Роль углеводного метаболизма в устойчивости растений к гипотермии на примере картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Сабельникова, Елена Павловна

• Сабельникова, Елена Павловна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сабельникова, Елена Павловна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Физиологические и молекулярные механизмы повреждений 6 и устойчивости растений к действию гипотермии

1.2 Инвертазы растений, их физиологическая роль и значение 21 при гипотермии

1.3 Функции углеводов в низкотемпературной адаптации 32 растений

1.4 Трансгенные растения, как модель для изучения стрессовых 36 ответов

Глава 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты исследования

2.2 Выращивание растений in vitro

2.3 Определение проницаемости мембран

2.4 Определение интенсивности перекисного окисления 42 липидов

2.5 Измерение газообмена растений

2.6 Определение активности разных типов инвертаз в листьях 44 растений

2.7 Определение содержания Сахаров в листьях растений

2.8 Исследование ультраструктурной организации

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1 Влияние введенного гена дрожжевой инвертазы на 46 углеводный метаболизм трансформированных растений картофеля {Solanum tuberosum L.) сорта Дезире

3.1.1 Анализ активности пататинового промотора и разных типов 46 инвертаз в вегетативных органах ВЗЗ-шу растений картофеля

3.1.2 Активность инвертаз и содержание Сахаров в листьях 51 контрольных и ВЗЗ-wv растений картофеля

3.1.3 Особенности фотосинтеза, дыхания и роста контрольных и 55 ВЗЗ-шу растений картофеля в условиях in vitro

3.2 Холодостойкость контрольных и ВЗЗ-inv растений 61 картофеля

3.2.1 Изменение интенсивности перекисного окисления 62 мембранных липидов при охлаждении контрольных и ВЗЗwv растений картофеля

3.2.2 Изменение ионной проницаемости клеточных мембран при 70 охлаждении контрольных и ВЗЗ-inv растений картофеля

3.3 Изменения в углеводном метаболизме и устойчивости к гипотермии контрольных и ВЗЗ-wv растений картофеля в условиях культивирования на средах с разной концентрацией сахарозы

3.3.1 Активность разных типов инвертаз и содержание Сахаров в 75 листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля в условиях культивирования на средах с разной концентрацией сахарозы

3.3.3 Интенсивность перекисного окисления липидов при 81 гипотермии в листьях контрольных и ВЗЗ-wv растений картофеля, выращенных на средах с разной концентрацией сахарозы

3.4 Действие холодового закаливания на углеводный 85 метаболизм и устойчивость к гипотермии контрольных и B33-//IV растений картофеля

3.4.1 Влияние низкой закаливающей температуры на активность 86 разных типов инвертаз в листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля

3.4.2 Изменение содержания Сахаров в листьях контрольных и 91 ВЗЗ-wv растений картофеля в условиях холодового закаливания

3.4.3 Интенсивность перекисного окисления липидов в листьях 97 контрольных и ВЗЗ-шу растений картофеля при холодовом закаливании

3.4.4 Изменение ионной проницаемости клеточных мембран при 100 адаптации контрольных и ВЗЗ-inv растений картофеля

3.4.5 Влияние низкотемпературной адаптации на 104 ультраструктурную организацию хлоропластов в листьях контрольных и B33-/«v растений картофеля

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль углеводного метаболизма в устойчивости растений к гипотермии на примере картофеля, трансформированного геном дрожжевой инвертазы»

Температура среды обитания является одним из наиболее значительных факторов, оказывающих существенное влияние на интенсивность и направленность физиологических и биохимических процессов (Туманов, 1979; Levitt, 1980). Известно, что в ответ на различные стрессоры, в том числе гипотермию, в растениях происходит неспецифическое усиление гидролиза полимерных форм углеводов и накопление низкомолекулярных растворимых Сахаров, что играет важную роль в формировании устойчивости к низким температурам (Максимов, 1952; Туманов, 1979; Трунова, 1984; 2007; Perera et al., 1995; Winter, Huber, 2000). Наиболее полно этот вопрос изучен на примере морозостойких растений (Трунова, 1963; 1998; Туманов и др. 1969; Самыгин, 1974; 1994) и в значительно меньшей степени у холодостойких растений, неустойчивых к льдообразованию, но адаптирующихся к низким положительным температурам (Дроздов, Курец, 2003).

Учитывая значимость Сахаров в устойчивости растений к гипотермии, значительный интерес представляют гидролитические ферменты углеводного метаболизма, в частности, инвертаза, катализирующая реакцию расщепления сахарозы на глюкозу и фруктозу и поэтому играющая важную роль в углеводном метаболизме. На сегодняшний день, вопрос о роли инвертаз (вакуолярной, ч апопластной, цитоплазматической) в устойчивости холодостойких растений к гипотермии остается открытым. Отсутствуют четкие экспериментальные доказательства связи активности инвертаз и содержания различных форм Сахаров с формированием устойчивости холодостойких растений к гипотермии, стратегия выживания которых направлена на сохранение от повреждений надземной части, как наиболее уязвимой к действию пониженных температур. Решению этих вопросов может способствовать использование трансформированных растений с измененным углеводным метаболизмом. В частности, трансформация типичного представителя группы холодостойких растений - картофеля геном дрожжевой инвертазы апопластной локализации способна изменить содержание и соотношение моно- и дисахаров в листьях за счет гидролиза сахарозы в апопласте (Kallarakal, 1989; Schaewen et al., 1990; Sonnewald et al., 1997) и, возможно, повлиять на устойчивость растений к гипотермии.

