Роль туберина в регуляции аутофагии на примере туберозного склероза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Пархитько, Андрей Александрович

• Пархитько, Андрей Александрович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пархитько, Андрей Александрович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Аутофагия: механизмы, регуляция и участие в поддержании 15 клеточного гомеостаза

1.1.1. Молекулярные механизмы образования аутофагосом

1.1.2. Молекулярные механизмы регуляции аутофагии

1.1.3. Роль аутофагии в поддержании клеточного гомеостаза

1.1.3.1. Роль аутофагии в развитии и дифференцировке

1.1.3.2. Роль аутофагии в селективной деградации митохондрий 22 (митофагия)

1.1.3.3. Роль аутофагии в регуляции метаболизма

1.1.3.4. Роль аутофагии в регуляции иммунитета

1.2. Методы определения активности аутофагии

1.2.1. Электронная микроскопия

1.2.2. Анализ деградации долгоживущих белков

1.2.3. Мечение аутофагических вакуолей монодансилкадаверином

1.2.4. Определение внутриклеточной локализации белка ЬСЗ

1.2.5. Деградация специфических для аутофагии субстратов

1.3. Роль аутофагии в развитии опухолей

1.3.1. Сигнальный путь Т8С/Ш1еЬ/тТСЖС

1.3.2. Общие представления о супрессорах опухолевого роста 33 туберине и гамартине

1.3.3. Кин азный комплекс тТОЯС

1.3.4. Неканонические функции туберин/гамартинового комплекса

1.3.4.1. Неканонические функции туберин/гамартинового 42 комплекса, связанные с центросомами

1.3.4.2. Неканонические функции туберин/гамартинового 43 комплекса, связанные с транспортом, секрецией и активацией сигнальных каскадов через плазматическую мембрану

1.3.4.3. Неканонические функции туберин/гамартинового 44 комплекса, связанные с регуляцией актинового цитоскелета

1.3.5. Рабин-8 - новый регулятор киназного комплекса тТОЯС

1.4. Туберозный склероз как модель для изучения роли аутофагии в 46 развитии опухолей

1.4.1. Туберозный склероз: характеристика, клинические проявления и лечение

1.4.2. Животные модели туберозного склероза

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Материалы

2.1.1. Реагенты

2.1.2. Клеточные линии

2.2. Методы работы с клеточными культурами

2.2.1. Трансфекция

2.2.2. Получение лентивирусных частиц и инфекция

2.2.3. Иммуноблоттинг

2.2.4. Коиммунопреципитация

2.2.5. Измерение уровня АТР

2.2.6. Измерение дыхательной активности митохондрий

2.2.7. Определение количества мертвых клеток с использованием 56 иодида пропидия

2.3. Методы работы с мышами

2.3.1. Мыши, гетерозиготные по генам Tsc2 и Beclinl

2.3.2. Образование подкожных опухолей в иммунодефицитных 58 мышах

2.3.3. Подсчет макроскопических опухолей на поверхности почек

2.3.4. Гистохимическое окрашивание

2.4. Методы измерения активности аутофагии 59 2.4.1. Трансмиссионная электронная микроскопия

2.5. Статистический анализ 60 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 61 3.1. Регуляция аутофагии туберин/гамартиновым комплексом

3.1.1. Инактивация туберин/гамартинового комплекса ингибирует 61 аутофагию

3.1.2. Регуляция аутофагии туберин/гамартиновым комплексом происходит через регуляцию mTORCl

3.1.3. Регуляция аутофагии туберин/гамартиновым комплексом в 68 условиях стресса

3.1.4. Опухолевые клетки с инактивированным геном TSC2 71 характеризуются снижением уровня аутофагии по сравнению с окружающими нормальными клетками

3.2. Влияние аутофагии на биоэнергетические функции, активацию 72 апоптоза и опухолевый рост в клетках с инактивированным геном Tsc

3.2.1. Инактивация гена Atg5 в клетках с инактивированным геном 72 Tsc2 приводит к дальнейшему снижению уровня аутофагии, ингибированию синтеза ATP, активации апоптоза в условиях стресса, а также к массовой клеточной гибели и образованию некротических зон при росте подкожных опухолей в иммунодефицитных мышах.

