Роль ядерно-цитоплазматического транспорта белка Кеар1 в регуляции ответа клетки на окислительный стресс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Филонов, Григорий Сергеевич

• Филонов, Григорий Сергеевич
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Филонов, Григорий Сергеевич

Список условных обозначений

Введение

1. Регуляция №£2-зависимой транскрипции генов (обзор литературы)

1.1. Введение

1.2. Nr£2 - центральный регулятор системы ответа клетки на окислительный стресс

1.3. Способы регуляции фактора Nrf

1.4. Ядерно-цитоплазматический транспорт белков, краткий обзор

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль ядерно-цитоплазматического транспорта белка Кеар1 в регуляции ответа клетки на окислительный стресс»

В процессе эволюции живые организмы разделились на два основных типа: прокариотические и эукариотические. Особенностью эукариотических клеток стало наличие ядра - отделенного от цитоплазмы мембраной компар-тмента, основной функцией которого стало хранение генетической информации. В связи с этим системы обслуживания ДНК и перевода генетического кода в аминокислотную последовательность значительно усложнились.

Поскольку для синтеза белка необходимо перевести мРНК из ядра в цитоплазму, а, с другой стороны, для осуществления процессов репликации и транскрипции нужно обеспечить наличие в ядре необходимых белков, то ядерная мембрана должна быть проницаема. Таким образом, возникла целая система ядерно-цитоплазматического транспорта, основной функцией которой стал перенос необходимых макромолекул через особые образования -ядерные поры.

Возникновение системы ядерно-цитоплазматического транспорта позволило создать очень гибкий механизм регуляции транскрипции различных генов, поскольку добавило еще один способ контроля активности транскрипционных факторов. Действительно, теперь транскрипционный фактор, находящийся в цитоплазме, остается неактивным до тех пор, пока не получит возможность перейти в ядро. С другой стороны его ядерная транслокация является более быстрым процессом, чем синтез фактора, начиная со стадии транскрипции или трансляции. Таким образом, пространственное разделение транскрипционного фактора и его генов-мишеней является очень частым способом его репрессии в условиях, когда активность фактора не требуется. И напротив, в условиях (часто неблагоприятных), когда транскрипция генов необходима, для осуществления ответа достаточно перевести фактор в ядро.

Поскольку подобный механизм является удобным для эукариотической клетки, то неудивительно, что на настоящее время известно довольно много различных транскрипционных факторов, регулируемых таким образом.

В данной работе описывается контроль активности транскрипционного фактора Nr£2 именно посредством ядерно-цитоплазматического транспорта. Nr£2 является ключевым белком ответа клетки в процессе очень опасного состояния - окислительного стресса, поэтому данное исследование является актуальным и позволяет по-новому взглянуть на способы защиты эукариотиче-ского организма от вредного действия окружающей среды.

1. РЕГУЛЯЦИЯ NRF2-3ABHCHMOfi ТРАНСКРИПЦИИ ГЕНОВ обзор литературы)

1.1. Введение

В процессе жизнедеятельности эукариотической клетки в цитоплазме и в ядре могут появляться активные формы кислорода и азота, способные повреждать важнейшие клеточные макромолекулы и в итоге приводить к гибели клетки. Подобное крайне неблагоприятное состояние называется окислительным стрессом. Оно может быть вызвано как проникновением в клетку извне ксенобиотиков и оксидантов, так и естественными сбоями в механизмах клеточного метаболизма. На уровне целого организма подобное состояние также вызывается действием ионизирующей радиации, облучения ультрафиолетом, в ходе фагоцитоза и воспалительных процессов [1]. Окислительный стресс является причиной целого ряда серьезных заболеваний: атеросклероз, нейродегенеративные заболевания, рак [1-4]. В связи с этим исследование молекулярных механизмов поведения эукариотической клетки в состоянии окислительного стресса является актуальной научной задачей.