Цель настоящей работы состояла в изучении зависимости формирования устойчивости к гипотермии растений картофеля от активности инвертаз и содержания разных форм Сахаров, изменения которых достигались тремя способами:

1) путем трансформации растений геном дрожжевой инвертазы; 2) культивированием in vitro на средах с различной концентрацией сахарозы и 3) длительной экспозицией при пониженной адаптирующей температуре. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние трансформации растений картофеля геном дрожжевой инвертазы на активность инвертаз, содержание разных форм Сахаров и устойчивость к гипотермии по определению перекисного окисления липидов в тканях листьев и экзоосмоса электролитов из них.

2. Определить интенсивность процесса фотосинтеза в условиях in vitro и его вклад в изменение содержания Сахаров в листьях растений исследуемых генотипов.

3. Изучить активность инвертаз и содержание разных форм Сахаров в листьях контрольных и трансформированных растений картофеля, выращенных на средах с разной концентрацией сахарозы (2, 4, 6%), и исследовать вызванные этим фактором изменения в устойчивости к гипотермии.

4. В период длительной адаптации растений картофеля к низкой положительной температуре изучить динамику активности инвертаз, содержания разных форм Сахаров и формирования холодостойкости.

5. Выявить изменения в ультраструктурной организации хлоропластов растений картофеля, вызванные трансформацией геном дрожжевой инвертазы, а также длительным воздействием низких положительных температур.

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Сабельникова, Елена Павловна

Выводы:

1. Эффективность встроенного гена дрожжевой инвертазы у ВЗЗ-wv растений картофеля, наряду с молекулярными методами, подтверждена значительно более высокой, по сравнению с контролем, активностью разных форм инвертаз (вакуолярной, апопластной, цитоплазматической). Среди вегетативных органов у ВЗЗ-wv растений наибольшая активность фермента выявлена в листьях.

2. Трансформация растений геном дрожжевой инвертазы с апопластной локализацией фермента приводила к особенно заметному увеличению активности кислой нерастворимой инвертазы, что, по-видимому, сопровождалось торможением загрузки флоэмы и накоплением Сахаров в листьях не только в форме глюкозы и фруктозы, но и в большей степени в форме сахарозы.

3. Установлено, что ВЗЗ-wv растения, обогащенные разными формами Сахаров, проявляли большую устойчивость к гипотермии, по сравнению с контрольными растениями, что проявлялось в меньшей интенсивности перекисного окисления липидов и более низком уровне выхода электролитов из клеток при разных режимах охлаждения.

4. Культивирование растений in vitro позволило выявить зависимость активности всех форм инвертаз, в том числе и кислой нерастворимой формы, а также степень аккумулирования Сахаров в клетках от содержания сахарозы в культуральной среде. Установлено, что на среде с 4% концентрацией сахарозы у обоих генотипов, и особенно у ВЗЗ-wv растений, формировалась наиболее высокая холодостойкость.

5. Показано, что при длительном охлаждении в условиях адаптирующих температур у контрольных и ВЗЗ-wv растений к третьим суткам происходило наибольшее увеличение активности инвертаз, главным образом кислых форм, и содержания Сахаров в виде сахарозы и глюкозы, которое коррелировало с повышением устойчивости растений к низкой положительной температуре, выраженной в большей степени у ВЗЗ-inv растений.

6. Более высокая холодостойкость ВЗЗ-inv растений подтверждена исследованиями ультраструктурной организации хлоропластов. Выявлено, что действие длительного охлаждения на растения, экспрессирующих ген инвертазы дрожжей, приводило к образованию более устойчивой к холоду, ксероморфной структуры и выражалось в редукции мембранных элементов хлоропластов, характерной для более холодостойких растений.

7. Совокупность полученных данных может служить убедительным доказательством важной роли инвертаз и особенно кислой нерастворимой формы в повышении содержания Сахаров, способствующих формированию устойчивости растений, относящихся к холодостойкому типу.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Многие произрастающие на Земле дикорастущие и культурные растения относятся к группе холодостойких видов, устойчивых к низким положительным температурам, но погибающим от образования льда при действии мороза. В эту группу входят хозяйственно важные растения, среди которых картофель, как продовольственная культура, занимает одно из первых мест. Однако механизм устойчивости холодостойких растений к гипотермии изучен в значительно меньшей мере, по сравнению с морозостойкими и теплолюбивыми растениями.

Известно, что формирование низкотемпературной устойчивости основано на реализации под влиянием гипотермии генетической программы адаптации растений, связанной с развитием комплекса защитных реакций, в числе которых существенное значение имеют, достаточно хорошо изученные для морозостойких растений, изменения в углеводном метаболизме. Это относится, прежде всего, к одному из ключевых ферментов - инвертазе, разным её типам, локализованным в различных клеточных компартментах и приводящих к изменению содержания и состава Сахаров. Применительно к холодостойким растениям доказательства важной роли Сахаров почти отсутствуют. Одной из причин недостаточного внимания к этой проблеме может быть тот факт, что у холодостойких растений, в отличие от морозостойких, при адаптации в условиях пониженных температур концентрация Сахаров в клетках изменяется в значительно меньшей степени. Другая причина, по-видимому, связана с отсутствием до недавнего времени методов прямого воздействия на углеводный метаболизм. Традиционные способы изменения содержания Сахаров и устойчивости путем закаливания низкими положительными температурами не достаточно эффективны, поскольку понижение температуры приводит к проявлению многих защитных реакций, в том числе и экспрессии не только генов белков углеводного метаболизма, но и белков холодового шока, существенно влияющих на формирование холодостойкости, что мешает однозначной интерпретации полученных результатов. В связи с этим в настоящей работе, наряду с традиционными, были использованы современные подходы и методы исследования.