3.2.2. Инактивация одного аллеля гена Beclinl приводит к 79 снижению уровня образования цистаденом в мышах, гетерозиготных по гену Tsc

3.2.3. Фармакологическое ингибирование аутофагии с 83 использованием хлорохина замедляет рост подкожных опухолей с инактивацией гена Tsc2 и развитие цистаденом в мышах, гетерозиготных по гену Tsc

3.3. Совместное влияние киназного комплекса mTORCl и 86 аутофагии на окислительную функцию митохондрий, синтез АТР и опухолевый рост.

3.4. Рабин-8 - новый белок, связывающийся с ГТФ-азой Rheb и 91 регулирующий активность киназного комплекса mTORC

3.4.1. Рабин-8 снижает активность киназного комплекса mTORCl

3.4.2. Коиммунопреципитация белков рабин-8, Rheb и mTOR

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль туберина в регуляции аутофагии на примере туберозного склероза»

Непрерывное обновление содержимого эукариоти ческой клетки происходит в результате точно сбалансированной работы процессов синтеза и деградации. Процесс деградации белка - консервативный клеточный процесс, который обеспечивает повторное использование аминокислот, а также осуществляет контроль качества внутриклеточных белков. В клетке существует две основные системы, которые участвуют в деградации белков - протеосомная и лизосомальная [1; 2]. В то время как протеосомная система осуществляет деградацию, в основном, короткоживущих белков и участвует в регуляции клеточных сигнальных систем, лизосомальная система является основным механизмом клеточной деградации долгоживущих внутриклеточных компонентов: белков, жировых накоплений, белковых агрегатов, органелл и т.д. Существует несколько основных способов доставки внутриклеточных компонентов в лизосомы, таких как макроаутофагия, микроаутофагия и шаперон-опосредованная аутофагия, при этом макроаутофагия (в дальнейшем -аутофагия, от греческого cinto - само и phagos - поедать) является основным процессом, участвующим в доставке макромолекул и органелл в лизосомы. В процессе аутофагии участки цитоплазмы и дефектные органеллы окружаются мембранами, образуя органеллы, называемые аутофагосомами. Последние впоследствии сливаются с лизосомами, где происходит их деградация [2; 3; 4].

В последнее время было идентифицировано множество генов, участвующих в регуляции различных стадий аутофагии (Autophagyrelated genes, или Atg). В частности, инактивация генов Atg5 и Beclinl (Atgó) приводит к полному прекращению аутофагии в клетке [5; 6].

В настоящее время накоплено множество данных о связи аутофагии с развитием различных заболеваний. Особый интерес представляют сведения об участии аутофагии в развитии опухолевых заболеваний, согласно которым в зависимости от типа опухоли, микроокружения и уровня малигнизации аутофагия может как замедлять, так и способствовать развитию опухолей [7; 8; 9]. Поскольку для большинства онкологических заболеваний в настоящее время не существует эффективных способов лечения, открывается возможность найти мишени для терапевтического воздействия на опухоль среди компонентов системы клеточной деградации [10; 11; 12; 13].

