Роль центросомы в динамической организации системы микротрубочек в клетке тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.11, доктор биологических наук в форме науч. докл. Алиева, Ирина Борисовна

• Алиева, Ирина Борисовна
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 1999

Заключение диссертации по теме «Эмбриология, гистология и цитология», Алиева, Ирина Борисовна

ВЫВОДЫ.

1. Анализ строения центросомы интерфазных клеток культуры ткани позволяет утверждать, что перицентриолярные сателлиты, первичные реснички и исчерченньтк кпрегггеи являются типичными и постоянными структурами, входящими помимо пары центриодей в ее состав:

- количество перицентриолярных сателлитов на одну центриоль в норме варьирует незначительно (1-2 на активную центриоль), однако может значительно возрастать в ходе экспериментальных воздействий. Поскольку большая часть микротрубочек отходит от головок перицентриолярных сателлитов, увеличение числа сателлитов всегда сопровождается возрастанием количества микротрубочек, расходящихся от центросомы;

- первичные реснички присутствуют в центросоме 20-30% клеток исследованных линий СПЭВ, КЕБ, ЗТЗ, РЖ1 на всех стадиях клеточного цикла, кроме митоза и ранней интерфазы, но отсутствуют в клетках НеЬа;

- исчерченные корешки встречаются у 25-30% клеток в популяции. Они могут быть обращены как к активной (материнской), так и к неактивной (дочерней) центриолям и, значительно реже, к обеим центриолям одновременно. Наличие исчерченных корешков не коррелирует с присутствием в центросоме первичной реснички.

2. Стереоскопическое изучение расположения микротрубочек в области центросомы и анализ расположения их концов в непосредственной близости от центриолей позволяет заключить, что помимо микротрубочек, проксимальные концы которых закреплены на одном из центров схождения микротрубочек, вокруг центросомы всегда существует значительное количество микротрубочек со свободными проксимальными концами. Свободные концы микротрубочек направлены в сторону одного из центров схождения микротрубочек.

Дистальные концы большинства микротрубочек не выходят за пределы анализируемого района центросомы. Свободный проксимальный конец имеют не более половины микротрубочек, радиально расходящихся от центросомы.

3. Методика стереореконструкции системы микротрубочек вокруг центросомы позволяет оценить их количество и измерить длину. В клетках СПЭВ, ТР, Ь-клеток и МЭФ от центросомы отходит малое количество микротрубочек, средняя длина которых не превосходит 1 мкм. Таким образом, большинство радиально расходящихся от центросомы микротрубочек короткие, они не доходят до периферии клеток.

4. В клетках существуют свободные микротрубочки, распространенные по всей цитоплазме и не связанные с центросомой, которые выявляются как на световом, так и на электронномикроскопическом уровне. Свободные микротрубочки составляют большинство (более 90%) от общей массы цитоплазматических микротрубочек. Средняя длина свободных микротрубочек превосходит среднюю длину микротрубочек, расходящихся от центросомы. Полученные результаты позволяют предположить, что в клетке существует две системы микротрубочек обладающие, возможно, разными свойствами.

5. Сравнение показало, что две системы микротрубочек по-разному реагируют на воздействие веществ. стабилизирующих и деполимеризуюших микротрубочки - популяция ассоциированных с центросомой микротрубочек более стабильна, чем цитоплазматическая сеть микротрубочек. Вместе с тем, внутри популяции ассоциированных с центросомой микротрубочек существуют различия в поведении закрепленных микротрубочек и микротрубочек со свободным проксимальным концом.

6. Исследование свойств связанных с центросомой микротрубочек показывает. что в ответ на целый ряд воздействий их сеть всегда гипертрофируется. Числа микротрубочек существенно увеличивалось при воздействии веществ, как нарушающих энергетический обмен в клетке (ДНФ, ДНФ в сочетании с ДОГ, ФКФ, азид натрия), так и подавляющих функции одного фермента (уабаин). Таким образом, сеть связанных с центросомой микротрубочек способна однотипно реагировать на ряд повреждающих воздействий, что возможно является неспецифическим ответом на ухудшение внутриклеточного метаболизма.

7. В ходе воздействия ингибиторов энергетического обмена увеличение числа микротрубочек, отходящих центросомы, сопровождается увеличением угла наклона активных нентриолей по отношению к плоскости субстрата - активные центриоли ориентированы преимущественно перпендикулярного к субстрату. К увеличению доли перпендикулярно ориентированных активных центриолей приводят только те ингибиторы, которые деполяризуют плазматическую мембрану (ДНФ, ФКФ, уабаин). Описанная реакция развивается как при сильном общем угнетении метаболизма клетки (ДНФ+ДОГ), так и при выключении лишь одного фермента (уабаин). Разрушение микротрубочек и микрофиламентов не припятствует возникновению преимущественно перпендикулярной ориентации активной центриоли.