Применение растений, трансформированных геном дрожжевой инвертазы, позволило изменить углеводный метаболизм без воздействия низкой температуры. Впервые экспериментально показано, что повышение содержания Сахаров за счет активации разных форм инвертаз приводило к значительному увеличению конститутивной устойчивости, что в представленной работе было подтверждено многими методами.

Благодаря использованию растений с введенным геном дрожжевой инвертазы апопластноЙ локализации, была выявлена важная роль кислой нерастворимой формы в повышении содержания сахарозы в листьях за счет торможения загрузки флоэмы. Этот процесс чрезвычайно важен для холодостойких растений, у которых, в отличие от морозостойких, стратегия адаптации направлена в основном на сохранение надземной части растений, в том числе и листьев. Полученные данные подтверждены и традиционными методами: как выращиванием растений картофеля на средах с повышенным содержанием сахарозы, так и их длительным закаливанием при пониженных температурах, при этом обнаружена способность растений картофеля развивать максимальную холодостойкость к третьим суткам адаптации. Таким образом, используя традиционные и современные методы исследования, продемонстрирована связь формирования устойчивости холодостойких растений с активацией инвертаз и накоплением Сахаров.

На основании полученных данных можно сделать следующие выводы.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сабельникова, Елена Павловна, 2007 год

1. Аверьянов А.А., Лапикова В.П. (1989) Взаимодействие Сахаров с гидроксильным радикалом в связи с фунгитоксичностью выделений листьев. Биохимия, 54, 10, 1646-1651.

2. Александров В.Я. (1985) Реактивность клеток и белки. Л.: Наука, 318 с. Астахова Н.В., Климов С.В., Трунова Т.И., Райхман Л.Д. (1991) Влияние холодового закаливания на ультраструктуру клеток озимой пшеницы. ДАН, 320, 1, 252-255.

3. Балагурова Н. И., Тихова М. А., Маркова Т. М. (1987) Электронно-микроскопическое исследование влияния низкой положительной температуры на палисадные клетки. Физиология растений, 34,3,612-617.

4. Балагурова Н.И., Дроздова С.Н., Тихова М.А., Сулимова Г.М. (1980) Влияние низких положительных и отрицательных температур на ультраструктуру клеток листьев картофеля. Бот. журн., 65, 8,1156-1161.

5. Барабой В. А. (1991) Механизмы стресса и перекисное окисление липидов. Успехи современной биологии. 111,6,923-931.

6. Белоус A.M., Бондаренко В.Н. (1982) Структурные изменения биологических мембран при охлаждении. Киев: Наукова думка, 225 с.

7. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. (1985) Перекисное окисление липидов мембран и природные антиксиданты. Успехи химии, LIV, 9,1540-1558.

8. Веселова Т.В., Веселовский В.А., Чернавский Д.С. (1993) Стресс у растений. М.: Изд-во Моск. ун-та., 144 с.

9. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. (1972) Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: изд-во Наука, 252 с.

10. Доспехов Б.А. (1977) Методика опытного дела. М.: Колос, 416 с.

11. Дубинина И.М. (1969) Инвертаза и её индуцирование в корневой системе сахарнойсвеклы. Физиология растений, 16,6, 981-987.

12. Дубинина И.М., Бураханова Е.А. (1971) О природе активации инвертазы впереживающих тканях. Физиология растений, 18, 5, 980-986.

13. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. (1984) Подавление активностиинвертазы в проводящих пучках сахарной свеклы как необходимое условие длятранспорта сахарозы. Физиология растений, 31,1,153-161.

14. Дубинина И.М., Бураханова Е.А., Кудрявцева Л.Ф. (1982) Регуляция активностиинвертазы в культурах изолированных тканей сахарной свеклы. Физиологиярастений, 29, 6, 1188-1195.

15. Ермаков Е. И., Полевой А. В. (1993) Изменение баланса эндогенных ИУК и АБК в корнях проростков кукурузы при прямом и опосредованном низкотемпературном стрессе. Докл. Росс. акад. с.-х. наук, 3, 16-19.

16. Жиров В.К., Мерзляк М.Н., Кузнецов Л.В. (1982) Перекисное окисление мембранных липидов холодостойких растений при повреждении отрицательными температурами. Физиология растений, 29, 6, 1045-1052.

17. Заботин А.И., Барышева Т.С., Заботина О.А., Ларская И.А., Лозовая В.В. (1995) Клеточная стенка растений и формирование гипотермического синдрома. Докл. РАН, 343, 567-570.

18. Заботина О.А, Аюпова Д.А, Ларская И.А, Николаева О.Г, Петровичева Г.А, Заботин А.И. (1998) Физиологически активные полисахариды, накапливающиеся в корнях озимой пшеницы в ходе низкотемпературной адаптации. Физиология растений, 45,262-267.

19. Зауралов О. А, Жидкин В. И. (1982) Влияние охлаждения на соотношение эндогенных регуляторов роста в растениях проса В сб: Растения и среда. Межвуз. сб. науч. тр. Саранск, с. 118-130.

20. Карасев Г.С, Нарлева Г.И, Боруах К.К, Трунова Т.И. (1991) Изменение состава и содержания полипептидов в процессе адаптации озимой пшеницы к низким отрицательным температурам. Физиология и биохимия культурных растений, 23, 5, 480.

21. Кириченко Е.Б. (1984) Физико-химические факторы экорезистентности растений в онтогенезе и филогенезе. Пущино: ОНТИ АН СССР, 19 с.

22. Колоша О.И. (1975) Физиологические основы морозостойкости озимых злаковых культур. В сб: Методы и приемы повышения зимостойкости озимых зерновых культур. М.: Колос, с. 294-306.

23. Колоша О.И., Костенко И.И. (1976) Морозостойкость озимых зерновых культур в связи с водным режимом и ходом метаболических процессов. В сб: Устойчивость растений к неблагоприятным температурным условиям среды. Киев: Наук. Думка, с. 5-19.