Для защиты клетка выработала сложный механизм, включающий в себя первую и вторую фазу ответа на окислительный стресс [5]. Если попавшее в цитозоль соединение гидрофобно, то именно в процессе первой фазы ответа осуществляется его перевод в водорастворимую форму ферментами группы цитохрома Р450. Однако получаемые в итоге соединения часто ядовиты (в основном именно они и вызывают появление активных форм кислорода), поэтому требуется дополнительная модификация (как правило, конъюгация с гидрофильными молекулами, например с глутатионом) для безопасного вывода образовавшихся продуктов из клетки [6]. Эта стадия осуществляется белками т.н. второй фазы ответа клетки на окислительный стресс. Если же соединение, проникшее в клетку, уже водорастворимо, то оно сразу подвергается действию ферментов второй фазы ответа.

Основным регуляторным белком второй фазы ответа клетки на окислительный стресс является транскрипционный фактор Nr£2, под контролем которого находятся все гены, кодирующие детоксифицирующие ферменты [7]. Механизмы регуляции фактора Nr£2 и являются предметом обсуждения настоящего обзора.

1.2. Nrf2 - центральный регулятор системы ответа клетки на окислительный стресс

Nrf2 - белок семейства CNC bzip

Nrf2 - это белок длиной 581 аминокислотный остаток и массой 66 кДа (электрофоретическая подвижность у него аномальна и соответствует белку размером около 110 кДа). Nrf2 относится к семейству транскрипционных факторов с доменом CNC (cap'n'collar) и с участком т.н. основной лейциновой молнии (bzip - basic zipper). Этот белок был впервые обнаружен при поиске транскрипционных факторов, взаимодействующих с регуляторными областями глобинового и других эритроидных генов, и назван по сходству с основным регулятором этого локуса - NF-E2 (Nrf2 - NF-E2 related factor 2) [8, 9]. В отличие от NF-E2, распространенного только в гематопоэтических клетках

10], Nrf2 встречается во всех клетках организма, что уже в самом начале исследования его свойств позволяло предположить его важные функции. Кроме Nrf2 к семейству CNC bzip транскрипционных факторов относятся белки Nrfl и Nrf3, свойства которых будут затронуты далее.

Nr£2 взаимодействует со специфической областью ДНК в промоторных областях генов, кодирующие белки ответа клетки на окислительный стресс, называемой ARE (antioxidant response element, участок ответа на оксиданты)

11], или EpRE (electrophile response element, участок ответа на электрофилы)

12]. Свое название данные последовательности получили вследствие того, что репортерные конструкции под их контролем активировались под действием оксидантов или электрофилов. Общий вид последовательности ARE:

А

5'T—ANN— С G

TGA—NNNGC Т

3' (Л/С означает, что в этом положении может находиться либо аденин, либо цитозин, коровый участок выделен скобками) [13].

Последовательность в промоторной области гена гемоксигеназы человека и крысы исторически была названа StRE (stress response element, участок ответа на стресс), поскольку в данном случае репортерная конструкция отвечала также на действие гема и форболовых эфиров [14].

На настоящее время последовательность ARE найдена в промоторных областях генов глутатион-Б-трансферазы (GST) [15-18], хиноноксидоредукта-зы (NQ01) [19, 20], гемоксигеназы (НО-1) [14, 21], гамма-глутамилцистеинсинтетазы (yGCS) [22] и т.п. (табл. 1-1).

Таблица 1-1. Последовательности ARE, найденные в различных генах. Прописными буквами обозначены нуклеотиды, входящие в коровый участок.

Ген Последовательность ARE

GSTA2 крысы 5'taatggTGACAAAGCaact3'

GSTA1 мыши 5 'taatggTGAC AAAGC aact3'

GSTP крысы 5'tcactaTGATTC AGCaact31

NQ01 крысы 5 'tcacagTGACTTGGCaaaa3'

NQ01 человека 5'tcacagTGACTCAGCagaa3'

Для взаимодействия с ДНК фактору Nrf2, как и всем белкам его семейства, необходимо гетеродимеризоваться с другими белками, обладающими доменом bzip, а именно с белками семейства малых Maf (MafF, К и G), а также с ATF4 и c-Jun. Подробнее данное взаимодействие будет рассмотрено ниже.