Онкологические заболевания - это комплексные полигенные заболевания; в развитие которых вовлечено множество различных сигнальных каскадов, регулирующих клеточную дифференцировку, пролиферацию и выживаемость [14; 15]. Абсолютное большинство опухолевых заболеваний характеризуется активацией сигнального пути PI3K7Akt/mTORCl. Результатом активации данного сигнального пути является активация киназного комплекса mTORCl, высококонсервативной серин/треониновой протеинкиназы, регулирующей процессы белкового синтеза, транскрипции, клеточного деления, апоптоза и метаболизма [16]. Привлекательной генетической моделью для изучения роли киназного комплекса mTORCl в регуляции опухолевого роста служит заболевание туберозный склероз (ТС), возникающее в результате инактивирующих мутаций в генах TSC1 или TSC2. Продукты генов TSC1 и TSC2, гамартин и туберин, соответственно, образуют гетеродимер, который, при наличии ростовых факторов, глюкозы, кислорода и аминокислот фосфорилируется и инактивируется, в результате чего происходит активация киназного комплекса mTORCl [17; 18]. Соответственно, мутации в генах TSC1 или TSC2 приводят к постоянной и неконтролируемой активации киназного комплекса mTORCl и как следствие к активации клеточной пролиферации и процессов анаболизма. Привлекательность модели ТС для изучения роли киназного комплекса mTORCl и аутофагии в развитии опухолей определяется тем, что при инактивации гена TSC2 происходит активация комплекса mTORCl без активации множества других сигнальных путей, которые регулируются другими участниками каскада PI3K/Akt/mTORCl.

Настоящая работа посвящена исследованию молекулярных механизмов регуляции аутофагии при инактивации гена TSC2, а также изучению роли аутофагии в регуляции биоэнергетических функций клеток с инактивированным геном TSC2, их способности к опухолевому росту и регрессии в результате инактивации генов, необходимых для осуществления аутофагии. В работе также описана ранее неизвестная функция белка рабин-8 в регуляции киназного комплекса mTORC 1.

Целью диссертационной работы являлся комплексный анализ молекулярных механизмов регуляции аутофагии супрессором опухолевого роста туберином, а также изучение роли аутофагии в регуляции биоэнергетических функций клеток в норме и при развитии опухолей на различных генетических моделях.

В связи с вышеуказанной целью ставились следующие задачи:

1. Исследовать влияние гена TSC2 на процесс аутофагии.

2. Проанализировать, зависит ли регуляция активности аутофагии от активности киназного комплекса mTORCl.

3. Изучить влияние аутофагии на биоэнергетические функции клеток с инактивированным геном TSC2, на активацию процессов их клеточной смерти, а также на их способность к опухолевому росту.

4. Проанализировать возможность использования модуляторов аутофагии для лечения опухолей с инактивированным геном TSC2 в качестве самостоятельных агентов или в комбинации с противоопухолевыми агентами, используемыми в настоящее время.

5. Изучить влияние белка рабин-8 на регуляцию активности киназного комплекса mTORCl.

Научная новизна работы. В ходе работы впервые прямо продемонстрирована возможность регуляции аутофагии геном супрессором опухолевого роста Tsc2; показано, что регуляция аутофагии туберином происходит через регуляцию киназного комплекса mTORCl. Показано влияние дальнейшего ингибирования аутофагии на различные аспекты жизнедеятельности клеток с инактивированным геном Tsc2, такие как активность митохондрий, синтез АТР и возможность активации клеточной смерти. Впервые было показано, что гены Atg5 и Beclinl необходимы для опухолевого роста, вызванного инактивацией гена Tsc2. Также описано ранее неизвестное участие белка рабин-8 в регуляции киназного комплекса mTORCl.

Практическая значимость диссертации. При отсутствии эффективных терапевтических средств для лечения опухолевых заболеваний и, в частности, ТС, в настоящее время активно ведется поиск и изучение различных процессов, вовлеченных в развитие опухолей. В данной работе установлено, что нормальное функционирование аутофагии необходимо для развития опухолей при ТС. Показано, что использование ингибиторов аутофагии замедляет рост опухолей при ТС и, в комбинации с ингибиторами киназного комплекса mTORCl, усиливает регрессию опухолей. Таким образом, полученные данные позволяют говорить о потенциальной возможности использования ингибиторов аутофагии в качестве терапевтических агентов для лечения ТС.

Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно выполнен основной объем исследований, проведены обработка и анализ полученных экспериментальных данных, сформулированы основные положения диссертации, составляющие ее новизну и практическую значимость, а также подготовлены материалы публикаций в научных журналах. Подготовка образцов для трансмиссионной электронной микроскопии и их анализ выполнены при участии М. Jarnik (Fox Chase Cancer Center, Филедельфия, США). Анализ дыхательной активности митохондрий выполнен с помощью J. Wu (National Heart Lung and Blood Institute, Бетесда, США). Анализ и сортировка клеток с помощью проточного флуоресцентного цитометра проводились в специализированном отделе (Fox Chase Cancer Center, Филедельфия, США).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Аутофагия - процесс, при котором участки цитоплазмы и дефектные органеллы доставляются в лизосомы, где происходит их деградация. Образующиеся аминокислоты, нуклеотиды и триглицериды используются для синтеза новых белков, нуклеиновых кислот и липидов. У высших эукариот описано несколько способов доставки органелл и макромолекул в лизосомы (аутофагии). Эндоцитоз участвует в доставке макромолекул с клеточной поверхности в лизосомы. Часть цитоплазмы может быть захвачена лизосомами путем инвагинации лизосомальной мембраны: процесс, называемый микроаутофагией. Таким же способом происходит и захват пероксисом, так называемая пексофагия. Существует направленный и селективный транспорт цитозольных белков в лизосомальное пространство, который зависит от наличия в этих белках специфического мотива (КРЕК(£) и опосредуется лизосомально-ассоциированным белком ЬАМР-2а и белком теплового шока Нзс73. Макроаутофагия - это основной лизосомальный путь, ответственный за неселективную доставку цитоплазматического материала во время клеточного голодания и утилизацию дефектных органелл. В дальнейшем мы будем рассматривать только процессы макроаутофагии и называть ее аутофагией

Интенсивность аутофагии может быть различной. Аутофагия на низком уровне происходит во всех клетках, осуществляя гомеостатические функции через утилизацию белков и органелл. Процесс быстро активируется в клетках, испытывающих недостаток питательных веществ, ростовых факторов и энергии. Аутофагия также активируется в клетках, подвергающихся структурным перестройкам в ходе развития, или в случае необходимости для клетки избавиться от продуктов окислительного стресса, инфекционных агентов или белковых агрегатов.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пархитько, Андрей Александрович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В последние несколько лет резко возрос интерес к изучению аутофагии не только как гомеостатическому процессу, обеспечивающего деградацию внутриклеточных белков и способствующего клеточному обновлению, но и как к процессу, играющему важнейшую роль при развитии различных патологий. Одной из таких патологий является развитие опухолей, в результате инактивации генов супрессоров опухолевого роста или активации онкогенов. До настоящего времени до конца не выяснено, как изменяется активность аутофагии в результате генетических изменений при образовании опухолевых клеток, каковы молекулярные механизмы, лежащие в основе этих изменений и как влияет изменение уровня аутофагии на рост опухолевых клеток.

При сравнении уровня аутофагии в различных клеточных линиях с интактным и инактивированным геном TSC2 нами установлено, что инактивация гена TSC2 приводит к снижению уровня аутофагии как в нормальных условиях, так и в условиях клеточного стресса. Аутофагия также снижена в опухолевых клетках с инактивацией гена TSC2 от больных ТС по сравнению с окружающими нормальными клетками. Использование ингибитора киназного комплекса mTORCl -рапамицина показало, что снижение уровня аутофагии в клетках с инактивированным геном TSC2 происходит в результате активации mTORCl и его ингибирование приводит к нормализации уровня аутофагии. Также в результате нашего исследования была выявлена ранее неизвестная функция белка рабин-8, регулирующего активность киназного комплекса тТ(ЖС1 в результате взаимодействия с ГТФ-азой ШгеЬ.

Чтобы выяснить последствия снижения уровня аутофагии в клетках, мутантных по гену ТБС2, аутофагию ингибировали двумя способами - с помощью короткошпилечных РНК против генов Atg5 и ВесИп1 или с помощью хлорохина - фармакологического ингибитора аутофагии. Показано, что ингибирование аутофагии снижало окислительную функцию митохондрий и синтез АТФ, индуцировало клеточную смерть в условиях ограниченного количества питательных веществ в среде, а также приводило к замедлению опухолевого роста.