24. Колупаев Ю.Е., Борисенко Л.Р., Рябчун Н.И. (1993) Особенности проявления активности инвертазы в условиях гипотермии в связи с морозостойкостью озимых злаков. Физиол. и биохим. культ, раст, 25,4,378-393.

25. Колупаев Ю.Е., Трунова Т.И. (1994) Активность инвертазы и содержание углеводов в колеоптилях пшеницы при гипотермическом и солевом стрессах. Физиология растений, 41, 4, 552-557.

26. Колупаев Ю.Е., Трунова Т.И. (1992) Особенности метаболизма и защитные функции углеводов растений в условиях стрессов. Физиол. биохим. культ, раст., 24, 6, 523-533.

27. Кузнецов Вл. В., Кимпел Дж., Годжиян Дж., Ки Дж. (1987) Элементы неспецифичности генома растений при холодовом и тепловом стрессе. Физиология растений, 34, 5, 853-858.

28. Куркова Е.Б. (1970) Изменение ультраструктуры клеток различных по холодостойкости сортов огурцов. Физиология и биохимия культурных растений, 2, 4,385-389.

29. Лютге У., Хигинботам Н. (1984) Передвижение веществ в растениях. М.: Колос, 408 с.

30. Новицкая Г.В., Суворова Т.А. (1994) Изменение липидного состава мембранных фракций проростков озимой пшеницы при низкотемпературной адаптации. Физиология растений, 41, 539-545.

31. Опритов В.А., Худяков В.А., Пятыгин С.С. (1992) О роли жидкостности липидного матрикса плазмалеммы клеток высшего растения в модуляции активности Н5+0-АТФазы при различных формах умеренного холодового воздействия. Физиология растений, 39, 3, 533-540.

32. Пахомова В.М. (1992) Об адаптивном значении увеличения проницаемости мембран при обратимой альтерации клеток отсеченных корней. Физиология и биохимия культурных растений, 24, 6, 568.

33. Петрова О.В., Колоша О.И., Сухарева И.Б. (1984) Изменение в составе легкорастворимых белков озимой пшеницы при криоадаптации. Физиология и биохимия культурных растений, 16, 2, 166-170.

34. Попов В.Н. (2002) Сравнительное исследование низкотемпературной адаптации томата и огурца в связи с их углеводным метаболизмом. Дисс. канд. биол. наук, Москва, 115 с.

35. Приходько Н.В. (1977) Изменение проницаемости клеточных мембран как общее звено механизмов неспецифической реакции растений на внешние воздействия. Физиол. и биохим. культ, раст., 9, 3, 301-309.

36. Романов Г.А. (2000) Генетическая инженерия растений и пути решения проблемы биобезопасности. Физиология растений, 47, 3,343-353.

37. Савич И.М., Таджибаева Т. Л. (1988) Влияние холодового стресса на изопероксидазы проростков кукурузы и пшеницы, различающихся по изоэлектрическим точкая. Физиология растений, 35, 5, 841-847.

38. Трунова Т.И. (1984) Физиологические и биохимические основы адаптации растений к морозу. С-х. биология, 6, 3-10.

39. Хочачка П., Сомеро Дж. (1977) Стратегия биохимической адаптации. М. Мир, 400 с.

40. Худяков В.А., Гнездилов А.В., Яркова О.Ю. (1986) Термоиндуцированные структурные переходы в плазматических мембранах растений различной холодоустойчивости. В сб.: Биоэлектрогенез и транспорт веществ у растений. Горький, Изд-во Горьк. Ун-та, с. 58-61.

41. Шеяхметова И.Ш. (1987) Адаптационные изменения липидов при формировании морозостойкости озимой пшеницы и влияние света на этот процесс. Автореф. дисс. канд. биол. наук, Москва, с. 14.

42. Эйдус Л.Х. (1977) Неспецифическая реакция клеток и радиочувствительность. М.: Агропромиздат, 151 с.

43. Alia, Hayashi H., Sakamoto A., Murata N. (1998) Enhancement of the tolerance of Arabidopsis to high temperatures by genetic engineering of the synthesis of glycinebetaine. Plant J., 16, 155.

44. Bartolozzi F., Mencuccini M., Fontanazza G. (2001) Enhancement of frost tolerance in olive shoots in vitro by cold acclimation and sucrose increase in the culture medium. Plant Cell, tissue and organ culture, 67, 299-302.

45. Benhamou N., Grenier J., Chrispeels M. (1991) Accumulation of ^-fructosidase in the cell walls of tomato roots following infection by a fungal wilt pathogen. Plant Physiology, 97, 739-750.

46. Berberich Т., Kusano T. (1997) Cycloheximide induces a subset of low temperature inducible genes in maize. Molecular & General Genetics, 254, 3,275-283.

47. Beruter J. (1985) Sugar accumulation and changes in the activities of related enzymesduring development of apple fruit. J. Plant Physiol, 121, 331-341.

48. Billett E.E, Billett M.A. and Burnett J.H. (1977) Stimulation of maize invertase activityfollowing infection by Ustilago maydis. Phytochemistry, 16, 1163-1166.

49. Bournay A, Hedley P, Maddison A, Waugh R, Machray G. (1996) Exon skippinginduced by cold stress in a potato invertase gene transcript. Nucleic Acids Research, 24,2347-2351.

50. Bracho G, Whitaker J. (1990) Purification and partial characterization of potato (Solanum tuberosum) invertase and its endogenous proteinaceous inhibitor. Plant Physiology, 92, 386-394.