Сравнение первичной структуры Nrf2 и его гомолога из организма курицы, белка ЕСН, позволило выделить несколько консервативных областей, названных доменами Nehl-6 (Nr£2-ECH homology) (рис.1-1) [23]. Участок Nehl содержит уже упоминаемые выше домены CNC и bzip, участвующие в гете-родимеризации и связывании с ДНК [8]. Фрагменты Neh3, Neh4 и Neh5 являются независимыми доменами и отвечают за активацию транскрипции. Исходя из результатов, полученных при помощи дрожжевой двугибридной системы, фрагмент Neh3 взаимодействует с белком CHD6 (хромо-АТФаза/геликаза ДНК-связывающий белок) [24]. Neh4 и Neh5 кооперативного взаимодействуют с ферментом ацетилтрансферазой (СВР - CRFB binding protein), вызывая тем самым деконденсацию хроматина и привлекая далее все необходимые транскрипционные факторы [24, 25]. Neh6 необходим для репрессор-независимой деградации транскрипционного фактора, о чем подробнее будет рассказано далее [26]. Также отдельного рассмотрения требует и N-концевой домен Neh2, отвечающий за взаимодействие Nrf2 с белком-репрессором Keapl [23].

Активация транскрипции eh3

Взаимодействие Деградация ДНКс репрессором, связывающий деградация домен

Рис. 1-1. Схематическое представление доменов фактора Nrf2.

Nrf2 - ключевой фактор ответа клетки на окислительный стресс Исследования по сверхпродукции Nrf2 в клеточных линиях подтвердили его роль основного активатора транскрипции генов второй фазы ответа клетки на окислительный стресс. В его присутствии увеличивались количество как детоксифицирующих ферментов (и их РНК соответственно), так и активность репортерных генов, находящихся под контролем ARE [11, 27].

Непосредственный окислительно-восстановительный потенциал в клетках мышей, как дикого типа, так и с нокаутированным геном nrj2 был измерен при помощи двух методов (real-time electron paramagnetic resonance imaging и spin probe kinetic analysis): результаты продемонстрировали, что присутствие Nrf2 снижает уровень активных форм кислорода in vivo [28].

Дополнительным подтверждением особой роли фактора Nrf2 в ответе клетки на окислительный стресс стали исследования фенотипа мышей с нокаутированным геном nrf2. В подобных организмах существенно уменынилась как базальная, так и индуцируемая активность генов защитных белков (GST, NQOl, НО-1, yGCS). Кроме того, мутантные мыши оказались очень чувствительны к условиям окислительного стресса (действие ацетаминофена, бутилированного гидрокситолуола, выхлопов дизельного двигателя, сигаретного дыма и т.п.) [29-32], в их организмах в подобных условиях образуется большее, по сравнению с мышами дикого типа, количество аддуктов ДНК, чаще встречаются злокачественные новообразования [30, 33-35]. Стоит отметить, что перспективное терапевтическое средство олтипраз, активирующее транскрипцию генов белков ответа клетки на окислительный стресс, оказалось неэффективно в клетках с нарушенным синтезом фактора Nrf2 [35]. Многочисленные исследования показывают, что клетки, непродуцирующие Nrf2, чаще вступают в апоптоз под действием различных индукторов окислительного стресса (оксид азота, пероксид водорода, действие ультрафиолета и т.п.) [36-40]. Сверхэкспрессия же Nrf2 в клетках, напротив, уменьшает количество апоптотических клеток, образовавшихся под действием Fas лиганда [41].

Процесс хронического воспаления, считающийся одной из причин раковых заболеваний, также зависит от присутствия в клетках Nrf2. В мышах с нарушениями в его гене это состояние проходит очень остро, а внутриклеточный и иммунный ответы на него развиваются медленнее по сравнению с организмами дикого типа [42].

Несмотря на то, что мыши с разрушенным геном nrf2 развиваются нормально в лабораторных условиях, женские особи живут меньше, чем мыши дикого типа, и в их организмах развивается серьезное аутоиммунное заболевание, что указывает на Nrf2 как на один из белков, контролирующих подобные процессы [43,44].

Таким образом, все накопленные на настоящее время данные позволяют утверждать, что именно Nrf2 является ключевым регулятором активности генов ферментов II фазы ответа клетки на окислительный стресс. Его присутствие в клетке жизненно необходимо для нормального функционирования организма в неблагоприятных окружающих условиях.