8. Получены экспериментальные подтверждения возможной регуляторной роли центросомы в митозе: нарушение связи центросомы с микротрубочками в К-митозе приводит к возникновению многополюсных митозов после снятия митостатического воздействия. Один из полюсов в таких ана- и телофазных клетках лишен центриолей, он способен обеспечить расхождение хромосом, но не нормальную цитотомию. Таким образом, в митозе центросома определяет не только формирование веретена деления, но и нормальное протекание его последующих событий.

9. С помощью кроличьих поликлональных антител против С-концевого фрагмента человеческого у-тубулина было показано, что количество у-тубулина на центросоме непостоянно. Минимальное количество у-тубулина наблюдается в интерфазной центросоме, а в ходе клеточного цикла его количество циклически изменяется: в прометафазе интенсивность свечения вдвое выше, чем в интерфазе, а в метафазе - интенсивность максимальная. В течение ана- и телофазы количество у-тубулина в митотических полюсах снижается до уровня интерфазиых клеток.

10. Полученные результаты позволяют предположить, что радиальная сеть микротрубочек, наблюдаемая в световой микроскоп, является квазирадиальной на электронкомикроскопическом уровне - центросома, как носитель у-тубулииовых затравок для полимеризации микротрубочек, благодаря своему специфическому положению в геометрическом центре клетки, упорядочивает сеть микротрубочек в интерфазе. Степень упорядоченности определяется количеством работающих затравок - чем их больше, тем более упорядоченной становится сеть микротрубочек, тем выраженнее ее радиальность. При воздействия ингибиторов энергетического обмена упорядочение сети микротрубочек является общей и неспецифической реакцией центросомы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1987. Изучение условий обратимости метафазного блока и индукции многополюсных митозов при действии нокодазола. Цитология, т. 29, N6, с. 560-567.

2. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1987. Влияние Са2+ -ионофора А23187 на ультраструктуру клеток и поведение клеточного центра. Цитология, т. 29, N9, с. 354.

3. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1988. Нокодазол приводит к инактивации центров организации микротрубочек и появлению областей локальной полимеризации микротрубочек в К-митозе. Биополимеры и клетка, т. 4, N2, с. 91-100.

4. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. 1988. Complete destruction of polar microtubules is a necessary and sufficient condition for induction of multipolar mitoses in cultured cells. Proc. 4-th Intern. Congress of Cell Biology, Montreal, p. 38.

5. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1988. Стереоскопический анализ расположения микротрубочек в районе клеточного центра. 13-я Всесоюзная конференция по электронной микроскопии, с. 119.

6. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1989. Реакция клеточного центра на воздействие кальциевого ионофора А23187. Цитология, т. 31, N3, с. 259-266.

7. Алиева И.Б., Воробьев И.А. Ченцов Ю.С. 1989. Стереоскопический анализ расположения микротрубочек вокруг центросомы в клетках культуры ткани. ДАН СССР, т. 305, N5, с. 1232-1234.

8. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1989. Поведение центросомы при воздействии ингибиторов энергетического обмена на клетки культуры ткани. Биологические науки, N6, с. 45-49.

9. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1989. Морфофункциональная характеристика исчерченных корешков центросомы культивируемых клеток СПЭВ. Цитология, т. 31, N9, с. 1016-1019.

10. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1989. Поведение клеток и распределение центриолей при многополюсном митозе, индуцированном действием нокодазола. Цитология, т. 31, N6, с. 633-641.

11. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1990. Реакция центросомы в клетках культуры ткани на деполяризацию клеточных мембран. Биологические науки, N 4, с. 45- 52.

12. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1990. Влияние разрушения элементов цитоскелета на индуцированные разобщителем изменения центросомы. Цитология, т. 32, N6, с. 620-625.

13. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. 1990. Stereoscopic analisys of microtubules around the centrosome in tissue culture cells. J. Cell Biology, v. Ill, N5, pt.2, p. 298a.

14. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1991. Стереоскопический анализ строения центросомы в клетках перевивной и первичной клеточных культур. Цитология, т. 33, N5, с. 18-26.

15. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. 1991. Induction of multipolar mitoses in cultured cells: decay and restructuring of the mitotic apparatus; distribution of centrioles. Chromosoma, v. 100, p. 532-542.

16. I.B. Alieva, E.A. Vaisberg, E.S. Nadezhdina and I.A. Vorobjev, 1992. Microtubule and intermediate filament patterns around the centrosome in interphase cells. In: "The centrosome." Kalnins V.C. (ed.). Acad. Press 1992. p. 103-129.

17. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1992. Стереоскопический анализ строения центросомы в клетках культуры ткани при действии ингибиторов энергетического обмена. 1. 2,4-динитрофенол, дезоксиглюкоза, азид натрия и кальциевый ионофор А23187. Цитология, т. 34, N5, с. 64-74.

18. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1992. Стереоскопический анализ строения центросомы в клетках культуры ткани при действии трифторметоксикарбонил-цианидфенилгидразона и уабаина. Цитология, т. 34, N7, с. 17-23.

19. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. 1994. Dynamics of intracellular calcium concentration and microtubules in A23187-treated PK cells. Cell Biol. Intern. 18, N5, p. 443.

20. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. The centrioles and microtubules in PK cells treated with calcium ionophore A23187. 9th Annual Meeting of the European Cytoskeleton Forum. Dundee, 7-12 September 1994. P12.

21. Алиева И.Б., Воробьев И.A. 1994. The centrioles and microtubules in PK cells treated with calcium ionophore A23187. Intern. Symposium on Biological Motility. Puschino, 1994. Sept. 25-30. p. 209-210.

22. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. 1994. Centrosome behavior under the action of uncoupler and the effect of disruption of cytoskeleton elements on the uncoupler-induced alterations of the centrosome J. Structural Biology v. 113. p. 217-224.

23. RJE.Uzbekov, I.B. Alieva, and I.A. Vorobjev. 1995. Chromosome and centrosome movement after UV microirradiation of mitotic spindle. Eur. J. Cell Biol., Supplement volume, p. 195.

24. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. 1995. Centrosome behavior and orientation of centrioles under the action of energy transfer inhibitors. Cell Biol. International v. 19. N2 103-112.

25. Yu.A. Komarova, E.V. Ryabov, R.E .Uzbekov, I.B. Alieva, S.E. Uzbekova and

I.A. Vorobjev. 1995. Gamma-tubulin is constandy associated with centrioles and not with microtubule organizing centers. Mol. Cell Biol. v. 6: 39a

26. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1995. Анализ ориентации центриолей в клетках культуры СПЭВ при действии кальциевого ионофора А23187. Цитология, т. 37. N5/6, с. 491-499.

27. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1995. Свободные цитоплазматические микротрубочки и микротрубочки, связанные с центросомой, по-разному реагируют на воздействие таксола и нокодазола. Цитология, т. 38, N2, с.175.

28. Комарова Ю.А., Рябов Е.В., Узбеков Р.Э., Узбекова С.В., Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1996. Локализация гамма-тубулина в культивируемых клетках. Цитология, т. 38, N 2, с. 211.

29. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1996. Свободные цитоплазматические микротрубочки и микротрубочки, связанные с центросомой, по-разному реагируют на воздействие таксола и нокодазола. Цитология, т. 38, N 2, с. 175.

30. Комарова Ю.А., Рябов Е.В., Алиева И.Б., Узбеков Р.Э., Узбекова С.В., Воробьев И.А. 1996. Поликлональные антитела против человеческого у-тубулина окрашивают центриоли в клетках различной тканевой принадлежности. Биологические мембраны, т. 13, N5, с. 468-478.

Komarova Yu.A., Е.А. Ryabov, I.B. Alieva, R.E. Uzbekov, S.V. Uzbekova, and LA. Vorobjev. Polyclonal antibodies against human y-tubulin stain centrioles in mammalian cells from different tissues. Memb and Cell Biol., v. 10, N 5, pp 502-512.

31. I.B. Alieva, I.A. Vorobjev. 1996. Microtubule pattern around the centrosome in cultured cells after experimental treatment. High voltage electron microskopic study. Progress in Biophys. and Molec. Biol., vol. 65, suppl 1, p.175.

32. I.B. Alieva, R.E. Uzbekov, I.A. Vorobjev. 1996. Effect of ultraviolet microirradiation of mitotic cells. Int. Meeting on UV/Blue light. 25-31 Aug., Marburg, p.76.

33. I.B. Alieva, I.A.Vorobjev. 1996. Stereoscopic Dynamics of microtubule pattern around the centrosome in the interphase PK cells under taxol and nocodazole treatements. Mol. Cell Biol. Supplement volume 7, 576a.

34. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1996. Влияние повышения концентрации кальция, вызванного действием ионофора А23187, на митоз культивируемых клеток СПЭВ. Цитология, т. 38, N12, с. 1261-1268.

35. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1997. Стереоскопический анализ расположения микротрубочек вокруг центросомы интерфазных клеток СПЭВ после действия таксола и нокодазола. Биологические мембраны, т. 14, N. 1, с. 18-28.

I.B. Alieva, I.A.Vorobjev. 1997. Stereoscopic analysis of distribution of microtubules around the centrosome in the interphase PK cells after treatements with taxol and nocodazole. Membr. and Cell Biol., v. 14, N1, p. 629-639.

36. I.B. Alieva, L.A. Gorgidze, YU.A. Komarova, I.A.Vorobjev. 1997. Immunofluorescent and electron microskopic studies of the expression of primary cilium in tissue cultured cells. 12th Meeting of the European Cytoskeletal Forum. 6-11 Sept., Siena, Italy. P. 31.

37. Vorobjev I.B., Alieva I.B., Borisy G.G., Chernobelskaya O.A., Grigoriev I.S.

Microtubules distribution and dynamics in cultured mammalian cells. 1997. Cell Biol. Int., V. 21 (12), p. 903-905.

38. Алиева И.Б., Горгидзе JI.A., Комарова Ю.А., Чернобельская О.А., Воробьев

И.А. 1997. Эксперимен'^^ая модель ¿^^зучения первичной реснички в клетках культуры ткани. Биологические мембраны, т. 15, N6, с. 709717.

39. I.B. Alieva, I.A.Vorobjev. 1998. Interphase microtubules in cultured cells: long or short? Mol. Cell Biol. Supplement volume 9.

40. Алиева И.Б., Воробьев И.А. 1999. Микротрубочки в интерфазных культивируемых клетках - длинные или короткие? Биологические мембраны, т. 16, в печати .

41. Воробьев И.А., Узбеков Р.Э., Комарова Ю.А., Алиева И.Б. 1998. Распределение у-тубулина в интерфазных и митотических клетках при стабилизации и деполимеризации микротрубочек. Биологические мембраны, т. 16, в печати.

Гарнитура Times. Формат 60x90/16. Печать офсетная. Уч.-изд. л 1,0 Усл. печ. л 1,5. Тираж ЮОэкз.

Биоинформсервис", 117984, Москва, ул. Вавилова 32. Отпечатано с готового оригинал-макета.

Заключение.

Несмотря на бурное развитие в последние годы новых методов исследования внутриклеточных структур, единственной доказанной функцией центросомы на сегодняшний день остается организация радиальной системы микротрубочек в интерфазной клетке. При этом полимеризация микротрубочек далеко не в полной мере определяется непосредственно центросомой: на ней закладывается и может расти небольшое по сравнению с общим количеством в клетке число микротрубочек. Результаты данной работы и анализ литературных данных позволяют заключить, что это количество, по-видимому, определяется количеством работающих затравок - гаммасом - сердцевину которых составляет у-тубулин. Центросома, как носитель затравок, благодаря своему специфическому положению в геометрическом центре большинства клеток, организует упорядоченную радиальную сеть, и эта организующая роль более сложна, нежели представлялось ранее. Как показано в настоящей работе, с центросомой связаны в основном короткие микротрубочки, которые не доходят до периферии клетки и самостоятельно не способны организовать внутриклеточный транспорт, существование которого показано не только для таких специализированных клеток, как меланофоры (ИосЦопоу е! а!., 1997), но и для клеток нормального эпителия и фибробластов (Григорьев и др., 1997; Чернобельская и др., 1998; Григорьев и др., 1999). Если принять конвейерную гипотезу сборки микротрубочек, предложенную Воробьевым и Ченцовым (1982), то с учетом современных данных работа центросомы может быть описана так: расходящиеся от центросомы микротрубочки связаны с ЦОМТ не постоянно, а лишь в течение определенного промежутка времени; в последующем микротрубочки с некоторой отличной от нуля вероятностью отделяются от ЦОМТ и, постепенно удаляясь от центросомы, но сохраняя радиальную направленность, формируют в цитоплазме сложную сеть микротрубочек. На освобождающихся гаммасомах может инициироваться рост новых микротрубочек. Выдвинутая позднее гипотеза динамической нестабильности (Мкс1шоп, КгесЬпег, 1984), согласно которой микротрубочки в равновесных условиях с некоторой вероятностью могут расти или же быстро разбираться, не объясняет происхождения коротких свободных микротрубочек, количество которых, как было продемонстрировано в настоящей работе, может быть достаточно большим. Но в совокупности с настоящими данными она дополняет конвейерную гипотезу сборки микротрубочек. По-видимому, распределение микротрубочек, отделившихся от центросомы, является следствием трех одновременно происходящих процессов: инициации роста микротрубочек на центросоме, отделение их в дальнейшем от ЦОМТ с определенной (не нулевой) вероятностью и динамической нестабильности как прикрепленных, так и отделившихся микротрубочек. Описанная схема не противоречит факту существования в клетке системы цитоплазматических микротрубочек, способных к спонтанной самосборке и разборке вне связи с какими-либо структурами (УогоЬуеу а а1., 1997; '\¥а(18\\'огй1 й а!., 1997). По-видимому, в клетке существует две системы микротрубочек, возможно выполняющие разные функции. Происходящий в настоящее время бурный прогресс в исследовании динамики микротрубочек, обусловленный развитием молекулярно-биологических методов и видеомикроскопической техники, позволяет надеяться, что в обозримом будущем появятся экспериментальные данные, позволяющие четко разграничить две системы микротрубочек не только структурно, но и функционально.