51. Brunner M, Kocsy G, Ruegsegger A, Schmutz D, Brunold C. (1995) Effect of chilling on assimilatory sulfate reduction and glutathione synthesis in maize. J. Plant Physiol., 146, 5-6, 743-747.

52. Cabane M, Calvet P, Vincens P, Boudet A. M. (1993) Characterization of chilling acclimation-related proteins in soybean and identification of one as a member of the heat-shock protein (HSP-70) family. Planta, 190, 3, 346-353.

53. Caffery M., Tonseca V, Leopold A.C. (1988) Lipid-sugar interactions Reveauce to anhydrous biology. Plant Physiol., 3, 754-758.

54. Calderon P, Pontic N.G. (1985) Increase of sucrose Synthase activity in wheat plante after a chilling shoch. Plant Sci., 42, 3, 173-176.

55. Carlson M. (1987) Regulation of sugar utilization in Saccharomyces species. Journal of Bacteriology, 169, 4873-4877.

56. Chen H.H., Li P.H., Brenner M.L. (1983) Involument of abscisic acid in potato cold acclimation. Plant Physiol., 71,2,362-365.

57. Chen J., Black C. (1992) Biochemical and immunological properties of alkaline invertase isolated from sprouting soybean hypocotyls. Archives of Biochemistry and Biophysics, 295,61-69.

58. Chen Z-Q., Xu C-H., Chen M-Y., Xu L.W., Ke-Bin L.S.-Q., Kuang T-Y. (1994) Effect of cold hardening on thylakoide membrane lipids and proteins of spring wheat and winter wheat. Acta Bot. Sinica., 36,6,423-429.

59. Cheng W., Taliercio E., Chourey P. (1996) The Miniature 1 seed locus of maize encodes a cell-wall invertase required or normal development of endosperm and maternal cells in the pedicel. The Plant Cell, 8, 971-983.

60. Crawford R. M. M., Huxter T. J. (1977) Root growth and carbohydrate metabolism at low temperatures. J. Exp. Bot., 28, 105, 917-925.

61. Crespi M.D., Zabaleta E.J., Pontis H.G., Salerno G.L. (1991) Sucrose synthase expression during cold acclimation in wheat. Plant Physiol., 96, 3, 887-891. Czapski G. (1984) On the use of *OH scavengers in biological systems. Israel J. Chem., 24,1,29-32.

62. Darley C. P., Davies J. M., Sanders D. (1995) Chill-induced changes in the activity and abundance of the vacuolar proton-pumping pyrophosphatase from mung bean hyrocotyls. Plant Physiol., 109, 2, 659-665.

63. Delaney T.P. (1997) Genetic Dissection of Acquired Resistance to Disease. Plant Physiol., 113, 5-12.

64. Dochlert D.C., Felker F.C. (1987) Characterisation and distribution of invertase activity in developing maise kernels. Physiologia Plantarum, 70, 51-57.

65. Ebrahim M. К. Н., Vogg G., Osman M. N. E. H., Komor E. (1998) Photosynthetic performance and adaptation of sugarcane at suboptimal temperatures. J. Plant Physiol., 153, 5-6, 587-592.

66. Eschrich W., Eschrich B. (1992) Control of phloem unloading by source activities and light. Plant Physiology and Biochemistry, 25, 625-634.

67. Fleischmacher O.L., Prado F.E., Sampietro A.R. (1980) Cell wall invertases from apex and callus tissues. Plant Cell Physiol., 21, 7, 1273-1281.

68. Goupil P., Croisille Y., Croisille E. and Ledoigt G. (1988) Jerusalem artichoke invertases-immunocharacterization of a soluble form and its putative precursors. Plant Science, 54, 45-54.

69. Greenland A.J., Lewis D.H. (1981) The acid invertases of the developing third leaf ofoat. 11. Changes in the activities of soluble isoinzymes. New Phytol., 88,2,279-288.

70. Grout B.W., Millam S. (1985) Photosynthetic Development of Micropropagated

71. Strawberry Plantlets Following Transplanting. Annals Bot., 55,1,129.

72. Guo J-Q., Yang Y-Z., Chen W-T. (1994) Protective effect of exogenous cholesterol onrice seedling during chilling injury. Acta Bot.Sinica., 36 (Suppl), 203-206.

73. Guy C. Huber J.L.A., Huber S.C. (1992) Sucrosephosphate synthase and sucroseacclimation at low temperature. Plant Physiol., 100, 1, 502-508.

74. Guy C. L. (1990) Cold acclimation and freezing stress tolerance: role of proteinmetabolism. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol., 41, 187-223.

75. Hakam N., Simon J.P. (1996) Effect of low temperatures on the activity of oxygenscavenging enzymes in two populations of the C-4 grass Echinochloa crusgalli (L.).

76. Physiologia Plantarum, 91,2,209-216.

77. Hamilton E.W., Heckathorn S.A. (2001) Mitochondrial Adaptations to NaCl. Complex I Is Protected by Anti-Oxidants and Small Heat Shock Proteins, Whereas Complex II Is Protected by Proline and Betaine. Plant Physiol., 126, 1266.

78. Hodges D.M., Andrews C.J., Johnson D.A., Hamilton R.I. (1997) Antioxidant enzyme responses to chilling stress in differentially sensitive inbred maize lines. Journal of Experimental Botany, 48, 310, 1105-1113.

79. Hodgson R.A.J., Raison J.K. (1991) Lipid peroxidation and superoxide dismutase activity in relation to photoinhibition induced by chilling in moderate light. Planta., 185, 2,215-219.

80. Hong J. H., Gross К. C. (2000) Involvement of ethylene in development of chilling injury in fresh-cut tomato slices during cold-storage. J. Amer. Soc. Hortic. Sci., 125, 6, 736-741.