Что касается других членов семейства CNC bzip, то Nrfl участвует в регуляции базальной активности ряда генов второй фазы ответа на окислительный стресс (гены, кодирующие GST-P и GST-Ms, yGSC), но не сильно влияет на индуцируемую транскрипцию этих генов [45-47]. Клетки с нокаутированным геном nrfl также оказались чувствительны к условиям окислительного стресса, в них падал уровень глутатиона и возрастало количество реакционно-способных форм кислорода [45]. Репортерные конструкции под контролем ARE отвечали на сверхэкспрессию Nrfl, однако в гораздо меньшей степени, чем на появление в клетках Nrf2 [48]. Изучение локализации фактора показало, что Nrfl находится в эндоплазматическом ретикулуме за счет присутствия на N-конце белка трансмембранного домена. Индуктор стресса в эндоплазматическом ретикулуме (туникамицин) вызывает перелокализацию фактора в ядро, демонстрируя его активное участие в процессе ответа клетки на подобный стресс [49]. NrO в свою очередь также не участвует в активации ARE-зависимой транскрипции, а в некоторых условиях ингибирует ее, что подробнее будет рассмотрено ниже [50,51].

Гены-мишени Nrf2

Каков же спектр генов, активируемых фактором Nrf2? Для ответа на поставленный вопрос ряд научных коллективов использовал технологию ДНК микрочипов, сравнивая профили экспрессии генов в клетках мышей дикого типа и с нокаутированным геном nrfl в нормальных условиях и после обработки индукторами окислительного стресса.

В ходе экспериментов были использованы клетки легких, печени, пищеварительного тракта, нервной системы [52-57]. В качестве индукторов использовались D3T (ЗН-1,2-дитиол-3-тион), сульфорафан, трет-бутилгидрохинон, условия гипероксии.

В результате гены, активирующиеся только в клетках nrf2+/+ мышей, можно разделить на следующие группы:

- ферменты метаболизма ксенобиотиков. Среди них NQOl, GST, UDP гликозилтрансфераза, эпоксидгидролаза-1, альдегид-оксидаза-1 и другие;

- антиоксиданты (НО-1, тиоредоксин, катал аз а-1, глутатионредуктаза-1, транскетолаза и др.);

- белки системы деградации (различные субъеденицы 26S протеасомы, убиквитин 2 и др.);

- шапероны (Hsp, 86 кДа 1, 2 белка из подсемейства В гомологов Hsp 40 и др.);

- факторы белкового транспорта (Ran, Sec 23а, Sec 61 и др.);

- сигнальные молекулы (митоген-активируемая протеинкиназа-10 и др.);

- транскрипционные факторы и регуляторы (Maf G и др.);

- факторы процессинга РНК и трансляции (фактор сплайсинга 10, белок RNPA1 и др.).

Как и ожидалось, значительная часть 1\Н2-зависимых генов кодирует ферменты метаболизма ксенобиотиков и антиоксиданты. Также важную роль в процессе ответа клетки на окислительный стресс играют шапероны и белки системы деградации, поскольку в процессе стресса в цитоплазме могут накапливаться поврежденные или неправильно свернутые белки [52-57]. Кроме генов, активирующихся во всех типах клеток, существуют и тканеспецифичные. Так, в нейронах Nrf2 регулирует транскрипцию генов, кодирующих белки метаболизма кальция [57]. Кроме того, Nrf2 регулирует транскрипцию генов, контролирующих ферменты воспалительного ответа клеток легкого в процессе сепсиса [52]. В nrf2m/~ тканях оказалась нарушена экспрессия генов системы врожденного иммунитета (белки узнавания пептидогликанов, воспалительные цитокины, хемокины и др.).

Результаты этих экспериментов, проверенные в ряде случаев также методом RT-PCR, подтвердили предыдущие выводы, что главная категория генов, подверженных регуляции транскрипционным фактором Nrf2, кодирует ферменты детоксификации ксенобиотиков и антиоксиданты. В ряде случаев показано, что промоторная область этих генов содержит несколько функциональных последовательностей ARE, т.е. активация осуществляется непосредственно путем присоединения Nrf2. Остальные гены, экспрессируемые только в nrf2+/+ организмах, предположительно содержат эту последовательность, однако не исключено, что активация их транскрипции осуществляется

14 нако не исключено, что активация их транскрипции осуществляется другими клеточными механизмами.