Вместе с тем, данная работа поднимает и ряд новых вопросов, определяющих перспективы дальнейших исследований. Так, в работе показано, что в центросоме, наряду с закрепленными, существует значительное количество микротрубочек со свободными проксимальными концами. Если следовать конвейерной гипотезе сборки микротрубочек на центросоме, то микротрубочки со свободными концами - готовые кандидаты на роль уходящих микротрубочек - тех, которые завершили свой рост, оторвались от затравки и покидают центросому. Это с одной стороны. С другой стороны, затравкой для полимеризации микротрубочек (или ее основной частью) принято считать описанный в последние годы у-тубулин. Однако, несмотря на крайне интенсивное изучение этого белка, вопрос о его точном месте нахождения в клетке остается открытым - и здесь без метода электронной микроскопии не обойтись. Если у-тубулин расположен на центриоли или в головках сателлитов - это очередное свидетельство в пользу конвейерной гипотезы, а если у-тубулин расположен вокруг центриолей? Тогда, может быть, что наблюдаемые свободные микротрубочки никогда и не были связаны с центриолями и их рост идет от затравок, расположенных вокруг центриолей. Тогда конвейер не нужен - в цитоплазму уходят именно эти микротрубочки, а микротрубочки, связанные с центриолями, возможно никуда и не уходят, оставаясь всегда связанными и задавая направления (как бы являясь основой) жесткого каркаса для создания радиальной сети микротрубочек. Не исключено, что эта радиальная сеть может состоять из микротрубочек незначительной длины, перекрывающихся концевыми участками друг относительно друга. Разработанная в ходе выполнения данной работы методика стереореконструкций позволит в будущем продвинуться в разрешении этого вопроса.

По-прежнему остается малопонятной также и роль собственно центриолей в составе центросомы. С одной стороны, они чрезвычайно широко распространены в клетках многоклеточных животных и структура девяти триплетов микротрубочек является универсальным "каркасом". В то же время, центриоли не являются обязательным компонентом клеток многоклеточного организма. Если попытаться проследить, в каких случаях центриоли исчезают, то оказывается, что их нет только в терминально дифференцированных клетках, которые не имеют радиальной системы микротрубочек (Комарова, Воробьев, 1886; Мо£етеп й а1., 1997 ). Хотя центриоли как таковые сами по себе с микротрубочками не связаны, необходимость центриолей для формирования компактной функционирующей центросомы следует признать очевидной. Можно утверждать, что структуры с микротрубочками, расходящимися от них радиально по сфере, и не содержащие центриолей, в природе крайне редки (за исключением типа простейших). Для интерфазной подвижной клетки необходима одна и только одна система радиальных микротрубочек (в митозе - две и только две). Анализ литературных данных и результаты настоящего исследования позволяют полагать, что центриоли с их уникальным механизмом удвоения, продолжительным периодом созревания являются наилучшим кандидатом на роль ядра в центре организации микротрубочек. Центросома, ядро которой составляют центриоли, задает каркас для сложно организованной и упорядоченной системы радиальных микротрубочек, тянущихся от центра на периферию, определяет и изменяет степень выраженности этой системы в норме и при различных воздействиях на клетку.