81. Jaynes Т.A., Nelson O.E. (1971) An invertase inactivator in maize endosperm and factors effecting inactivation. Plant Physiology, 47,629-634.

82. Johnson I.R., Thornley J. H.M. (1985) Temperature dependence of plant and crop processes. Ann. Botany., 55, 1, 1-24.

83. Jones R.A., Kaufman P.B. (1975) Multiples forms of invertase in developing oat internodes. Plant, physiol., 55, 114-119.

84. Jones T. L., Turcker D. E., Ort D. R. (1998) Chilling delays circadian pattern of sucrose phosphate synthase and nitrate reductase activity in tomato. Plant Physiol., 118, 1, 149158.

85. Jouve L., Engelmann F., Noirot M., Charrier A. (1993) Evaluation of biochemical markers (sugar, prolin, malonedialdehyde and ethylene) for cold sensitivity in microcuttings of two coffee species. Plant Sci., 91,1, 109-116.

86. Kallarakal J., Komor E. (1989) Transport of Hexoses by the Phloem of Ricinus communis L. Seedling. Planta., 177, 336-341.

87. Klimov S.V., Astakhova N.V., Trunova T.I. (1999) Changes in photosynthesis, dark respiration rates and photosynthesis carbon partitioning in winter rye and wheat seedlings during cold hardening. J. Plant Physiol., 155, 6, 734-739.

88. Klimov S.V., Trunova T.I. (1999) An increased ratio of photosynthesis to respiration at low temperatures is a prerequisite for cold hardening of winter cereals. In: Morozoodpornose. Ed. By T. Holubowicz. Poznan, pp. 61-67.

89. Koike S., Satake T. (1987) Sterility caused by cooling treatment at the flowering stage inrice plants. II. The abnormal digestion of starch in pollen grain and metabolic changes inanthers following cooling treatment. Jap. J. Crop Sci., 56, 4, 666-672.

90. Konstantinova Т., Parvanova D., Atanasson A., Djilianov D. (2002) Freezing toleranttobacco, transformed to accumulate osmoprotectants. Plant Sci., 163,157.

91. Koster K.L., Lynch D.V. (1992) Solute accumulation and compartmentation during thecold acclimation of Puma rye. Plant Physiol., 98, 1, 108-113.

92. Kotyk A., Janacek K., Koruta J. (1988) Biophysical chemistry of membrane functions. Chichester etc.: J. Wiley and Sons, pp. 377.

93. Kratsch H. A., Wise R. R. (2000) The ultrastructure of chilling stress. Plant Cell Environm., 23, 4, 337-350.

94. Maciejewska U., Kacperska A. (1987) Changes in the level of oxidized and reduced pyridine nucleotides during cold acclimation of winter rape plants. Physiol. Plant., 69, 4, 687-691.

95. Markowski A., Augustyniak G., Janowiak F. (1990) Sensitivity of different species of field crops to chilling temperature. III. ATP content and electrolyte leakage from seedlings leaves. Actaphysiol. plantarum., 12, 2, 167-173.

96. Massacci A., Jannelli M.A., Pietrini F., Loreto F. (1995) The effect of growth at low temperature on photosynthetic characteristics and mechanism of photoprotection of maize leaves. J.Exptl. Botany., 46, 282, 119-127.

97. Masuda H., Ozeki Y., Amino S., Komamine A. (1984) Changes in Cell Wall Polysaccharides during Elongation in a 2,4-D Free Medium in a Carrot Suspension Culture. Physiol. Plantarum., 62, 65-72.

98. Matsuo Т., Graham D., Patterson B. D., Hockley D. B. (1994) An electrophoretic method to detect cold-induced dissociation of proteins in crude extracts of higher plants. Anal. Biochemistry, 223, 2, 181-184.

99. Matsushita K., Uritani I. (1976) Isolation and characterization of acid invertase inhibitor from sweet potato. Journal of Biochemistry, 79, 633-639.

100. Matsushita К, Uritani S. (1977) Synthesis and apparent turnover of acid invertase in relation to invertase inhibitor in wounder sweet potato root tissue. Plant Physiol., 59, 5, 879-883.

101. Maynard J.W, Lucas W.J. (1982) Sucrose and Glucose Uptake into Beta Vulgaris Leaf

102. Tissues. A Case for General Retrieval Systems. Plant Physiol., 70, 1436-1443.

103. Mazliak P. (1977) Glyco- and phospholipids of biomembranes in higher plants. In: Lipidsand lipid polymers in higher plants. Berlin etc.: Springer Verlag, pp. 48-77.

104. Mercado J. A, Reid M. S, Valpuesta V, Quesada M. A. (1997) Metabolic changes andsusceptibility to chilling stress in Capsicum annuum plants grown at suboptimaltemperature. Austral. J. Plant Physiol., 107, 2, 166-173.

105. Miller W. B, Ranwala A.P. (1994) Characterization and localization of three soluble invertase forms from Lilium longiflorum flower buds. Physiologia Plantarum., 92, 247253.

106. Ming Gong, Arnold H. van der Luit, Marc R. Knight, and Anthony J. (1998) Trewavas. Heat-Shock-Induced Changes in Intracellular Ca Level in Tobacco Seedlings in Relation to Thermotolerance. Plant Physiol., 116,429-437.

107. Minorsky P.V. (1985) An heuristic hypothesis of chilling injuri in plants: a role for calcium as the primary physiological transducer of injuri. Plant Cell Environm., 8, 2, 7594.

108. Morris L.L. (1982) Chilling injury of horticultural crops: An overview. Hort Sci., 17, 2, 161-162.

109. Munro S, Perham H.R.B. (1985) Nature, 317, 377.

110. Murashige T, Skoog F. (1962) A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15, 473-497.

111. Murelli C, Rizza F., Albini F.M., Dulio A, Terzi V„ Cattivelli L. (1995) Metabolic changes associated with cold-acclimation in contrasting cultivars of barley. Physiol. Plantarum, 94, 1, 87-93.