Нельзя не отметить, что наряду с активацией транскрипции в клетках, обработанных D3T, наблюдалась и репрессия ряда генов [53]. Так, среди белков, уровень мРНК которых в клетках мышей дикого типа понижен, по сравнению с nrf2'f' организмами, оказались несколько изозимов цитохрома Р450, карбоновые ангидразы 3 и 14 и некоторые белки, относящиеся к системе биосинтеза и метаболизма холестерина и липидов. Возможно, снижение активности этих белков способствует преодолению клеткой состояния окислительного стресса.

Приведенные выше данные о необходимости фактора Nr£2 для эффективного преодоления условий окислительного стресса, вызываемого различными индукторами в разных типах клеток, позволили высказать предположение о ключевой роли этого фактора в механизме защиты на уровне целого организма. Похоже, что транскрипционный фактор Nr£2 является универсальным регулятором системы ответа на окислительный стресс различных типов клеток организма, причем активируются не только классические, ARE-зависимые, но и необходимые в данных условиях тканеспецифичные гены [58].

В большинстве описанных тканях и клеточных линиях уровень экспрессии самого гена nrf2 не изменяется под действием индукторов окислительного стресса, однако в кератиноцитах промоторная область его гена содержит 2 функциональные последовательности ARE [59]. Экспрессия репортерного гена под контролем участка из промоторной области гена nrf2 усиливается под действием D3T. В условиях данного эксперимента взаимодействие Nrf2 и фрагмента из его промоторной области было продемонстрировано как in vivo, так и in vivo. Исходя из этих данных ген nrf2 в данной системе предположительно является саморегулируемым, т.е. его активность на каком-то этапе ответа клетки на стресс может контролироваться самим фактором Nrf2 [59].

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Филонов, Григорий Сергеевич

выводы

1) Keapl является белком-челноком, содержащим классический лейцин-богатый сигнал экспорта из ядра.

2) Транскрипционный фактор Nrf2 мигрирует между ядром и цитоплазмой, и его экспорт из ядра опосредован репрессором Keapl.

3) Keapl с мутацией в сигнале экспорта из ядра, взаимодействуя с Nrf2, является активатором, а не репрессором №Т2-зависимой экспрессии генов.

4) Белок Keapl может входить в состав транскрипционного комплекса, образуемого фактором Nrf2 с ARE.

5) Предложена новая модель регуляции ответа клетки на окислительный стресс.

1.5. Заключение

Изложенные данные литературы позволяют утверждать, что изучение механизмов регуляции ответа клетки на окислительный стресс является актуальной темой, привлекающей внимание множества научных групп. Исследование данной проблемы ведется быстрыми темпами, появляющиеся в зарубежной печати публикации постоянно уточняют уже имеющиеся данные и постепенно открывают новые факты, тем не менее, до недавнего времени оставались вопросы, на которые не было ответа. Каким образом осуществляется базальная транскрипция генов, подконтрольных Nrf2, за счет чего дезактивируется транскрипционный фактор в условиях возвращения клетки в нормальное состояние? Существовавшая модель не давала адекватный ответ на поставленные вопросы. В связи с этим, изучение свойств белков Nr£2 и Keapl с совершенно новой для них стороны, а именно в свете их постоянного ядерно-цитоплазматического транспорта, являлось задачей, решению которой и посвящена настоящая работа.

2. РОЛЬ ЯДЕРНО-ЦИТОПЛАЗМАТИЧЕСКОГО ТРАНСПОРТА БЕЛКА Keapl В РЕГУЛЯЦИИ ОТВЕТА КЛЕТКИ НА ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ

СТРЕСС (результаты и обсуждение)

2.1. Keapl способен перераспределяться в ядро

Исследование началось в то время, когда Keapl было принято считать цитоплазматическим белком, который связан с актином и за счет этого удерживает Nr£2 в цитоплазме. Однако в нашей лаборатории в ходе поиска при помощи метода дрожжевой двугибридной системы партнеров ядерного белка человека протимозина а был найден Keapl [131]. Опыты по прямому связыванию рекомбинантных Keapl и протимозина а и их мутантов подтверждают, что это взаимодействие высокоспецифично. Поскольку протимозин а является исключительно ядерным белком, то в нашей лаборатории возникло предположение о том, что Keapl может на короткое время появляться в ядре, и его наблюдаемая цитоплазматическая локализация свидетельствует лишь о равновесном распределении белка в клетке.

