microbiol. 1993. - V. 8. - P. 123-131.

164. Wattiau P, Bernier B, Deslee P, Michiels T, Cornelis G.R. Individual chaperones required for Yop secretion by Yersinia II Proc. Natl. Acad. Sei. USA. -1994. -V. 91. P. 10493-10497.

165. Wattiau P, Cornelis G.R. Identification of DNA sequences recognized by VirF, the transcriotional activator of the Yersinia yop regulon // J. Bacteriol. -1994.-V. 176.-P. 3878-3884.

166. Wattiau P, Woestyn S, Cornelis G.R. Customised secretion chaperones in pathogenic bacteria // Mol. Microbiol. 1996. - V. 20. - P. 255-262.

167. Williams A.W, Straley S.C. YopD of Yersinia pestis plays a role in negative regulation of the low-calcium response in addition to its role in translocation of Yops // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 350-358.

168. Woestyn S, Allaoui A, Wattiau P, Cornelis G.R. YscN, the putative ener-gizer of the Yersinia Yop secretion machinery // Ibid. 1994. - V. 176. - P. 15611569.

169. Woestyn S, Sory M.-P, Boland A, Lequenne O, Cornelis G.R. The cyto-solic SycE and SycH chaperones of Yersinia protect the region of YopE and YopH involved in translocation across eukaryotic cell membranes // Mol. Microbiol. -1996.-V. 20.-P. 1261-1271.

170. Yother J, Chamness T.W., Goguen J.D. Temperature-controlled plasmid regulon associated with low calcium response in Yersinia pestis II J. Bacteriol. -1986.-V. 165.-P. 443-447.

171. Zahorchak R.J, Charnetzky W.T, Little R.V, Brubaker R.R. Consequences of Ca2+ deficiency on macromolecular synthesis and adenylate energy charge in Yersinia pestis II J. Bacteriol. 1979. - V. 139. - P. 792-799.

172. Zahorchak R.J, Brubaker R.R. Effect of exogenous nucleotides on Ca2+ de112pendence and V antigen synthesis in Yersinia pestis II Infect. Immun. 1982. - V. 38.-P. 933-939.

173. Zhang Z., Wang Y., Dixon J.E. Dissecting the catalitic mechanism of pro-tein-tyrosine phosphatases // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - V. 91. - P. 16241627.

174. Zhang Z.Y., Wang Y., Wu L., Fauman E.B., Stuckey J.A., Schubert H.L. Saper M.A., Dixon J.E. The Cys(X)5Arg catalytic motif in phosphoester hydrolysis// Biochemistry. 1994. - V. 33. - P. 15266-15270.

175. Zhang Z.Y. Kinetic and mechanistic characterization of a mammalian pro-tein-tyrosine phosphatase, PTP1 // J. Biol. Chem. 1995. - V. 270. - P. 11199 11204.