112. Nelson C.J., Smith D. (1986) Fructans: their nature and occurrence. Current Top. Plant Biochem. Physiol., 5, 1.

113. Olien C.R. (1984) An adaptive response of rye to freezing. Crop Sci., 24,1, 51-54. Olien C.R., Lester C.E. (1985) Freezing-induced changes in soluble carbohydrates of rye. Ibid., 25, 2, 288-290.

114. Palta J.P., Whitaker B.D., Weiss L.S, (1993) Plasma membrane lipids associated with genetic variability in freezing tolerance and cold acclimation of Solanum species. Plant Physiol., 103,3, 793-803.

115. Pardka S., Jmram H. (1987) Correlated changes in carbohydrate levels and associated enzyme activities during development and senescence of ray florits in Chrysanthemum. Proc. Indian. Acad. Sci. (Plant Sci), 97, 377-384.

116. Parr D.R., Edelman J., Hawker J.S. (1976) Growth and sucrose metabolism of carrot callus strains with normal and low acid invertase activity. Physiol. Plantarum, 37, 223228.

117. Peschke J., Riegler J., Mohwald H. (1987) Quantitative analysis of membrane distortions induced by mismatch of protein and lipid hydrophobic thickness. Eur.Biophys. J., 14, 7, 385-391.

118. Pilon-Smits E.A.H., Ebskamp M.J.M., Paul M.J., Jeuken M.J.W., Weisbeek P.J., Smeekens S.C.M. (1995) Improved Performance of Transgenic Fructan-Accumulating Tobacco under Drought Stress. Plant Physiol., 107, 125.

119. Platt-Aloia К. (1988) Physiological regulation of membrane fluidity. Alan. R. Lice, Ink., 259-271.

120. Poovaiah B.W., Reddy A.S.N. (1987) Calcium messenger system in plants. Crit. Rev. Plant. Sci., 6, 1,47-103.

121. Pressey R. (1966) Separation and properties of potato invertase and invertase inhibitor.

122. Archives of Biochemistry and Biophysics, 113, 667-674.

123. Pressey R., Shew R. (1966) Effect of temperature on invertase, invertase inhibitor and sugar in potato tuber. Plant Physiology, 41, 10, 1657-1661.

124. Pryor W.A., Start W., Rock C.L. (2000) Beta carotene: from biochemistry to clinical trials. Nutr. Rev., 58, 1, 39.

125. Purvis A.C., Rice J.D. (1983) Low temperature induction of invertase activity in Grapefruit flavedo tissue. Phytochemistry, 22,4, 831-834.

126. Quinn P.J. (1989) Effect of sugar on the phase behaviour of phospholipid model membranes. Biochem. Soc. Transactions., 17, 6, 957-960.

127. Rausch Т., Greiner S. (2004) Plant Protein Inhibitors of Invertases. Biochimica et Biophysica Acta, 1696 , 253-261.

128. Ricardo C. (1974) Alkaline /?-fructosidases of tuberous roots; possible physiological function. Planta, 118, 333-343.

129. Ricardo C.P.P., Rees T. (1970) Invertase activity during the development of carrot roots. Phytochemistry, 9, 239-247.

130. Richter C. Gogvadze V., Laffran chi R., Schlapbach R., Schweizer M., Suter M., Walter P., Yaffee M. (1995) Oxidants in mitochondria:from physiology to disease. BBA, 1271, 67-74.

131. Ristic Z., Salzman R., Ashworth E.N., Bordelon B. (1993) Changes in lipid metabolism in the leaf tissue of Arabidopsis thaliana during rapid cold acclimation. Plant Physiol. (Suppl.), 102, 1,92.

132. Roberts D.W.A. (1975) The invertase complement of cold-hardly and cold sensitive wheat leaves. Can. J. Bot., 53, 1333-1337.

133. Roberts D.W.A. (1982) Changes in the of invertase daring the development of uheat leaves graving inder cold-hardening and nonhardening conditions. Canad, J. Bot., 60, 1, 1-6.

134. Roberts D.W.A. (1976) A method for separeting the verios forms of invertase in extractsof single leaves of plante of wheat. Canad. J. Bot., 54, 13,1509-1511.

135. Roitsch Т., Biyner M., and Godt D.E. (1995) Induction of apoplastic invertase of

136. Chenopodiwn rubrum by D-glucose and a glucose analog and tissue-specific expressionsuggest a role in sink-source regulation. Plant Physiology, 108,285-294.

137. Roitsch T. and Gonzalez M-C. (2004) Function and regulation of plant invertases: sweetsensation. Trends Plant Sci., 9, 12, 606-613.

138. Roitsch Т., Balibrea M.E., Hofmann M„ Proels R., Sinha A.K. (2003) Extracellular invertase: key metabolic inzime and PR protein. Journal of Experimental Botany, 54, 513-524.

139. Rorem E., Schwimmer S. (1963) Double pH optima of potato invertase. Experientia, 19, 150-151.

140. Rosha-Sosa M., Sonnewald U., Frommer W., Stratmann M., Schell J., Willmeitzer L. (1989) Both Developmental and Metabolic Signals Activate the Promoter of a Class I Patatin Gene. EMBO J., 8, 23-29.

141. Rybka Z. (1995) Estimation of energy expenditure in wheat crowns during acclimation tofrost using metabolic inhibitors. Acta Physiol. Plantarum, 17, 1, 31-36.