Для проверки этого предположения было решено более подробно исследовать внутриклеточную локализацию белка Keapl.

В первую очередь была исследована локализация эндогенного белка Keapl в клетках линии HeLa (карцинома шейки матки человека) и HepG2 (трансформированные гепатоциты человека). Окрашивание зафиксированных параформальдегидом клеток проводилось первичными моноклональными антителами к Keapl, а затем вторичными, конъюгированными с хромофором. Наблюдения, проводимые при помощи лазерной сканирующей конфокальной микроскопии, продемонстрировали, что эндогенный репрессор действительно является исключительно цитоплазматическим белком, (рис.2-1 А,В). Самые простые предположения в данном случае, - белок не имеет сигналов импорта в ядро (Nuclear Localization Signal - NLS) или, более того, он постоянно связан с актином. Однако существует и другая возможность: белок является челноком. т.е. постоянно перемещается между ядром и цитоплазмой, причем экспорт осуществляется быстрее импорта. При этом он может содержать как сигнал импорта в ядро, так и сигнал экспорта из него (NES - Nuclear Export Signal).

Для проверки челночных свойств эндогенного Keapl исследуемые клетки были обработаны специфическим ингибитором ядерного экспорта лепто-мицином Б (Leptomycin В, LMB) (рис.2-2).

W • ■ fl о* г, t *

1MB + - +

Рис.2-1, Локализация эндогенного белка Keapl в клетках линии HepG2 (А и Б) и HeLa (В и Г) до и после обработки LMB. Использованы моноклональные антитела 2Н5 к белку Keapl.

Из литературы известно, что действие на клетки наномолярных количеств LMB специфически ингибирует фактор ядерного экспорта CRM1 за счет взаимодействия с остатком цистеина в его центральной консервативной области, прекращая таким образом активный транспорт из ядра многих белков-челноков. Более того, известно, что именно CRM1 связывается со специфической аминокислотной последовательностью транспортируемых белков, известной как лейцин-богатый сигнал ядерного экспорта [138].

О ОН о^ о

Рис.2-2. Структурная формула лептомнцина Б.

Обработка исследуемых клеток i.MB действительно вызвала перераспределение R'eap 1 из цитоплазмы в ядро, что свидетельствовало о том, что ре-прессор на самом деле является челноком (рис.2-1Б.Г). Во всех описанных выше случаях исследования локализации эндогенного белка существовала вероятность того, что наблюдаемая флуоресценция отвечает не только местоположению Keapl, но и локализации других клеточных компонентов, обладающих сродством к используемым антителам. Для доказательства того, что антитела специфично окрашивают эндогенный белок, к клеткам в процессе окрашивания был добавлен рекомбинантный химерный белок GST-Keapl(308-624 а.о.), который должен был конкурировать за антитела с эндогенным белком, находящимся в зафиксированных клетках, и тем самым ослаблять свечение хромофора. Так и получилось (рис.2-3), что подтвердило специфичность окрашивания Кеар) данными антителами.

А ВЬ

Рис.2-3, Окрашивание эндогенного Keapl в клетках линии HeLa антителами 2Н5 в присутствии GST (А. контроль) и GST-Keap 1(308-624} (Б). Оба поля сняты в одинаковых условиях, при добавлении рекомбинантного репрессора свечение хромофора ослабевает.

Также была исследована локализация сконструированных нами химерных белков EGFP-Keapl.

EGFP является биологически инертным и, как правило, не влияет на свойства слитых с ним белков. Кроме того, он не содержит каких-либо сигнальных последовательностей, что делает его удобным маркером для изучения локализации и транспорта в клетке соединенных с ним белков. Также использование химерных конструкций на основе GFP позволяет нам наблюдать локализацию белков непосредственно в живых клетках. Сохранение белком

Keapl-GFP функциональных свойств репрессора Nrf2-зависимой экспрессии генов описано в литературе [23].

В качестве векторов для экспрессии химерных белков были использованы плазмиды pEGFP-Cl, -С2 и -СЗ, отличающиеся только открытой рамкой считывания полилинкера. Общая схема синтеза химерных белков в эукарио-тических клетках приведена на рисунке 2-4. am ы I (ДНКЕОРР ~

I Кезр1

И «ГО дммииоммых и — SV40 poly А точечные чутлнюв I

Транскрипция и трансляция

Keapl и

Рис.2-4. Схематическое изображение участка плач миды. кодирующего химерный белок EGFP-Keapl, с необходимыми регуляторными элементами.