142. Sacher J.A., Hatch M.D., Glasziou K.T. (1963) Regulation of invertase synthesis in sugarcane by auxin and sugar-mediated control system. Physiol. Plant., 16, 836-842.

143. Sairam R.K., Spirastava G.C. (2000) Induction of oxidative stress and antioxidantactivity by hydrogen peroxide treatment and susceptible wheat genotypes. Biol1. Plantarum, 43, 381-386.

144. Salanoubat M., Dtlliard G. (1989) The steady-state level of potato sucrose synthase mRNA is dependent on wounding, anaerobiosis and sucrose concentration. Ibid., 84, 181-185.

145. Sampietro A., Vattuone M., Prado F. (1980) A regulatory invertase from sugar cane leaf-sheaths. Phytochemistry, 19, 1637-1642.

146. Sasaki Т., Todokoro K., Suzuki S. Multiple forms of invertase of potato tuber storage at low temperature. Phytochemistry, 10, 2047-2050.

147. Sauter J.J. (1988) Seasonal changes in the efflux of sugar from parenchyma cells into the apoplast in popular stem. Trees., 2, 4, 242-249.

148. Savitch L.V., Harhey Т., Huner N.P.A. (2000) Sucrose metabolism in spring and winter wheat in response to high irradiance, cold stress and cold acclimation. Physiol. Plantarum, 108, 3,270-278.

149. Schmulling Т., Schell J., Spena A. (1988) Single enes from Agrobacterium rhizogenes Influence Plant Development. EMBOJ., 7,2621-2629.

150. Schneider J. C., Nielsen E., Somerville C. (1995) A chilling-sensitive mutant of Arabidopsis is deficient in chloroplast protein accumulation at low temperature. Plant Cell Environm., 18, 1, 23-31.

151. Schwimmer S., Makower R., Rorem E. (1961) Invertase and invertase inhibitor in potato. Plant Physiology, 36, 313-316.

152. Serrano M., Pretel M. Т., Martinez-Madrid M. C., Romojaro F„ Riquelme F. (1998) C02 treatment of Zucchini squash reduces chilling-induced physiological changes. J. Agr. Food Chem., 46, 7, 2465-2468.

153. Shearman L.L., Olien C.R., Marchetti B.L., Everson E.H. (1973) Characterization offreezing inhibitors from winter wheat cultivars. Crop. Sci., 13, 514-519.

154. Simon E.W. (1974) Phospholipids and plant membrane permeability. New Phytol, 73, 3,377.420.

155. Singh J., Laroche A. (1988) Freezing tolerance in plants: a biochemical overview. Biochem. And Cell Biol., 66, 6, 650-657.

156. Sonnewald U., Brauer M., von Schaeven A., Stitt M., Willmitzer L. (1991) Transgenic Tobacco Plants Expressing Yeast-derived Invertase in Either the Cytosol, Vacuole or

157. Apoplast: a Powerful Tool for Studying Sucrose Metabolism and Sink/Sourse Interactions. Plant J., 1, 96-106.

158. Sonnewald U., Hajlrezaei M.-R., Kossmann J. Heyer A., Thethewey R.N., Willmitzer L. (1997) Increased Potato Tuber Size Resulting from Apoplastic Expression of a Yeast Invertase. Nature Biotechnol., 16, 794-797.

159. Stanzer M., Sjolund R.D., Komor E. (1988) Transport of Glucose, Fructose and Sucrose by Steptanthus tortuosus Suspension Cells. 1. Uptake at Low Sugar Concentration. Planta, 53, 6, 270.

160. Steponkus P.L. (1984) Role of the plasma membrane in freezing injury and cold acclimation. Annu. Rev. Plant. Physiol., 35, 543-584.

161. Sturm A., Chrispeels M. (1990) cDNA cloning of carrot extracellular /?-fructosidase and its expression in response to wounding and bacterial infection. The Plant Cell, 2, 11071119.

162. Suzuki Т., Kaneko M., Harada T. (1997) Increase in freezing resistance of excised shoot tips of Asparagus officinalis L by preculture on sugar-rich media. Cryobiology, 34, 3, 264-275

163. Tymowska-Lalanne Z, Kreis M. (1998) The plant Invertases: Physiology, Biochemistry and Molecular Biology. Adv. Bot. Res., 28, 71-117.

164. Uemura M, Steponkus P.L. (1998) Alterations in the incidence of freeze-induced lesions of arabidopsis protoplast by artificial manipulation of intracellular sugar content. Plant Cell. Physiol., 39 (Suppl.), 140.

165. Uemura M, Steponkus P.L. (1989) Effect of cold acclimation on the incidence of two forms of freezing injury in protoplasts isolated from rye leaves. Plant Physiol., 91, 3, 1131-1137.

166. Uemura M, Steponkus P.L. (1997) Effect of cold acclimation on the lipid composition of the inner and outer membran of the chloroplast envelope isolated from rye leaves. Plant Physiol, 114, 1493-1499.

167. Vereshchagin A.G, Trunova T.I, Shayakhmetova I.S, Tsydendambaev V.D. (1990) On the role of cell membrane lipids in cold hardening of winter wheat leaves and crowns. Plant Physiol. Biochem., 28, 5, 623-630.

168. Weil M. and Rausch T. (1990) Cell wall invertase in tobacco crown gall cells. Plant Physiolog, 94, 1575-1581.

169. Weiss L.S., Whitaker B.D., Palta J.P. (1993) Temporal changes in plasma membrane lipids during cold acclimation of potato species differing in acclimation capacity. Plant Physiol. (Suppl.), 102, 1, 84.

170. Wu L.L., Song I., Kim D., Kaufman P.B. (1993) Molekular basis of the increase in invertase activity elicited by gravistimulation of oat-shoot pulvini. Plant. Physiol., 142, 179-183.