Изучение локализации методом флуоресцентной микроскопии в живых и зафиксированных клетках на следующий день после трансфекции продемонстрировало, что, как и в случае эндогенного репрессора, химерный белок находится преимущественно в цитоплазме (рис.2-5А). При обработке LMB химерный белок EGFP-K.eapl также перераспределялся в ядро (рис.2-5В).

Рис.2-5. А и В - локализация в клетках химерного белка EGFP, соединенного с KeaptWT, в последнем случае трансфицированные клетки обработаны LMB. Б - окрашивание ядер клеток в эксперименте А красителем Hoechst3342. Здесь и далее локализация наблюдается в клетках линии 1 leLa.

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ БИБЛИОТЕКА

На основании всех описанных выше результатов можно было сделать два вывода:

Keapl способен активно накапливаться в ядре, поскольку масса EGFP-KeaplWT (порядка 100 кДа) заведомо превышала верхний предел размера белков для прохода через ядерную пору без участия активного транспорта (40-60 кДа), и возможность пассивной диффузии этого полипептида в ядро была исключена;

Keapl быстро экспортируется из ядра и, по-видимому, содержит лейцин-богатый NES, поскольку LMB блокирует экспорт белков, содержащих именно такой сигнал экспорта из ядра. Однако существует вероятность того, что он транспортируется из ядра в комплексе с другим белком, несущим такой сигнал.

Следующим шагом была проверка гипотезы о наличии в Keapl сигнала экспорта из ядра. Для этого необходимо было продемонстрировать, что Keapl содержит короткую лейцин-богатую последовательность, которая: а) необходима для экспорта из ядра; б) достаточна для него.

2.2. Идентификация сигнала ядерного экспорта белка Keapl

Сначала был проведен анализ аминокислотной последовательности белка Keapl человека. Классический сигнал экспорта из ядра, охарактеризованный для целого ряда белков, имеет следующий общий вид: v i lxwlx2lxl

F где X - это любая аминокислота; жирным выделены остатки аминокислот, наиболее важные для функционирования всего сигнала, -мутации по этим положениям полностью прекращают ядерный экспорт [139].

В белке Keapl (рис.2-6), который довольно богат гидрофобными участками, были найдены две последовательности, похожие на классический сигнал экспорта из ядра. Они находились в N-концевой половине, причем участок с 301-го по 310-й остаток имел наибольшее сходство с лейцин-богатым мотивом. В таблице 2-1 приведены эти последовательность в сравнении с уже охарактеризованными сигналами ядерного экспорта других белков.

1 mqpdprpsga gaccrflplq sqcpegagda vmyastecka evtpsqhgnr tfsytledht

61 kqafgimnel rlsqqlcdvt Iqvkyqdapa aqfmahkwl assspvfkam ftnglreqgm

121 ewsiegihp kvmerliefa ytasismgek cvlhvmngav myqidswra csdflvqqld

181 psnaigianf aeqigcvelh qrareyiymh fgevakqeef fnlshcqlvt lisrddlnvr

241 cesevfhaci nwvkydceqr rfyvqallra vrchsltpnf lqmqlqkcei lqsdsrckdy

301 Ivkifeel308tl310 hkptqvmp 318

319 cr apkvgrliyt aGGyfrqsls yleaynpsdg twirl adlqv 360

361 prsglagcw ggllvavGGr nnspdgntds saldcynpmt nqwspcapms vp 412

412 rnrigvgv idghivavGG shgcihhnsv eiyeperdew hlvapmlt 458

459 rr igvgvavlnr llvavGGfdg tnrlnsaecx ypernewrmi tamnti 506

507 rsga gvcvlhnciv aaGGvdgqdq lnsveiydve tetwtfVapm 550

551 khrrsalpit vhqgrivvlG Gvdghtflds vecydpdtdt ws 591

592 evtmitsg rsgvgvavtm epcrkqidqq nctc 624

Рис.2-6. Аминокислотная последовательность белка Keapl человека. Жирными буквами обозначены участки, исследуемые или упоминаемые в настоящей работе. Предполагаемые области диглициновых повторов выделены в отдельные строки (остатки 319-591), аминокислотные остатки, консервативные среди Kelch повторов других белков, подчеркнуты.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Филонов, Григорий Сергеевич, 2007 год

1. Berlett, B.S. and E.R. Stadtman, Protein oxidation in aging, disease, and oxidative stress. J Biol Chem, 1997.272(33): p. 20313-6.

2. Jacobson, M.D., Reactive oxygen species and programmed cell death. Trends Bio-chem Sci, 1996.21(3): p. 83-6.

3. Cerutti, P.A., Prooxidant states and tumor promotion. Science, 1985. 227(4685): p. 375-81.

4. Ames, B.N., M.K. Shigenaga and T.M. Hagen, Oxidants, antioxidants, and the degenerative diseases of aging. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(17): p. 7915-22.

5. Holtzclaw, W.D., A.T. Dinkova-Kostova and P. Talalay, Protection against elec-trophile and oxidative stress by induction of phase 2 genes: the quest for the elusive sensor that responds to inducers. Adv Enzyme Regul, 2004.44: p. 335-67.

6. Hayes, J.D. and L.I. McLellan, Glutathione and glutathione-dependent enzymes represent a co-ordinately regulated defence against oxidative stress. Free Radic Res, 1999.31(4): p. 273-300.

7. Itoh, К., K. Igarashi, N. Hayashi, M. Nishizawa and M. Yamamoto, Cloning and characterization of a novel erythroid cell-derived CNC family transcription factor heterodimerizing with the small Maffamily proteins. Mol Cell Biol, 1995. 15(8): p. 4184-93.

8. Venugopal, R. and A.K. Jaiswal, Nrfl and Nrf2 positively and c-Fos and Fral negatively regulate the human antioxidant response element-mediated expression of NAD(P)H:quinone oxidoreductasel gene. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(25): p. 14960-5.

9. Nguyen, Т., H.C. Huang and C.B. Pickett, Transcriptional regulation of the antioxidant response element. Activation by Nrf2 and repression by MafK. J Biol Chem, 2000.275(20): p. 15466-73.

10. Wasserman, W.W. and W.E. Fahl, Functional antioxidant responsive elements. Proc Natl Acad Sci USA, 1997.94(10): p. 5361-6.

11. Friling, R.S., A. Bensimon, Y. Tichauer and V. Daniel, Xenobiotic-inducible expression of murine glutathione S-transferase Ya submit gene is controlled by an electrophile-responsive element. Proc Natl Acad Sci USA, 1990. 87(16): p. 625862.

12. Reinhart, J. and W.R. Pearson, The structure of two murine class-mu glutathione transferase genes coordinately induced by butylated hydroxyanisole. Arch Biochem Biophys, 1993. 303(2): p. 383-93.

13. Li, Y. and A.K. Jaiswal, Regulation of human NAD(P)H:quinone oxidoreductase gene. Role of API binding site contained within human antioxidant response element. J Biol Chem, 1992.267(21): p. 15097-104.

14. Mulcahy, R.T. and J.J. Gipp, Identification of a putative antioxidant response element in the 5'-flanking region of the human gamma-glutamylcysteine synthetase heavy submit gene. Biochem Biophys Res Commun, 1995.209(1): p. 227-33.

15. Itoh, K., N. Wakabayashi, Y. Katoh, T. Ishii, K. Igarashi, J.D. Engel and M. Ya-mamoto, Keapl represses nuclear activation of antioxidant responsive elements by Ntf2 through binding to the amino-terminal Neh2 domain. Genes Dev, 1999. 13(1): p. 76-86.

16. Nioi, P., T. Nguyen, P.J. Sherratt and C.B. Pickett, The carboxy-terminal Neh3 domain of Nif2 is required for transcriptional activation. Mol Cell Biol, 2005. 25(24): p. 10895-906.

17. Katoh, Y., K. Itoh, E. Yoshida, M. Miyagishi, A. Fukamizu and M. Yamamoto, Two domains ofNrf2 cooperatively bind СВР, a CREB binding protein, and syner-gistically activate transcription. Genes Cells, 2001. 6(10): p. 857-68.